Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64063

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Streszczenie

Do wizualizacji pojedynczych komórek w całym ciele żywego embrionalnego, larwalnego lub młodocianego danio pręgowanego można użyć wielu metod. Pokazujemy, że żywe ryby z fluorescencyjnie zaznaczonymi błonami plazmatycznymi można skanować w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym w celu określenia objętości tkanki mięśniowej i liczby obecnych włókien mięśniowych. Opisano skuteczne podejścia do pomiaru liczby i wielkości komórek u żywych zwierząt w czasie i zweryfikowano je pod kątem bardziej żmudnych metod segmentacji. Opisano metody, które pozwalają na kontrolę aktywności elektrycznej, a tym samym kurczliwej mięśni. Utrata aktywności skurczowej mięśni szkieletowych znacznie zmniejszyła wzrost mięśni. U larw opisano protokół, który pozwala na ponowne wprowadzenie wzorzystej aktywności skurczowej wywołanej elektrycznie. Opisane metody minimalizują wpływ zmienności międzyosobniczej i pozwolą na analizę wpływu bodźców elektrycznych, genetycznych, lekowych lub środowiskowych na różnorodność komórkowych i fizjologicznych parametrów wzrostu w kontekście żywego organizmu. Następnie można przeprowadzić długoterminową obserwację zmierzonych skutków zdefiniowanej interwencji we wczesnym okresie życia u poszczególnych osób.

Wprowadzenie

Regulowany wzrost tkanki, obejmujący wzrost liczby komórek (hiperplazja) i/lub rozmiar komórek (hipertrofia), jest kluczowym czynnikiem rozwoju, regeneracji oraz adaptacji ekologicznej i ewolucyjnej. Pomimo ogromnych postępów w zrozumieniu genetyki molekularnej zarówno biologii komórki, jak i biologii rozwoju w ostatnich dziesięcioleciach, mechanistyczne zrozumienie regulacji wielkości tkanek i narządów jest wciąż w powijakach. Jedną z przyczyn tej luki w wiedzy jest trudność w ilościowym określeniu wzrostu tkanek w organizmach żywych z niezbędną dokładnością przestrzenną i czasową.

Różne aspekty wzrostu całych organizmów mogą być mierzone wielokrotnie w czasie, ujawniając krzywe wzrostu dla każdej osoby1,2,3,4,5. Coraz bardziej wyrafinowane metody skanowania, takie jak podwójna absorpcjometria promieniowania rentgenowskiego (DXA), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI), umożliwiają śledzenie wzrostu całych narządów i innych obszarów ciała (na przykład poszczególnych zidentyfikowanych mięśni szkieletowych) u pojedynczych osób, zarówno ludzkich, jak i w organizmach modelowych6,7,8,9,10. Jednak metody te nie mają jeszcze rozdzielczości, aby ujawnić pojedyncze komórki, a zatem powiązania między zachowaniami komórkowymi a wzrostem poziomu tkanek były trudne do dostrzeżenia. Aby stworzyć takie powiązania, tradycyjne badania często opierały się na kohortach podobnych pojedynczych zwierząt, z których kilka jest składanych w ofierze w kolejnych punktach czasowych, a następnie analizowanych w szczegółach cytologicznych. Takie podejścia wymagają uśredniania obserwowanych zmian w grupach (najlepiej podobnych, ale jednak zmiennych) osobników, a zatem cierpią z powodu braku rozdzielczości czasowej i przestrzennej, co utrudnia znalezienie skorelowanych zdarzeń na poziomie komórkowym sugerujących przyczynę i skutek.

Badania nad modelowymi organizmami bezkręgowców, początkowo u C. elegans i D. melanogaster, obeszły te problemy, rozwijając mikroskopię optyczną, aby osiągnąć rozdzielczość komórkową i dokładnie mierzyć wzrost w czasie u pojedynczych osób. Takie badania ujawniły uderzająco niezmienne zachowania linii komórkowych we wzroście tych małych organizmów modelowych11,12,13,14,15,16,17. Jednak wiele zwierząt, w tym wszystkie kręgowce, ma nieokreślone linie komórkowe i kontroluje wzrost tkanek za pomocą tajemniczych procesów sprzężenia zwrotnego, które służą do przekształcenia genetycznie zakodowanego programu wzrostu w funkcjonalny trójwymiarowy organizm ze wszystkimi jego tkankami i narządami składowymi odpowiednio dopasowanymi pod względem wielkości. Aby zrozumieć te złożone procesy wzrostu, pożądane jest obrazowanie całych tkanek lub narządów w czasie u pojedynczych osób, które mogą być eksperymentalnie manipulowane za pomocą interwencji genetycznych, farmakologicznych lub innych w wybranym momencie, a następnie analizowany efekt.

