Artykuł metodologiczny

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

DOI:

10.3791/64215

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Oklahoma Children's Hospital, 2Oklahoma University Health Sciences Center, 3Department of Surgery, University of Oklahoma Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy są nowym narzędziem badawczym w badaniach nad chorobami zapalnymi jelit, takimi jak martwicze zapalenie jelit (NEC). Są tradycyjnie uprawiane w konformacji podstawno-bocznej (BO), gdzie wierzchołkowa powierzchnia komórki nabłonka jest skierowana w stronę wewnętrznego światła. W tym modelu dostęp do powierzchni świetlnej enteroidów w celu leczenia i eksperymentów jest trudny, co ogranicza możliwość badania interakcji gospodarz-patogen. Aby obejść ten problem, stworzono model neonatal apical-out (AO) martwiczego zapalenia jelit. Ponieważ zmiany przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego są patologiczne dla NEC, protokół ten określa użycie żółcieni lucyferowej (LY) jako markera przepuszczalności parakomórkowej. LY przenika przez barierę nabłonkową jelit przez wszystkie trzy główne szlaki parakomórkowe: porowe, nieszczelne i nieograniczone. Wykorzystanie LY w modelu AO pozwala na szersze badanie przepuszczalności w NEC. Po uzyskaniu zgody IRB i rodziców, pobrano próbki chirurgiczne tkanki jelitowej od wcześniaków. Jelitowe komórki macierzyste pobrano za pomocą izolacji krypty i wykorzystano do hodowli enteroidów. Enteroidy hodowano do dojrzałości, a następnie przekształcano w AO lub pozostawiano w konformacji BO. Pacjenci ci albo nie byli leczeni (kontrola), albo byli leczeni lipopolisacharydem (LPS) i poddawani warunkom niedotlenienia w celu indukcji NEC in vitro. Do oceny przepuszczalności użyto LY. Barwienie immunofluorescencyjne białka wierzchołkowego zonula occludens-1 i białka podstawnobocznego β-kateniny potwierdziło konformację AO. Zarówno enteroidy AO, jak i BO leczone LPS i hipoksją wykazały znacznie zwiększoną przepuszczalność parakomórkową w porównaniu z kontrolą. Zarówno enteroidy AO, jak i BO wykazywały zwiększony wychwyt LY do światła leczonych enteroidów w porównaniu z kontrolami. Wykorzystanie LY w modelu enteroidu AO pozwala na badanie wszystkich trzech głównych szlaków przepuszczalności parakomórkowej. Dodatkowo pozwala na badanie interakcji gospodarz-patogen i ich wpływu na przepuszczalność w porównaniu z modelem enteroidalnym BO.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy to trójwymiarowe (3D) struktury pochodzące z ludzkich komórek macierzystych jelitowych ograniczonych do narządów1,2. Składają się one w całości z linii nabłonkowej i zawierają wszystkie zróżnicowane typy komórek nabłonka jelitowego2. Enteroidy utrzymują również polaryzację komórkową składającą się z wierzchołkowej powierzchni świetlnej tworzącej wewnętrzny przedział i powierzchni podstawno-bocznej skierowanej w stronę otaczających mediów. Enteroidy są unikalnym modelem, ponieważ zachowują cechy gospodarza, z którego zostały wygenerowane3. Tak więc enteroidy generowane przez wcześniaki stanowią model, który jest przydatny do badania chorób, które dotykają przede wszystkim tę populację, takich jak martwicze zapalenie jelit (NEC).

Tradycyjny model enteroidalny jest hodowany w konformacji podstawno-bocznej (BO), gdzie enteroid jest zamknięty w kopule macierzy błony podstawnej (BMM). BMM indukuje enteroid do utrzymania struktury 3D z powierzchnią podstawno-boczną na zewnątrz. Enteroidy BO są odpowiednim modelem dla NEC, który wypełnia lukę między dwuwymiarowymi (2D) pierwotnymi liniami komórek ludzkich a modelami zwierzęcymi in vivo2,4. NEC jest indukowany w enteroidach poprzez umieszczenie patogenów, takich jak LPS lub bakterie, w pożywkach otaczających enteroidy, a następnie narażenie na warunki niedotlenienia2,3. Wyzwanie związane z enteroidalnym modelem NEC BO polega na tym, że nie pozwala on na skuteczne badanie interakcji gospodarz-patogen, które zachodzą na powierzchni wierzchołkowej in vivo. Zmiany w przepuszczalności jelit są spowodowane tymi interakcjami gospodarz-patogen. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób przepuszczalność wpływa na patofizjologiczne podłoże choroby, należy stworzyć model, który obejmuje leczenie powierzchni wierzchołkowej.

