Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół izolowania wystarczającej ilości pojedynczych niekardiomiocytów o wysokiej żywotności z serca myszy po zawale mięśnia sercowego (MI). Można to wykorzystać do późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej i pierwotnej hodowli komórek.

Streszczenie

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest jedną z najczęstszych chorób sercowo-naczyniowych, z rosnącą śmiertelnością na całym świecie. Niekardiomiocyty stanowią ponad połowę całkowitej populacji komórek serca i przyczyniają się do adaptacyjnej kompensacji uszkodzenia mięśnia sercowego, w tym reakcji zapalnych, naprawy tkanek i tworzenia blizn. Aby zbadać mikrośrodowisko serca po zawale mięśnia sercowego, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) jest szeroko stosowane do identyfikacji różnych typów komórek serca i komunikacji międzykomórkowej. Wśród procedur przygotowania próbki sekwencyjnej scRNA, przygotowanie zawiesiny komórki jest jednym z najbardziej krytycznych etapów, ponieważ żywotność komórki może wpływać na jakość wyników sekwencjonowania scRNA. Dlatego zaprojektowaliśmy eksperymentalny protokół przygotowania zawiesiny komórek niekardiomiocytów z serc myszy po zawale mięśnia sercowego z dodatkowym naciskiem na poprawę żywotności komórek poprzez wybór łagodnych enzymów trawiennych, kontrolowanie czasu trawienia i stosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Na koniec wyizolowaliśmy komórki CD45 ⁺ z zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty uzyskanej za pomocą tego protokołu, a następnie przeprowadziliśmy sekwencję scRNA.

Wprowadzenie

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest jedną z najczęstszych chorób sercowo-naczyniowych, a jego śmiertelność wzrasta na całym świecie¹. Wskaźnik zawału mięśnia sercowego jest spowodowany niedostatecznym dopływem krwi do otaczającego mięśnia sercowego, co może być wynikiem zablokowania tętnicy wieńcowej, które występuje z pęknięciem blaszki miażdżycowej. Chociaż przezskórna interwencja wieńcowa (PCI) zmniejszyła śmiertelność pacjentów z ostrym zawałem serca, wysoka częstość występowania niewydolności serca po zawale serca pozostaje problemem². Kluczową patofizjologią leżącą u podstaw niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego jest kompensacyjna reakcja organizmu na urazy serca, która polega na zastąpieniu martwego mięśnia sercowego niekurczliwymi bliznami zwłóknieniowymi. Te reakcje adaptacyjne w znacznym stopniu opierają się na miejscowym zapaleniu, w którym pośredniczą interakcje między wieloma typami komórek a komórkami tkanki serca, a to zapalenie jest obecnie uważane za potencjalny cel terapeutyczny w celu zmniejszenia powstawania blizn zwłóknieniowych, a tym samym ochrony przed niewydolnością serca po zawale mięśnia sercowego3^,4. Co ciekawe, mikrośrodowisko w miejscu zawału doświadcza zależnej od czasu przemiany w typach i funkcjach komórek naciekających na różnych etapach MI^1,5. Wiele badań wykazało, że niekardiomiocyty (np. komórki odpornościowe, fibroblasty i komórki śródbłonka) odgrywają kluczową rolę w zapaleniu po zawale serca i naprawie tkanek5^,6. W ostatnich latach sekwencjonowanie pojedynczych komórek było szeroko stosowane jako potężne narzędzie do wyjaśniania zaangażowania i funkcji niekardiomiocytów w mikrośrodowisku po zawale mięśnia sercowego^7,8_. Dostarcza to wglądu w patofizjologię urazów i naprawy po zawale mięśnia sercowego oraz rozwój potencjalnych terapii przeciwko niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) to technika używana do szczegółowego badania całych transkryptomów za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS)^7,8,9. Ostatnio rozwój scRNA-Seq zrewolucjonizował dziedzinę badań biomedycznych. W porównaniu z konwencjonalnym sekwencjonowaniem masowym, scRNA-Seq analizuje profile ekspresji genów i niejednorodność transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki^7,8. Technika ta znacząco promuje badania nad patofizjologią komórkową klasy MI9^,10 poprzez identyfikację różnych typów komórek krążących w mikrośrodowisku po zawale mięśnia sercowego i odkrycie interakcji między kardiomiocytami a niekardiomiocytami. Odkrycia te przyczyniają się do odkrycia nowych celów terapeutycznych dla pacjentów po zawale serca (MI WIDE). Ogólnie rzecz biorąc, eksperyment post-MI oparty na scRNA-seq obejmuje trzy główne sekcje: (1) ustanowienie modelu zwierzęcego po zawale mięśnia sercowego; 2) przygotowanie zawiesiny komórek; oraz (3) sekwencjonowanie próbek i analiza danych. Warto zauważyć, że przygotowanie zawiesiny komórkowej jest najbardziej krytycznym krokiem w przygotowaniu eksperymentu scRNA-Seq, ponieważ jakość zawiesiny komórkowej decyduje o dokładności wyników.

Ten protokół ma na celu ekstrakcję zawiesiny komórek niekardiomiocytów z tkanki serca po zawale mięśnia sercowego; co istotne, szczegółowe informacje na temat utrzymania żywotności i rozdzielczości komórek są zawarte. Tymczasem sprzęt używany w tym protokole, taki jak zestawy chirurgiczne dla myszy, respiratory dla gryzoni i wirówki, można znaleźć w większości ośrodków doświadczalnych na zwierzętach i laboratoriów biomedycznych, a zatem koszt eksperymentu tego protokołu jest stosunkowo niski. Ponadto, jeśli weźmie się pod uwagę punkty czasowe i miejsca zawału jako zmienne, protokół ten może być stosowany do symulacji szerokiego zakresu scenariuszy klinicznych, zwłaszcza w przypadku powikłań po zawale mięśnia sercowego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Zhejiang i zostały zatwierdzone przez Komitet Doradczy ds. Zwierząt na Uniwersytecie Zhejiang.

1. Operacja podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (podwiązanie LAD)

UWAGA: Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J zostały użyte jako modele. Serca pobrano 2 tygodnie po zaw. Operację podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem i demonstracją¹¹.

1. Przed zabiegiem należy zdezynfekować narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
2. Zważ mysz, a następnie znieczul mysz wstrzyknięciami dootrzewnowymi 1% pentobarbitalu sodu (50 mg/kg). Obserwuj odruch szczypania palców u nóg i zmierz częstość oddechów, aby ocenić głębokość znieczulenia podczas zabiegu.
3. Umieść mysz na stole operacyjnym z poduszką grzewczą o temperaturze 37 °C. Używaj maści okulistycznej, aby zapobiec odwodnieniu oczu.
4. Spryskaj lewą klatkę piersiową i szyję przedsercową kremem do depilacji, a do usunięcia włosów użyj bawełnianych wacików. Zdezynfekuj skórę jodoforem, a następnie 70% alkoholem, aby trzykrotnie oczyścić obszar.
5. Wykonaj nacięcie szyjki macicy w linii środkowej (0,8-1,0 cm) pod mikroskopem. Oddziel skórę, mięśnie i tkanki otaczające tchawicę, a następnie włóż kaniulę 20 G do tchawicy.
   UWAGA: Podczas wkładania kaniuli do tchawicy pod mikroskopem obserwuj, czy rurka nie jest wprowadzona do przełyku.
6. Podłącz mysz do respiratora dla gryzoni ustawionego na 0.2 ml objętości oddechowej z prędkością 150 uderzeń na minutę.
7. Naciąć klatkę piersiową myszy ukośnie wzdłuż linii środkowej obojczyka sterylnymi nożyczkami. Wypreparuj tkankę podskórną, aby odsłonić żebra.
8. Sterylnymi nożyczkami przeciąć skórę ukośnie wzdłuż lewej linii środkowej obojczyka (0,8-1,0 cm). Wykonaj torakotomię lewą, aby oddzielić trzecie i czwarte żebro, aby odsłonić serce. Użyj zwijacza żeber, aby uzyskać dobrą widoczność.
9. Otwórz osierdzie zakrzywionymi kleszczami, a następnie podwiąż lewą przednią tętnicę zstępującą (poniżej wyrostka lewego przedsionka) za pomocą jedwabnego szwu 7-0. Blada przednia ściana lewej komory wskazuje, że perfuzja mięśnia sercowego została pomyślnie przerwana.
10. Zwolnij retraktor żeber i zszyj nacięcie klatki piersiowej warstwami za pomocą jedwabnego szwu 5-0, jednocześnie usuwając powietrze z klatki piersiowej. Zszyj nacięcie szyi jedwabnym szwem 5-0.
11. Wyjmij rurkę dotchawiczą z myszy po przywróceniu jej spontanicznego oddychania. Dootrzewnowo wstrzyknąć 0,5 ml wstępnie podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej. Buprenorfinę (0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie co 12 godzin, aby zminimalizować ból.
12. Na koniec umieść mysz na poduszce grzewczej, aby poczekać na reanimację. Monitoruj mysz, aby upewnić się, że nie cierpi na nadmierną duszność lub krwotok poprzez obserwację wzrokową.
13. Przywróć mysz do klatki po przebudzeniu. Przez pierwszy tydzień codziennie monitoruj mysz, aby sprawdzić, czy jej mobilność, pielęgnacja i nawyki żywieniowe są odpowiednie. Zgodnie z potrzebami eksperymentu, zbierz serce w różnych punktach czasowych po MI.
    UWAGA: W tym protokole zawiesinę jednokomórkową przygotowano z sercem 2 tygodnie po zawale mięśnia sercowego.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej serca

1. Przygotowanie roztworów i pożywek
   1. Bufor dysocjacji tkanek serca: Wymieszaj 10 mg kolagenazy IV (600 U/ml), 5 mg dyspazy II (0,5 U/ml) i 50 μl DNazy I (100 μg/ml) w 5 ml RPMI 1640. Przed użyciem podgrzej to podłoże do 37 °C w łaźni wodnej.
   2. Bufor do przemywania komórek: Przygotować 1% BSA lub 10% FBS w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, PH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
   3. Roztwór perfuzyjny: Wstępnie schłodzony PBS (PH 7,4) jako roztwór perfuzyjny.
   4. Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC): Użyj buforu do lizy krwinek czerwonych zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z listą odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu.
2. Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (150 mg/kg).
3. Rozwarstwienie serca
   1. Umieść mysz w pozycji leżącej, mocując jej tylne kończyny za pomocą taśmy klejącej.
   2. Spryskaj ciało 70% etanolem, a następnie przetnij pionowo skórę brzucha i mięśnie, unikając przebijania wątroby. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową, unikając przebicia serca.
   3. Użyj wstępnie schłodzonego PBS (PH 7,4) do perfuzji lewej komory, aż do zaobserwowania bezbarwnego płynu perfuzyjnego (potrzebne jest około 15 ml PBS [pH 7,4]).
   4. Delikatnie unieś serce z klatki piersiowej za pomocą kleszczy i odetnij nadmiar tkanki przyczepionej na zewnątrz serca nożyczkami okulistycznymi. Umieść serce w 1 ml wstępnie schłodzonego PBS (PH 7,4) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Dysocjacja enzymatyczna tkanki serca
   1. Przenieś serce myszy do jednego dołka na 24-dołkowej płytce ze 150 μl buforu dysocjacji tkanki sercowej umieszczonego na lodzie i pokrój je na małe kawałki (~1 mm) nożyczkami.
   2. Przenieść zmieloną tkankę serca do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z 5 ml buforu dysocjacji tkanek.
      UWAGA: Zalecana objętość bufora dysocjacji tkanek serca wynosi 5 ml / serce.
   3. Umieścić probówkę wirówkową w elektrycznie termostatyzowanej wytrząsarce posuwisto-zwrotnej z prędkością 125 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Pipetować zawiesinę tkankową w górę i w dół 10 razy co 20 minut.
   4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę i grudki. Dodać 25 ml buforu do płukania komórek, aby przepłukać oryginalną probówkę, a następnie przenieść ją w celu przepłukania sitka komórkowego. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby jeszcze bardziej usunąć grudki komórek.
   5. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową odwirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić próbkę komórkową w 1 buforze do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Dodać czterokrotnie większą objętość buforu do przemywania komórek i odwirowywać przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu do przemywania komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do przemywania komórek.
   9. Zmieszać 18 μl zawiesiny komórek z 2 μl roztworu barwiącego oranżek akrydyny (AO)/jodku propidyny (PI) (9:1) i dodać 10 μl mieszaniny do szkiełka w komorze liczącej. Oceń liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.

Wyniki

Poprzez zastosowanie sekcji 2 niniejszego protokołu uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek o wysokiej żywotności. Niemniej jednak nadal można było zaobserwować fragmenty komórkowe (Rysunek 1A); w związku z tym przeprowadzono fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), aby dodatkowo poprawić jakość preparatu¹⁶. Po sortowaniu FACS średnia wielkość komórki zmniejszyła się z 9,6 µm do 9,1 µm (Tabela 1), co sugeruje, że FACS pozwala na skuteczne zmniejszen...

Dyskusja

Artykuł ten miał na celu opisanie protokołu izolacji pojedynczych niekardiomiocytów z serc myszy po zawale mięśnia sercowego. Protokół może być stosowany do izolowania różnych typów komórek w mikrośrodowisku post-MI z wysoką jakością, w tym komórek odpornościowych, komórek śródbłonka i fibroblastów. Trzy podstawowe czynniki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości zawiesiny komórek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Pierwszym z nich jest ustawienie trawienia enzymatycznego. Ważne jest, aby kontrolowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Barwnik z pomarańczy akrydynowej / jodku propidyny	Logos biosystems	F23001
Zautomatyzowany  Komórka  Licznik	Logos biosystems	L20001
Surowica bydlęca Albumina	Servicebio	G5001	Działanie cytoprotekcyjne
Szkiełka do liczenia komórek	Logos biosystems	L12001
Kolagenaza Typ IV	Gibco	17104019	Enzymy trawienne
Dispase II	Sigma	D4693	Enzymy trawienne
Dnaza I	Roche	11284932001	Zapobiegaj zlepianiu się komórek
Falcon  40μ m Sitko do komórek	Falcon	352340	Usuń grudki komórek
Falcon  70μ m Sitko do komórek	Falcon	352350	Usuń niestrawioną tkankę i grudki
Sortownik komórek przepływowych	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI
Uchwyt na igły	FST	12061-01
Kleszczyki do okulistyki	RWD	F14012-10
Nożyczki okulistyczne	RWD	S11036-08
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Servicebio	G4202-500ML
Bufor do lizy RBC	Beyotime	C3702-120ml	Usuń czerwone krwinki
Zwijacz żeber	FST	17005-04
Respirator dla gryzoni	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent  roztwór enzymu
Sterylne nożyczki	RWD	S14014-10

10054963976859