Każdy mięsień szkieletowy kręgowca ma określony rozmiar, kształt i funkcję, a także dobrze scharakteryzowane interakcje z sąsiednimi tkankami, takimi jak kości, ścięgna i nerwy. Niektóre mięśnie są małe, leżą tuż pod skórą i dlatego są dobrymi kandydatami do badań obrazowych w wysokiej rozdzielczości. Podobnie jak większość narządów, każdy mięsień rośnie przez całe życie embrionalne, poporodowe i młodzieńcze, zanim osiągnie stabilny rozmiar dorosłego człowieka. Mięśnie mają jednak również wyjątkową zdolność do zmiany rozmiaru w dorosłym życiu, w zależności od użytkowania i odżywiania18, a ta właściwość ma duży wpływ na sprawność organizmu, wyniki sportowe i niezależne życie. Utrata masy mięśniowej i funkcji w starszym wieku, sarkopenia, jest kwestią budzącą coraz większe zaniepokojenie społeczeństw stojących w obliczu starzejącej się populacji19,20,21.

My i inni skupiliśmy się na wzroście zdefiniowanych bloków tkanki mięśni szkieletowych w segmentalnie powtarzającym się ciele larw danio pręgowanego, jako pozornie zamkniętym systemie zawierającym kilkaset komórek, w których można obserwować i manipulować wzrostem, utrzymaniem i naprawą tkanek22,23,24,25,26. Chociaż niektóre prace ilościowe zostały wcześniej zgłoszone25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nie jest dostępna żadna szczegółowa i zwalidowana metoda pomiaru przyrostu mięśni w szczegółach komórkowych u poszczególnych organizmów kręgowców w czasie. W tym miejscu opisano skuteczny protokół wykonywania takich powtarzających się pomiarów, wraz z walidacją, a także podano przykład jego użycia do analizy zmian zarówno w przerostowym, jak i hiperplastycznym wzroście w odpowiedzi na zmienioną aktywność elektryczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i na podstawie odpowiednich licencji brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych, zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku i późniejszymi modyfikacjami. Zarodki/larwy powinny być hodowane w temperaturze 28,5 °C do czasu zakończenia gastrulacji, ale następnie mogą być trzymane w temperaturze 22–31 °C w celu kontrolowania tempa rozwoju. Ryby mogą być skanowane lub stymulowane w temperaturze pokojowej.

1. Znieczulenie larw danio pręgowanego

  1. Krzyżuj odpowiednie fluorescencyjne dorosłe ryby reporterowe, takie jak Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg reference36 lub Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg reference37 i zbieraj zarodki zgodnie z opisem38.
  2. W momencie wyboru, np. 2 dni po zapłodnieniu (dpf), krótko znieczulij zarodki za pomocą pożywki rybnej zawierającej trikainę (woda dla ryb lub pożywka E3) i przeprowadź badanie przesiewowe pod kątem EGFP lub mCherry pod mikroskopem fluorescencyjnym, takim jak Leica MZ16F. Jeśli ktoś ma wiele zarodków, wybierz te z najjaśniejszym sygnałem. Natychmiast po badaniu przesiewowym należy umieścić zarodki na normalnym pożywce dla ryb.

2. Montaż ryb do skanowania konfokalnego

  1. Włącz konfokalny system skanowania laserowego i lasery, aby system ustabilizował się na 30-60 min.
    UWAGA: W tym przypadku użyliśmy mikroskopu Zeiss LSM 5 Exciter z pionowym statywem materiałowym (który zwiększa odległość roboczą) wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy w wodzie 20x/1,0 W.
  2. Przygotuj 1% niskotopliwą agarozę (LMA) i przechowuj w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C do wielokrotnego użycia w probówce o pojemności 1,5 ml. Aby uniknąć szoku cieplnego, wyjmij podwielokrotność LMA z bloku grzewczego i pozwól mu ostygnąć do temperatury nieco powyżej ustawienia przed nałożeniem na larwę, testując na skórze, aby ocenić odpowiednią temperaturę, tak jak w przypadku oceny temperatury mleka modyfikowanego dla niemowląt.
  3. Wybierz rybę, która ma być zamontowana i przejściowo znieczulij każdą rybę po kolei Trikainą (0,6 mM w podłożu rybnym).
  4. Wziąć szalkę Petriego o średnicy 60 mm, która została pokryta warstwą 1% agarozy i umieścić ją na mikroskopie preparacyjnym
    5. .
  5. Przenieść larwę za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 1 ml na pokrytą 60 mm szalką Petriego i usunąć jak najwięcej przeniesionego podłoża. Następnie, nadal używając pipety Pasteura, umieść 5 do 10 kropli LMA na rybie i szybko ustaw poziomo w widoku bocznym za pomocą kleszczy (lub polerowanej ogniowo cienkiej szklanej igły) przed zastygnięciem LMA. W celu uzyskania optymalnego obrazowania pożądane jest umieszczenie larwy blisko górnej powierzchni LMA.
    1. Alternatywnie, używając plastikowej pipety Pasteura o pojemności 1 ml, należy zebrać larwę z jak najmniejszą ilością podłoża rybnego i przenieść larwę do podwielokrotności schłodzonego LMA. Pozwól larwie zatonąć przez 5 sekund, aby całkowicie otoczyć się LMA. Następnie należy pobrać larwę i przenieść ją w postaci kropli LMA na pokrytą agarozą szalkę Petriego. Szybko zorientuj i ustaw larwę zgodnie z powyższym opisem.
  6. Ustawić larwę tak, aby zarówno jej oś przednio-tylna, jak i grzbietowo-brzuszna znajdowały się w odległości 10° od poziomu (patrz uwaga "Błąd i jego korekta" w ppkt 4.6 poniżej).
    1. Jeśli larwa nie jest prawidłowo zamontowana poziomo w pobliżu powierzchni kropli agarozy, usuń ją i ponownie osadź . Larwy można łatwo odzyskać poprzez delikatne odsysanie za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 1 ml drobnoziarnistej, a LMA można delikatnie usunąć za pomocą chusteczek Kimwipes. Praktyka naprawdę czyni mistrza w procedurze montażu; Poświęć popołudnie na osadzenie kilku nieistotnych larw, zanim spróbujesz tego w prawdziwym eksperymencie.
      UWAGA: O konstrukcji mikroskopu: Wiele laboratoriów używa odwróconych mikroskopów konfokalnych do obrazowania przez szkiełko nakrywkowe. Stwierdziliśmy, że wielokrotne osadzanie i usuwanie ryb trzymanych w agarozie pod szkiełkiem nakrywkowym w celu obserwacji w mikroskopie odwróconym prowadzi do większych strat próbek podczas wielokrotnego skanowania niż w opisanej procedurze z użyciem mikroskopu pionowego. Z tego powodu zaleca się stosowanie systemu pionowego, jeśli jest dostępny. Niemniej jednak kluczem do wysokiej jakości danych jest odpowiedni dobór i wykorzystanie parametrów obiektywu i skanowania, temat zbyt obszerny, aby go tutaj omawiać.

3. Skanowanie konfokalne

  1. Gdy LMA stężeje, zalej naczynie około 10 ml pożywki rybnej zawierającej trikainę. Jeśli planujesz złapać stosy konfokalne, pozwól zamontowanej rybie odpocząć przez co najmniej 10 minut przed przystąpieniem do skanowania, ponieważ wystąpi obrzęk agarozy.
  2. Załaduj naczynie na próbkę do etapu układu konfokalnego, zlokalizuj larwę i skup się na żądanym somicie. Somite 17 może być wybrany ze względu na łatwość lokalizacji w pobliżu ujścia odbytu i łatwość obrazowania. Sprawdź, licząc somity od anterior.
    UWAGA: Pierwszy somit jest zrośnięty za uchem i nie ma przedniej granicy, ale można go łatwo zaobserwować jako włókna mięśni prążkowanych.
  3. Ustaw tak, jakby chciał uchwycić stos Z, definiując górę (tj. tuż nad skórą) i dół (tj. tuż pod struną grzbietową, tak aby uwzględnić cały somit, nawet jeśli ryba jest zamontowana lekko przekrzywiona). Zarówno lewa, jak i prawa strona mogą być przechwytywane zgodnie z potrzebami. Zapewni to, że wszystkie szybkie skany YZ przechwycą żądane regiony.
  4. Uchwyć obraz XY w następujący sposób. Zorientuj obszar skanowania w stosunku do ryby, zgodnie z pozwala na to oprogramowanie konfokalne. Ustaw rybę tak, aby oś przednio-tylna była równoległa do obrazowanej osi X, a oś grzbietowo-brzuszna była równoległa do osi Y z somitem 17 w środku pola, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1. Skoncentruj się na płaszczyźnie środkowego poziomu w najwyższym miotomii, w której widoczne są całe połówki somitu epaxialnego i hypaxjalnego wraz z pionową i poziomą mioseptą i uchwyć obraz XY o wysokiej rozdzielczości. Pamiętaj, aby nazwać i zapisać obraz.
  5. Uchwyć jeden lub więcej obrazów YZ w następujący sposób. W Reprezentatywnych wynikach (poniżej) porównano dokładność metod 2-warstwowych i 4-warstwowych. W podejściu 2-warstwowym stosuje się pojedyncze skany XY i YZ. W podejściu 4-warstwowym trzy skany YZ są uśredniane, aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie objętości miotomii. Jeśli jest to wymagane przez oprogramowanie konfokalne, zmień orientację pola skanowania.
    1. Narysuj dokładnie linię grzbietowo-brzuszną w poprzek wybranego somitu prostopadle do przednio-tylnej osi ryby w wybranej pozycji przednio-tylnej. Wykonaj skanowanie linii stosu Z.
    2. Powtórz skanowanie linii YZ trzy razy w zdefiniowanych pozycjach przednio-tylnych wzdłuż wybranego miotomii, aby uchwycić YZa, YZm i YZp. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2A. Nazwij i zapisz te obrazy razem z powiązanym obrazem XY.
      UWAGA: Przy wyborze płaszczyzn YZ: Miotom ma kształt litery V, a jego forma zmienia się podczas wzrostu. Aby uzyskać najdokładniejszą ocenę objętości miotomu 17 metodą 4-warstwową, umieść YZa na przednim końcu miotomu, YZp na tylnych końcach miotomu na krańcach grzbietowych i brzusznych oraz YZm w połowie drogi między YZa i YZp. Zakładając, że somit zwęża się równomiernie, średnia pomiarów z każdej sekcji YZ będzie reprezentować miotom jako całość. W przypadku metody 2-warstwowej pojedynczy skan YZ należy umieścić na tylnym końcu poziomej przegrody mięśniowej, która w przybliżeniu odpowiada przednio-tylnemu środkowi miotomii będącej przedmiotem zainteresowania (takiej jak YZm). Alternatywnie, zestaw trzech odcinków YZ można pobrać z przodu, pośrodku i z tyłu poziomej przegrody mięśniowej, ale, jak pokazano poniżej, taki pomiar nieznacznie zawyży lub zaniży objętość miotomy (odpowiednio dla somitów rostralnych i ogonowych z powodu zwężania się miotomii). Zasadniczo, kluczem do odtwarzalności jest spójność w ustawianiu płaszczyzn plastrów YZ między rybami a doświadczeniami.

4. Analiza

  1. Ponieważ miotom zmienia rozmiar wzdłuż ryby w stopniowany sposób, zawsze pracuj z tym samym somitem w badaniach porównawczych.
  2. Aby zmierzyć i obliczyć objętość miotomii, użyj oprogramowania konfokalnego (takiego jak pliki .lsm utworzone za pomocą oprogramowania mikroskopowego Zeiss ZEN) lub uniwersalnego oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym, takiego jak Fiji/ImageJ.
    UWAGA: W przypadku zmiany formatów plików należy upewnić się, że rozmiar kroku Z jest prawidłowo przenoszony, ponieważ nie wszystkie programy mogą poprawnie odczytywać zastrzeżone formaty plików konfokalnych. Na przykład, aby zaimportować obraz skanowania liniowego ZEN do Fidżi, najpierw użyj polecenia File/Export, aby wyeksportować jako .tif w oknie Obraz w pełnej rozdzielczości - format pojedynczej płaszczyzny, a następnie zaimportuj do Fidżi. Chociaż YZ scan.lsm można otworzyć bezpośrednio na Fidżi, wynikowe obrazy YZ są zazwyczaj kompresowane w wymiarze Z z powodu nieprawidłowej oceny rozmiaru kroku Z.
  3. Analiza z wykorzystaniem ZEN
    1. Najpierw otwórz pliki XY scan.lsm w ZEN. Przejdź do zakładki Grafika i wybierz narzędzie Linia. Narysuj linię między dwiema pionowymi mioseptami somitu 17 obejmującą całą długość miotomu (równolegle do przednio-tylnej osi ryby). Zaznacz pole M, aby wyświetlić wartości pomiaru (długość = 89,71 μm, patrz plik uzupełniający 2).
    2. Otwórz pliki YZ scan.lsm. Na karcie Grafika wybierz narzędzie Zamknięte Beziera. Narysuj na obwodzie miotomu. Po zakończeniu zaznacz pole M, co ujawni wartość pomiaru (Obszar = 11980,01 μm2, patrz plik uzupełniający 3).
    3. Zapisuj wartości każdego pomiaru ręcznie w arkuszu kalkulacyjnym. Uśrednij pomiary CSA zgodnie z wymaganiami. Objętość miotomii można obliczyć jako objętość = długość miotomii x CSA, tj. 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
  4. Analiza przy użyciu Fidżi/ImageJ
    1. Otwórz pliki XY scan.lsm w Fidżi/ImageJ. Sprawdź, czy obrazy XY otwierane bezpośrednio na Fidżi są poprawnie skalibrowane w skali, tak jak powinny.
    2. Wybierz narzędzie Linia prosta z ikon. Narysuj linię wzdłuż somitu 17 zgodnie z opisem w kroku 4.3.1. Ustaw parametry pomiaru, przechodząc do opcji Analizuj, a następnie wybierz opcję Ustaw pomiary..., a następnie zaznacz następujące pola Obszar i Wyświetlaj etykietę. Aby dokonać pomiaru, wystarczy nacisnąć skrótu M lub przejść do menu Analiza i wybrać opcję Zmierz. Pojawi się wyskakujące okienko z listą wszystkich wartości pomiarów (tj. Długość = 90,023 μm; patrz plik uzupełniający 4). Wyniki można zapisać w formie .csv i otworzyć w programie Microsoft Excel lub podobnym w celu późniejszej analizy.
    3. Aby zmierzyć CSA na obrazach YZ, otwórz obrazy YZ w .tif formacie, zgodnie z opisem w kroku 4.2.
    4. Skalibruj obrazy YZ .tif, ponieważ są one nieskalibrowane podczas eksportowania. Parametry kalibracji można uzyskać w ZEN, przechodząc do Info wybranych obrazów: zapisz wartości Skalowanie X (0,489 μm) i Skalowanie Z (0,890 μm; patrz Plik uzupełniający 5). Następnie, gdy obrazy są otwarte na Fidżi, przejdź do Obraz i wybierz Właściwości.... Wprowadź 0,489 μm dla szerokości i wysokości piksela oraz 0,890 μm dla głębokości wokseli. Zaznacz pole Globalne, aby uniwersalnie zastosować kalibrację, jeśli przewiduje się powtórzenie pomiaru obrazów YZ (patrz plik uzupełniający 6).
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie obrazy YZ są przechwytywane przy użyciu tych samych parametrów skanowania; uruchom ponownie Fiji/ImageJ lub zmodyfikuj wartości kalibracji, jeśli wymagany jest nowy zestaw kalibracji.
    5. Aby zmierzyć CSA skalibrowanych obrazów YZ, wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów z ikon. Narysuj obwód somitu i naciśnij M, aby wyświetlić wartości pomiaru (Obszar = 11980.395 μm2; patrz plik uzupełniający 7). Objętość miotomii można obliczyć jako objętość = długość miotomii x CSA, tj. 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
    6. Powtórz pomiary na pozostałych obrazach XY i YZ. Zaleca się używanie tego samego oprogramowania do wszystkich pomiarów w ramach serii eksperymentalnej w celu zachowania spójności. Oszacowanie objętości z każdego oprogramowania jest podobne, ale nie identyczne ze względu na różne narzędzia do rysowania, tj. ZEN = 1,074 ×10 6 μm3 i Fidżi/ImageJ = 1,079 × 106 μm3. Wzrost miotomii między dwoma punktami czasowymi (tj. 3 do 4 dpf) można obliczyć jako: (objętość 4 dpf - objętość 3 dpf) / objętość 3 dpf × 100%.
      UWAGA: O błędzie i jego korekcie. Podczas wsiadania ryba powinna być zorientowana w płaszczyźnie strzałkowej (tj. osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej) jak najbliżej poziomu, aby uniknąć odpowiednio odchylenia i przechylenia. Dzieje się tak, ponieważ zarówno długość miotomu L mierzona na podstawie skanu XY, jak i CSA mierzona na podstawie skanu YZ będą przeszacowane, jeśli ryba wykazuje odchylenie (obrót wokół osi grzbietowo-brzusznej) z powodu ukośnego montażu przednio-tylnego. Ani pochylenie, ani przechylenie podczas montażu nie powinny wpływać na pomiary po skanowaniu, jak opisano w rozdziale 3. Niemniej jednak rotacja grzbietowo-brzuszna (rolka) pogarsza jakość obrazu. Prosta trygonometria pokazuje, że do 10 ° odchylenia da 3% błąd w pomiarze objętości, ponieważ mierzone L i CSA zwiększają się proporcjonalnie do (cosq)-1, gdzie q jest kątem oddalonym od przednio-tylnego poziomego (odchylenie). Odchylenie o 15° i 20° spowoduje odpowiednio 7% i 13% zawyżenie szacunków objętości.
      Ponieważ struna grzbietowa jest cylindryczna, włączenie całej struny grzbietowej do skanu YZ można wykorzystać do obliczenia kąta i zakresu nachylenia na podstawie orientacji i wielkości osi głównej i mniejszej, a tym samym skorygować zmierzone L i CSA w celu maksymalizacji dokładności. Poprawiony CSA = Zmierzone CSA x oś molowa / oś główna struny grzbietowej. Skorygowane L = Zmierzone L x Oś mała struny grzbietowej / Oś struny grzbietowej w kierunku mikroskopu Z.
      Dalsze rozważania pozwalają na dodatkową korektę L. W miarę wzrostu miotomii przekrzywia się w płaszczyźnie koronalnej (normalnej do osi grzbietowo-brzusznej) tak, że miotomia przyśrodkowa jest nieco przednia w stosunku do miotomii bocznej. Patrząc od grzbietu, pionowa miosepta po lewej i prawej stronie tworzy szeroką szewronę skierowaną do przodu. Jeśli odchylenie jest niskie, morfologia ta nie wpływa na pomiar L. Ale jeśli odchylenie jest znaczące, korekcja trygonometryczna staje się trudna, a lepszym podejściem jest bezpośredni pomiar rzeczywistego L poprzez oszacowanie współrzędnych XYZ dwóch punktów, w których przednia i tylna pionowa miosepta spotykają się ze struną grzbietową w poziomej przegrodzie mięśniowej. Prosta trygonometria pozwala na obliczenie True L z tych współrzędnych jako L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]. Słabe strony tego ostatniego podejścia polegają na tym, że a) wybór punktów może się różnić w zależności od operatora i b) nie jest zachowywany wizualny zapis wybranych punktów. Uwzględnienie tej zasady nie ma wpływu na korektę CSA.

5. Opcjonalna metoda: Usuń i przywróć aktywność elektryczną mięśni

  1. Stwórz komorę stymulacyjną.
    1. Weź płytkę dołka o wymiarach 6 x 35 mm, utwórz dwa małe otwory (o średnicy <5 mm, oddalone od siebie o 1 cm) z każdej strony każdej studzienki (patrz Rysunek 1) za pomocą wąskiej lutownicy.
      UWAGA: Z gorącą lutownicą należy obchodzić się ostrożnie i w razie potrzeby pracować w dygestorium, aby uniknąć wdychania pary.
    2. Przeciągnij parę srebrnych lub platynowych drutów (o długości ~20 cm) przez otwory każdej studzienki (patrz Rysunek 1). Klej wielokrotnego użytku (np. BluTack) można nakładać w pobliżu otworów, aby utrzymać druty na miejscu i zapewnić 1 cm odstępu między drutami (patrz Rysunek 1).
  2. Przy 3 dpf podziel rybę na trzy warunki: pożywka dla ryb Kontrola, Nieaktywna i Nieaktywna + Stymulant.
    1. W przypadku grup nieaktywnych i nieaktywnych+Stim larwy należy znieczulić po 72 godzinach od zapłodnienia (hpf) trikainą (0,6 mM).
      UWAGA: Zgodnie z reference38, zamrożone porcje trikainy są rozmrażane i rozcieńczane (40 μL/ml pożywki rybnej, do końcowego stężenia 0,6 mM) przed dodaniem do ryb. Nie należy dodawać tricainy bezpośrednio do wody zawierającej ryby, ponieważ niektóre ryby mogą otrzymać duże dawki. Wywar Tricaine należy zużyć w ciągu miesiąca i nigdy nie zamrażać ponownie.
    2. Dla pożywki rybnej Kontroluj ryby, pozostaw je nieznieczulone.
  3. W wybranym czasie (czasie) po rozpoczęciu ekspozycji na tricainę (tj. w 80 hpf) przygotuj grupę Inactive+Stim do stymulacji.
    1. Przygotuj 60 ml 2% agarozy (1,2 g proszku agarozy w 60 ml pożywki rybnej) i rozpuść całkowicie za pomocą kuchenki mikrofalowej, ostudzić, dodać trikainę i wlać 4 ml do każdej studzienki komory stymulacji (Rysunek 1).
    2. Natychmiast dodaj wykonane na zamówienie 4-dołkowe grzebienie między elektrodami (utworzone przez wycięcie tworzyw sztucznych (np. polipropylenu) o pożądanych wymiarach i sklejenie ze sobą za pomocą Superglue; patrz Rysunek 1). Odczekaj 10 minut, aż żel stwardnieje. Ostrożnie usuń grzebienie, aby utworzyć cztery prostokątne dołki.
    3. Napełnij każdą studzienkę wodą trykainową i umieść pojedynczą znieczuloną larwę Inactive+Stim w każdej studzience za pomocą mikropipety, tak aby ich przednio-tylna oś była prostopadła do elektrod (patrz Rysunek 1).
    4. Sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym preparacyjnym, czy każda ryba jest w pełni znieczulona w każdej studzience komory.
  4. Podłącz regulowany stymulator generujący wzorce elektrofizjologiczne do komory za pomocą kontrolera polaryzacji, używając zacisków krokodylkowych podłączonych do każdej z elektrod po jednej stronie komory (patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Regulator polaryzacji służy do odwracania polaryzacji co 5 s, aby zapobiec elektrolizie i korozji elektrod.
  5. Stymuluj ryby. Na przykład 1s z ciągiem 200, impulsów 20 V, z czasem trwania impulsu 0,5 ms i separacją impulsów 4,5 ms, raz na 5 s daje skuteczny reżim odporności na skurcz powtarzany tężc
    6. .
  6. Regularnie sprawdzaj pod mikroskopem, aby upewnić się, że ryby są stymulowane; przykładowy bodziec elektryczny powinien wywołać widoczny obustronny skurcz i niewielki ruch, raz na 5 s.
  7. Aby uzyskać reżim oporu/dużej siły, stymuluj rybę z wysoką częstotliwością przez 5 minut, trzy razy, przy czym każde uderzenie jest oddzielone 5 minutami odpoczynku.
    UWAGA: Podczas gdy ryby po jednej stronie komory odpoczywają, zaciski krokodylkowe można podłączyć do pary elektrod po drugiej stronie komory, a te dodatkowe ryby stymulować.
  8. Po stymulacji ostrożnie wyjmij ryby z każdej studzienki, delikatnie wypłukując je plastikową pipetą i wróć do inkubatora w świeżym podłożu rybnym zawierającym trikainę.
  9. Wylej wodę z trykainy z wnętrza komory i użyj kleszczy, aby przeciąć i usunąć agarozę z każdej studzienki. Opłucz studzienki wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia.
    UWAGA: W przypadku korzystania z elektrod z drutu srebrnego, od czasu do czasu tlenek srebra może gromadzić się na powierzchni drutu po eksperymencie stymulacyjnym. Ponieważ tlenek srebra jest mniej przewodzący niż srebro, aby zachować powtarzalność, przed ponownym użyciem zestawu ostrożnie zetrzyj tlenek srebra z drutu za pomocą chusteczek Kimwipes.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szybki i precyzyjny pomiar objętości somitu
Opisano metodę przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy wolumetrycznej, która umożliwia szybki pomiar wzrostu mięśni u larw zebrafish. Wielkość mięśni u żywych zwierząt można mierzyć, wykorzystując ryby z GFP skierowaną do błony komórkowej (β-actin:HRAS-EGFP) lub mCherry (α-actin:mCherry-CAAX) w obrębie ich błon plazmatycznych. Larwy poddano krótkotrwałej anestezji przy użyciu trikainy, zamocowano w agarozie niskotopliwej i obra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metodę dokładnego i skutecznego szacowania objętości mięśni żywych larw danio pręgowanego w stadiach lub w wariantach genetycznych, w których pigmentacja nie stanowi dużej przeszkody w obrazowaniu i gdy przejściowe znieczulenie i/lub unieruchomienie jest dobrze tolerowane. Podczas gdy zastosowaliśmy laserową skaningową mikroskopię konfokalną, opisane podejścia mają zastosowanie do mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem lub mikroskopii arkuszowej światła oraz do każdej innej metody, która ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy są głęboko wdzięczni wysiłkom członków laboratorium Hughes: dr Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin i Vladimir Snetkov za opracowanie opisanych protokołów, a także Henry'emu Roehlowi, Christinie Hammond, Davidowi Langenau i Peterowi Currie za udostępnienie plazmidów lub linii danio pręgowanego. SMH jest naukowcem Rady ds. Badań Medycznych (MRC) ze wsparciem w ramach grantów programowych G1001029, MR/N021231/1 i MR/W001381/1. Ukończyła studia doktoranckie MRC w ramach programu doktoranckiego w King's College London. Praca ta korzystała z trygonometrycznego wkładu Davida M. Robinsona, uczonego, mentora i przyjaciela.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klej, Blu TackBostik-
-Próżnia w aerozolu ---
AgarozaSigma-AldrichA9539-Agaroza
, niska temperatura żelowaniaSigma-AldrichA9414Po stopieniu przechowywać w temperaturze 37oC w grzejniku blokowym, aby pozostać w postaci płynnej do wielokrotnego użytku.
Grzejnik blokowyCole-ParmerSBH130-BODIPY
FL C5-ceramidThermo ScientificD3521Do rozcieńczenia w wodzie dla ryb i stosowania w 5 &mikro; M jak inkubacja przez noc.
Zaciski krokodylkowe i druty---
Fidżi / imageJNational Institutes of Health, NIH-
Podłoże rybne, Woda-Woda z systemu cyrkulacyjnego zebrana z obiektu rybnego.
Pożywka rybna, pożywka E3-E3 jest opisana w Księdze Danio pręgowanego. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 i 0,33 mM MgSO4 w wodzie destylowanej).
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaLeica MZ16FOczekuje się, że odpowiedni będzie również mikroskop fluorescencyjny innego rodzaju.
Szklana igłaWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6Polerowanie ogniowe w celu zapobieżenia uszkodzeniu zarodków podczas manipulacji.
Stymulator trawyInstrumenty do trawyS88Oczekuje się, że odpowiednie będą również stymulatory innego rodzaju.
Kimwipes, Delikatne wycieraczkiKimberly-Clark Professional13258179-Laserowy
mikroskop skaningowy (LSM) ZeissLSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM innego rodzaju również będą odpowiednie.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-dołkowa płytkaThermo Scientific140675-Obiektyw
, 20 i razy;/1,0 W zanurzenie w wodziePipeta Zeiss-
-Pasteur, z podziałką 1 mlPipeta Starlab GroupE1414-0100-Pasteur
, Micro Fine Tip 1 mlStarlab GroupE1414-1100-szalka
Petriego, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plazmid, CMV-CeruleanChristina L. Hammond (University of Bristol)pCS2+_cerulean_kanR plazmid wstrzykiwany w 25-75 pg w stadium jednokomórkowym. Cytowanie: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080.
Plazmid, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (University of Sheffield)-Do transkrypcji in vitro przy użyciu promotora SP6 (można stosować plazmidy zawierające inne markery znakowania błony);
syntetyzowane mRNA z czapeczką, które należy wstrzyknąć w 100-200 pg w stadium jednokomórkowym.
Kontroler impulsów Hoefer Scientific InstrumentsPC750-Lutownica
---
TricaineSigma-AldrichE10521Metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu / MS-222; do rozpuszczenia w wodzie dla ryb i stosowania w temperaturze 0,6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Kleszcze zegarmistrzowskie, nr 5--
Drut, PlatynowyGoodfellowPT005142/12o średnicy 0,40 mm; droga alternatywa dla srebra.
Drut SilverAcros Organics317730010średnicy 0,25 mm (badano zakres średnic tj. 0,25-0,5 mm, które dały podobne wyniki).
Danio pręgowany, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute)-oficjalna nazwa ZFIN: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Cytowanie: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordá n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Obrazowanie heterogeniczności komórek nowotworowych po przeszczepieniu komórek do optycznie czystego danio pręgowanego z niedoborem odporności. Nat Commun. 2016 Sty 21;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358.
Danio pręgowany, α-aktyna:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN oficjalna nazwa: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Cytowanie: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Utrata Tropomoduliny4 w zmutowanym prä danio pręgowanego; GE powoduje powstawanie pręcików cytoplazmatycznych i osłabienie mięśni przypominające miopatię nemalinową. Dis Model Mech. 2014 Grudzień; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376.
Danio pręgowany, β-aktyna: HRAS-EGFP--oficjalna nazwa ZFIN: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Cytowanie: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I i Kimelman D. Wizualizacja morfogenezy w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego przy użyciu barwnika estru metylowego BODIPY TR jako istotnego barwnika przeciwstawnego dla GFP. Od dewelopera: Dyn. 2005 Luty; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/DVDY.20252.
Oprogramowanie ZENZeiss--
rybna do zadań Oczekuje się, że -

Bibliografia

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162(2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123(2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10(2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247(2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028(2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728(2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567(2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676(2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161(2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232(2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751(2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391(2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Mięśnie danio pręgowanegomikroskopia konfokalnastymulacja elektrycznapomiar włókien mięśniowychobrazowanie żywych tkanekobjętość miotomówwzrost zależny od aktywnościmetoda czterech przekrojówlarwy danio pręgowanego
Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.