Co i in. jako pierwsi wykazali, że dojrzałe enteroidy BO mogą być indukowane do tworzenia konformacji wierzchołkowej (AO) poprzez usunięcie kopuł BMM i ponowne ich zawieszenie w mediach5. W artykule tym wykazano, że enteroidy AO utrzymują prawidłową polaryzację nabłonka, zawierają wszystkie typy komórek jelitowych, podtrzymują barierę nabłonkową jelit i umożliwiają dostęp do powierzchni wierzchołkowej5. Wykorzystanie enteroidów AO jako modelu NEC pozwala na fizjologiczne odtworzenie procesu chorobowego i badanie interakcji gospodarz-patogen.

Jednym z głównych czynników wpływających na patofizjologię NEC jest zwiększona przepuszczalność jelit6. Zaproponowano kilka cząsteczek jako sposób badania przepuszczalności jelit in vitro7. Wśród nich żółcień lucyferowa (LY) jest barwnikiem hydrofilowym o pikach wzbudzenia i emisji odpowiednio przy 428 nm i 540 nm8. Ponieważ przechodzi przez wszystkie główne szlaki parakomórkowe, został wykorzystany do oceny przepuszczalności parakomórkowej w różnych zastosowaniach, w tym barier nabłonka krew-mózg i jelit8,9. Tradycyjne zastosowanie LY wykorzystuje komórki hodowane w monowarstwach na półprzepuszczalnej powierzchni10. LY nakłada się na powierzchnię wierzchołkową i przechodzi przez parakomórkowe białka ścisłego połączenia, aby zgromadzić się po stronie podstawno-bocznej. Wyższe stężenia LY w przedziale podstawno-bocznym wskazują na zmniejszenie białek połączeń ścisłych, a następnie na rozpad bariery komórkowej nabłonka jelitowego i zwiększoną przepuszczalność10. Zostało to również opisane w modelach enteroidalnych 3D BO, w których LY dodano do pożywki, a poszczególne enteroidy zobrazowano pod kątem wychwytu LY do klasy lumen11. Chociaż pozwala to na analizę jakościową poprzez wizualizację wychwytu LY, analiza ilościowa jest ograniczona. Protokół ten przedstawia unikalną technikę, która wykorzystuje LY do oceny przepuszczalności parakomórkowej przy użyciu modelu enteroidalnego NEC in vitro w enteroidach AO przy zachowaniu orientacji 3D. Metoda ta może być stosowana zarówno do jakościowej, jak i ilościowej analizy przepuszczalności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne badania zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) na Uniwersytecie Oklahoma. Przed pobraniem ludzkich próbek chirurgicznych wymagana była zgoda rodziców zgodnie ze specyfikacją IRB. Po zatwierdzeniu przez IRB i uzyskaniu zgody rodziców, ludzką tkankę jelita cienkiego pobrano od niemowląt (skorygowany wiek ciążowy (GA) w zakresie 36-41 tygodni w momencie pobierania próbki, wszystkie z historią przedwczesnego porodu w szacowanym GA 25-34 tygodni, 2:1 M:F) poddanych operacji NEC lub innej resekcji jelita, takiej jak usunięcie stomii lub naprawa atrezji. Enteroidy zostały wygenerowane z tkanki uzyskanej z jelita czczego lub jelita krętego.

