Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szeroko stosowana jako technika jakościowa i ilościowa w dziedzinie chemii organicznej^1,2,3. Głównymi zaletami TLC jest to, że zapewnia szybkie wykrywanie, elastyczne wymagania dotyczące próbek i nie wymaga specjalistycznego sprzętu⁴. Do tej pory, mimo że opracowano wiele zaawansowanych podejść, TLC jest nadal główną metodą identyfikacji nieznanych próbek w mieszaninie. Wyzwaniem związanym z tym podejściem jest jednak brak bezpiecznego i niedrogiego sprzętu do ilościowego określania wydajności próbki, zwłaszcza w przypadku rozwijających się laboratoriów o ograniczonych budżetach. Niniejsze badanie miało zatem na celu opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody łączącej TLC w celu oszacowania wydajności próbek.

W przeciwieństwie do wysokowydajnej TLC (HPTLC), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatografii gazowej (GC) z surowymi wymaganiami dotyczącymi próbek, czasochłonnością i zaangażowaniem wieloetapowego przygotowania próbki1^,5, TLC wykazało kilka zalet. Po pierwsze, w celu przygotowania próbki, HPLC i GC nie mogą wykryć surowego ekstraktu, ponieważ surowy ekstrakt może zatkać kolumnę HPLC i GC. Po drugie, gdy próbki nie są odpowiednie dla promieniowania UV (ważne dla analizy HPLC) lub mają niską lotność (ważne dla analizy GC), TLC można zastosować do tych próbek, a użycie odczynnika do wizualizacji sprawia, że izolowane próbki są widoczne na cienkich warstwach^6,7,8. Po trzecie, w przypadku zwykłych użytkowników, HPLC i GC na ogół wymagają stosunkowo długiego czasu wstępnego szkolenia przed samodzielną pracą w porównaniu z TLC. Ponadto ilościowa analiza TLC, znana jako TLC o wysokiej wydajności (HPTLC), może digitalizować informacje na płytce TLC za pomocą bardzo czułego skanera. Jednak koszt systemu HPTLC jest stosunkowo wysoki. W związku z tym opracowanie opłacalnego i szybkiego podejścia do ilościowego oznaczania próbek na płytce TLC jest ważnym tematem.

Podobne metody zostały opracowane do oznaczania plonów TLC; na przykład, Johnson⁹ opisała technikę, która pozwala na ilościowe określenie próbek na płytce TLC za pomocą skanera płaskiego podłączonego do komputera. W 2001 roku El-Gindy i in.¹⁰ opracowali metodę densytometryczną TLC-, która została wykorzystana do wykrycia związku o gęstości optycznej, a technika ta została również zastosowana przez Elkady et al.¹¹. W 2007 roku Hess² zaprezentował metodę cyfrowo wzmocnioną TLC (DE-TLC) zastosowaną do wykrywania wydajności związku na płytce TLC za pomocą kamery cyfrowej w połączeniu ze światłem UV. Hess porównał również różnice w kosztach między metodą HPTLC i DE-TLC i doszedł do wniosku, że metoda DE-TLC może być stosowana w laboratoriach szkół średnich i studenckich ze względu na jej przystępny koszt². Jednak koszt metody densytometrycznej TLC był nadal wysoki, a działanie światła ultrafioletowego wymaga odpowiedniego wcześniejszego przeszkolenia na wypadek, gdyby użytkownicy mogli być narażeni na promieniowanie ultrafioletowe. W związku z tym, zgodnie z TLC, pożądane jest opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody ilościowego określania wydajności próbki.

Niniejsze badanie opisało protokół wykrywania próbki na płytce TLC za pomocą oświetlacza niebieskiej diody LED i opracowało model regresji o wysokiej niezawodności (wysoka wartość R-kwadrat) do pomiaru wymiarów pasm, a następnie określenia wydajności złożonej. Ostatecznie stwierdzono, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest stosunkowo bezpieczna (vs. Metoda wykrywania promieniowania UV), tanie (vs. GC, HPLC i HPTLC) oraz skuteczne (w porównaniu z metodą testu biologicznego) podejście do kwantyfikacji plonów.

Obecny protokół jest opisany na przykładzie lowastatyny. Lowastatyna została wyekstrahowana z tygodniowego Aspergillus terreus.

1. Ekstrakcja związków

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ekstrakcji związków, zobacz Rysunek 1.

1. Kultura Aspergillus terreus na agarze z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C.
2. Suszyć kulturę w temperaturze 40 °C przez 24 godziny. Wysuszoną kulturę przenieść do probówki o pojemności 50 ml za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodać 15 ml octanu etylu.
3. Potrząsać mieszaniną energicznie, wirując przez 1 minutę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 40 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
4. Sonikować mieszaninę za pomocą kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz (patrz tabela materiałów) w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę.
5. Odwirować mieszaninę o stężeniu 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 11 μm.
6. Ekstrahować filtrat z równą objętością sterylnej wody w rozdzielaczu.
7. Po rozdzieleniu faz zebrać warstwę organiczną, a następnie odparować w wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów). Rozpuścić pozostałość w 2 ml octanu etylu.

