Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64209

⸱

13 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Streszczenie

Zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) w modelach zwierzęcych umożliwiają precyzyjną manipulację genetyczną w celu badania zjawisk fizjologicznych. Danio pręgowany został wykorzystany jako skuteczny model genetyczny do badania wielu kwestii związanych z chorobami dziedzicznymi, rozwojem i toksykologią na poziomie całego narządu i organizmu. Dzięki dobrze opisanemu i zmapowanemu genomowi danio pręgowanego opracowano liczne narzędzia do edycji genów. Jednak skuteczność generowania i łatwość wykrywania precyzyjnych edycji knock-in za pomocą CRISPR jest czynnikiem ograniczającym. Opisano tutaj podejście knock-in oparte na CRISPR-Cas9 z prostym wykrywaniem precyzyjnych zmian w genie odpowiedzialnym za repolaryzację serca i związanym z zaburzeniem elektrycznym, zespołem długiego odstępu QT (LQTS). To podejście oparte na dwuprzewodnikowym RNA (sgRNA) wycina i zastępuje sekwencję docelową oraz łączy genetycznie kodowany gen reporterowy. Użyteczność tego podejścia wykazano poprzez opisanie nieinwazyjnych pomiarów fenotypowych funkcji elektrycznych serca u larw danio pręgowanego typu dzikiego i z edytowanymi genami. Takie podejście umożliwia efektywne badanie wariantów związanych z chorobą w całym organizmie. Co więcej, strategia ta oferuje możliwości wprowadzania wybranych sekwencji egzogennych, takich jak geny reporterowe, ortologi lub edytory genów.

Wprowadzenie

Strategie edycji genów oparte na CRISPR w modelach zwierzęcych umożliwiają badanie genetycznie dziedzicznych chorób, rozwoju i toksykologii na poziomie całego organizmu1,2,3. Danio pręgowany stanowi potężny model, który w wielu aspektach fizjologicznych jest bliższy ludziom niż modele komórek mysich lub pochodzących od ludzi4. Szeroki wachlarz narzędzi i strategii genetycznych został wykorzystany u danio pręgowanego zarówno dla forward5, jak i reverse genetic screening6. Kompleksowe mapowanie genetyczne i adnotacje u danio pręgowanego ułatwiły podejście do edycji genów jako podstawową technikę inżynierii celowanych nokautów genów (KO) i precyzyjnych knock-inów (KIs)7.

Pomimo tego, generowanie precyzyjnych edycji KI u danio pręgowanego jest ograniczone przez niską wydajność i trudność dokładnego wykrywania. Chociaż nukleazy efektorowe podobne do czynników transkrypcyjnych (TALEN) zostały z powodzeniem wykorzystane i zoptymalizowane pod kątem KIs8, CRISPR zapewnia ulepszoną strategię edycji genów z prostszym celowaniem w sgRNA. W licznych badaniach wykorzystano CRISPR do generowania precyzyjnych wskaźników KI u danio pręgowanego9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, chociaż te edycje wygenerowane przez naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) za pośrednictwem CRISPR są zwykle nieefektywne z niskimi wskaźnikami wewnętrznej skuteczności, które wymagają genotypowania jako głównego ekranu9,10,14,21. Świadczy to o potrzebie wydajnego systemu KI CRISPR u danio pręgowanego, a także niezawodnego systemu o wysokiej przepustowości do wykrywania precyzyjnych edycji.