1. Hodowle enteroidów pochodzące od niemowląt ludzkich: izolacja krypty i posiew z całej tkanki

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną, bufor chelatujący #1 i bufor chelatujący #2 (Tabela 1) zgodnie z poprzednim raportem4. chelatujące przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 48 godzin.
  2. Przygotować pożywkę dla ludzkiego minijelita (Tabela 1). Przed użyciem przechowywać bulion w temperaturze -20 °C i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Przygotować 50% pożywki kondycjonowane L-WRN (CM) (Tabela 1). Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    UWAGA: 100% baza L-WRN dla kondycjonowanych pożywek jest opisana w protokole Miyoshi et al.12.
  4. Wygeneruj enteroidy z próbek tkanki jelita cienkiego uzyskanych z próbek chirurgicznych zgodnie z poprzednim raportem4. Umieść cztery dołki enteroidów w 24-dołkowej płytce z kawałka tkanki jelitowej o masie 0,75-2,5 g.
    UWAGA: Enteroidy można z powodzeniem wytworzyć z tkanki przechowywanej w 30 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C przez okres do 48 godzin.
  5. Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do góry nogami na 15-20 minut, aby umożliwić polimeryzację kopuł BMM4.
  6. Dodaj 500 μl 50% L-WRN CM (zgodnie z opisem w kroku 1.3) z 0,5 μl Y-27632, inhibitora ROCK (RI, patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Po 2-3 dniach wymień na 50% L-WRN CM bez RI.

2. Generowanie enteroidów AO

  1. Hoduj enteroidy osadzone w BMM przez 7-10 dni z 50% L-WRN CM4.
  2. Usunąć pożywkę i dodać 500 μl roztworu do odzyskiwania komórek (CRS, patrz tabela materiałów) do jednego dołka. Zeskrob kopułę, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, a następnie dodaj roztwór CRS/enteroid/BMM do następnego dołka.
  3. Zeskrob kopułę, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół i umieść roztwór w probówce do mikrowirówki. Dodaj 500 μl CRS do drugiego dołka, pipetuj w górę i w dół, a następnie dodaj do pierwszego dołka. Przenieść ten roztwór do tej samej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Powtórz krok 2.3, łącząc dwie studzienki w jednej probówce do mikrowirówki, aż cała zawartość studzienki znajdzie się w CRS.
    UWAGA: Więcej niż dwie studzienki można połączyć w jedną większą stożkową probówkę o pojemności 15 ml, jeśli generują duże objętości enteroidów AO. Utrzymanie proporcji 500 μl CRS na studzienkę jest ważne, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność BMM.
  5. Umieścić probówki do mikrowirówek (krok 2.3) z zbiorczym roztworem CRS/enteroid/BMM na rotatorze na 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu rozpuszczenia BMM.
  6. Odwirować roztwór o sile 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4°C, następnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając osad.
  7. Zawiesić osad enteroidalny w 1 ml 50% L-WRN CM (przygotowanym w kroku 1.3) w probówce mikrowirówki. Delikatnie odpipetować 500 μl ponownie zawieszonego roztworu enteroidu/pożywki do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej o bardzo niskim nasadce (patrz tabela materiałów).
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni przed rozpoczęciem eksperymentu.

3. Weryfikacja konformacji enteroidu AO za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego metodą całej góry

  1. Po inkubacji enteroidów w zawiesinie pożywki przez 3 dni, odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z jednego dołka do probówki do mikrowirówki.
  2. Odwirować zawiesinę enteroidu/pożywki o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  3. Zawiesić enteroidy w 20 μl BMM. Pobrać pipetę 10 μl zawiesiny enteroidalnej na szkiełko mikroskopowe i rozprowadzić cienką warstwą o wymiarach około 1 cm na 1 cm kwadratowych. Powtórzyć czynność z pozostałymi 10 μl zawiesiny enteroidalnej na oddzielnej części tego samego szkiełka, tak aby pozostały dwa rozmazy zawiesiny enteroid/BMM.
  4. Pozostawić rozmazy enteroidu/BMM do zestalenia się w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
  5. Pracując w dygestorium, umieść szkiełko w słoiku do barwienia i napełnij 4% paraformaldehydem, aż pokryje rozmaz enteroidu/BMM (~ 30 ml na jedno szkiełko w przypadku użycia szklanego słoika do barwienia o pojemności 10 szkiełek). Odczekać 30 minut (w temperaturze pokojowej) na utrwalenie.
    UWAGA: 4% paraformaldehydu jest niebezpieczny i może powodować uszkodzenie/podrażnienie oczu, podrażnienie skóry i raka. Podczas korzystania z niego zawsze pracuj pod wyciągiem. Podczas obchodzenia się z nim należy nosić rękawice ochronne i środki ochrony osobistej. Wyrzuć go do zatwierdzonego pojemnika na odpady.
  6. Wyrzuć 4% paraformaldehydu do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodać 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do słoika do barwienia lub do momentu, gdy PBS pokryje rozmazy enteroidowe/BMM. Pozostaw na 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć PBS do butelki na odpady paraformaldehydu. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
  7. Napełnij nowy słoik do barwienia 30 ml 0,5% Triton X-100 rozcieńczony w PBS. Umieścić szkiełko z rozmazami enteroidalnymi/BMM w roztworze Triton i pozostawić do przepuszczalności przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Wyrzuć 0,5% Triton X-100 rozcieńczony w PBS. Dodaj 30 ml PBS do słoika do barwienia i pozostaw na 3 minuty. Usunąć PBS przez dekantację.
  9. Delikatnie przetrzyj szkiełko wokół rozmazów enteroidowych/BMM, uważając, aby ich nie naruszyć. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (barierowego pisaka PAP, patrz Tabela materiałów), narysuj okrąg wokół każdego z rozmazów enteroidu/BMM. Przygotować 20% surowicę, specyficzną dla zwierzęcia, u którego wyhodowano przeciwciało drugorzędowe (patrz Tabela Materiałów).
  10. Połóż szkiełko mikroskopowe płasko na stole laboratoryjnym. Zatkać szkiełko na 1 godzinę w temperaturze 4 °C, odpipetowując 100 μl specyficznej 20% surowicy z kroku 3.9 na każdy z rozmazów enteroidalnych/BMM otoczonych przez hydrofobowy pisak barierowy.
  11. Przygotować 100 μl roztwór z rozcieńczeniami 1:100 i 1:200 odpowiednio pierwszorzędowych przeciwciał β-kateniny i ZO-1, rozcieńczonych w PBS.
    UWAGA: Każde przeciwciało pierwszorzędowe musi pochodzić od innego zwierzęcia, aby zapewnić, że będą miały odrębne kanały immunofluorescencyjne podczas obrazowania. W niniejszym badaniu wykorzystano mysie przeciwciało β-kateninowe i królicze przeciwciało ZO-1 (patrz tabela materiałów).
  12. Postukaj w szkiełko na blacie, aby usunąć 20% serum i delikatnie wytrzyj do sucha, uważając, aby nie zakłócić rozmazów enteroidowych/BMM. Odpipetować 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego β-kateniny/ZO-1 na jeden z rozmazów enteroidowych/BMM. Odpipetować 100 μl PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego na drugi rozmaz z enteroidu/BMM jako kontrolę ujemną.
  13. Wyłóż dno plastikowego pojemnika mokrym ręcznikiem papierowym, aby stworzyć nawilżony pojemnik. Umieścić szkiełko w pojemniku, uważając, aby nie naruszyć roztworów pokrywających rozmazy z enteroidu/BMM. Umieść pokrywkę na pojemniku, aby go uszczelnić, i przechowuj na płasko w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka. Upewnij się, że pojemnik jest zamknięty, aby uniknąć wysuszenia.
  14. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, dotknij szkiełka na liczniku, aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i PBS z rozmazów enteroidowych/BMM.
  15. Wykonaj etap mycia, umieszczając szkiełko w słoiku do barwienia i napełniając 30 ml PBS lub do momentu, gdy PBS pokryje rozmazy enteroidowe/BMM. Pozostaw na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć PBS i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
  16. Przygotować 200 μl przeciwciał drugorzędowych dla dwóch różnych kanałów immunofluorescencyjnych, przy czym każde przeciwciało ma rozcieńczenie 1:1000 w PBS (patrz tabela materiałów). Trzymaj roztwór z dala od światła.
  17. Pobrać pipetą 100 μl roztworu przeciwciał wtórnych na każdy z rozmazów enteroidowych/BMM. Umieść go w ciemności i pozostaw na 1 godzinę w temperaturze RT.
  18. Dotknij suwaka na liczniku, aby usunąć przeciwciała wtórne. Powtórz kroki prania opisane w kroku 3.15, upewniając się, że wszystkie prania są wykonywane w ciemności.
  19. Dodać kroplę podłoża mocującego 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (Fluoroshield z DAPI, patrz Tabela Materiałów) do każdego z rozmazów enteroidowych/BMM i nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że oba rozmazy są odpowiednio pokryte. Unikaj uwięzienia pęcherzyków pod szkiełkiem nakrywkowym. Trzymaj szkiełko w ciemności, aż będzie gotowe do oglądania pod mikroskopem.
    UWAGA: Natychmiastowe obrazowanie preparatów daje najbardziej optymalne wyniki; jednak szkiełka można przechowywać płasko w nawilżonym pojemniku w temperaturze 4 °C i obrazować przez okres do 1 tygodnia po dodaniu DAPI.

4. Indukcja eksperymentalnego NEC

  1. Upewnij się, że enteroidy AO znajdowały się w zawiesinie przez co najmniej 72 godziny przed użyciem.
  2. Delikatnie odpipetować całą zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki do mikrowirówki.
    UWAGA: Wiele studzienek można połączyć w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml, jeśli uzdatniana jest duża objętość studzienek. W przypadku tego protokołu zaleca się co najmniej trzy studzienki na grupę badaną.
  3. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  4. Dodać 10 μl 5 mg/ml lipopolisacharydu (LPS, patrz tabela materiałów) do 500 μl 50% LWRN CM na studzienkę (końcowe stężenie 100 μg/ml LPS).
  5. Zawiesić enteroidy AO oznaczone jako grupa badana w 50% LWRN + LPS i podwielokrotności 500 μl zawiesiny na 24-dołkowej płytce o bardzo niskim stopniu mocowania. Zawiesić enteroidy AO oznaczone jako nieleczone kontrole w 500 μl 50% LWRN CM na studzienkę. Porcję 500 μl tej zawiesiny do oddzielnej 24-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie.
  6. Wywołać niedotlenienie w enteroidach AO traktowanych LPS za pomocą modułowej komory inkubatora (MIC) z 1% O2 , 5% CO2 i 94% N2 zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Leczyć enteroidy z hipoksją i LPS przez 24 godziny.
  7. Umieścić kultury niepoddane działaniu substancji i kultury poddane działaniu LPS + hipoksji, nadal w komorze MIC, w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 2 na 24 godziny.

5. Pomiar przepuszczalności parakomórkowej za pomocą LY

  1. Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Ciepły DPBS i 50% LRWN CM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Odwirować zawiesinę enteroid/pożywkę o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Wyjmij nośnik. Umyj enteroidy ciepłym 500 μl DPBS.
  4. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  5. Powtórz kroki 5.3-5.4 jeszcze raz, w sumie dwa razy.
  6. Po umyciu dodaj 450 μl ciepłego 50% LWRN CM (przygotowanego w kroku 1.3).
  7. Dodaj 50 μl 2,5 mg/ml LY (końcowe stężenie wynosi 0,25 μg/μl, patrz tabela materiałów) do każdego dołka i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 godziny.
  8. Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej.
  9. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, następnie usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny.
  10. Przemyć enteroidy 500 μl ciepłym DPBS.
  11. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny.
  12. Powtórz kroki 5.10-5.11 jeszcze trzy razy, co daje w sumie cztery prania.
  13. Ponownie zawiesić każdą granulkę w 1 000 μl zimnego DPBS i energicznie pipetować w górę iw dół, aby oddzielić enteroidy.
  14. Przygotować wzorce dla krzywej wzorcowej LY rozcieńczonej w DPBS (100 ng/ml; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
  15. Odpipetować 150 μl każdej próbki na basenik w trzech powtórzeniach na 96-dołkowej płytce.
  16. Zmierzyć fluorescencję przy piku wzbudzenia 428 nm i piku emisji 536 nm na czytniku płytkowym zdolnym do odczytu fluorescencji (patrz tabela materiałów). Korzystając z oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów), oblicz stężenia, interpolując krzywą wzorcową i używając krzywej czteroparametrowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konformacja AO
Enteroidy zawieszone w 50% pożywce LWRN przez 72 godziny przyjmują konformację AO (Rysunek 1). Zostało to potwierdzone za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z wykorzystaniem enteroidalnych całych wierzchołków białka wierzchołkowego, zonula occludens-1 (ZO-1) i białka podstawno-bocznego, β-kateniny (Ryc. 1). Enteroidy AO pokazują ZO-1 (zielony) na zewnętrznej, wierzchołkowej powierzchni enteroidu, podczas gdy β-katenina (czerwona) z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przepuszczalność jelit jest złożona i odzwierciedla funkcję bariery nabłonkowej. Bariera jelitowa składa się z pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych, która pośredniczy w transporcie międzykomórkowym i parakomórkowym14. Przepuszczalność parakomórkowa opiera się na białkach ścisłego połączenia, które uszczelniają przestrzeń między komórkami nabłonkowymi14. W ramach tego transportu parakomórkowego istnieją trzy odrębne szlaki, przez które cząsteczki mogą się krzyżować: pory...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych praw własności ani interesów komercyjnych w żadnym z wymienionych produktów lub koncepcji omawianych w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Ashley Nelson z University of Rochester Medical Center za jej pomocną pomoc w pracy z naszym modelem enteroidu. Chcielibyśmy również podziękować Oddziałowi Chirurgii Dziecięcej Uniwersytetu w Oklahomie za wsparcie tego projektu. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research oraz Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 przyznany Wydziałowi Chirurgii w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[leu] 15-gastryna 1milipor SigmaG9145-.1MG
100 &mikro; m sterylne sitko komórkoweCorning431752
100% kondycjonowane LWRNWykonane we własnym zakresie zgodnie z Miyoshi et al.12
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychCorning3526
96-dołkowa, przezroczysta płyta dolnaGreiner Bio-One655090
A-83-01R& D Systems2939/10
Alexa Fluor 488 koza anty-królik wtórny ab, 1:1000InvitrogenA-11034
Alexa Fluor 594 koza anty-mysz wtórna ab, 1:1000InvitrogenA-11032
Amfoterycyna BThermo Fisher Scientific15290026
Anti-zonula occludens-1 królik pierwotny ab, 1:200Sygnalizacja komórkowa#D6L1E
Anty-β-katenina mysz pierwotna ab, 1:100Sygnalizacja komórkowa# 14-2567-82
Suplement B-27 bez witaminy AThermo Fisher Scientific17504-044
Barierowy długopis PAPLaboratorium urządzeń naukowych9804-02
BMM (Matrigel)CorningCB-40230C
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354270
Nożyczki
DMEMThermo Fisher Scientific11-965-118
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific11320-082
DPBSThermo Fisher Scientific14-190-144
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Milipor SigmaGF144
Etylenodiaminotetraoctowy kwas (EDTA)Millipore SigmaEDS-500G
EVOS m7000 System obrazowaniaInvitrogenAMF7000
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio-Products100-525
Fluoroshield z DAPIKleszcze
15-750-060
Szkiełka nakrywkowe szklane
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
GraphPad Prism 9Dotmatics
InsulinaThermo Fisher Scientific12585014
Lipopolisacharyd (LPS)Millipore SigmaL2630-25MG
Lucyfer Żółty CH, Sól LitowaInvitrogenL453
Modułowa komora inkubatoraBillups Rothenberg Inc.MIC101
N-2suplement Thermo Fisher Scientific17502-048
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630-080
N-acetylocysteinaMillipore SigmaA9165-5G
NikotynamidMillipore SigmaN0636-100G
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140-148
Wirówka
Mikrowirówka
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093
SB202190Millipore SigmaS7067-5MG
SpectraMax iD3Molekularny urządzenia
Tube Revolver RotatorThermoFisher Scientific88881001
Ultra-low attachment 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejCorning3473
Y-27632, inhibitor ROCK (RI)Tocris1254
preparacyjne Millipore Sigma F6057-20mL Gentamycyna Thermo Fisher Scientific z chłodzeniem z wahadłowym wiadrem stołowa z chłodzeniem Czytnik mikropłytek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492(2020).
  2. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  3. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  4. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  5. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  6. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  8. Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186(2021).
  9. Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900(2019).
  10. Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
  11. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383(2019).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
  14. Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
  15. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  16. Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677(2021).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871(2018).
  19. Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330(2021).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enteroidy z wierzcho kiem na zewn trzprzepuszczalno parakom rkowamartwicze zapalenie jelittraktowanie lipopolisacharydemindukcja hipoksjifluorescencyjny czytnik p ytekbarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły