Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z astrocytów z ludzkiego osocza

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64107

⸱

3 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sant Pau Memory Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Biomedical Research Institute Sant Pau, Universitat Autònoma de Barcelona, 2Center of Biomedical Investigation Network for Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 3Movement Disorders Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, 4Department of Endocrinology and Nutrition, Hospital Clínic de Barcelona, August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute - IDIBAPS, 5Spanish Biomedical Research Network in Physiopathology of Obesity and Nutrition (CIBEROBN)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z astrocytów (ADEV) z ludzkiego osocza. Opiera się na oddzieleniu EV przez wytrącanie polimerów, a następnie na immunowychwytywaniu ADEV w oparciu o ACSA-1. Analiza ADEV może dostarczyć wskazówek do badania zmian w szlakach zapalnych żywych pacjentów, nieinwazyjnie za pomocą płynnej biopsji.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to biologiczne nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie komórki do komunikacji komórkowej i eliminacji odpadów. Uczestniczą w szerokim zakresie funkcji, działając na inne komórki i przenosząc ich ładunki do innych komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Biorąc pod uwagę ich obecność w płynach biologicznych, EV stanowią doskonałe źródło do badania procesów chorobowych i mogą być uważane za płynną biopsję w celu odkrycia biomarkerów. Atrakcyjnym aspektem analizy EV jest to, że można je wybierać na podstawie markerów ich pochodzenia, odzwierciedlając w ten sposób środowisko określonej tkanki w ich ładunku. Jednak jedną z głównych przeszkód związanych z metodami izolacji EV jest brak konsensusów metodologicznych i ustandaryzowanych protokołów. Astrocyty to komórki glejowe pełniące istotną rolę w mózgu. W chorobach neurodegeneracyjnych reaktywność astrocytów może prowadzić do zmienionego ładunku EV i nieprawidłowej komunikacji komórkowej, ułatwiając/nasilając postęp choroby. W związku z tym analiza EV astrocytów może prowadzić do odkrycia biomarkerów i potencjalnych celów chorobowych. Protokół ten opisuje 2-etapową metodę wzbogacania EV pochodzących z astrocytów (ADEV) z ludzkiego osocza. Po pierwsze, EV są wzbogacane z plazmy zdefibrynowanej poprzez wytrącanie na bazie polimerów. Następnie następuje wzbogacenie ADEV poprzez wychwytywanie immunologiczne oparte na ACSA-1 za pomocą mikrokulek magnetycznych, w których zawieszone EV są ładowane na kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym. Magnetycznie oznakowane ACSA-1+ EV są zatrzymywane w kolumnie, podczas gdy inne EV przepływają przez nią. Po wyjęciu kolumny z magnesu, ADEV są eluowane i są gotowe do przechowywania i analizy. Aby potwierdzić wzbogacenie markerów astrocytów, w eluacie można zmierzyć kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) lub inne specyficzne markery astrocytarne pochodzenia wewnątrzkomórkowego i porównać je z przepływem. Protokół ten proponuje łatwą, efektywną czasowo metodę wzbogacania ADEV z osocza, która może być wykorzystana jako platforma do badania markerów istotnych dla astrocytów.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna grupa błoniastych nanocząsteczek wydzielanych przez wszystkie typy komórek, przenoszących białka, lipidy i kwasy nukleinowe1. Mikropęcherzyki (100-1000 nm), egzosomy (30-100 nm) i ciała apoptotyczne (1000-5000 nm) stanowią główne typy EV, wyróżnione miejscem ich pochodzenia2,3. EV regulują ważne procesy fizjologiczne, takie jak prezentacja antygenu i odpowiedź immunologiczna4, recykling receptorów, eliminacja metabolitów5 i komunikacja komórkowa6. Regulacja tych procesów może zachodzić poprzez bezpośrednie wiązanie między białkami wzbogaconymi w błonie komórkowej EV a celami w komórkach biorcy i/lub poprzez internalizację i uwalnianie ich ładunku w cytoplazmie komórki biorcy7. Chociaż pojazdy elektryczne pełnią podstawowe funkcje komórkowe, z patologicznego punktu widzenia zyskują coraz większe zainteresowanie w dziedzinie nowotworów i neurologii. Rzeczywiście, kilka badań wykazało, że EV mogą pomóc w promowaniu migracji komórek nowotworowych8,9 lub toksycznych agregatów białkowych nasion w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera10,11.

EVs mogą być wybierane i wzbogacane z płynów biologicznych na podstawie markerów powierzchni komórek związanych z komórką ich pochodzenia, odzwierciedlając w ten sposób środowisko określonej tkanki w ich cargo12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ponadto, biorąc pod uwagę ich obecność we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), ślinie, moczu i mleku matki, EV stanowią doskonałe, nieinwazyjne narzędzie diagnostyczne i mogą być uważane za płynną biopsję w celu odkrycia biomarkerów. Jest to szczególnie interesujące w neurologii, biorąc pod uwagę trudności w badaniu analitów mózgu w dostępnych płynach innych niż płyn mózgowo-rdzeniowy.

