Obecny protokół opracował metodę szacowania wydajności związków na płytce TLC przy użyciu techniki niebieskiego oświetlenia LED. Zaletą tego podejścia jest to, że jest bezpieczne, skuteczne, niedrogie i pozwala badaczowi na jednoczesny pomiar wielu próbek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest dostępną techniką analityczną, która jest szeroko stosowana w badaniach chemii organicznej do ilościowego określania wydajności nieznanych próbek. W ramach niniejszego badania opracowano skuteczną, tanią i bezpieczną metodę szacowania wydajności próbek na płytce TLC przy użyciu oświetlacza z niebieską diodą LED. Lowastatyna wyekstrahowana z Aspergillus terreus była przykładem związku zastosowanego w niniejszym badaniu. Do oceny wydajności lowastatyny wykorzystano modele regresji oparte na standardzie lowastatyny. Porównano trzy metody: test biologiczny, detekcję UV i oświetlenie niebieskimi diodami LED. Wyniki pokazały, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest znacznie bardziej efektywna czasowo niż metody wykrywania UV i testów biologicznych. Dodatkowo, niebieskie oświetlenie LED było stosunkowo bezpieczną opcją ze względu na obawy związane z zagrożeniami biologicznymi w metodzie testu biologicznego (np. infekcja mikrobiologiczna) i ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe w metodzie wykrywania UV. W porównaniu z drogimi metodami wymagającymi specjalistycznych przyrządów i długotrwałego szkolenia przed samodzielną pracą, takimi jak GC, HPLC i HPTLC, użycie oświetlacza z niebieską diodą LED było ekonomiczną opcją do oszacowania wydajności próbek z płytki TLC.
Wprowadzenie
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szeroko stosowana jako technika jakościowa i ilościowa w dziedzinie chemii organicznej1,2,3. Głównymi zaletami TLC jest to, że zapewnia szybkie wykrywanie, elastyczne wymagania dotyczące próbek i nie wymaga specjalistycznego sprzętu4. Do tej pory, mimo że opracowano wiele zaawansowanych podejść, TLC jest nadal główną metodą identyfikacji nieznanych próbek w mieszaninie. Wyzwaniem związanym z tym podejściem jest jednak brak bezpiecznego i niedrogiego sprzętu do ilościowego określania wydajności próbki, zwłaszcza w przypadku rozwijających się laboratoriów o ograniczonych budżetach. Niniejsze badanie miało zatem na celu opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody łączącej TLC w celu oszacowania wydajności próbek.
W przeciwieństwie do wysokowydajnej TLC (HPTLC), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatografii gazowej (GC) z surowymi wymaganiami dotyczącymi próbek, czasochłonnością i zaangażowaniem wieloetapowego przygotowania próbki1,5, TLC wykazało kilka zalet. Po pierwsze, w celu przygotowania próbki, HPLC i GC nie mogą wykryć surowego ekstraktu, ponieważ surowy ekstrakt może zatkać kolumnę HPLC i GC. Po drugie, gdy próbki nie są odpowiednie dla promieniowania UV (ważne dla analizy HPLC) lub mają niską lotność (ważne dla analizy GC), TLC można zastosować do tych próbek, a użycie odczynnika do wizualizacji sprawia, że izolowane próbki są widoczne na cienkich warstwach6,7,8. Po trzecie, w przypadku zwykłych użytkowników, HPLC i GC na ogół wymagają stosunkowo długiego czasu wstępnego szkolenia przed samodzielną pracą w porównaniu z TLC. Ponadto ilościowa analiza TLC, znana jako TLC o wysokiej wydajności (HPTLC), może digitalizować informacje na płytce TLC za pomocą bardzo czułego skanera. Jednak koszt systemu HPTLC jest stosunkowo wysoki. W związku z tym opracowanie opłacalnego i szybkiego podejścia do ilościowego oznaczania próbek na płytce TLC jest ważnym tematem.
Podobne metody zostały opracowane do oznaczania plonów TLC; na przykład, Johnson9 opisała technikę, która pozwala na ilościowe określenie próbek na płytce TLC za pomocą skanera płaskiego podłączonego do komputera. W 2001 roku El-Gindy i in.10 opracowali metodę densytometryczną TLC-, która została wykorzystana do wykrycia związku o gęstości optycznej, a technika ta została również zastosowana przez Elkady et al.11. W 2007 roku Hess2 zaprezentował metodę cyfrowo wzmocnioną TLC (DE-TLC) zastosowaną do wykrywania wydajności związku na płytce TLC za pomocą kamery cyfrowej w połączeniu ze światłem UV. Hess porównał również różnice w kosztach między metodą HPTLC i DE-TLC i doszedł do wniosku, że metoda DE-TLC może być stosowana w laboratoriach szkół średnich i studenckich ze względu na jej przystępny koszt2. Jednak koszt metody densytometrycznej TLC był nadal wysoki, a działanie światła ultrafioletowego wymaga odpowiedniego wcześniejszego przeszkolenia na wypadek, gdyby użytkownicy mogli być narażeni na promieniowanie ultrafioletowe. W związku z tym, zgodnie z TLC, pożądane jest opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody ilościowego określania wydajności próbki.
Niniejsze badanie opisało protokół wykrywania próbki na płytce TLC za pomocą oświetlacza niebieskiej diody LED i opracowało model regresji o wysokiej niezawodności (wysoka wartość R-kwadrat) do pomiaru wymiarów pasm, a następnie określenia wydajności złożonej. Ostatecznie stwierdzono, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest stosunkowo bezpieczna (vs. Metoda wykrywania promieniowania UV), tanie (vs. GC, HPLC i HPTLC) oraz skuteczne (w porównaniu z metodą testu biologicznego) podejście do kwantyfikacji plonów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Obecny protokół jest opisany na przykładzie lowastatyny. Lowastatyna została wyekstrahowana z tygodniowego Aspergillus terreus.
1. Ekstrakcja związków
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ekstrakcji związków, zobacz Rysunek 1.
- Kultura Aspergillus terreus na agarze z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C.
- Suszyć kulturę w temperaturze 40 °C przez 24 godziny. Wysuszoną kulturę przenieść do probówki o pojemności 50 ml za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodać 15 ml octanu etylu.
- Potrząsać mieszaniną energicznie, wirując przez 1 minutę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 40 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
- Sonikować mieszaninę za pomocą kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz (patrz tabela materiałów) w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę.
- Odwirować mieszaninę o stężeniu 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 11 μm.
- Ekstrahować filtrat z równą objętością sterylnej wody w rozdzielaczu.
- Po rozdzieleniu faz zebrać warstwę organiczną, a następnie odparować w wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów). Rozpuścić pozostałość w 2 ml octanu etylu.
2. Oddzielenie surowego ekstraktu przez kolumnę adsorpcyjną fazy normalnej (NP)
- Wypełnij kolumnę żelem krzemionkowym NP jako fazą stacjonarną i użyj n-heksan: octan etylu: kwas trifluorooctowy (H: E: T; 80: 20: 0,1, v / v / v) jako fazę ruchomą.
- Załadować 2 ml ekstraktu (etap 1) do kolumny i dodać rozpuszczalnik fazy ruchomej o natężeniu przepływu 1 ml/min w celu wymycia ekstraktu.
UWAGA: Natężenie przepływu było regulowane ręcznie za pomocą kranu. - Sprawdzić ścieki za pomocą TLC, aby potwierdzić obecność lowastatyny, a następnie odparować w wyparce obrotowej w temperaturze 45 °C, aż rozpuszczalnik zostanie usunięty. Ten krok trwa około 20-25 minut.
- Rozpuścić pozostałość w 1 ml octanu etylu, a następnie wymieszać z równą objętością 1% kwasu trifluorooctowego.
- Odwirować mieszaninę o sile 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać warstwę organiczną do nowej szklanej probówki.
3. Przygotowanie i ładowanie płytek do chromatogramu cienkowarstwowego (TLC)
- Za pomocą pipety kapilarnej nanieść 5 μl próbek i wzorce lowastatyny (patrz tabela materiałów) na linię podstawową płytki do chromatyki do chromatyki do chromatyki TLC, pozostawiając 1 cm obwódkę po bokach płytki do chromatyki TLC.
- Suszyć płytkę TLC w dygestorium przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Umieścić płytkę delikatnie za pomocą kleszczyków w nasyconej szklanej komorze zawierającej rozpuszczalnik fazy ruchomej. Przykryj komorę szklaną pokrywką i pozwól płytce w pełni się rozwinąć.
- Wyjąć płytkę z komory, gdy linia rozpuszczalnika osiągnie 1 cm od górnej krawędzi płytki.
4. Analiza przez oświetlacz niebieskiej diody LED
- Zaznacz linię rozpuszczalnika ołówkiem. Suszyć płytę w dygestoriach przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Po wysuszeniu należy natychmiast namoczyć płytkę w rozpuszczalniku 10%H2SO4, a następnie suszyć w dygestorium przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Umieść talerz na panelu grzewczym, aż pojawią się brązowe plamy. Upewnij się, że płytka nie jest przegrzana, ponieważ może to utrudnić wizualizację lowastatyny.
- Przenieś płytkę do oświetlacza z niebieską diodą LED i zeskanuj za pomocą kompatybilnego darmowego oprogramowania (MiBio Fluo) (patrz Tabela Materiałów).
5. Szacowanie plonów za pomocą modelu regresji
- Zmierz wymiary pasm za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz Tabela materiałów).
- Ustal model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (patrz tabela materiałów) w oparciu o malejące stężenia wzorców lowastatyny, w tym 1 mg/ml, 0,75 mg/ml, 0,5 mg/ml i 0,25 mg/ml.
- Zastosuj model regresji, aby oszacować wydajność próbek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy przedstawiono metodę iluminacji niebieską diodą LED do szacowania wydajności związków; metoda ta została zwalidowana i porównana z metodą bioassay oraz metodami z detekcją UV (Tabela 1). W celu przewidzenia wydajności próbek opracowano modele regresji w oparciu o odpowiednio wymiary prążków oraz stężenia standardów dla trzech metod. Po pierwsze, w wynikach metody bioassay współczynnik R-kwadrat pomiędzy wymiarami strefy inhibicji a standardami lovastatyny wyniósł 0,99, a wydajność prób...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu opisano nowe podejście, oświetlacz z niebieską diodą LED, do ilościowego oznaczania związków bez użycia drogiego i specjalistycznego sprzętu, takiego jak metoda HPTLC, HPLC i GC, a metoda została porównana z testem biologicznym i metodami wykrywanymi w promieniowaniu UV w celu oceny wydajności kwantyfikacji. W rezultacie stwierdzono, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest stosunkowo bezpiecznym i skutecznym protokołem stosowanym do ilościowego określania wydajności docelowych związków na ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amerykański agar bakteriologiczny | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Oświetlacz Blue-LED | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Wirówka | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Kompaktowa lampa | UVP | UVP UVGL-25 | |
| Octan etylu | MACRON | MA-H078-10 | |
| Bibuła filtracyjna 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| standardu lowastatyny | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Rosół z dekstrozy ziemniaczanej H | STBIO MEDIA | ||
| Parownik obrotowy | EYELA | SB-1000 | |
| Kwas siarkowy | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| Żel krzemionkowy TLC 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Kwas trifluorooctowy | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultradźwiękowa maszyna wibracyjna | DELTA | DC600 |
Bibliografia
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