Celem tego badania było opisanie platformy do generowania precyzyjnego genu sercowego KI w sercach danio pręgowanego z prostym i wysokoprzepustowym wykrywaniem udanych edycji. Opisano podejście oparte na CRISPR-Cas9 do zastępowania eksonów dwoma sgRNA, które opiera się na podejściu TALEN8. Podejście to polega na wycięciu sekwencji docelowej przy użyciu dwóch przewodników sgRNA i zastąpieniu egzogenną sekwencją matrycy, która zawiera interesujący nas KI, a także genetycznie kodowany gen reporterowy intronowy (Figura 1). Integracja genetycznie kodowanego reportera fluorescencyjnego w sekwencji intronowej genu docelowego umożliwia skuteczne wykrywanie edycji dodatnich. Następnie opisano platformę fenotypowania do oceny funkcji elektrycznej serca u larw danio pręgowanego w celu nieinwazyjnej charakterystyki wariantów genów związanych z dziedzicznym LQTS, zaburzeniem elektrycznym serca, które predysponuje osoby do nagłej śmierci sercowej.

Te podejścia zwiększą dostęp i wykorzystanie edycji genów KI danio pręgowanego do modelowania chorób dziedzicznych oraz rozwiązywania problemów biologicznych i fizjologicznych, takich jak mapowanie wzorców ekspresji genów i regulacja rozwoju. Ponieważ serca danio pręgowanego są lepiej równoległe do cech elektrofizjologicznych ludzkiego serca niż modele mysie, mogą być szczególnie atrakcyjne jako genetycznie podatny system do modelowania chorób serca7,22,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z użyciem danio pręgowanego zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i procedurami Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Simona Frasera oraz Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami i zostały zakończone zgodnie z protokołem # 1264K-18.

1. Projektowanie komponentów CRISPR do precyzyjnych edycji

  1. Aby zaprojektować dwa przewodniki sgRNA, które będą używane do wycinania sekwencji zawierającej miejsce docelowe KI, najpierw zidentyfikuj ortolog danio pręgowanego dla interesującego genu.
    UWAGA: Rysunek 2 przedstawia podsumowanie kroków, które należy wykonać, aby dokonać precyzyjnych edycji przy użyciu podejścia CRISPR-Cas9 opartego na dwóch sgRNA.
  2. Następnie użyj narzędzia do projektowania, takiego jak CRISPOR24, które zawiera wybór Danio rerio jako gatunku i enzymu Cas, który ma być użyty.
    UWAGA: Genem będącym przedmiotem zainteresowania w tym badaniu był zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), a docelową mutacją był aminokwas R56Q.
    1. W przypadku podejścia opartego na dwóch sgRNA należy wybrać jedną lokalizację sgRNA, która poprzedza docelowy ekson, a drugą sgRNA, która znajduje się w bezpośrednim dolnym intronie.
    2. Upewnij się, że wybrane sgRNA mają wysoką swoistość i niskie przewidywane wiązanie poza celem. Użyj rankingów CRISPOR, aby zidentyfikować prowadnice z minimalnym wiązaniem niedocelowym. Nie bierz pod uwagę prowadnic, które nie mają rozbieżności w sekwencji wysiewu potencjalnych niedocelowych elementów.
    3. Zidentyfikuj najbardziej prawdopodobne potencjalne miejsca niedocelowe (na podstawie wyników CRISPOR wybierz trzy największe potencjalne miejsca eksonów poza celem) do genotypowania sekwencjonowania Sangera opartego na PCR w kroku 6.1.3.
    4. Po wybraniu dwóch sgRNA należy uzyskać odwrotny dopełniacz dla każdego z nich, tak aby należało użyć czterech oligonukleotydów: dwóch komplementarnych oligonukleotydów, które poprzedzają mutację i dwóch komplementarnych oligonukleotydów, które znajdują się poniżej.
    5. Na każdym z czterech oligonukleotydów dodaj kompatybilne miejsca restrykcyjne w celu włączenia do wybranego plazmidu prowadzącego; w celu integracji z plazmidem DR274 użyj miejsca restrykcyjnego 5' BsaI, aby utworzyć zwis. Upewnij się, że miejsce rozpoznawania Bsa1 jest zaprojektowane na końcu 5' prowadnicy wybranej z CRISPOR, a miejsce rozpoznawania Bsa1 jest zaprojektowane na końcu 5' nici komplementarnych, aby zapewnić prawidłową orientację prowadnic w plazmidzie DR274 (patrz Rysunek 3).
  3. Aby zaprojektować egzogeniczny szablon używany do HDR u danio pręgowanego (Rysunek 1), wybierz dwa fragmenty sekwencji, które będą flankować gen reporterowy mVenus YFP umieszczony w plazmidzie pKHR5.
    UWAGA: Zamierzona modyfikacja/edycja może być zawarta zarówno w nadrzędnym, jak i podrzędnym fragmencie.
    1. Korzystając z Ensembl, zlokalizuj miejsce docelowe w sekwencji genu będącej przedmiotem zainteresowania, w tym w przybliżeniu sekwencję flankującą 2 kb (ramię homologii), która zostanie użyta do utworzenia szablonu.
      UWAGA: Ramiona homologii mogą być symetryczne lub asymetryczne25,26 i około 1 kb każdy, przed i za miejscem docelowym.
    2. Podziel szablon na dwa segmenty, które zostaną wstawione po obu stronach genu reporterowego mVenus YFP (patrz Rysunek 4). Upewnij się, że miejsce podziału znajduje się w intronie, aby sekwencja kodowania nie została przerwana.
      UWAGA: Jeśli gen jest dobrze scharakteryzowany, sprawdź funkcjonalne role w intronie, takie jak miejsca splicingu lub regiony regulatorowe. Regiony znajdujące się blisko końców 5' lub 3' są częściej zaangażowane w splicing mRNA.
    3. Włączyć modyfikacje do sekwencji matrycy, które obejmują: i) ciche mutacje w motywie sąsiadującym z protospacerem przewodnika (PAM) lub sekwencji zarodkowej (należy pamiętać o alternatywnych miejscach PAM, na które enzym Cas może być skierowany), aby zapobiec ponownemu przecięciu enzymu Cas; ii) zmiany odsetek; iii) tworzenie miejsc endonukleazy restrykcyjnej w celu ułatwienia klonowania do plazmidu pKHR5, który zawiera gen reporterowy mVenus YFP (patrz Rysunek 3).
      UWAGA: W tym badaniu pierwszy segment matrycy zawierał XhoI przed miejscem mutacji R56Q i SalI za nim, podczas gdy drugi segment matrycy zawierał EcoRI przed przewodnią sekwencją docelową i BamHI za nią. Jeśli którekolwiek z wybranych miejsc restrykcyjnych jest obecne w sekwencji szablonu, wymagane będą mutacje w celu ich wyciszenia lub można zastosować alternatywne podejścia, takie jak montaż Gibsona.

2. Przygotowanie składników CRISPR do mikroiniekcji zarodków

  1. Przygotuj Cas9 do mikroiniekcji na 1 tydzień przed mikroiniekcją. Użyj białka Cas9 lub przygotuj mRNA Cas9 za pomocą transkrypcji in vitro.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano mRNA Cas9, ponieważ wydajność była zwykle wyższa.
    1. Amplifikować kultury bakteryjne dostępnego w handlu niebieskiego bakteryjnego agaru XL1 (zawierającego plazmid Cas9) przy użyciu odpowiedniego antybiotyku, takiego jak ampicylina. Użyj 675 μl płynnej kultury (z 325 μl glicerolu), aby stworzyć zapasowy zapas glicerolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.
    2. Pozostałą część płynnej kultury należy wykorzystać do oczyszczania miniprep, zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem miniprep. Zawiesić końcowe oczyszczone DNA w 50 μl dostarczonego buforu elucyjnego. Określić ilościowo produkt za pomocą spektrofotometru w celu zbadania wydajności i czystości.
    3. Linearyzować 2 μg oczyszczonego DNA poprzez trawienie restrykcyjne przy użyciu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego oraz przy użyciu odpowiedniego buforu i czasu inkubacji, jak podano dla enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.
    4. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, ponownie zawieszając go w 30 μl dostarczonego buforu elucyjnego.
    5. Po ilościowym określeniu produktu należy użyć go jako szablonu do transkrypcji in vitro przy użyciu odpowiedniego zestawu do transkrypcji dla interesującego nas promotora. Postępuj zgodnie z dostarczonym protokołem i oczyść za pomocą wytrącania chlorku litu27. Ponownie zawiesić oczyszczony RNA w 10 μl H2O bez nukleaz i oznaczyć go ilościowo przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C do użycia w mieszance do mikroiniekcji.
  2. Przygotuj dwa przewodniki sgRNA.
    1. Przygotować plazmid sgRNA za pomocą rusztowania, amplifikując kultury bakteryjne z dostępnego w handlu agaru bakteryjnego XL1 Blue (szczegóły w Tabeli materiałów) w taki sam sposób, jak MLM3613 powyżej (krok 2.1.1), z wyjątkiem użycia kanamycyny zamiast ampicyliny.
    2. Wyżarz dwie pary komplementarnych jednoniciowych oligonukleotydów (ssODN) dla zaprojektowanych powyżej przewodników sgRNA, najpierw ponownie zawieszając ssODN w buforze do wyżarzania 1x do stężenia 100 μM.
    3. W oddzielnych reakcjach dla każdego z dwóch sgRNA wyżarzaj parę komplementarnych ssODN za pomocą termocyklera. Zmieszać 2 μg każdej komplementarnej pary ssODN z 50 μl buforu do wyżarzania i inkubować w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie schłodzić do 25 °C przez 45 min.
    4. Trawić dostępny w handlu plazmid, który zawiera rusztowanie gRNA. Trawić 2 μg plazmidu DR274 przy użyciu 1 μl BsaI, 2 μl odpowiedniego buforu i ddH2O do 20 μL w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Potwierdź linearyzację (opcjonalnie: oczyść za pomocą zestawu do oczyszczania PCR) za pomocą elektroforezy żelowej28.
    5. W dwóch oddzielnych reakcjach ligacji (po jednej dla każdego sgRNA) podwiązywać wyżarzone ssODN za pomocą zlinearyzowanego plazmidu DR274. Użyj stosunku wkładki molowej do wektora wynoszącego 3:1, obliczając odpowiednią masę za pomocą internetowego kalkulatora podwiązania. Wymieszać wymaganą masę insertu i wektora z 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl buforu ligacyjnego i ddH2O do 12 μl i inkubować w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.
    6. Przekształć 2 μl ligowanego produktu w odpowiednie kompetentne komórki (takie jak komórki 10β) przy użyciu standardowych metod, a następnie amplifikować i oczyszczać produkt za pomocą dostępnego w handlu zestawu Miniprep. Opcjonalnie: utwórz zapas glicerolu tego produktu.
    7. Transkrybuj dwa sgRNA, linearyzując 2 μg każdego przewodnika przy użyciu 3' miejsca restrykcyjnego za kierownicą, które znajduje się jak najbliżej końca sekwencji przestrzennej. W przypadku plazmidu DR274 należy dokonać linearyzacji za pomocą HindIII, a następnie oczyścić matrycę RNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, ponownie zawieszając w 30 μl buforu elucyjnego.
    8. Dokonaj transkrypcji dwóch przewodników za pomocą zestawu do transkrypcji RNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta i oczyść za pomocą wytrącania chlorku litu27. Zawiesić dwa oczyszczone przewodniki sgRNA w 10 μl H2Obez nukleaz, określić ilościowo i przechowywać w temperaturze -20 °C do użycia w mieszance do mikroiniekcji.
      UWAGA: Zestaw do transkrypcji RNA nie może zawierać czapeczki 5' ani ogona poli-A.
  3. Przygotuj dwuniciowy, egzogeniczny szablon reportera HDR.
    UWAGA: Matryca jest syntetyzowana w dwóch częściach, jednej przed i jednej za genem reporterowym mVenus YFP. Te dwa segmenty są syntetycznymi konstruktami zamówionymi przez komercyjnego dostawcę, a następnie sekwencyjnie ligowanymi do plazmidu pKHR5 (który zawiera mVenus YFP).
    1. Przygotować plazmid pKHR5 poprzez amplifikację kultur bakteryjnych z dostępnego na rynku szczepu bakterii DH5α (szczegóły w Tabeli Materiałów) w taki sam sposób, jak MLM3613 powyżej (krok 2.1.1).
      UWAGA: Plazmid pKHR5 zawiera sekwencję genu reporterowego mVenus YFP.
    2. Ponownie zawieś dwa zaprojektowane powyżej segmenty matrycy do 100 μM w buforze TE, a następnie przekształć w komórki 10β.
    3. Trawić pierwszy segment matrycy (ten przed genem reporterowym mVenus YFP) i plazmid pKHR5 za pomocą enzymów restrykcyjnych wybranych w kroku 1.3.3.
      UWAGA: Sekwencyjne trawienie pKHR5 jest konieczne ze względu na bliskie sąsiedztwo wybranych miejsc restrykcji w MCS.
    4. Aby przygotować plazmid pKHR5 dla poprzedzającego segmentu matrycy, należy przetrawić 4 μg pKHR5 (zgodnie z krokiem 2.2.4) za pomocą SalI, a następnie oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Zawiesić w 30 μl ddH2O i użyć go jako matrycy do drugiej reakcji trawienia z XhoI. Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    5. Przygotować pierwszy segment matrycy, trawiąc 2 μg segmentu matrycy (etap 2.3.2), 1 μl XhoI, 1 μl SalI, 2 μl odpowiedniego buforu i ddH2O do 20 μl przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i oczyścić produkt żelem.
    6. Związać poprzedzający segment matrycy z kroku 2.3.5 do przygotowanego pKHR5, stosując warunki reakcji opisane w kroku 2.2.5. Przekształć ligowany produkt w kompetentne komórki 10β, amplifikuj i oczyść za pomocą minipreparatu (opcjonalnie: utwórz zapas glicerolu tego produktu).
    7. Użyć zligowanego produktu z kroku 2.3.6 (który zawiera pierwszy segment matrycy zligowany do plazmidu pKHR5 przed genem reporterowym mVenus YFP) i przetrawić, aby przygotować się do drugiego (za reporterem mVenus) segmentu matrycy. Roztrawić 4 μg ligowanego produktu (od etapu 2.3.6, jak w kroku 2.2.4) za pomocą BamHI, a następnie oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Zawiesić ponownie w 30 μl ddH2O i użyć go jako matrycy do drugiej reakcji trawienia z EcoRI. Oczyść produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
    8. Przygotować drugi segment matrycy, trawiąc 2 μg segmentu matrycy (etap 2.3.2), 1 μl BamHI, 1 μl EcoRI, 2 μl odpowiedniego buforu i ddH2O do 20 μl przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i oczyścić produkt żelem.
    9. Odwiązać dalszy segment matrycy do przygotowanego pKHR5 (z kroku 2.3.7), stosując warunki reakcji opisane w kroku 2.2.5. Przekształć ligowany produkt w kompetentne komórki, amplifikuj i oczyść za pomocą zestawu miniprep. Stwórz zapas glicerolu tego produktu końcowego, który zawiera oba segmenty matrycowe ligowane po obu stronach genu reporterowego mVenus YFP w obrębie pKHR5.
  4. Przygotuj mieszankę mikroiniekcyjną, używając mRNA Cas9, dwóch sgRNA i egzogennej matrycy reporterowej HDR.
    1. Wymieszaj 200 ng/μL mRNA Cas9, 100 ng/μL każdego sgRNA i 200 ng/μL egzogennej matrycy reporterowej HDR w 1x buforze do wstrzykiwań do końcowej objętości 20 μL.
    2. Przechowywać mieszankę do mikroiniekcji w temperaturze -20 °C i wyrzucić niewykorzystaną mieszankę po trzech cyklach zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: Użyj 4 nl tej mieszanki do mikroiniekcji do mikroiniekcji do woreczka żółtkowego każdego zarodka.

3. Hodowla danio pręgowanego i mikroiniekcja zarodków

UWAGA: Protokoły hodowli danio pręgowanego i mikroiniekcji zarodków jednokomórkowych zostały opisane wcześniej29,30,31.

  1. Do hodowli używaj danio pręgowanego szczepu AB w wieku 6-12 miesięcy. Wstrzyknąć zarodki w stadium jednokomórkowym po około 40 minutach od zapłodnienia (patrz Rysunek 5).
    UWAGA: Płeć biologiczna wstrzykniętych zarodków nie była znana; Dymorfizm płciowy nie jest widoczny do około 3 miesiąca życia32.

4. Badanie przesiewowe genów reporterowych larw danio pręgowanego edytowanych przez CRISPR-Cas9

  1. Wizualizacja integracji YFP z larwami danio pręgowanego po mikrowstrzyknięciu komponentów CRISPR-Cas9 w celu przeprowadzenia udanych edycji HDR.
    1. Na szalce Petriego o średnicy 25 mm znieczulij 24 larwy danio pręgowanego po 3 dniach od zapłodnienia (dpf) w 0,3% sulfonianu metanu trikainy (MS-222, buforowanym do pH 7,0-7,4 za pomocą HEPES i wodorotlenku sodu), aż stracą odruch samoprostowania (zwykle 1-2 min). Po znieczuleniu przenieś każdą larwę do indywidualnego dołka na 24-dołkowej płytce.
    2. Za pomocą mikroskopu zdolnego do wykrywania GFP/YFP, badanie przesiewowe pod kątem fluorescencji genu reporterowego w oczach każdej larwy.
    3. Uchwyć obrazy każdej larwy i udokumentuj obecność lub brak ekspresji genu reporterowego.

5. Fenotypowanie larw danio pręgowanego edytowanych przez CRISPR-Cas9

  1. Po badaniu przesiewowym genu reporterowego należy wykonać fenotypowanie serca (częstość akcji serca, wymiary osierdzia, EKG) na każdej larwie. Fenotyp równej liczby larw reporterowych genowo-dodatnich i -ujemnych.
    1. Użyj kamery CCD (np. blackfly USB3) oraz oprogramowania do nagrywania wideo i obrazu (np. Micromanager for ImageJ), aby zmierzyć tętno i wymiary osierdzia, podczas gdy larwy są znieczulane.
    2. Aby zmierzyć tętno za pomocą Micromanagera, utwórz obszar zainteresowania (ROI), aby uchwycić serce i wykluczyć inne struktury.
      1. Zaimportuj wideo do ImageJ jako sekwencję obrazów i upewnij się, że w polu liczba obrazów została wprowadzona prawidłowa liczba klatek.
      2. Po otwarciu pliku użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta, aby narysować ROI w sercu, ale z wyłączeniem innych ruchomych elementów, a następnie zapisz ROI w menedżerze ROI (analiza | Narzędzia | Menedżer ROI).
      3. Kliknij pozycję plugins | install (zainstaluj) i wybierz algorytm pomiaru tętna, aby zainstalować kod w folderze domyślnym, a następnie wybierz wtyczkę u dołu karty wtyczek. Nagraj uderzenia na minutę (bpm) z wyskakującego okienka.
        UWAGA: Algorytmy wykrywania obrazu zostały napisane specjalnie do wykrywania tętna poprzez pomiar indywidualnych zmian gęstości pikseli związanych ze skurczem skurczowym komór. Kod można znaleźć na stronie https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
    3. Zmierz wymiary osierdzia za pomocą bezpłatnego narzędzia, takiego jak ImageJ, aby swobodnie narysować ROI wokół worka osierdziowego i jednego z oczu. Otwórz obraz w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby najpierw narysować ROI wokół worka osierdziowego, zapisując go w menedżerze ROI, jak w kroku 5.1.2, a następnie powtórz dla oka. Wybierz te dwa ROI w zarządzaniu ROIr, a następnie kliknij przycisk zmierz. Zapisz obszar dla każdego, aby później obliczyć obszar worka osierdziowego znormalizowany do obszaru oka u każdej larwy.
    4. Po pomiarach tętna i osierdzia zapisz EKG od poszczególnych larw.
      UWAGA: Protokoły rejestracji EKG danio pręgowanego zostały opisane wcześniej33,34,35,36.

6. Genotypowanie larw danio pręgowanego edytowanego przez CRISPR-Cas9

  1. Po przeprowadzeniu analiz fenotypowych należy przeprowadzić genotypowanie on- i potencjalne off-target, aby potwierdzić dokładną i precyzyjną edycję genów HDR.
    1. Znieczulij każdą larwę o zawartości 3 dpf w 0,3% MS-222 i klipsie ogonowym, aby wyizolować gDNA metodą HOTShot37. Inkubować każdy wycięty zacisk ogonowy w 15 μl 25 mM NaOH w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Następnie zneutralizować 1,5 μl Tris-HCl i odwirować przy 13 800 x g przez 30 s. Zachowaj supernatant, który zawiera wyekstrahowany gDNA.
    2. Odzyskać larwy w pożywce E3 i zwrócić je do systemu pomieszczeń, jeśli planowany jest dalszy rozwój lub badania.
    3. Używając wyekstrahowanego gDNA jako matrycy, wykonaj sekwencjonowanie Sangera oparte na PCR w miejscach docelowych i potencjalnie poza celem.
      UWAGA: Opcjonalnie: zagnieżdżone podejście PCR może być korzystne dla niektórych regionów genów.
    4. Upewnij się, że projekt startera na miejscu wychwytuje miejsce mutacji i najbliższe miejsce wiązania sgRNA. Zaprojektuj oddzielny starter sekwencjonowania, aby wykryć przejście od wstawionego ramienia homologii i genu docelowego, aby potwierdzić integrację z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Zaprojektuj startery, aby zsekwencjonować trzy najważniejsze potencjalne miejsca niedocelowe zidentyfikowane w kroku 1.2.3.
      UWAGA: Programy do projektowania przewodników często sugerują użycie podkładów, ale w celu osiągnięcia optymalnych wyników może być konieczne dostosowanie.
    5. Skompiluj genotypowanie on- i off-target, tętno, wymiary osierdzia, fenotypowanie EKG i dane genów reporterowych możliwe do zidentyfikowania dla każdego danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skuteczność zastosowania tej metody CRISPR do wymiany eksonu z użyciem dwóch sgRNA została potwierdzona poprzez wprowadzenie i prostą detekcję precyzyjnej edycji w celu stworzenia wariantu R56Q związanego z LQTS w genie zkcnh6a u rybek zebrafish. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywną larwę w 3 dpf, która na etapie jednej komórki embrionu została wstrzyknięta komponentami CRISPR zgodnie z powyższym opisem. Rysunek 6A pokazuje ekspresję genu reporterowego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Inżynieria precyzyjnych edycji genów przy użyciu CRISPR-Cas9 jest wyzwaniem ze względu na niską wydajność mechanizmów HDR i ich skuteczne wykrywanie. W tym miejscu opisano podejście oparte na CRISPR-Cas9 do zastępowania eksonów dwoma sgRNA, które zapewnia precyzyjne edycje u danio pręgowanego z prostym wizualnym wykrywaniem pozytywnych edycji. Skuteczność tego podejścia wykazano poprzez generowanie precyzyjnych edycji w genie zkcnh6a . W pracy pokazano, w jaki sposób można ocenić czynność serca u larw danio pręg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) oraz granty Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (T.W.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Program
CRISPORTEFOR Infrastructure
ENSEMBLEuropejski Instytut
ImageJNational Institutes of Health (NIH)
Micro-ManagerOpen Source (Github)
NEBiocalculatorNowa Anglia Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-dołkowa płytkaVWR
25 mm szalka PetriegoVWR
Blackfly USB3 KameraTeledyne FLIR
C1000 Thermal CyclerBio-Rad
Wirówka 5415CEppendorf
Zestaw do ekstrakcji żelu EZNAOmega Biotek
MAXIscript T7 Zestaw do transkrypcjiInkubator Invitrogen
MaxQ 5000Barnstead Lab Line
transkrypcjiQiagen
mMessage mMachine T7 Ultra
ND1000Zestaw do oczyszczania Nanodrop
PCRQiagen
PLI 100A PicoinjectorAparat
PowerPac Podstawowy zasilaczBio-Rad
Stemi 305 SteroskopZeiss
Wide Mini Sub Cell GTBio-Rad
ZebTec Obudowa danio pręgowanego SystemTecniplast
SERVICES
Gene SynthesisGenewiz
Sanger SekwencjonowanieGenewiz
REAGENTS
10β Kompetentne komórkiNEB
10X Bufor PCRQiagen
100 mM Mieszanina nukleotydówABM
AmpicylinaSigma
BamHI Endonukleaza z buforemNEB
BsaI Endonukleaza z buforemPlazmid NEB
DR274 (XL1 Niebieski bakteryjny agar stab)Addgene
EcoRI Endonukleaza z buforemNEB
Glicerol
HEPESSigma
HindIII Endonukleaza z buforemNEB
KanamycynaSigma
Błękit metylenowyPlazmid Sigma
MLM3613 (XL1 Niebieski bakteryjny agar stab)Addgene
MS-222 (Trikaina)Sigma
pKHR5 (DH5 i alfa; bakteryjny agar stab)Addgene
PmeI Endonukleaza z buforemNEB
Endonukleaza SalI z buforemNEB
Wodorotlenek soduSigma
T4 Ligaza z buforemSigma
Taq PolimerazaQiagen
TE BuforChlorowodorek Sigma
Tris Endonukleaza
RECIPES
Bufor do wyżarzania (pH 7,5-8,0)10 mM TrisSigma
50 mM NaClSigma
1 mM EDTASigma
E3 Media (pH 7,2)5 mM NaClSigma
0,17 mM KClSigma
0,33 mM CaCl2Sigma
0,33 mM MgSO4Sigma
Bufor do iniekcji (pH 7,5)20 mM HEPESSigma
150 mM KClSigma
Bioinformatyki Zestaw do miniprepu Zestaw do Spektrofotometr Invitrogen Harvard System elektroforezy Plazmid Sigma XhoI z buforem NEBSolution Dostawca składników

Bibliografia

  1. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  2. Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
  3. Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
  4. Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
  5. Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
  6. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  7. González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
  8. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  9. Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
  10. Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).
  11. Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).
  12. de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).
  13. Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340(2020).
  14. Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  15. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).
  16. Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
  17. Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).
  18. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968(2020).
  19. Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  20. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  21. Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
  22. Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
  23. Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
  24. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  25. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  26. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
  29. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  30. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  32. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  33. Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
  34. Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552(2013).
  35. Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
  36. Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
  37. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
  40. Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
  41. MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstawka CRISPR Knock Inprecyzyjna edycja gen wrepolaryzacja sercazesp wyd u onego odst pu QTintegracja genu reporterowegosekwencjonowanie metod Sangeraprojektowanie matrycy HDRfenotypowanie EKGmodelowanie wariant w chorobowych
Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.