Astrocyty zyskują coraz większe zainteresowanie, ponieważ znajdują się na skrzyżowaniu komunikacji nerwowo-naczyniowej21. W warunkach fizjologicznych są odpowiedzialne za zachowanie bariery krew-mózg, recykling neuroprzekaźników, dostarczanie składników odżywczych i czynników wzrostu do neuronów i innych komórek glejowych22,23,24 a także obronę neuroimmunologiczną, biorąc pod uwagę ich plastyczność metaboliczną od stanów prozapalnych do przeciwzapalnych i odwrotnie25,26,27. Ważnym mechanizmem, za pomocą którego astrocyty realizują swoje funkcje regulacyjne, jest komunikacja za pośrednictwem EVs28,29. Gastrocytoza reaktywna jest kluczową cechą charakterystyczną kilku chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera,30 zanik wieloukładowy (MSA), postępujące porażenie nadjądrowe (PSP)31 i stwardnienie zanikowe boczne (ALS)32. Reaktywność astrocytów może prowadzić do zmiany ładunku EV, uwolnienia mediatorów stanu zapalnego i nieprawidłowej komunikacji komórkowej, ułatwiając w ten sposób rozprzestrzenianie się patologii i prowadząc do neurodegeneracji10,11. Dlatego badanie EV pochodzących z astrocytów (ADEV) i zmian w ich ładunku jest atrakcyjnym zasobem do badania procesów neurodegeneracyjnych w sposób nieinwazyjny.

Obecnie istnieje kilka metodologii izolacji pojazdów elektrycznych, z których każda ma swoje zalety i wady33. Konieczne jest rozważenie, która metoda jest bardziej odpowiednia dla konkretnego zastosowania, w zależności od końcowego zastosowania, które Cię interesuje. W dziedzinie neurologii, a dokładniej w badaniach astrocytów, najczęściej stosowaną metodą jest wytrącanie na podstawie polimerów, a następnie wychwytywanie immunologiczne12,18,19,20,34. Jednak nawet przy zastosowaniu tego samego podejścia nadal istnieje niejednorodność między badaniami na różnych etapach stosowanych do izolacji pojazdów elektrycznych. W związku z tym istnieje potrzeba jasnej, ustandaryzowanej metodologii krok po kroku, aby ułatwić badania EV astrocytów i odtwarzalność badań. Wytrącanie na bazie polimerów ułatwia badania przesiewowe biomarkerów, ponieważ jest to szybka, prosta procedura, która nie wymaga skomplikowanego sprzętu, co prowadzi do wysokiej wydajności EV bez wpływu na ich aktywność biologiczną35.

Obecny protokół opisuje szczegółową, prostą, dwuetapową metodę wzbogacania ADEV z ludzkiego osocza. Opiera się na wytrącaniu całkowitej frakcji EV na bazie polimerów, a następnie na immunowychwytywaniu EV astrocytów. Biorąc pod uwagę ważne funkcje astrocytów, analiza ADEV może rzucić światło na odkrycie biomarkerów i szlaków zapalnych mózgu, które można badać w sposób nieinwazyjny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania opisane w niniejszym protokole przeprowadzono z wykorzystaniem próbek osocza ludzkiego pobranych od zdrowych dorosłych dawców obu płci (zakres wieku 65,9-81,3 lat, 45,5% kobiet) z kohorty Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN), Barcelona, Hiszpania36. Uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniu. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań medycznych zawartymi w Deklaracji Helsińskiej oraz prawem hiszpańskim. Komitet Etyki Badań Sant Pau (CEIC) przeanalizował i zatwierdził protokół pobierania i przechowywania próbek osocza ludzkiego z kohorty SPIN (#16/2013).

1. Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) astrocytów z ludzkiej osocza

UWAGA: Niniejszy protokół obejmuje wykorzystanie próbek osocza ludzkiego. Wszystkie szczegóły dotyczące odczynników i materiałów laboratoryjnych użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Do przeprowadzenia tej procedury nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt, jednak prosimy o zapoznanie się z zasadami bezpieczeństwa dla każdego odczynnika, określonymi indywidualnie przez każdego producenta.

