Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64216

⸱

2 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Centre for Advanced Imaging, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology and ARC Training Centre for Innovation in Biomedical Imaging Technology, The University of Queensland, 3School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 4Mater Research and Mater Research Institute, The University of Queensland, 5Pathology Queensland, Royal Brisbane Women's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Większość mysich modeli przerzutów do mózgu jest skomplikowana przez przerzuty ogólnoustrojowe, mylące analizę śmiertelności i wyników interwencji terapeutycznej. Przedstawiono tutaj protokół wewnętrznego wstrzykiwania komórek rakowych do tętnicy szyjnej, który wytwarza spójne guzy wewnątrzczaszkowe z minimalnymi guzami ogólnoustrojowymi.

Streszczenie

Przerzuty do mózgu są przyczyną ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z rakiem. Krytycznych aspektów chorób przerzutowych, takich jak złożone mikrośrodowisko nerwowe i interakcja komórek zrębu, nie można w pełni odtworzyć za pomocą testów in vitro; W związku z tym modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla badania i zrozumienia efektów interwencji terapeutycznej. Jednak większość metod ksenoprzeszczepu guza mózgu nie powoduje przerzutów do mózgu w sposób konsekwentny pod względem ram czasowych i obciążenia guza. Modele przerzutów do mózgu generowane przez dosercowe wstrzyknięcie komórek rakowych mogą powodować niezamierzone obciążenie guzem pozaczaszkowym i prowadzić do zachorowalności i śmiertelności z przerzutami do mózgu. Chociaż wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek rakowych może ograniczyć powstawanie guzów pozaczaszkowych, ma kilka zastrzeżeń, takich jak wstrzyknięte komórki często tworzą pojedynczą masę guza w miejscu wstrzyknięcia, duże zajęcie opon mózgowo-rdzeniowych i uszkodzenie naczyń mózgowych podczas penetracji igły. Protokół ten opisuje mysi model przerzutów do mózgu generowanych przez wstrzyknięcie do tętnicy szyjnej wewnętrznej. Metoda ta powoduje konsekwentne wytwarzanie guzów wewnątrzczaszkowych bez udziału innych narządów, co umożliwia ocenę środków terapeutycznych w przypadku przerzutów do mózgu.

Wprowadzenie

Przerzuty do mózgu stanowią rozpowszechniony nowotwór złośliwy wiążący się z bardzo złym rokowaniem1,2. Standard opieki nad pacjentami z przerzutami do mózgu ma charakter multimodalny i obejmuje neurochirurgię, radioterapię całego mózgu i/lub radiochirurgię stereotaktyczną, w zależności od ogólnego stanu zdrowia pacjenta, obciążenia chorobą poza czaszką oraz liczby i lokalizacji guzów w mózgu3,4. Pacjenci z maksymalnie trzema zmianami wewnątrzczaszkowymi kwalifikują się do resekcji chirurgicznej lub radiochirurgii stereotaktycznej, natomiast w przypadku pacjentów z licznymi zmianami zaleca się radioterapię całego mózgu, aby uniknąć ryzyka infekcji i obrzęków związanych z operacją5. Jednakże radioterapia całego mózgu może powodować uszkodzenia radiowrażliwych struktur mózgu, co przyczynia się do obniżenia jakości życia6.

Terapia systemowa stanowi nieinwazyjną alternatywę i logiczne podejście w leczeniu pacjentów z licznymi zmianami chorobowymi7. Jest ona jednak rzadziej rozważana ze względu na utrwalone przekonanie, że terapie systemowe wykazują niską skuteczność, ponieważ pasywne dostarczanie leków cytotoksycznych via krwiobieg nie pozwala na osiągnięcie stężeń terapeutycznych w mózgu bez ryzyka wystąpienia niebezpiecznej toksyczności8. Paradygmat ten zaczyna ulegać zmianie w związku z niedawnym zatwierdzeniem przez amerykańską Agencję Żywności i Leków (FDA) terapii systemowej (tucatinib w połączeniu z trastuzumabem i kapecytabiną, wskazanej w leczeniu przerzutów do mózgu w przerzutowym raku piersi HER2+)9,10,11,12 oraz aktualizacją wytycznych terapeutycznych, które obejmują rozważenie opcji terapii systemowej u pacjentów z przerzutami do mózgu13,14.

W tym kontekście rozwój w dziedzinie terapii celowanej molekularnie, immunoterapii oraz alternatywnych systemów dostarczania leków, takich jak celowane nanonośniki leków, może potencjalnie pomóc w przezwyciężeniu trudności związanych z leczeniem przerzutów do mózgu15,16,17,18. Ponadto badane są podejścia chemiczne i mechaniczne mające na celu poprawę dostarczania leków via permeabilizację bariery guza mózgu19,20. Aby badać i optymalizować takie podejścia w celu dostosowania ich do zamierzonych celów, kluczowe jest wykorzystanie modeli przedklinicznych, które nie tylko odzwierciedlają złożoną fizjologię przerzutów do mózgu, ale także umożliwiają obiektywną analizę odpowiedzi na lek wewnątrzczaszkowo.

Ogólnie rzecz biorąc, obecne podejścia do modelowania przerzutów do mózgu in vivo obejmują wewnątrzsercowe (lewa komora), dożylne (zazwyczaj w żyłę ogonową), wewnątrzczaszkowe lub wewnątrztętnicze (wspólna tętnica szyjna) wstrzykiwanie komórek nowotworowych u myszy21,22,23,24,25,26,27. Poza strategiami wszczepiania guza, do modelowania nowotworów przydatne są genetycznie modyfikowane modele mysie, w których tworzenie guza jest wyzwalane przez usunięcie genów supresorowych lub aktywację onkogenów. Jednakże zgłoszono jedynie kilka genetycznie modyfikowanych modeli mysich, które prowadzą do powstania guzów wtórnych, a jeszcze mniej takich, które niezawodnie wywołują przerzuty do mózgu28,29,30.

Metody engraftmentu, takie jak wstrzykiwanie wewnątrzsercowe (do lewej komory) i dożylne (zazwyczaj do żyły ogonowej), naśladują systemiczne rozprzestrzenianie się nowotworu. Modele te zazwyczaj prowadzą do powstania zmian w wielu narządach (np. mózgu, płucach, wątrobie, nerkach, śledzionie), w zależności od tego, które łoże kapilarne wychwyci najwięcej komórek nowotworowych podczas ich pierwszego przejścia przez układ krążenia.31Jednakże niespójne tempo engraftmentu w mózgu będzie wymagało użycia większej liczby zwierząt, aby osiągnąć wielkość próby zapewniającą pożądaną moc statystyczną. Liczba komórek nowotworowych, które ostatecznie zagnieździły się w mózgu poprzez Stosowane metody wstrzykiwania wewnątrzsercowego i dożylnego są zróżnicowane. W konsekwencji obciążenie guzami przerzutowymi w mózgu może różnić się między zwierzętami, a różnice w progresji choroby mogą utrudniać standaryzację harmonogramu eksperymentu oraz interpretację wyników. Obciążenie guzami poza czaszką może prowadzić do śmiertelności z przyczyn niezwiązanych z przerzutami do mózgu, co czyni te modele nieprzydatnymi do oceny skuteczności wewnątrzczaszkowej. W celu ograniczenia powstawania ognisk poza czaszką, wykorzystując sztuczne procesy selekcji klonalnej, opracowano linie komórkowe o tropizmie do mózgu, jednak wskaźniki przyjęcia przeszczepów były niespójne, a proces selekcji klonalnej może redukować heterogenność zazwyczaj występującą w guzach ludzkich.32.

Metody przeszczepiania specyficzne dla mózgu, takie jak wstrzykiwanie wewnątrzczaszkowe i wewnątrztętnicze do tętnicy szyjnej, umożliwiają bardziej spójne i wydajne modelowanie przerzutów do mózgu. W metodzie wewnątrzczaszkowej33 komórki nowotworowe są zazwyczaj wstrzykiwane do przedniego płata kory mózgowej, co generuje szybki i powtarzalny wzrost guza przy niskim zaangażowaniu systemowym. Choć procedura jest dobrze tolerowana i charakteryzuje się niską śmiertelnością33, jej wadą jest to, że stanowi ona stosunkowo prymitywne podejście, które szybko wprowadza (zlokalizowany) bolus komórek do mózgu i nie modeluje wczesnej patogenezy przerzutów do mózgu. Igła uszkadza naczynia krwionośne tkanki mózgowej, co następnie wywołuje miejscowy stan zapalny5,34. Z doświadczenia wynika, że istnieje tendencja do cofania się wstrzykiwanego zawiesiny komórek nowotworowych podczas wyciągania igły, co prowadzi do zajęcia opon miękkich. Alternatywnie, metoda wewnątrztętnicza dostarcza komórki do wspólnej tętnicy szyjnej, gdzie mikrokrążenie mózgowe jest pierwszym napotkanym łożem kapilarnym, co modeluje przeżycie w krwiobiegu, ekstrawazację i kolonizację24. Zgodnie z ustaleniami innych autorów25, nasze doświadczenia z tą metodą wykazały, że może ona prowadzić do powstania guzów w obrębie twarzy z powodu niezamierzonego dostarczenia komórek nowotworowych via zewnętrzną tętnicę szyjną do łożysk kapilarnych w tych tkankach (dane niepublikowane). Można zapobiec powstawaniu guzów twarzy poprzez uprzednie podwiązanie zewnętrznej tętnicy szyjnej przed wstrzyknięciem do wspólnej tętnicy szyjnej (Rysunek 1). W dalszej części artykułu metoda ta określana jest jako „wstrzykiwanie do wewnętrznej tętnicy szyjnej”. Z doświadczenia wiadomo, że metoda wstrzykiwania do wewnętrznej tętnicy szyjnej spójnie generuje przerzuty do mózgu przy bardzo niewielu zdarzeniach systemowych i z sukcesem stosowano ją do tworzenia modeli przerzutów do mózgu dla różnych nowotworów pierwotnych (np. czerniaka, raka piersi i raka płuca) (Rysunek 1). Wadami są to, że jest ona trudna technicznie, czasochłonna, inwazyjna i wymaga dokładnej optymalizacji liczby komórek oraz harmonogramu monitorowania. Podsumowując, zarówno metoda wewnątrzczaszkowa, jak i metoda wstrzykiwania do wewnętrznej tętnicy szyjnej pozwalają na stworzenie modeli mysich odpowiednich do oceny wpływu terapeutycznego na przeżywalność związaną z guzami mózgu.

Niniejszy protokół opisuje metodę iniekcji do tętnicy szyjnej wewnętrznej w celu stworzenia mysiego modelu przerzutów do mózgu z niemal całkowitym brakiem zajęcia systemowego, co czyni go odpowiednim do przedklinicznej oceny dystrybucji leków oraz skuteczności eksperymentalnych terapii.

Schemat modelu przerzutów do mózgu u myszy; komórki nowotworowe wstrzykiwane do tętnicy szyjnej; wyniki patomorfologiczne pokazują przerzuty do mózgu czerniaka, raka płuc i piersi.
Rycina 1: Schematyczny opis protokołu wstrzykiwania do wewnętrznej tętnicy szyjnej w celu wywołania przerzutów do mózgu. Wstrzykiwanie do wewnętrznej tętnicy szyjnej wraz z podwiązaniem zewnętrznej tętnicy szyjnej pozwala na wiarygodne wytworzenie modelu przerzutów do mózgu z różnych nowotworów pierwotnych. W tym protokole na tętnicy szyjnej umieszcza się trzy podwiązania (oznaczone na rysunku jako L1-L3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Queensland (UQCCR/186/19) oraz Australijskim Kodeksem Opieki i Wykorzystywania Zwierząt do Celów Naukowych.

1. Przygotowanie komórek rakowych do iniekcji

UWAGA: W tym badaniu użyto linii komórkowej ludzkiego raka piersi, BT-474 (BT474). BT474 hodowano w kompletnej pożywce wzrostowej składającej się z pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% insuliny. Komórki utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w atmosferze powietrznej. Uwierzytelnij linię komórkową za pomocą satelitarnych powtórzeń tandemowych testów35, potwierdź ekspresję białka reporterowego (np. lucyferazy), jeśli występuje, i sprawdź, czy nie ma zakażenia mykoplazmą.

  1. Wysiewaj komórki rakowe BT474 o gęstości wysiewu 2,0 x 106 komórek do kolby T75 przy użyciu 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i kultury (w temperaturze 37 °C z 5% CO2) do 70% -80% zbiegu przed wstrzyknięciem.
  2. W dniu wstrzyknięcia należy wyrzucić pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć monowarstwę komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  3. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego odczynnika do dysocjacji kultur komórkowych (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu oderwania komórek. Po 5 minutach delikatnie postukać w kolbę, aby ułatwić odłączanie komórek.
  4. Dodać 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby ugasić aktywność odczynnika dysocjacyjnego.
  5. Delikatnie zawiesić komórki przez pipetowanie, aby zmniejszyć grudki komórek.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 180 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu, aby zminimalizować zlepianie się komórek.
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Zdekantować supernatant w celu usunięcia pozostałości surowicy/odczynnika dysocjacyjnego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml HBSS.
  10. Umieść sitko o pojemności 100 μm na świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuść przez nie zawiesinę komórek, aby usunąć grudki komórek.
    UWAGA: Zawiesina jednokomórkowa jest niezbędna, aby zminimalizować niedrożność naczyń krwionośnych i ryzyko udaru mózgu po wstrzyknięciu.
  11. Oblicz liczbę żywotnych komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru za pomocą standardowych metod.
  12. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową HBSS do stężenia komórek 2,5 x 106 komórek/ml.
  13. Trzymaj rurkę poziomo na lodzie i delikatnie kołysz rurkę od czasu do czasu, aby zminimalizować zbrylanie. Zawiesina komórek może być przechowywana na lodzie maksymalnie przez 6 godzin
    UWAGA: Bujanie odbywało się ręcznie, ale można to również zrobić za pomocą wytrząsarki przy niskich obrotach.

2. Przygotowanie myszy do zabiegu

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 4-5 tygodniowe samice myszy NOD scid. Wprowadź miękki pokarm regeneracyjny (np. żel dietetyczny, hydrożel, puree z myszy) myszom na 3 dni przed zabiegiem, aby zachęcić do karmienia po zabiegu.

  1. Narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Spryskaj i przetrzyj obszar operacyjny i sprzęt środkiem do dezynfekcji powierzchni, a następnie 70% etanolem.
  2. Umieść matę grzewczą dla zwierząt pod deską chirurgiczną, aby zapobiec hipotermii. Włącz to 30 minut przed zabiegiem. Spryskaj i przetrzyj deskę chirurgiczną środkiem do dezynfekcji powierzchni, a następnie 70% etanolem.
  3. Przygotuj czystą klatkę dla zwierząt i ciepłą poduszkę grzewczą do rekonwalescencji.
  4. Załóż czysty sprzęt ochrony osobistej (fartuch, maska, siatka na włosy i rękawiczki). Utrzymuj sterylność przez cały czas trwania zabiegu, używając czystych rękawic egzaminacyjnych i techniki "tylko końcówki instrumentów".
  5. Znieczulij mysz komorą anestezjologiczną przy użyciu 5% izofluranu o przepływie tlenu 2 l/min, aż mysz straci odruch pedałowania.
  6. Wyjąć zwierzę z komory i umieścić je w stożku nosowym dostarczającym 2% izofluranu przy przepływie tlenu 2 l/min na pozostałą część zabiegu chirurgicznego.
  7. Mysz do dziurkowania uszu do identyfikacji i używania elektrycznych maszynek do strzyżenia do golenia futra w okolicy szyi. Oczyść nadmiar włosów z odsłoniętej skóry za pomocą taśmy.
  8. Zważ mysz, aby obliczyć wymagane dawki leków znieczulających i przeciwbólowych. Buprenorfinę i meloksykam należy podawać odpowiednio w dawkach 50 μg/kg mc. i 1 mg/kg mc. we wstrzyknięciu podskórnym.
  9. Przenieś mysz na ciepłą deskę chirurgiczną i zabezpiecz stożek nosowy taśmą.
  10. Nałóż lubrykant do oczu na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  11. Delikatnie zabezpiecz mysz, najpierw zaczepiając górne zęby siekaczy za pomocą nici przyklejonej do deski chirurgicznej, a następnie przyklejając taśmą przednie i tylne nogi. Ten krok wydłuża ciało i utrzymuje szyję prosto podczas zabiegu.
  12. Wykonaj przedoperacyjne przygotowanie skóry zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przetrzyj szyję miejscowym środkiem antyseptycznym (powidon-jod), aby zmniejszyć obciążenie mikroflorą skóry i usunąć luźne włosy. Oczyść od środka skóry, kierując się na zewnątrz, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu miejsca nacięcia. Powtórz proces, używając 70% etanolu. Wykonaj trzy naprzemienne rundy jodu i etanolu w celu dezynfekcji.
    2. Połóż serwetę chirurgiczną na zwierzęciu. Jest on wycinany i formowany z kawałka sterylnego ręcznika papierowego lub torby autoklawu.
  13. Rozłóż sterylne ręczniki papierowe lub torby autoklawe na narzędzia chirurgiczne.
  14. Sprawdź, czy nie ma odruchu za pomocą "Testu szczypania", aby zapewnić wystarczające znieczulenie przed kontynuowaniem zabiegu.

3. Wewnętrzna iniekcja do tętnicy szyjnej

UWAGA: W tym eksperymencie, kaniula infuzyjna 31 G i konfiguracja strzykawko-sterownika aktywowanego stopą została wykorzystana w celu ułatwienia procedury wstrzykiwania (Rysunek Uzupełniający 1). Ta konfiguracja jest opcjonalna, a użytkownik może użyć strzykawki insulinowej 31 G i pominąć kroki 3.11 i 3.12. Aby przygotować kaniulę infuzyjną, należy pociągnąć i oddzielić część igły od części strzykawkowej igły 31 G za pomocą dwóch par zacisków do szwów. Następnie przymocuj igłę do jednego końca cienkiego rurki infuzyjnej o długości około 10 cm.

  1. Umieść mikroskop preparacyjny nad myszą.
  2. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie 15 mm wzdłuż linii środkowej w okolicy szyi, zaczynając od 5 mm poniżej szczęki do wlotu klatki piersiowej.
  3. Za pomocą dwóch par kleszczy ustawionych pod kątem rozchyl skórę i leżące pod nią gruczoły ślinowe, a następnie zastosuj retraktory, aby tchawica była odsłonięta. Następnym krokiem będzie odsłonięcie pochewki tętnicy szyjnej, która leży równolegle do tchawicy.
  4. Za pomocą dwóch par kleszczy o cienkim kącie pod kątem tępo wypreparuj tkankę mięśniową i tłuszczową przylegającą do tchawicy, aby odsłonić prawą osłonkę tętnicy szyjnej. Pochewka tętnicy szyjnej to włóknista warstwa pokrywająca tętnicę szyjną wspólną, żyłę i nerw błędny, a wiązkę tę można uwidocznić za pomocą jaskrawoczerwonej tętnicy szyjnej wspólnej. W tym badaniu wstrzyknięcie wykonano na prawą tętnicę szyjną.
  5. Oczyść odcinek tętnicy szyjnej wspólnej ogonowej do rozwidlenia tętnicy szyjnej otaczającej powięzi i oddziel go od nerwu błędnego i żył.
  6. Odizoluj i oczyść rozwidlenie tętnicy szyjnej (połączenie, które łączy tętnice szyjne zewnętrzne i wewnętrzne) od otaczających nerwów i powięzi. Umieść cienkie kleszcze pod tętnicą szyjną zewnętrzną i przełóż szew jedwabny (o grubości 5-0) pod tętnicą. Zawiąż węzeł i zaciśnij szew i odetnij nadmiar linii.
    UWAGA: Ta ligatura (L1) zapobiegnie przedostawaniu się wstrzyknięcia przez tętnicę szyjną zewnętrzną.
  7. Umieść cienkie kleszcze pod wspólną tętnicą szyjną i przełóż szew jedwabny (grubość 5-0) pod tętnicą. Zawiązać węzeł i zacisnąć szew w pozycji bliższej do proponowanego miejsca wstrzyknięcia. Odetnij nadmiar szwu, pozostawiając około 10 mm linii.
    UWAGA: Ta druga ligatura (L2) ograniczy przepływ krwi i krwawienie po wstrzyknięciu. Służy również do ustawiania i przytrzymywania tętnicy szyjnej podczas wstrzyknięcia.
  8. Przeciąć i zwilżyć pasek (autoklawowanych) jednorazowych wycieraczek o niskiej zawartości kłaczków (patrz Tabela materiałów) o wymiarach około 10 mm x 5 mm. Złożyć pasek na 4 mm x 5 mm o grubości 2-3 mm i umieścić go pod tętnicą szyjną w proponowanym miejscu wstrzyknięcia. Spowoduje to podparcie naczynia podczas wstrzyknięcia.
  9. Na tętnicy szyjnej wspólnej rostralnej do proponowanego miejsca wstrzyknięcia umieścić trzecie podwiązanie (L3) z luźnym węzłem. Jest on dokręcany dopiero po wstrzyknięciu (w kroku 3.16).
  10. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i pobrać 200 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej (z igłą 31 G).
  11. Załadować strzykawkę do sterownika strzykawki, który jest podłączony do aktywującego pedału nożnego.
  12. Przymocuj cienką kaniulę z igłą 31 G do strzykawki i zalej linię.
  13. Sprawdź, czy tętnica szyjna jest dobrze ustawiona i pod ciśnieniem.
  14. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków kątowych, z których jeden delikatnie napina się na końcu pierwszej ligatury, a drugi trzyma igłę 31 G, powoli włóż igłę skosem do góry w światło naczynia krwionośnego, uważając, aby jej nie przebić.
  15. Powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 1.13) do tętnicy szyjnej wspólnej w stężeniu 10 μl/s. Spowoduje to dostarczenie 2,5 x 105 komórek do naczynia krwionośnego. Udane wstrzyknięcie jest uwidocznione poprzez usunięcie krwi z naczynia krwionośnego tętnicy szyjnej.
  16. Delikatnie podnieść i zacisnąć luźną ligaturę (L3) (od kroku 3.9) natychmiast po wyjęciu igły, aby zapobiec cofaniu się i krwawieniu. Przyciąć nadmiar szwu.
    UWAGA: Normalne jest obserwowanie niewielkiej ilości krwi tryskającej po wyjęciu igły. Nie może jednak wystąpić aktywne krwawienie po zaciśnięciu trzeciej ligatury.
  17. Usuń kawałek zwilżonych, niestrzępiących się jednorazowych wycieraczek.
  18. Za pomocą pipety P200 dwukrotnie przepłukać jamę operacyjną 150-200 μl sterylnej wody lub soli fizjologicznej.
  19. Sprawdź ponownie, czy nie ma krwawienia, a następnie wyjmij zwijacze.
  20. Zmień położenie tkanek miękkich, gruczołów ślinowych i skóry nad tętnicą szyjną i tchawicą.
  21. Zamknij warstwę skóry nacięcia za pomocą uchwytu na igłę do szwów, kleszczyków i wchłanialnego lub niewchłanialnego szwu monofilamentowego 6/0 w ciągły wzór.
  22. Wyrzuć strzykawkę z igłą do kaniuli i przygotuj nową konfigurację dla następnej myszy. Użycie nowej strzykawki zapewni, że liczba komórek wstrzykniętych każdej myszy będzie stała.
    UWAGA: Reprezentatywne migawki procedury znajdują się na rysunku uzupełniającym 2. Jeśli naczynie zostanie przebite lub rozerwane przez igłę, co wskazuje na wyciek wstrzyknięcia lub krwawienie, zabieg uważa się za nieudany. Następnie igłę należy wyjąć, a trzecią ligaturę natychmiast zacisnąć, aby zapobiec dalszemu krwawieniu. Jeśli krwawienie utrzymuje się po zaciśnięciu szwu, zwierzę musi zostać poddane eutanazji za pomocą pentobarbitalu.

4. Odzyskiwanie po wstrzyknięciu

  1. Należy wstrzyknąć buprenorfinę (50 μg/kg) i meloksykam (1 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym jako środek przeciwbólowy po operacji.
  2. Przenieś zwierzę do ciepłej i czystej klatki, aby wyzdrowiało ze znieczulenia. To normalne, że zwierzę po przebudzeniu ma przytłumioną aktywność (skulone i nieaktywne lub poruszające się powoli).
  3. Po 30-45 minutach przenieś myszy do długoterminowego przetrzymywania.
  4. Zapewnij myszom miękką dietę (żel dietetyczny, hydrożel, zacier) przez co najmniej tydzień po operacji i codziennie sprawdzaj stan fizyczny ze szczególną uwagą pod kątem oznak udaru, infekcji, krwawienia wokół miejsca rany.
  5. Dwa dni po operacji typowe jest, że zwierzę ma zmniejszoną aktywność, łagodną potarganą sierść i straciło 15% masy ciała przed operacją. Podawaj leki przeciwbólowe (meloksykam) codziennie przez 2-3 dni po operacji, aby opanować ból i wspomóc powrót do zdrowia.
  6. Od 3 dnia zwierzęta muszą odzyskać aktywność, zwiększyć częstotliwość karmienia i pielęgnacji oraz ponownie przybrać na wadze. Eutanazja zwierząt z utrzymującymi się deficytami kondycji fizycznej (ból, skulenie, brak aktywności, utrata masy ciała) po 4 dniach po operacji poprzez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 200 mg/kg we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
  7. Wszczepienie i progresję guza można monitorować za pomocą znieczulenia i wybranej metody obrazowania, takiej jak obrazowanie bioluminescencyjne, MRI lub PET/MRI. Wymóg i zdolność do wykonania takiego obrazowania będą z natury zależne od indywidualnych celów projektu i obiektu, w którym jest on wykonywany, a także w zależności od rodzaju znacznika reporterowego, użytych linii komórkowych, dostępności odpowiednich urządzeń radiochemicznych i obrazowania jądrowego36,37
    UWAGA: Niektóre zwierzęta mogą nie reagować dobrze i doświadczać udaru pomimo udanego zabiegu. Po zabiegu zwierzęta, które wykazują jakiekolwiek objawy niepokoju neurologicznego (odwracanie głowy i ciągnięcie na bok, krążenie, turlanie się, rzucanie, utrata funkcji motorycznych) muszą zostać natychmiast poddane eutanazji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie wstrzykiwania do tętnicy szyjnej wspólnej z podwiązaniem lub bez podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej
Gdy komórki nowotworowe wstrzykiwano via tętnicę szyjną wspólną bez uprzedniego podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej24, guzy twarzy stwierdzono u 77,8% przeszczepionych myszy (n = 7/9 zwierząt). Przykład guza twarzy przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 3. Metoda opisana w niniejszym protokole zapobiega niezamierzonym przer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przerzuty do mózgu to złożony proces rozprzestrzeniania się komórek rakowych z ich pierwotnego miejsca do mózgu. Dostępne są różne modele zwierzęce, które odzwierciedlają pewne etapy tego wieloetapowego procesu, a projektowanie przedklinicznych badań przerzutów wiąże się z fizjologicznymi i praktycznymi względami41,42. W większości opublikowanych badań nad zastosowaniem nanomedycyny w leczeniu przerzutów do mózgu wykorzystano modele wewnątrzsercowe

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o publikacji pracy.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC), grant numer APP1162560. ML zostało sfinansowane ze stypendium podyplomowego UQ. Serdecznie dziękujemy wszystkim, którzy pomagali w hodowli zwierząt i obrazowaniu in vivo zwierząt. Dziękujemy Royal Brisbane and Women's Hospital za przekazanie porcji cyrkonu do tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 i mikro; m Sitko do komórekCorningCLS431752
30G Igła MicrolanceBD23748
Strzykawka insulinowa 31G Ultra-Fine IIBD326103
Kleszcze kątoweProscitechT67A-SSDrobno spiczaste, kątowe bez ząbkowania, końcówka 18mm, długość 128 mm
Mata
Antybiotyk i środek przeciwgrzybiczyWorki do autoklawu ThermoFisher Scientific15240062
BT-474 (HTB-20) linia komórkowa raka piersiATCCHTB-20
Buprenorfina (TEMGESIC)
Licznik komórek hrabinyThermoFisher ScientificC10227
Diet-76AClearH2O72-07-5022
Mikroskop
Dziurkacz
Maszynki
Kleszcze o cienkim kącieProscitechDEF11063-07Kątowy 45°, Końcówka gładka, Szerokość końcówki: 0,4 mm, Wymiar końcówki: 0,4 x 0,3 mm, długość 9cm
Cienkie rurki do kaniuli, Średnica zewnętrzna rurki (in) 1/32, ID rurki (in) 1/100inCole ParmerEW-06419-00
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher Scientific26140079
Zbilansowany roztwór soli Hanka bez wapnia i magnezuThermoFisher Scientific14170120
HydrogelClearH2O70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Jednorazowe chusteczkiKimberly Clark- KimwipesZ188964
Puree z myszy Meloksykam
(METACAM)
StożekWykonany z rurki do mikrofuge
Lubrykant do oczu PAA (Carbomer 2mg/g)  Bausch and lomb
Roztwór jodu powidonuBetadine2505692
ŚOI (rękawica, maska, fartuch, siatka na włosy)
RetraktoryKent ScientificSURGI-5001
RPMI 1640 MediaThermoFisher Scientific11875093
Szew jedwabny 13mm 5-0, P3, 45cmEthiconJJ-640G
Sterylna sól fizjologicznaThermoFisher ScientificTM4469
Taśma
DeskaDeska do krojenia owinięta w torbę do sterylizacji w autoklawie.
Nożyczki chirurgiczneProscitechT104Wymiary końcówki (dł. x gł.): 38x7mm, długość 115mm
Kleszcz do szwów / Zakrzywione kleszcze BrophyProscitechT113CZakrzywiony, zaokrąglony wąski końcówka 2 mm, z ząbkami, długość 165 mm
Uchwyt na igłę do szwów (uchwyt igły Olsen Hegar)ProscitechTC1322-180długość 190 mm, zacisk zapadkowy
Sterownik strzykawkowy z pedałem nożnym / UMP3 Ultra mikropompaWorld Precision InstrumentsUMP3-3
T75 kolba do hodowli tkankowychThermoFisher Scientific156499
Thread
Trigene II płyn do dezynfekcji powierzchniCeva
Trypan Blue i szkiełka z komorą do liczenia komórekThermoFisher ScientificC10228
TrypLE Express mediumdysocjująceThermoFisher 12605010
grzewcza dla zwierzątpreparacyjnydo uszudo strzyżenia elektrycznego nosowy klejąca chirurgiczna Naukowy

Bibliografia

  1. Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Reports. 14 (1), 48-54 (2012).
  2. Australian Institute of Health and Welfare. Cancer in Australia. , Canberra: AIHW. (2017).
  3. Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
  4. Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
  5. Zimmer, A. S., Van Swearingen, A. E. D., Anders, C. K. HER2-positive breast cancer brain metastasis: A new and exciting landscape. Cancer Reports. 5 (4), (2020).
  6. Brown, P. D., et al. Postoperative stereotactic radiosurgery compared with whole brain radiotherapy for resected metastatic brain disease (NCCTG N107C/CEC·3): a multicentre, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet Oncology. 18 (8), 1049-1060 (2017).
  7. Murrell, J., Board, R. The use of systemic therapies for the treatment of brain metastases in metastatic melanoma: Opportunities and unanswered questions. Cancer Treatment Reviews. 39 (8), 833-838 (2013).
  8. Stemmler, H. J., et al. Ratio of trastuzumab levels in serum and cerebrospinal fluid is altered in HER2-positive breast cancer patients with brain metastases and impairment of blood-brain barrier. Anticancer Drugs. 18 (1), 23-28 (2007).
  9. Venur, V. A., Leone, J. P. Targeted therapies for brain metastases from breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1543(2016).
  10. Murthy, R., et al. Tucatinib with capecitabine and trastuzumab in advanced HER2-positive metastatic breast cancer with and without brain metastases: a non-randomised, open-label, phase 1b study. The Lancet Oncology. 19 (7), 880-888 (2018).
  11. Murthy, R. K., et al. trastuzumab, and capecitabine for HER2-positive metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 382 (7), 597-609 (2019).
  12. Shah, M., et al. FDA approval summary: Tucatinib for the treatment of patients with advanced or metastatic HER2-positive breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (5), 1220-1226 (2021).
  13. Vogelbaum, M. A., et al. Treatment for brain metastases: ASCO-SNO-ASTRO guideline. Journal of Clinical Oncology. 40 (5), 492-516 (2021).
  14. Ramakrishna, N., et al. Management of advanced human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer and brain metastases: ASCO guideline update. Journal of Clinical Oncology. 10, (2022).
  15. Li, J., et al. A multifunctional polymeric nanotheranostic system delivers doxorubicin and imaging agents across the blood-brain barrier targeting brain metastases of breast cancer. ACS Nano. 8 (10), 9925-9940 (2014).
  16. Mittapalli, R. K., et al. Paclitaxel-hyaluronic nanoconjugates prolong overall survival in a preclinical brain metastases of breast cancer model. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (11), 2389-2399 (2013).
  17. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), 991-1001 (2015).
  18. Patil, R., et al. MRI virtual biopsy and treatment of brain metastatic tumors with targeted nanobioconjugates: nanoclinic in the brain. ACS Nano. 9 (5), 5594-5608 (2015).
  19. Brighi, C., et al. MR-guided focused ultrasound increases antibody delivery to non-enhancing high-grade glioma. Neuro-Oncology Advances. 2 (1), (2020).
  20. Inamura, T., Black, K. L. Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14 (5), 862-870 (1994).
  21. Priego, N., et al. Abstract 2746: Stat3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Cancer Research. 79, 2746(2019).
  22. Wyatt, E. A., Davis, M. E. Method of establishing breast cancer brain metastases affects brain uptake and efficacy of targeted, therapeutic nanoparticles. Bioengineering & Translational Medicine. 4 (1), 30-37 (2018).
  23. Nakayama, J., et al. The in vivo selection method in breast cancer metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1886(2021).
  24. Zhang, C., Lowery, F. J., Yu, D. Intracarotid cancer cell injection to produce mouse models of brain metastasis. Journal of Visualized Experiments. 120, 55085(2017).
  25. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).
  26. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  27. Hu, X., Villodre, E. S., Woodward, W. A., Debeb, B. G. Modeling brain metastasis via tail-vein injection of inflammatory breast cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 168, (2021).
  28. Cho, J. H., et al. AKT1 activation promotes development of melanoma metastases. Cell Reports. 13 (5), 898-905 (2015).
  29. Meuwissen, R., et al. Induction of small cell lung cancer by somatic inactivation of both Trp53 and Rb1 in a conditional mouse model. Cancer Cell. 4 (3), 181-189 (2003).
  30. Kato, M., et al. Transgenic mouse model for skin malignant melanoma. Oncogene. 17 (14), 1885-1888 (1998).
  31. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  32. Sulaiman, A., Wang, L. Bridging the divide: preclinical research discrepancies between triple-negative breast cancer cell lines and patient tumors. Oncotarget. 8 (68), 113269-113281 (2017).
  33. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. 91, 52017(2014).
  34. Geisler, J. A., et al. Modeling brain metastases through intracranial injection and magnetic resonance imaging. Journal of Visualized Experiments. 160, (2020).
  35. Reid, Y., Storts, D., Riss, T., Minor, L., et al. in Assay Guidance Manual. eds Markossian, S. et al.) Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  36. Janowicz, P. W., et al. Understanding nanomedicine treatment in an aggressive spontaneous brain cancer model at the stage of early blood brain barrier disruption. Biomaterials. , 283(2022).
  37. Houston, Z. H., et al. Understanding the Uptake of Nanomedicines at Different Stages of Brain Cancer Using a Modular Nanocarrier Platform and Precision Bispecific Antibodies. ACS Cent Sci. 6 (5), 727-738 (2020).
  38. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46, 6387-6392 (1986).
  39. Clemons, T. D., et al. Distinction between active and passive targeting of nanoparticles dictate their overall therapeutic efficacy. Langmuir. 34 (50), 15343-15349 (2018).
  40. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), (2021).
  41. Masmudi-Martín, M., et al. Brain metastasis models: What should we aim to achieve better treatments. Advanced Drug Delivery Reviews. 169 (20), 79-99 (2021).
  42. Carney, C. P., et al. Harnessing nanomedicine for enhanced immunotherapy for breast cancer brain metastases. Drug Delivery and Translational Research. 11 (6), 2344-2370 (2021).
  43. Hamilton, A. M., et al. Nanoparticles coated with the tumor-penetrating peptide iRGD reduce experimental breast cancer metastasis in the brain. Journal of Molecular Medicine. 93 (9), Berlin, Germany. 991-1001 (2015).
  44. Bao, Y., et al. Synergistic chemotherapy for breast cancer and breast cancer brain metastases via paclitaxel-loaded oleanolic acid nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 17 (4), 1343-1351 (2020).
  45. Kotb, S., et al. Gadolinium-based nanoparticles and radiation therapy for multiple brain melanoma metastases: Proof of concept before phase I trial. Theranostics. 6 (3), 418-427 (2016).
  46. Zhang, T., et al. Multitargeted nanoparticles deliver synergistic drugs across the blood-brain barrier to brain metastases of triple negative breast cancer cells and tumor-associated macrophages. Advanced Healthcare Materials. 8 (18), 1900543(2019).
  47. He, C., et al. Blood-brain barrier-penetrating amphiphilic polymer nanoparticles deliver docetaxel for the treatment of brain metastases of triple negative breast cancer. Journal of Controlled Release. 246, 98-109 (2017).
  48. Wang, X., et al. Enhanced anti-brain metastasis from non-small cell lung cancer of osimertinib and doxorubicin co-delivery targeted nanocarrier. International Journal of Nanomedicine. 15, 5491-5501 (2020).
  49. Gries, M., et al. Multiscale selectivity and in vivo biodistribution of NRP-1-targeted theranostic AGuIX nanoparticles for PDT of glioblastoma. International Journal of Nanomedicine. 15, 8739-8758 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model przerzutów do mózguwstrzykiwanie do tętnicy szyjnej wewnętrznejwstrzykiwanie komórek nowotworowychprzerzuty do mózgu myszywewnątrzczaszkowe tworzenie guzadostarczanie leków do mózgumonitorowanie progresji guzaobrazowanie bioluminescencyjnepodwiązanie tętnicy szyjnejhistologia guzów mózgu
Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.