2. Oddzielenie surowego ekstraktu przez kolumnę adsorpcyjną fazy normalnej (NP)

1. Wypełnij kolumnę żelem krzemionkowym NP jako fazą stacjonarną i użyj n-heksan: octan etylu: kwas trifluorooctowy (H: E: T; 80: 20: 0,1, v / v / v) jako fazę ruchomą.
2. Załadować 2 ml ekstraktu (etap 1) do kolumny i dodać rozpuszczalnik fazy ruchomej o natężeniu przepływu 1 ml/min w celu wymycia ekstraktu.
   UWAGA: Natężenie przepływu było regulowane ręcznie za pomocą kranu.
3. Sprawdzić ścieki za pomocą TLC, aby potwierdzić obecność lowastatyny, a następnie odparować w wyparce obrotowej w temperaturze 45 °C, aż rozpuszczalnik zostanie usunięty. Ten krok trwa około 20-25 minut.
4. Rozpuścić pozostałość w 1 ml octanu etylu, a następnie wymieszać z równą objętością 1% kwasu trifluorooctowego.
5. Odwirować mieszaninę o sile 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać warstwę organiczną do nowej szklanej probówki.

3. Przygotowanie i ładowanie płytek do chromatogramu cienkowarstwowego (TLC)

1. Za pomocą pipety kapilarnej nanieść 5 μl próbek i wzorce lowastatyny (patrz tabela materiałów) na linię podstawową płytki do chromatyki do chromatyki do chromatyki TLC, pozostawiając 1 cm obwódkę po bokach płytki do chromatyki TLC.
2. Suszyć płytkę TLC w dygestorium przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Umieścić płytkę delikatnie za pomocą kleszczyków w nasyconej szklanej komorze zawierającej rozpuszczalnik fazy ruchomej. Przykryj komorę szklaną pokrywką i pozwól płytce w pełni się rozwinąć.
4. Wyjąć płytkę z komory, gdy linia rozpuszczalnika osiągnie 1 cm od górnej krawędzi płytki.

4. Analiza przez oświetlacz niebieskiej diody LED

1. Zaznacz linię rozpuszczalnika ołówkiem. Suszyć płytę w dygestoriach przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Po wysuszeniu należy natychmiast namoczyć płytkę w rozpuszczalniku 10%_H2SO4, a następnie suszyć w dygestorium przez 10 min w temperaturze pokojowej.
3. Umieść talerz na panelu grzewczym, aż pojawią się brązowe plamy. Upewnij się, że płytka nie jest przegrzana, ponieważ może to utrudnić wizualizację lowastatyny.
4. Przenieś płytkę do oświetlacza z niebieską diodą LED i zeskanuj za pomocą kompatybilnego darmowego oprogramowania (MiBio Fluo) (patrz Tabela Materiałów).

5. Szacowanie plonów za pomocą modelu regresji

1. Zmierz wymiary pasm za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz Tabela materiałów).
2. Ustal model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (patrz tabela materiałów) w oparciu o malejące stężenia wzorców lowastatyny, w tym 1 mg/ml, 0,75 mg/ml, 0,5 mg/ml i 0,25 mg/ml.
3. Zastosuj model regresji, aby oszacować wydajność próbek.

To badanie przedstawiło metodę niebieskiego oświetlenia LED w celu oszacowania wydajności związków, a metoda ta została zwalidowana i porównana z testami biologicznymi i metodami wykrywanymi w promieniowaniu UV (Tabela 1). Modele regresji zostały opracowane w oparciu o wymiary pasm i stężenie wzorców odpowiednio dla trzech metod, aby przewidzieć wydajność próbek. Po pierwsze, w wynikach metody testu biologicznego kwadrat R między wymiarami strefy inhibicji a wzorcami lowastatyny wynosił 0,99, a wydajność próbki wynosiła 0,56 mg przewidywana przez model regresji (Rysunek 2). Po drugie, w metodzie detekcji UV kwadrat R między wzorcami lowastatyny a wymiarem prążków na płytce TLC wynosił 0,97, a wydajność próbki przewidywana przez model regresji wynosiła 0,53 mg (Rysunek 3). Warto zauważyć, że krawędzie pasma były rozmyte i zaobserwowano pasma o stosunkowo niskiej intensywności sygnału (Rysunek 3A). Po trzecie, w metodzie oświetlenia niebieskimi diodami LED, kwadrat R między wzorcami lowastatyny a wymiarem pasm na płytce TLC wynosił 0,98, a wydajność próbki wynosiła 0,54 mg przewidywana przez model regresji (Rysunek 4). Przewidywany plon przy użyciu oświetlacza z niebieską diodą LED był bliższy metodzie testu biologicznego (ustawionej jako kontrola). Wymiar opaski był proporcjonalny do ilości lowastatyny, a wyraźne pasma uzyskano metodą oświetlenia niebiesko-LED. Ponadto godziny pracy testów biologicznych, metod wykrywania promieniowania UV i oświetlenia niebieskimi diodami LED wynosiły odpowiednio około 24 godzin, 2 godziny i 1 godzinę; (Uwaga: godzina pracy oznacza całkowity czas spędzony na badaniu wydajności lowastatyny).

Rysunek 1: Przebieg działania protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metoda testu biologicznego. (A) Test biologiczny lowastatyny przeciwko Neurospora crassa (inkubowany przez 24 godziny w temperaturze 30 °C). Pod koniec próby, płytki agarowe o średnicy 90 mm zostały sfotografowane w świetle widzialnym. (B) Stężenia sześciu wzorców lowastatyny wynosiły: nr 1 (1 mg / ml), nr 2 (0,75 mg / ml), nr 3 (0,5 mg / ml) i nr 4 (0,25 mg / ml). Próbkę nr 5 rozcieńczono do 0,25× (1:4). Próbkę nr 6 rozcieńczono do 0,5× (1:2). Wymiar strefy inhibicji (mm2) został zmierzony za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Opracowano model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w oparciu o wymiar strefy inhibicji w standardach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Płytka chromatogramu cienkowarstwowego (TLC) wystawiona na działanie światła UV. (A) Azotan n-heksanu:octanu etylu (2:3 v/v) został użyty jako faza ruchoma w analizie TLC, a płytka TLC została wystawiona na działanie światła UV (365 nm) po namoczeniu w wywoływaczu (10% H2SO4). (B) Stężenia sześciu wzorców lowastatyny wynosiły: nr 1 (1 mg / ml), nr 2 (0,75 mg / ml), nr 3 (0,5 mg / ml) i nr 4 (0,25 mg / ml). Próbkę nr 5 rozcieńczono do 0,25× (1:4). Próbkę nr 6 rozcieńczono do 0,5× (1:2). Wymiar strefy inhibicji (mm2) został zmierzony za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Opracowano model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w oparciu o wymiar standardowych pasm lowastatyny na płytce TLC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Płytka chromatogramu cienkowarstwowego (TLC) zeskanowana przez oświetlacz niebieskiej diody LED. (A) Acetat n-heksanu:etylu (2:3 v/v) został użyty jako faza ruchoma w analizie TLC, a płytka TLC została zeskanowana przez oświetlacz niebieskiej diody LED. (B) Stężenia sześciu wzorców lowastatyny wynosiły: nr 1 (1 mg / ml), nr 2 (0,75 mg / ml), nr 3 (0,5 mg / ml) i nr 4 (0,25 mg / ml). Próbkę nr 5 rozcieńczono do 0,25× (1:4). Próbkę nr 6 rozcieńczono do 0,5× (1:2). Wymiar strefy inhibicji (mm2) został zmierzony za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Opracowano model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w oparciu o wymiar standardowych pasm lowastatyny na płytce TLC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie trzech metod wykrywania zastosowanych w tym badaniu.

Tabela 2: Porównanie poprzednich metod i obecnego badania.

Rysunek uzupełniający 1: Płytka chromatogramu cienkowarstwowego (TLC) z ampicyliną została zeskanowana metodą niebieskiego oświetlenia LED. (A) Octan etylu:metanol (9:13 v/v) został użyty jako faza ruchoma w analizie TLC, a płytka TLC została zeskanowana przez oświetlacz niebieskiej diody LED. (B) Stężenie czterech wzorców ampicyliny wynosiło: nr 1 (100 mg/ml), nr 2 (75 mg/ml), nr 3 (50 mg/ml) i nr 4 (25 mg/ml). Wymiary pasm zostały zmierzone za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Model regresji został opracowany przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w oparciu o wymiar standardowych pasm ampicyliny na płytce TLC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Płytka chromatogramu cienkowarstwowego (TLC) z apramycyną skanowana metodą oświetlenia niebieskiej diody LED. (A) Metanol:woda (6:5 v/v) została użyta jako faza ruchoma w analizie TLC, a płytka TLC została zeskanowana przez oświetlacz niebieskiej diody LED. (B) Stężenie czterech wzorców apramycyny wynosiło: nr 1 (50 mg/ml), nr 2 (40 mg/ml), nr 3 (30 mg/ml) i nr 4 (20 mg/ml). Wymiary pasm zostały zmierzone za pomocą oprogramowania do obrazowania. (C) Opracowano model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów w oparciu o wymiar standardowych prążków apramycyny na płytce TLC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.