  1. Pobieranie i przechowywanie próbek
    1. Krew należy pobrać do probówek vacutainer z EDTA (kolor fioletowy), zgodnie ze zstandaryzowanymi protokołami pobierania osocza36,37. W celu odseparowania osocza wirować przez 10 min przy 2000 x g w temperaturze 4 °C w czasie od 30 do 120 min po pobraniu. Osocze, będące górną, klarowną warstwą cieczy (nadosadem), należy rozdzielić na aliquoty o objętości 500 µL.
    2. Aby usunąć resztki komórkowe, aliquoty należy wirować przez 15 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać nadosad. Osocze przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Zgodnie z powszechną praktyką w analizach płynów ustrojowych, próbki należy rozdzielić na aliquoty przed przechowywaniem i unikać więcej niż trzech cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Wzbogacanie całkowitej frakcji EV
    UWAGA: Wszystkie użyte odczynniki muszą zostać przefiltrowane przez filtr 0,22 µm.
    1. Rozmrozić 500 µL próbek osocza. Dodać trombinę w proporcji 1:100 w celu usunięcia czynników krzepnięcia. Wymieszać przez trzykrotne odwrócenie probówki i pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Uzupełnić objętość do 1 mL za pomocą roztworu roboczego soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS): DPBS + 3x stężony koktajl inhibitorów proteaz (rozcieńczony ze stoku 10x koktajlu inhibitorów proteaz). Wymieszać przez odwrócenie.
    3. Próbki wirować przez 20 min przy 6000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać nadosad. Uzupełnić objętość roztworem roboczym DPBS do osiągnięcia 1 mL.
    4. Dodać 252 µL roztworu do precypitacji EV i wymieszać przez trzykrotne odwrócenie. Inkubować przez 60 min w temperaturze 4 °C.
    5. Próbki wirować przez 20 min przy 1500 x g w temperaturze 4 °C, aby wyprecypitować całkowitą frakcję EV (osad). Zebrać 1 mL nadosadu. Frakcję tę należy oznaczyć jako osocze pozbawione EV (EV-depleted plasma) i wykorzystać jako kontrolę negatywną dla markerów wzbogacania EV (Brak EV), a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    6. Pozostały osad wirować przez 5 min przy 1500 x g w temperaturze 4 °C. Odlać pozostały nadosad. Resuspender osad w 500 µL wody ultrapurej zawierającej stężone inhibitory proteaz i fosfataz (stężenie końcowe 3x, rozcieńczone ze stoku 100x, patrz Tabela Materiałów).
    7. Energicznie pipetować w górę i w dół, aby rozbić osad, unikając pienienia; wymieszać w wirówce wortexowej i agitować na rotacyjnym wytrząsaniu do probówek przez 30 min w temperaturze pokojowej aż do całkowitej resuspensji. Należy zapewnić całkowitą resuspensję osadu, ponieważ jest to krytyczny etap dla późniejszego etapu immunowychwytu.
  3. Immunowychwyt ADEVs
    UWAGA: ADEVs posiadają markery astrocytów. Wybranym markerem do wzbogacania ADEV via immunowychwyt jest GLAST. GLAST, czyli transporter glutaminianu-asparaginianu (UniProtKB-P43003), jest najliczniejszym transporterem glutaminianu, ekspresjonowanym głównie przez astrocyty w móżdżku i neocortex mózgu38. Przeciwciało anty-GLAST (ACSA-1, antygen powierzchniowy komórek astrocytarnych-1) jest specyficzne dla epitopu zewnątrzkomórkowego GLAST i zostało opracowane do identyfikacji astrocytów. Jest to najczęściej stosowany cel dla immunowychwytu ADEVs z ludzkiego osocza12,20,34.
    1. Do każdej próbki zawierającej całkowite preparaty EV dodać 10 µL biotynylowanego przeciwciała anty-GLAST (ACSA-1). Wymieszać dokładnie i delikatnie. Inkubować przez 1 h w temperaturze 4 °C na rotacyjnym wytrząsaniu do probówek.
    2. Dodać 10 µL magnetycznych mikrokulek sprzężonych z monoklonalnymi przeciwciałami anty-biotynowymi (mysi IgG1). Wymieszać dokładnie i delikatnie. Inkubować przez 1 h w temperaturze 4 °C na rotacyjnym wytrząsaniu do probówek.
    3. Umieścić mikrokolumnę w polu magnetycznym separatora MACS. Przygotować kolumnę, płucząc ją 500 µL PBS z 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Odlać filtrat.
    4. Nanieść zawiesinę EV/ACSA-1/mikrokulek na kolumnę. Na tym etapie nie naciskać tłoka. Zebrać filtrat. Oznaczyć go jako EV nieastrocytarne (Brak ADEVs) i zachować jako kontrolę, jeśli jest to wymagane.
    5. Przepłukać kolumnę dwukrotnie 500 µL PBS z 0,5% BSA. Odlać filtrat.
    6. Wyjąć kolumnę z separatora magnetycznego i umieścić ją w probówce zbiorczej o niskiej adhezji o pojemności 1,5 mL. Nanieść pipetą 500 µL PBS z 0,5% BSA na kolumnę. Mocno docisnąć tłokiem do kolumny i zebrać eluat.
    7. Oznaczyć jako EV ACSA-1+ (ADEVs). Niezlizowane EV przechowywać w temperaturze -20 °C przez krótkie okresy lub w -80 °C przez dłuższe okresy (>6 miesięcy).
      UWAGA: Przeciwciała anty-ACSA-1 wiążą się z epitopem GLAST-1/EAAT-1. Magnetyczne mikrokuleczki wiążą się z powinowactwem do kompleksu anty-ACSA-1-EV. Mikrokolumny MACS zawierają zoptymalizowaną matrycę, która generuje silne pole magnetyczne po umieszczeniu w magnesie, co jest niezbędne do zatrzymania znakowanych ADEVs.
      Schematyczną reprezentację procedury wzbogacania ADEV przedstawiono na Rysunku 1.
  4. Liza EV
    UWAGA: EV muszą zostać całkowicie zlizowane w celu wykrycia markerów wewnątrz pęcherzykowych. Zaleca się stosowanie dwóch sekwencyjnych metod, takich jak liza chemiczna, a następnie mechaniczna.
    1. Przeprowadzić lizę chemiczną EV, dodając odczynnik do ekstrakcji białek (patrz Tabela Materiałów) w proporcji 100 µL próbki na 150 µL odczynnika do ekstrakcji. Dodać 100x inhibitory proteaz i fosfataz, aby osiągnąć stężenie końcowe 1x. Energicznie wymieszać w wirówce wortexowej i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 min.
    2. Przeprowadzić lizę mechaniczną w procedurze dwuetapowej: przepuścić chemicznie zlizowany roztwór EV dwukrotnie przez strzykawkę (igła G29). Następnie sonikować próbki przez 45 s w ultradźwiękowej kąpieli wodnej z chłodzeniem. Zzamrozić zlizowane EV w temperaturze -80 °C.
    3. Rozmrozić próbki w temperaturze 37 °C przez 5 min. Ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania zlizowanych EV. Przed analizą ponownie rozmrozić przez 5 min w temperaturze 37 °C.

figure-protocol-1
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja dwuetapowej procedury wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z astrocytów. W pierwszym etapie, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są wzbogacane z defibrynowanej ludzkiej plazmy poprzez etapy wytrącania opartego na polimerach oraz wirowania. Po całkowitej resuspensji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, pęcherzyki z astrocytów są następnie wyselekcjonowane metodą immunowychwytu z użyciem biotynilowanych przeciwciał anty-GLAST (ACSA-1) oraz magnetycznych mikrokulek anty-biotynowych. Skróty: ACSA-1 = antygen powierzchniowy komórek astrocytarnych-1; ADEVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z astrocytów; DPBS = bufor fosforanowy Dulbecco; EVs = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; GLAST = transporter glutaminianu-asparaginianu; No ADEVs = nieastrocytarne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; No EVs = brak pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (plazma pozbawiona pęcherzyków zewnątrzkomórkowych); PIC = koktajl inhibitorów proteaz; RT = temperatura pokojowa. Rycina stworzona w BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Walidacja protokołu

  1. Charakterystyka całkowitej frakcji EV przed immunowychwytem
    1. Do analizy Western blot należy wykorzystać lizowane całkowite EV (osad po precypitacji polimerowej po resuspensji) oraz rozcieńczone próbki osocza. Próbki należy uzupełnić 4-krotnym buforem do próbek Laemmli (5 µL na 15 µL próbki), gotować przez 10 min w temperaturze 90 °C i nanieść na 10% żele akrylamidowe stain-free.
    2. Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE) należy przeprowadzić w buforze Tris/glicyna/SDS przy 80 V przez 30 min, a następnie przy 200 V przez 40 min. Po zakończeniu SDS-PAGE żel należy wyjąć z szklanych płytek i zwizualizować całkowitą zawartość białek po 1-minutowej ekscytacji UV.
    3. Białka należy przenieść z żelu na aktywowaną metanolem membranę PVDF 0,2 µm za pomocą systemu półsuchego przy 25 V i 2,5 A przez 10 min (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów). Po transferze membranę należy blokować w buforze blokującym przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko Alix (1:1000), CD9 (1:1000) lub Kalneksynie (1:1000); szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów.
    4. Membranę należy przemyć trzy razy przez 10 min w soli buforowanej trisem z 0,1% Tween 20 (TBST) i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym HRP rozcieńczonym 1:7500 w buforze blokującym. Membranę należy przemyć w TBST cztery razy przez 10 min. Wszystkie etapy przemywania i inkubacji należy przeprowadzać przy łagodnym mieszaniu membrany na shakerze platformowym.
    5. Należy zmieszać w stosunku 1:1 roztwór chemiluminescencyjny z buforem nadtlenkowym i inkubować membrany przez 5 min w temperaturze pokojowej. Prążki należy naświetlić i zarejestrować za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego (szczegóły w Tabeli materiałów).
  2. Walidacja wzbogacenia markerów specyficznych dla astrocytów we frakcji ADEV
    ​UWAGA: Kwaśne białko włókienkowe glejowe (GFAP) jest głównym białkiem włókien pośrednich w komórkach astrocytarnych i niezbędnym elementem ich cytoszkieletu podczas rozwoju. GFAP można wykryć w tkance mózgowej i płynach biologicznych, będąc dobrze znanym markerem astrocytów39. Dlatego marker ten został ilościowo określony przy użyciu komercyjnej technologii wykrywania biomarkerów w celu wykazania wzbogacenia markerów pochodzenia astrocytarnego we frakcji ADEV. Ta technologia biomarkerów jest ultrazczułą techniką, która umożliwia pomiar pojedynczych cząsteczek białek z czułością do 1000 razy większą niż konwencjonalne analizy immunoenzymatyczne. Technika ta opiera się na zastosowaniu paramagnetycznych mikrocząsteczek sprzężonych z przeciwciałami zaprojektowanymi do wiązania się ze specyficznymi celami40,41 (patrz Tabela materiałów).
    1. Do analizy biomarkerów należy wykorzystać lizowane próbki EV. Aby sprawdzić wzbogacenie markerów astrocytów, należy porównać poziomy GFAP w eluarcie (ADEVs) i w części niezatrzymanej (No ADEVs) przy użyciu komercyjnego ultrazczułego testu immunoenzymatycznego.
    2. Próbki należy rozcieńczyć w stosunku 1:4 (25 µL EV + 75 µL buforu do analizy), przygotować kalibratory i przeprowadzić analizę w urządzeniu do wykrywania biomarkerów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Próbki można rozcieńczać bezpośrednio na płytce.
    3. Próbki i kalibratory należy badać w dubletach. Zakres ilościowy dla testu GFAP wynosił 1,37-1000 pg/mL. Do obliczenia stężeń GFAP z krzywej kalibracyjnej należy użyć platformy analitycznej oprogramowania producenta.
    4. Aby oszacować współczynnik zmienności (CV) protokołu dla wzbogacenia markerów astrocytów, należy zmierzyć poziomy GFAP w preparatach ADEV uzyskanych z identycznych powtórzeń połączonych próbek ludzkiego osocza i obliczyć CV jako (odchylenie standardowe/średnia) x 100. W tym protokole CV obliczono dla N = 10 identycznych próbek osocza.
  3. Walidacja wzbogacenia markerów EV we frakcji ADEV
    1. Aby zwalidować wzbogacenie markerów EV, należy zmierzyć poziomy Alix i CD81 metodą ELISA (patrz Tabela materiałów) w lizowanych, nierozcieńczonych próbkach EV, zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki i kalibratory należy badać w dubletach.
    2. Odczyt płytek należy przeprowadzić przy 450 nm i 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Do obliczenia stężeń Alix i CD81 należy zastosować liniową krzywą kalibracyjną. Zakres ilościowy dla testu Alix wynosił 47-3000 pg/mL, a dla CD81 0,156-10 ng/mL.
  4. Charakterystyka rozmiaru i morfologii ADEV
    1. Analiza śledzenia nanocząstek
      1. Do pomiaru stężenia cząstek i rozkładu wielkości świeżych, nielizowanych preparatów EV należy zastosować analizę śledzenia nanocząstek (NTA).
      2. Świeże, nielizowane zawiesiny ADEV (10 µL) należy rozcieńczyć filtrowanym PBS zgodnie z zakresem detekcji instrumentu (20-100 cząstek/klatkę). Używając dostarczonego oprogramowania, należy nagrać trzy 60-sekundowe filmy z następującymi ustawieniami: prędkość przepływu strzykawki 30 a.u., poziom kamery 13 oraz próg detekcji 5. Stężenia cząstek należy skorygować o objętość próbki wejściowej, objętość resuspensji EV oraz rozcieńczenie niezbędne do odczytu NTA.
        UWAGA: Zaleca się wcześniejszą wizualizację próbki zawierającej roztwór nośnikowy EV w celu weryfikacji efektu matrycy i czystości medium, w którym resuspenderowano EV.
    2. Kriomikroskopia elektronowa
      1. Do potwierdzenia obecności i morfologii EV w świeżych, nielizowanych zawiesinach ADEV (4 µL) należy zastosować kriomikroskopię elektronową (Cryo-EM). Próbki należy witryfikować za pomocą komercyjnego mroźnika typu plunge freezer na siatkach z dziurkowanego węgla (Holey carbon) przy następujących ustawieniach: 3,9 µL próbki, czas oczekiwania 10 s, czas blotowania 2 s.
      2. Próbki należy zanurzyć w ciekłym etanie-azocie w stacji kriogenicznej. Siatki należy przenieść do kriouchwytu utrzymywanego w temperaturze -179 °C do analizy w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. EV należy badać za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego przy napięciu przyspieszającym 200 kV i wyposażonego w kamerę CCD. Mikrografie należy pozyskać za pomocą oprogramowania.
  5. Analiza współprecypitacji lipoprotein
    1. Poziomy ludzkiego ApoB w nierozcieńczonym osoczu, lizowanych całkowitych próbkach EV i lizowanych próbkach ADEV należy oznaczyć testem immunoturbidymetrycznym z wykorzystaniem komercyjnego zestawu dostosowanego do komercyjnego autoanalizatora (szczegóły w Tabeli materiałów).
  6. Analiza markerów zapalnych w ADEV
    1. Do ilościowego oznaczenia stężenia 25 markerów zapalnych: eotaksyny, IFN Alpha2, IFN Gamma, IL-1 Alpha, IL-1 Beta, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC, MIP-1 Alpha, MIP-1 Beta, TGF Alpha, TNF Alpha, TNF Beta należy zastosować analizę opartą na kuleczkach (patrz Tabela materiałów).
    2. Należy wykorzystać lizowane, nierozcieńczone preparaty EV (25 µL) i inkubować próbki z kuleczkami przez noc w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami producenta. Płytkę należy przemyć, inkubować z 25 µL przeciwciał detekcyjnych, a następnie inkubować przez 1 h przy mieszaniu w temperaturze pokojowej.
    3. Do każdej studni należy dodać 25 µL Streptawidyny-PE i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Należy dodać 150 µL płynu osłonowego (sheath fluid) i inkubować przez 5 min pod wpływem mieszania. Płytkę należy odczytać na czytniku płytek dołączonym do systemu.
      ​UWAGA: Technika ta opiera się na analizach immunoenzymatycznych z użyciem przeciwciał, które wiążą się z powierzchnią magnetycznych mikrokuleczek pokrytych fluorescencyjnie. Technologia ta wewnętrznie koduje mikrosfery za pomocą różnych barwników. Każdy typ mikrosfery jest pokryty specyficznym przeciwciałem wychwytującym, dzięki czemu wiele sprzężonych kuleczek wychwytuje anality zawarte w próbkach, co umożliwia jednoczesną ilościową detekcję multipleksową kilkunastu analitów. System wykorzystuje platformę multipleksowej analizy immunoenzymatycznej opartą na kuleczkach do detekcji sygnału43.

3. Analiza danych

  1. Przeprowadź analizy statystyczne przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Oceń normalność rozkładu danych za pomocą testu Shapiro-Wilka. Porównania dwóch grup przeprowadź testem U Manna-Whitneya, a porównania trzech grup testem Kruskala-Wallisa z korekcją post-hoc Dunna. Poziom istotności ustal na p < 0.05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślnie przeprowadzono izolację ADEVs z osocza pobranego od zdrowych dawców. W celu uzyskania całkowitej frakcji EV zastosowano metodę precypitacji opartą na polimerze, a następnie wykonano immunowychwyt za pomocą magnetycznych mikrokulek w celu wyizolowania ADEVs.

Analiza Western blot całkowitej frakcji EV przed etapem immunowychwytywania wykazała brak kalneksyny (marker zanieczyszczeń komórkowych) oraz obecność Alix i białka transbłonowego CD9 w preparatach EV (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pojazdy elektryczne cieszą się dużym zainteresowaniem w badaniach biomedycznych ze względu na ich potencjał diagnostyczny i terapeutyczny. Obecnie jedną z głównych przeszkód związanych z metodami izolacji EV jest brak konsensusu metodologicznego i ustandaryzowanych protokołów. Badanie to dostarcza szczegółowego protokołu wzbogacania EV astrocytów z ludzkiego osocza poprzez wytrącanie na bazie polimerów i wychwytywanie immunologiczne KLAST.

Istnieją różne metodologie izolacji pojazdów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Belbin poinformował, że otrzymał osobiste honoraria od ADx NeuroSciences poza zgłoszoną pracą. Dr Alcolea poinformował, że otrzymał osobiste honoraria za usługi rady doradczej i/lub honoraria prelegentów od Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. i Esteve poza zgłoszoną pracą. Dr Lleó pełnił funkcję konsultanta lub zasiadał w radach doradczych firm Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols i Nutricia poza zgłoszonymi pracami. Dr Fortea poinformował, że otrzymywał osobiste honoraria za pracę w radach doradczych, komitetach orzekających lub honoraria mówców od AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio i Biogen poza zgłoszoną pracą. Doktorzy Alcolea, Belbin, LLeó i Fortea donoszą o posiadaniu patentu na markery synaptopatii w chorobach neurodegeneracyjnych (licencjonowane na ADx, EPI8382175.0). Nie zgłoszono żadnych innych ujawnień. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic więcej do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sorayi Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi i Oriol Sanchez Lopez za obsługę i przygotowanie próbki. Chcielibyśmy również podziękować za współpracę z José Amable Bernabé z ICTS "NANBIOSIS", jednostka 6 (Jednostka CIBER w Bioingineering, Biomaterials i Nanomedycynie) Instytutu Materiałoznawstwa w Barcelonie, Marti de Cabo Jaume z Zakładu Mikroskopii Elektronowej na Universitat Autonoma de Barcelona, dr Martą Soler Castany i Lią Ros Blanco z Platformy Cytometrii Przepływowej w Instytucie Badań Biomedycznych Sant Pau (IIB-Sant Pau), a także dr Joan Carles Escolà-Gil z grupy Patofizjologii chorób związanych z lipidami w IIB-Sant Pau za pomoc w oznaczaniu odpowiednio NTA, cryo-EM, Luminex i ApoB.

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fundacji Jérôme'a Lejeune'a (Projekt #1941 i #1913 dla MFI i MCI), Instituto de Salud Carlos III (PI20/01473 do JF, PI20/01330 do AL, PI18/00435 do DA i INT19/00016 do DA), Narodowego Instytutu Zdrowia (1R01AG056850-01A1, R21AG056974, oraz R01AG061566 do JF), Alzheimer's Association i Global Brain Health Institute (GBHI_ALZ-18-543740 do MCI), Stowarzyszenie na rzecz Zwyrodnienia Czołowo-Skroniowego (stypendium podoktoranckie w zakresie badań klinicznych, AFTD 2019–2021) do ODI oraz Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 do MCI). Prace te były również wspierane przez program CIBERNED (Program 1, Alzheimer Disease to AL and SIGNAL study. SS jest laureatem stypendium podoktorskiego "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) przyznanego przez Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Alix do Western blotEMD MilliporeABC40
i mikro; Separator MACSMiltenyi Biotec130-042-602&mikro; Separator MACS jest używany w połączeniu z µ Kolumny i mikrokulki MACS.
Przeciwciało pierwotne anty-kalneksyna do Western blottingGenetexGTX109669
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-CD9 przeciwko Western blottingSygnalizacja komórkowa13174
Bloker BSA (10%) 200 mlThermo Fisher37525
Bransonic 1510E-MT Kąpiel ultradźwiękowaBranson
COBAS 6000DiagnosticsAnalizator do immunoturbidymetrycznego oznaczania ApoB; komercyjny autoanalizator
cKompletny koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)Roche11873580001
Digital Micrograph 1.8 oprogramowanie do mikrofotografii
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mLThermo Fisher14190144
EveryBlot Blocking BufferBioRad12010020
Exoquick (roztwór do wytrącania egzosomów 5 ml) + Trombina System BioscienceEXOQ5TM-1ExoQuick 20 mL (EXOQ20A-1)
Gatan 895 USC 4000 kamera
System obrazowania chemiluminescencji GeneGnome XRQZestaw
Ludzki antygen CD81 (CD81)CusabioCSB-EL004960HU
Zestaw ELISA do zaprogramowanej śmierci komórki 6 (PDCD6IP)CusabioCSB-EL017673HU
Błona PVDF Immun-BlotBioRad1620177
Transmisyjny mikroskop elektronowy JEOL 2011 JEOL LTDWyposażony w  kamera CCD Gatan 895 USC 4000  (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, Stany Zjednoczone)
Lampy Lavender EDTA BD Vacutainer K2EBecton dickinson367525
Leica EM GP Komercyjna zamrażarka wgłębnaLeica Microsystem
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania 1,5 mlDeltalab4092.3NS
MACS & Kolumny z tłokami Miltenyi Biotec130-110-905&mikro; Kolumny z tłokami są specjalnie zaprojektowane do izolacji egzosomów z płynów ustrojowych
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Czytnik płytek MAGPIXLuminex Corporation80-073Multipleksator xMAP firmy Luminex (oprogramowanie Luminex xPonent v 4.3)
MicroBead Kit100 μ L Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotyna, człowiek, mysz, szczur – mały rozmiar; 100 μ L Mikrokulki antybiotynoweMiltenyi Biotec130-095-825
Zestaw MILLIPLEX MAP Panel ludzkiej cytokiny / chemokiny / czynnika wzrostu Panel z kulkami magnetycznymiEMD MilliporeHCYTA-60K-25
M-PER Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków 25 mlThermo Fisher78503W przypadku niektórych zastosowań, takich jak Western blot, można użyć bardziej agresywnych do lizy (np. RIPA)
Spektrofotometr MultiSkan SkyHighMicroplate ThermofisherA51119500C
NanoSight NS300Malvern PanalyticalNTA; wersja 3.4
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazyPierce Halt Thermo Fisher78441
Strzykawka polipropylenowa (G29)PeroxFarma1mL; 0,33x12mm-G29x1/2"
Wtórna anty-królik przeciwciałoThermo Fisher10794347
Zestaw do odkrywania Simoa GFAPQuanterix102336
Simoa, przyrząd SR-XUltraczuły system wykrywania biomarkerów Quanterix SR-X; komercyjna technologia wykrywania biomarkerów
West FemtoThermo Fisher34095Ultraczułe wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL) HRP 
System Turbotransferu Trans-BlotBioRad1704150
Automatyczny analizator Roche Można również kupić ELISA Syngene Strzykawka Test swoistych białek Apolipoproteina B - APOB (100 det) COBAS C/CI Roche Diagnostics 3032574122 SuperSignal

Bibliografia

  1. Pathan, M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Research. 47, 516-519 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Gustafson, D., Veitch, S., Fish, J. E. Extracellular vesicles as protagonists of diabetic cardiovascular pathology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 71(2017).
  4. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  5. Harding, C. V., Heuser, J. E., Stahl, P. D. Exosomes: Looking back three decades and into the future. Journal of Cell Biology. 200 (4), 367-371 (2013).
  6. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  7. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  8. Hood, J. L., San Roman, S., Wickline, S. A. Exosomes released by melanoma cells prepare sentinel lymph nodes for tumor metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  9. Rak, J. Microparticles in cancer. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 888-906 (2010).
  10. Ledreux, A., et al. Small neuron-derived extracellular vesicles from individuals with down syndrome propagate tau pathology in the wildtype mouse brain. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3931(2021).
  11. Winston, C. N., et al. Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimer's and Dementia: Diagnosis, Assessment and Disease Monitoring. 3, 63-72 (2016).
  12. Goetzl, E. J., Schwartz, J. B., Abner, E. L., Jicha, G. A., Kapogiannis, D. High complement levels in astrocyte-derived exosomes of Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 83 (3), 544-552 (2018).
  13. Fiandaca, M. S., et al. Identification of preclinical Alzheimer's disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: A case-control study. Alzheimer's and Dementia. 11 (6), 600-607 (2015).
  14. Mustapic, M., et al. Plasma extracellular vesicles enriched for neuronal origin: A potential window into brain pathologic processes. Frontiers in Neuroscience. 11, 278(2017).
  15. Hamlett, E. D., et al. Neuronal exosomes reveal Alzheimer's disease biomarkers in Down syndrome. Alzheimer's and Dementia. 13 (5), 541-549 (2017).
  16. Goetzl, E. J., et al. Abnormal levels of mitochondrial proteins in plasma neuronal extracellular vesicles in major depressive disorder. Molecular Psychiatry. 26 (12), 7355-7362 (2021).
  17. Goetzl, E. J., et al. Neuron-derived exosome proteins may contribute to progression from repetitive mild traumatic brain injuries to chronic traumatic encephalopathy. Frontiers in Neuroscience. 13, 452(2019).
  18. Goetzl, E. J., et al. Cargo proteins of plasma astrocyte-derived exosomes in Alzheimer's disease. FASEB Journal. 30 (11), 3853-3859 (2016).
  19. Goetzl, E. J., et al. Traumatic brain injury increases plasma astrocyte-derived exosome levels of neurotoxic complement proteins. FASEB Journal. 34 (2), 3359-3366 (2020).
  20. Nogueras-ortiz, C. J., et al. Astrocyte- and neuron-derived extracellular vesicles from Alzheimer's disease patients effect complement-mediated neurotoxicity. Cells. 9 (7), 1618(2020).
  21. Haydon, P. G., Carmignoto, G. Astrocyte control of synaptic transmission and neurovascular coupling. Physiological Reviews. 86 (3), 1009-1031 (2006).
  22. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  23. Rothstein, J., et al. Antisense knockout of glutamate transporters reveals a predominant role for astroglial glutamate transport in excitotoxicity and clearance of extracellular glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  24. Vasile, F., Dossi, E., Rouach, N. Human astrocytes: structure and functions in the healthy brain. Brain Structure and Function. 222 (5), 2017-2029 (2017).
  25. Balu, D. T., et al. Neurotoxic astrocytes express the D-serine synthesizing enzyme, serine racemase, in Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 130, 104511(2019).
  26. Sofroniew, M. V. Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation. Nature Reviews Neuroscience. 16 (5), 249-263 (2015).
  27. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24 (7), 931-938 (2018).
  28. Bianco, F., et al. Acid sphingomyelinase activity triggers microparticle release from glial cells. EMBO Journal. 28 (8), 1043-1054 (2009).
  29. Datta Chaudhuri, A., et al. Stimulus-dependent modifications in astrocyte-derived extracellular vesicle cargo regulate neuronal excitability. Glia. 68 (1), 128-144 (2020).
  30. Serrano-Pozo, A., Gómez-Isla, T., Growdon, J. H., Frosch, M. P., Hyman, B. T. A phenotypic change but not proliferation underlies glial responses in Alzheimer disease. American Journal of Pathology. 182 (6), 2332-2344 (2013).
  31. Tong, J., et al. Low levels of astroglial markers in Parkinson's Disease: relationship to α-synuclein accumulation. Neurobiology of Disease. 82, 243-253 (2015).
  32. Kamo, H., et al. A distinctive distribution of reactive astroglia in the precentral cortex in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 74 (1), 33-38 (1987).
  33. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  34. Winston, C. N., Goetzl, E. J., Schwartz, J. B., Elahi, F. M., Rissman, R. A. Complement protein levels in plasma astrocyte-derived exosomes are abnormal in conversion from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease dementia. Alzheimer's and Dementia: Diagnosis, Assessment and Disease Monitoring. 11, 61-66 (2019).
  35. Niu, Z., et al. Polymer-based precipitation preserves biological activities of extracellular vesicles from an endometrial cell line. PLoS ONE. 12 (10), 1-21 (2017).
  36. Alcolea, D., et al. The Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN) cohort: A data set for biomarker discovery and validation in neurodegenerative disorders. Alzheimer's and Dementia: Translational Research and Clinical Interventions. 5, 597-609 (2019).
  37. O'Bryant, S. E., et al. Guidelines for the standardization of preanalytic variables for blood-based biomarker studies in Alzheimer's disease research. Alzheimer's and Dementia. 11 (5), 549-560 (2015).
  38. Kim, K., et al. Role of excitatory amino acid transporter-2 (EAAT2) and glutamate in neurodegeneration: Opportunities for developing novel therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 226 (10), 2484-2493 (2011).
  39. Middeldorp, J., Hol, E. M. GFAP in health and disease. Progress in Neurobiology. 93 (3), 421-443 (2011).
  40. Mora, J., et al. Next generation ligand binding assays-review of emerging technologies' capabilities to enhance throughput and multiplexing. AAPS Journal. 16 (6), 1175-1184 (2014).
  41. Chunyk, A. G., et al. A multi-site in-depth evaluation of the quanterix simoa from a user's perspective. AAPS Journal. 20 (1), 1-12 (2018).
  42. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 26913(2014).
  43. Hansen, E. O., et al. Millipore xMap® Luminex (HATMAG-68K): An accurate and cost-effective method for evaluating Alzheimer's biomarkers in cerebrospinal fluid. Frontiers in Psychiatry. 12, 1-9 (2021).
  44. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogenous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  45. Gauthier, S. A., et al. Enhanced exosome secretion in Down syndrome brain - a protective mechanism to alleviate neuronal endosomal abnormalities. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 65(2017).
  46. Cataldo, A. M., et al. Endocytic pathway abnormalities precede amyloid β deposition in sporadic alzheimer's disease and down syndrome: Differential effects of APOE genotype and presenilin mutations. American Journal of Pathology. 157 (1), 277-286 (2000).
  47. Cataldo, A. M., et al. Down syndrome fibroblast model of Alzheimer-related endosome pathology: Accelerated endocytosis promotes late endocytic defects. American Journal of Pathology. 173 (2), 370-384 (2008).
  48. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  49. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: Transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zewn trzkom rkowe p cherzyki astrocyt wwzbogacanie EVwytr canie polimeroweimmunowychwytmagnetyczne mikrokulkimarker ACSA 1kwa ny bia kowy gliafibrylarnyp ynna biopsja
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły