Artykuł metodologiczny

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64298

⸱

13 stycznia 2023

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Streszczenie

Jelita zwierząt są kolonizowane przez mikroby komensalne, które wpływają na rozwój, zdrowie i zachowanie gospodarza. Precyzyjna kwantyfikacja kolonizacji jest niezbędna do badania złożonych interakcji między gospodarzem a drobnoustrojem, zarówno w celu walidacji składu mikrobiologicznego, jak i zbadania jego skutków. Drosophila melanogaster, która ma niską natywną różnorodność mikrobiologiczną i jest ekonomiczna w hodowli o określonym składzie mikrobiologicznym, pojawiła się jako organizm modelowy do badania mikrobiomu jelitowego. Analiza mikrobiomu pojedynczego organizmu wymaga określenia, które gatunki drobnoustrojów są obecne, i ilościowego określenia ich bezwzględnej liczebności. W artykule przedstawiono metodę analizy dużej liczby mikrobiomów poszczególnych much. Muchy są przygotowywane w 96-dołkowych płytkach, co umożliwia obsługę dużej liczby próbek jednocześnie. Liczebność drobnoustrojów określa się ilościowo, posiewając do 96 homogenatów całych much na jednej płytce agarowej w szeregu miejsc, a następnie zliczając jednostki tworzące kolonie (CFU), które rosną w każdym miejscu. Ten system powlekania jest połączony z automatyczną platformą kwantyfikacji CFU, która obejmuje fotografowanie płytek, różnicowanie kolonii fluorescencyjnych i automatyczne liczenie kolonii za pomocą wtyczki ImageJ. Zaletą jest to, że (i) metoda ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć różnice między zabiegami, (ii) metoda powlekania punktowego jest tak samo dokładna jak tradycyjne metody powlekania oraz (iii) zautomatyzowany proces liczenia jest dokładny i szybszy niż liczenie ręczne. Przedstawiony tutaj przepływ pracy umożliwia wysokoprzepustową kwantyfikację CFU w dużej liczbie powtórzeń i może być stosowany w innych systemach badań mikrobiologicznych, w tym in vitro i innych modelach małych zwierząt.

Wprowadzenie

Związek między mikrobiotą jelitową a ich zwierzęcym gospodarzem jest coraz częściej na pierwszym planie badań biologicznych1, które pokazują, że skład szczepu mikrobiomu jest ważny dla fizjologii gospodarza2,3,4. Tempo odkrywania zostało ograniczone przez czynniki zakłócające, takie jak wysoka naturalna zmienność międzyosobnicza i duża różnorodność kolonizujących bakterii5,6,7. Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, okazała się obiecującym modelem ze względu na naturalnie niski poziom mikrobiomu, łatwość obsługi i solidną genetykę gospodarza8,9,10,11. Muchy mogą być wolne od zarazków i ponownie powiązane ze zdefiniowaną mikrobiotą12, i wykazano, że flora wpływa na cechy fizjologiczne muchy13,14. Flora wrodzona składa się z ograniczonego zestawu bakterii, z których wszystkie są zdolne do hodowli, a ich bliscy krewni są również endogenni dla jelit ssaków, w tym pałeczki kwasu mlekowego, proteobakterie i enterokoki15.

Badanie wpływu mikrobiomu na cechy gospodarza wymaga ilościowego określenia mikrobiomu zarówno pod względem obecnych gatunków, jak i ich bezwzględnej liczebności16. Dominującymi sposobami analizy mikrobiomu muchy są liczba jednostek tworzących kolonie (CFU)17, sekwencjonowanie amplikonów genu 16S rRNA9 oraz qPCR genu 16S rRNA18. Liczbę CFU można uzyskać bez drogich odczynników, które potwierdzają żywotność komórek bakteryjnych19. Techniki 16S, w tym qPCR, mają tę zaletę, że tożsamość taksonomiczną drobnoustrojów można ustalić bez względu na ich wymagania dotyczące wzrostu lub morfologię kolonii20.

W przypadku, gdy eksperymenty wykorzystują muchy o zdefiniowanym mikrobiomie znanych bakterii (muchy gnotobiotyczne), zliczanie CFU ma szczególne zalety w porównaniu z sekwencjonowaniem21. Sekwencjonowanie jest kosztowne, wymaga ekstrakcji DNA, przygotowania biblioteki opartej na PCR i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu uzyskania względnej obfitości22. Ze względu na wysokie koszty, metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zazwyczaj muszą być wykonywane zbiorczo, aby obniżyć cenę za próbkę23. Dalsze metody, takie jak qPCR, są wymagane do uzyskania bezwzględnych obfitości16. W przeciwieństwie do tego, liczenie CFU jest szybkie i tanie i daje bezwzględną liczbę żywotnych komórek. Drosophila8 i inne modele małych mikrobiomów24, w tym robak, Caenorhabditis elegans25,26, oraz larwa danio pręgowanego, Danio rerio, uprawiana gnotobiobiotycznie27, mają ograniczony zakres bakterii, które mają znane cechy wzrostu28. W takich przypadkach, szczególnie w przypadku zwierząt gnotobiotycznych, liczenie CFU może rozróżnić wszystkie gatunki bakterii w wielogatunkowych zbiorowiskach jelitowych21,27,29. Metody liczenia CFU o wyższej przepustowości jeszcze bardziej poprawiłyby opłacalność i szybkość pomiaru składu mikrobiomu i mogłyby być stosowane w wielu innych eksperymentach mikrobiologicznych.

Liczenie CFU poprzez seryjne rozcieńczanie zawiesiny bakteryjnej na pożywce na bazie agaru jest standardową metodą w całej dziedzinie mikrobiologii. Kolonie, które rosną na płytkach, są następnie liczone ręcznie. Rozcieńczenia pozwalają badaczowi wybrać gęstość kolonii, która jest policzalna (np. ~100 CFU na płytkę), co oznacza, że kolonie nie wrastają jedna w drugą i można je policzyć w rozsądnym czasie. Większość mikrobiologów stosuje zasadniczo tę samą metodę liczenia CFU, która została opracowana 140 lat temu w laboratorium Roberta Kocha i w przypadku wielu zastosowań metoda ta jest nadal odpowiednia. Problem pojawia się jednak w przypadku próby ilościowego określenia dużej liczby próbek. Pojedyncza próbka może wymagać posiewu od 1 do 10 seryjnych rozcieńczeń próbki w celu uzyskania policzalnych CFU, więc eksperymenty obejmujące więcej niż kilkadziesiąt próbek stają się męczące. Opracowano różne metody mające na celu zwiększenie efektywności liczenia CFU. Zautomatyzowane powlekanie spiralne eliminuje potrzebę seryjnego rozcieńczania30, dzięki czemu do liczenia CFU potrzebna jest tylko jedna płytka, ale wydłuża się czas na płytki próbki. Wykrywanie rozcieńczenia metodą pojedynczej płytki (SP-SDS) umożliwia oszacowanie CFU na podstawie mniejszej liczby płytek na próbkę31. Metody te stanowią ulepszenie w stosunku do tradycyjnej metody powlekania naprowadzanego, ale nadal wymagają obsługi i posiewu próbek bakteryjnych pojedynczo, a zatem nie są idealne dla dużej przepustowości. Manipulowanie próbkami na płytkach 96-dołkowych i punktowe powlekanie tych 96 próbek na prostokątnych płytkach agarowych znacznie poprawia przepustowość próbek19.

Mikrobiomy zazwyczaj składają się z wielu szczepów i gatunków. Podczas gdy gatunki często można rozróżnić na podstawie morfologii kolonii lub pożywki wzrostowej, fluorescencja może być wykorzystana do dalszego rozróżniania różnych typów bakterii i ich cech wzrostu32. Na przykład różne genotypy tego samego gatunku mogą być znakowane różnymi genetycznie kodowanymi białkami fluorescencyjnymi. Metody obrazowania płytek, które uwzględniają fluorescencję, pozwalają naukowcom wykorzystać te techniki genetyczne w testach opartych na CFU32. Włączenie fluorescencji do wysokoprzepustowych metod liczenia CFU jeszcze bardziej zwiększyłoby ich użyteczność.

Ręczne liczenie CFU staje się kłopotliwe, gdy jest duża liczba próbek. Automatyczne liczenie CFU można przeprowadzić, fotografując płytę i przetwarzając obraz za pomocą specjalistycznego oprogramowania33. Sieuwerts i in. połączyli zwiększoną wydajność powlekania punktowego z automatycznym zliczaniem kolonii przy użyciu konwencjonalnej fotografii cyfrowej i oprogramowania ImageJ19.

Wysokoprzepustowa metoda badania fenotypów określonych związków mikroorganizmów i gospodarzy pomogłaby w badaniach nad gromadzeniem się społeczności mikrobiomu i wpływem na zdrowie i kondycję gospodarza. Do badań nad mikrobiomem Drosophila wysokoprzepustowa platforma mikrobiologiczna obejmowałaby obsługę próbek much w formacie 96-dołkowej płytki, lizę much bez lizy bakteryjnej, skuteczność posiewu punktowego, możliwość stosowania fluorescencji i rozróżniania wielu fluoroforów, kontrolowane środowisko świetlne do odtwarzalnego obrazowania płytek CFU oraz niezawodne oprogramowanie do automatycznego liczenia kolonii. W tym artykule opisano metodę zoptymalizowaną pod kątem oznaczania CFU u muszek gnotobiotycznych, która jest prosta, szybka i zautomatyzowana. Protokół ten przedstawia nowatorski przepływ pracy łączący najlepsze z wcześniej opublikowanych metod i zoptymalizowany pod kątem badania mikrobiomu jelitowego u Drosophila.

Protokół

1. Kolonizacja much

UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia do analizy ilościowej muszek z kulturowym mikrobiomem jelitowym poprzez posiewanie wzrostu CFU. Szczegółowy protokół hodowli much gnotobiotycznych został wcześniej opublikowany12.

  1. Ustanowić stabilną kolonizację przez komensalny gatunek bakterii.
    1. Przygotować świeżą kulturę bakteryjną, osad przez odwirowanie przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS do OD600 1,0. W tym protokole Lactiplantibacillus plantarum (wcześniej znany jako Lactobacillus plantarum) wyhodowano w ciągu nocy do OD600 wynoszącego 2,0.
    2. Odpipetować 100 μl na żywność w fiolce na muchy (patrz tabela materiałów). Rozprowadź równomiernie i pozostaw płyn do wchłonięcia przez 15-30 minut.
    3. Przenieś 20 wolnych od zarazków much do tej fiolki, używając standardowej techniki przewracania fiolki na fiolkę34. Każda mucha zje mniej więcej równą ilość dawki bakteryjnej35. Alternatywnie można dodać jaja wolne od zarazków.
    4. Przenoś muchy do świeżej, sterylnej żywności codziennie przez 3 dni. Zrób to wszystko w komorze bezpieczeństwa biologicznego i użyj sterylnej techniki (Rysunek 1A-1).
  2. Przed pomiarem obciążenia CFU przenieś muchy do fiolki zawierającej sterylną wodę agarową na 4 godziny, aby usunąć przejściowe bakterie z jelit. Fiolki z wodą agarową stanowią źródło wilgoci dla muchy, ale nie stanowią pożywienia dla muchy ani bakterii na powierzchni. Są one przygotowywane w tych samych sterylnych fiolkach na muchy, co w przypadku standardowej żywności, ale zawierają tylko wodę dejonizowaną i 1,5% agaru.

2. Homogenizacja muszek pojedynczo na 96-dołkowej płytce PCR

  1. Przygotuj wcześniej talerze do ubijania koralików.
    1. Wlej szklane koraliki 0,5 μm (patrz Tabela materiałów) na tackę do pomiaru koralików (wydrukowaną w 3D za pomocą dodatkowego pliku kodowania 1 S1-bead-measurer.stl). Rozłóż koraliki na tacy, aby wszystkie dołki były pełne i równe, a następnie zetrzyj nadmiar koralików do stożkowej tuby, aby je odzyskać.
    2. Umieść płytkę PCR z półspódniczką (patrz Tabela materiałów) do góry nogami na tacy miarowej i wyrównaj ją z dołkami, dopasowując ją do wgłębienia na tacy miarowej. Następnie szybko odwróć go, aby przenieść koraliki.
    3. Usuń nadmiar koralików z powierzchni płytki PCR i przykryj ją folią. Sprawdź płytkę PCR, aby upewnić się, że wszystkie studzienki zawierają koraliki. W razie potrzeby użyj miarki do ważenia, aby dodać koraliki do jednego dołka. Jeśli elektryczność statyczna powoduje przywieranie kulek do powierzchni płytki, przetrzyj lub spryskaj tylną część tacki pomiarowej i płytki PCR 70% etanolem.
    4. Przykryj folią aluminiową. W ten sposób można przygotować wiele płytek, a następnie sterylizować w autoklawie i przechowywać do późniejszego wykorzystania. Gdy będzie gotowy do użycia, dodaj 100 μl PBS do każdego dołka za pomocą 96-kanałowego pipetora (patrz Tabela materiałów).
  2. Przed homogenizacją wysterylizuj powierzchniowo muchy skolonizowane przez drobnoustroje (patrz krok 1) 70% etanolem.
    1. Znieczulij muchy 100% CO2 przez 5 s. Przenieś znieczulone muchy z fiolki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą małego lejka (Rysunek 1A-2). W tym badaniu zwykle dodawano 25 much na rurkę.
    2. Natychmiast rozpyl ~1 ml 70% etanolu do probówki, zamknij probówkę i mieszaj przez odwrócenie przez 10 s. Następnie odessaj etanol za pomocą pipety P1000, uważając, aby nie zassać żadnych much. Powtórz jeszcze raz z etanolem, a następnie dwa razy ze sterylnym PBS (Rysunek 1A-3).
  3. Po ostatnim umyciu PBS zamknij rurkę i nakrętką skierowaną w dół postukaj nią kilka razy mocno w ławkę, aby muchy weszły do nasadki.
  4. Otwórz probówkę i wlej muchy do studzienek za pomocą kleszczy (Rysunek 1A-4). Umieść po jednej muchy w każdej studzience (Rysunek 1A-5). Podczas ładowania trzymaj talerz na lodzie, aby muchy były znieczulone.
  5. Uszczelnij płytę za pomocą folii termozgrzewalnej Thermal Bond (patrz Tabela materiałów).
    1. Najpierw usuń wszelkie zabłąkane koraliki, które znajdują się w pobliżu studzienek, ponieważ mogą one spowodować wyciek z uszczelki foliowej. Upewnij się, że matowa strona folii jest skierowana w dół na płycie, a błyszcząca strona do góry w kierunku zgrzewarki. Mocno dociśnij zgrzewarkę (patrz Tabela materiałów) przez 5 sekund (Rysunek 1A-6). Polerowanie za pomocą aplikatora ręcznego (patrz Tabela materiałów), aby zabezpieczyć folię.
      UWAGA: Słabe uszczelnienie jest przyczyną utraty próbki.
  6. Zabezpiecz płytkę w wytrząsarce do płyt. Homogenizuj przez 5 minut (Rysunek 1A-7). Obracaj płytkę stopki przez 30 s w mini-wirówce do płytek (patrz tabela materiałów) na poziomie 350 x g, aby usunąć płyn z folii uszczelniającej.
  7. Usuń folię, trzymając płytkę, aby nie rozpryskiwać kropelek homogenatu muchowego z dołków.

3. Seryjne rozcieńczanie homogenatu muchowego i plamienie na płytkach CFU

  1. Umieść cztery prostokątne płytki do wzrostu agaru MRS (patrz Tabela materiałów) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i zdejmij ich pokrywki. W tym protokole agar MRS został użyty do wzrostu L. plantarum. Pozostaw te płytki do wyschnięcia na co najmniej 10 minut (20 minut, jeśli są świeżo wylane lub schłodzone z przechowywania).
    UWAGA: Jeśli płytki są mokre, kropelki z płytki 96-dołkowej spłyną razem i zrujnują liczenia.
  2. Przygotować trzy płytki rozcieńczające, dodając 100 μl PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej za pomocą pipetora 96-kanałowego. Załaduj stojak z końcówkami P20 do 96-kanałowego pipetora.
  3. Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10, odsysając 11,1 μl homogenatu z płytki próbki przygotowanej w sekcji 2 (Rysunek 1A-8). Pamiętaj, aby rysować od środka studzienek, a nie od dna studzienek, ponieważ homogenat muchy i szklane kulki zatkają pipety. Koraliki toną, a cząstki much unoszą się na wodzie, pozostawiając środkową warstwę w większości przezroczystą.
  4. Dozować 11,1 μl do pierwszej płytki rozcieńczającej, która zawiera już 100 μl sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytowej przez 10 s przy 600 obr./min. Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół przez pięć cykli. Przenieść 11,1 μl z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania dla dwóch następnych płytek rozcieńczających.
  5. Wykonać posiewy seryjne z rozcieńczeniami, jak opisano poniżej.
    1. Wyjmij płytki wzrostowe z szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej płytki, naniec 2 μl z każdej studzienki na płytki agarowe za pomocą pipety 96-dołkowej (Rysunek 1A-9).
      1. Powoli opuść głowicę pipety na płytkę, uważając, aby nie wbić się w agar. Dokładnie sprawdź płytkę i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane; jeśli nie, ręcznie dodaj 2 μl w odpowiednie miejsce. Sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem.
      2. Jeśli plamy biegną razem, wysusz nowy zestaw świeżych płytek agarowych przez dłuższy czas i powtórz plamienie. Jeśli istnieje wiele rodzajów płytek (np. z różnymi podłożami lub z antybiotykami), należy je również wykryć. Dozuje pozostały roztwór z powrotem do płytki rozcieńczającej i przejść do następnego wyższego stężenia.
        UWAGA: W przypadku punktowych rozcieńczeń należy wymieszać następne rozcieńczenie pięć razy, aby upewnić się, że zawartość końcówek pipet została oczyszczona z poprzedniego rozcieńczenia. Płytki rozcieńczające można przechowywać >8 godzin w temperaturze 4 °C bez wpływu na liczbę kolonii35.
  6. Powtórzyć proces powlekania zgodnie z opisem w kroku 3.5 dla pozostałych płytek rozcieńczających, przechodząc od najbardziej rozcieńczonych do najbardziej skoncentrowanych, aż do płytki z oryginalnym homogenatem.
  7. Gdy cały płyn zostanie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i umieść je w inkubatorze (Rysunek 1A-10). Dla Lactiplantibacillus i Acetobacter z Drosophila optymalna temperatura wynosi 30 °C na pożywkach MRS. Inkubuj, aż kolonie osiągną optymalną wielkość: kolonie są wystarczająco duże, aby je wyraźnie zobaczyć, ale nie na tyle duże, aby łączyły się lub przeszkadzały sobie nawzajem we wzroście (patrz reprezentatywne wyniki w celu ilościowego określenia optymalnej wielkości).
    UWAGA: Optymalne warunki wzrostu są zależne od odmiany i muszą być określone empirycznie. Dla Lactiplantibacillus z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 26 h do 30 h na agarze MRS. W przypadku Acetobacter z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 30 h do 48 h na MRS w zależności od szczepu.
  8. Po inkubacji, w razie potrzeby, przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do liczenia.

4. Kwantyfikacja CFU

  1. Określ ilościowo CFU, fotografując płytki, a następnie licząc kolonie za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania, jak opisano poniżej. Jeśli płytki były przechowywane w temperaturze 4 °C, najpierw pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową, aby nie doszło do kondensacji na płytach, która powoduje odblaski.
  2. Uporządkuj płyty w logicznej kolejności i utrzymuj je w tej kolejności podczas fotografowania — ułatwia to nazywanie plików. Ustaw wszystkie płytki tak, aby komórka A1 znajdowała się w lewym górnym rogu wszystkich płyt. Zaleca się oznaczenie narożnika A1 unikalnym identyfikatorem, aby upewnić się, że zdjęcia nie zostaną pomylone. Ułóż każdą serię rozcieńczeń w kolejności.
  3. Zdejmij pokrywę talerza i umieść talerz na stoliku z A1 zorientowanym we właściwym rogu. Dołączone są projekty pudełka na zdjęcia płyt (plik uzupełniający 1, plik uzupełniający 2), który jest zoptymalizowany pod kątem fotografowania tych płyt tacowych i zawiera opcje oświetlenia i filtrów do obrazowania kolonii fluorescencyjnych.
  4. Wyobraź sobie płyty. Użyj aparatu (patrz Tabela materiałów) z ustawieniami ręcznymi, aby uzyskać stały poziom ekspozycji między płytami. Zalecane jest ustawienie długiej ogniskowej, aby zminimalizować zniekształcenia perspektywy. Zrób zdjęcie za pomocą zdalnej migawki, aby zminimalizować rozmycie spowodowane drganiami aparatu.
  5. Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, rodzaj podłoża, współczynnik rozcieńczenia i wszelkie inne istotne szczegóły. Niektóre systemy operacyjne (patrz Spis materiałów) mają przydatną funkcję zmiany nazw wsadowych w Finderze poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy wybranych plików.

5. Automatyczne liczenie kolonii za pomocą zestawu Count-On-It (Plik uzupełniający 3)

  1. Przytnij obrazy za pomocą dostarczonej wtyczki Croptacular (Supplemental Coding File 2) dla ImageJ. Ta wtyczka pomaga podzielić obraz na uporządkowaną tablicę podregionów (np. 8 x 12 dla płytki 96-dołkowej). Podregiony będą liczone indywidualnie.
    UWAGA: Osobna wtyczka do liczenia okrągłych tabliczek o nazwie Circus jest opisana w Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.
    1. Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Wybierz nazwy plików, które odróżniają płyty, ponieważ te nazwy plików stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń. W tym folderze utwórz podfoldery o nazwach "przycięte" i "paragony" .
    2. Uruchom Croptacular i kliknij OK, aby rozpocząć przycinanie.
      UWAGA:Wyświetlane są ustawienia domyślne, które zwykle są wystarczające. W zależności od rozdzielczości obrazu, oświetlenia, rozmiaru plamki itp., pomocne może być dostosowanie parametrów bazowych.
    3. Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nadal nie wygląda na wyprostowany.
    4. Następnie narysuj pole graniczne obszaru, dla którego ma zostać wykonane liczenie. Dostosuj rozmiar i proporcje, aż wszystkie plamki znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.
    5. Upewnij się, że następny obraz automatycznie obraca się pod tym samym kątem, co pierwszy; wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane tak samo. Jeśli to prawda, naciśnij spację, aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio. Siatka również przywołuje tę samą pozycję, co na poprzednim obrazie; W razie potrzeby dostosuj, a następnie naciśnij Spacja.
  2. Wylicz kolonie na płytkach za pomocą dołączonej wtyczki Count-On-It: Gridiron dla ImageJ (Supplemental Coding File 4). Szczegółowe instrukcje dotyczące instalacji i korzystania z wtyczki znajdują się w Pliku Uzupełniającym 3.
    1. Uruchom Count-On-It > Gridiron. Użyj tych samych ustawień siatki, co w przypadku Croptacular. Użytkownicy mogą grupować cały folder, analizować pojedynczy obraz lub zaczynać od bieżącego obrazu.
    2. Ustaw próg na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności pikseli. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Idealnie byłoby, gdyby między wybranymi koloniami była pewna przestrzeń, ale oprogramowanie jest w stanie do pewnego stopnia segmentować plamy. Kliknij OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie", gdy próg jest zadowalający.
    3. Aby sprawdzić wyniki, powiększ i przyjrzyj się dokładniej liczbie kolonii. Kliknięcie przycisku Anuluj spowoduje przerwanie działania wtyczki. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
    4. Na pierwszym obrazie upewnij się, że dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień, na przykład w celu zmiany minimalnego rozmiaru kolonii. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj folderu "paragony" lub utwórz nowy folder.
    5. Po pierwszym obrazie następne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK, aby użyć tych ustawień lub je dostosować. Jeśli zdjęcia są spójne, a ustawienie jest dokładne, kliknij OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie".
      UWAGA: Gdy wszystkie obrazy w partii zostaną ukończone, tabela wyników zostanie automatycznie zapisana w tym samym folderze, co paragony.
    6. Przejrzyj paragony inwentaryzacyjne generowane przez oprogramowanie i ręcznie skoryguj wszelkie błędy liczenia. Wtyczka ImageJ jest statystycznie dokładna, ale zdarzają się błędy. Sprawdzaj paragony, aby badać wartości odstające i identyfikować błędy w liczeniu. Oprogramowanie zapisuje dane CFU jako plik .csv w tym samym folderze, co paragony.
  3. Analizuj dane za pomocą preferowanego przez użytkownika oprogramowania.

Wyniki

Wyznaczanie liczby CFU w setkach pojedynczych much w formacie płytki 96-dołkowej z wykorzystaniem testu kolonizacji
Aby zrozumieć skład mikrobiomów wielu pojedynczych much, zmierzono liczbę CFU zgodnie z załączonym protokołem, co umożliwiło identyfikację obecnych gatunków, określenie odsetka zkolonizowanych much oraz bezwzględnej liczby bakterii w każdej muszce. Przyczyny dużej obserwowanej zmienności składu mikrobiomu między osobnikami są słabo poznane, a kwantyfikacja statystycznego rozkładu kolonizacji może pomóc w badaniu tej zmienności36,37. W celu uzyskania znacznej liczby powtórzeń biologicznych opracowano wysokoprzepustowy schemat kwantyfikacji liczebności drobnoustrojów w wielu pojedynczych muchach z wykorzystaniem zliczania CFU (Rysunek 1A).

Końcowe oznaczanie liczby CFU może być zależne od sposobu postępowania z muchami przed analizą; czynniki te obejmują między innymi sterylizację powierzchni, czas od spożycia bakterii oraz usuwanie bakterii przejściowych z jelita. Po pierwsze, skupiając się na Muszka owocówka komensalne gatunki bakterii L. plantarum (Lp; patrz Lp szczep WF w pracy Obadia i wsp.36), muchom podano dawkę ok. 105 liczba CFU Lp i utrzymywano w grupach po 25 much na fiolkę. Muchy te były utrzymywane w tej samej fiolce przez 3 dni lub codziennie przenoszone (Przenoszone) na świeżą, sterylną pożywkę (Rycina 1B). Muchy, których nie przeniesiono, zostały następnie albo przemyte etanolem w celu usunięcia bakterii powierzchniowych (Przemyte), albo nie zostały przemyte (Nieprzemyte). Przemywanie spowodowało nieistotną statystycznie redukcję zmierzonej całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) (Rycina 1B), co wskazuje, że w tych ściśle kontrolowanych warunkach inokulacji powierzchnia muchy nie zostaje w ciągu 3 dni znacząco skolonizowana przez bakterie. Pozostałe grupy much przenoszono każdego dnia, aby ograniczyć akumulację bakterii namnażających się w pożywce (Transferred); dodatkowo jedną grupę przeniesiono na świeżą pożywkę na 4 h przed pobraniem próbek (Post-Transferred), lub umieszczono je w fiolkach zawierających jedynie sterylny agar z wodą na 4 h (Cleared), aby umożliwić usunięcie przejściowo spożytych drobnoustrojów z jelita. Każdy z tych kroków, mający na celu bardziej rygorystyczny pomiar kolonizacji, doprowadził do statystycznie istotnego zmniejszenia liczby CFU u much, z wyjątkiem przemywania powierzchni w etanolu. Przeniesienie na sterylną pożywkę (Post-Transferred) lub do agaru z wodą (Cleared) na 4 h przed pomiarem wywołało nieodróżnialne efekty, co wskazuje, że przeniesienie do warunków sterylnych na 4 h przed pomiarem redukuje ładunek bakteryjny. Wynik ten jest zgodny z interpretacją, według której niektóre bakterie w jelicie muchy mają charakter przejściowy, podczas gdy inne są związane z nim w sposób bardziej trwały.35Obfitość Lp wynosiły od 1 x 104.3 Jtk/mucha w przejaśnionych muchach do 1 x 104.9 Jednostki tworzące kolonie (CFU) w nieumytych muchach (n = 724 muchy).

Następnie przeprowadzono ten sam test z użyciem Acetobacter indonesiensis (Ai), bakterii gram-ujemnej kolonizującej jelita muchy (Rysunek 1C; zob. szczep Ai SB003 w Obadia et al.36). Podobnie jak w przypadku much skolonizowanych przez Lp, sterylizacja powierzchniowa spowodowała nieistotną redukcję CFUs. Analogicznie, codzienne przenoszenie na sterylne pożywkę znacząco zmniejszyło ładunek bakteryjny, a przeniesienie do warunków sterylnych na 4 h przed homogenizacją spowodowało dalszą redukcję ładunku bakteryjnego. Liczebność Ai wahała się od 1 x 104.7 CFUs/muchę u much oczyszczonych do 1 x 105.0 CFUs u much nieumytych (n = 528 much). Zatem dokładna kwantyfikacja bakterii jelitowych zależy od częstotliwości przenoszenia, w tym od dnia przeniesienia. Usunięcie zewnętrznego ładunku bakteryjnego poprzez mycie w etanolu miało nieistotny wpływ, jednak bardziej znaczące efekty mogą być obserwowane dla różnych szczepów bakterii lub różnych warunków hodowli. Czynniki te powinny być kontrolowane eksperymentalnie.

Przetestowano również potencjalny wpływ metody homogenizacji na liczbę CFU. Muchy homogenizowano za pomocą urządzenia typu bead beater z użyciem szklanych kulek o średnicy 0,5 µm w 100 µL PBS, co mogło obniżyć żywotność komórek bakteryjnych. Najpierw w PBS przygotowano zawiesinę bakterii Lp z hodowli, a następnie wysiano ją na pożywkę w celu policzenia CFU jako kontrolę pozytywną. Tę samą hodowlę umieszczono w płytce do urządzenia bead beater i (i) homogenizowano z kuleczkami, (ii) homogenizowano z kuleczkami i wolną od drobnoustrojów muchą lub (iii) homogenizowano w PBS bez kuleczek (Rysunek 1D). Homogenizacja z kuleczkami w obecności muchy nie miała istotnego wpływu na liczbę żywych komórek w roztworze, natomiast homogenizacja bakterii w nieobecności muchy spowodowała śmierć znacznej liczby komórek bakteryjnych. Homogenizacja w PBS bez kuleczek również znacząco zmniejszyła liczbę żywych komórek. Podobnie żywotność Ai została zachowana podczas homogenizacji w obecności muchy, podczas gdy homogenizacja bez muchy zmniejszyła liczbę żywych komórek w roztworze (Rysunek 1E). Wyniki te wskazują, że tkanka muchy chroni bakterie przed zniszczeniem przez kuleczki podczas homogenizacji. Jednak eksperymenty przedstawione na Rysunku 1D i Rysunku 1E przeprowadzono przy użyciu ponad 108 CFU na dołek. W praktyce stwierdzono, że w dołkach zawierających ~106 komórek lub mniej strata komórek była niewielka przy użyciu kuleczek bez obecności muchy. Chłodzenie płytki na lodzie w połowie procesu homogenizacji w bead beaterze również poprawia żywotność komórek. Znaczenie tych wyników polega na tym, że czytelnicy powinni mieć świadomość tych potencjalnych problemów i zaprojektować odpowiednie kontrole dla ich konkretnego przypadku użycia.

Dokładność metody spot plating na płytkach 96-dołkowych w wysokoprzepustowej kwantyfikacji CFU
Ponieważ celem jest pomiar liczby CFU dla setek lub tysięcy pojedynczych much, tradycyjne metody wysiewu przez rozcieranie są zbyt czasochłonne i wymagają zbyt dużego nakładu materiałów. Spot plating jest skuteczną i wydajną metodą hodowli i liczenia CFU19,31. Metoda spot plating wykorzystuje 96-kanałowy pipetor do naniesienia 2 µL zawiesiny bakteryjnej na podłoża przygotowane w prostokątnych płytkach do hodowli (Rycina 2A). Każda plamka reprezentuje ładunek bakteryjny pojedynczej próbki, dzięki czemu na jednej płytce można przeanalizować 96 much (Rycina 2B). Dokładność spot platingu porównano z tradycyjnym wysiewem poprzez inokulację płytek wzrostowych przy użyciu dokładnie tej samej zawiesiny Lp o OD 0,0001 dla obu metod. Zawiesinę poddano pięciokrotnym dwukrotnym rozcieńczeniom seryjnym w PBS. W bezpośrednim porównaniu 50 µL inokulum rozcierano na poszczególnych okrągłych płytkach lub naniesiono plamki o objętości 2 µL na prostokątne płytki MRS. Następnie płytki inkubowano w temperaturze 30 °C do momentu, aż kolonie stały się możliwe do policzenia. Wynikowe liczby CFU dla każdego rozcieńczenia wykorzystano do obliczenia pierwotnego stężenia zawiesiny i porównania wyników (Rycina 2C). Jako kontrolę liczono okrągłe płytki z 50–500 CFU. Nie zaobserwowano istotnych różnic między wysokoprzepustową metodą spot plating a tradycyjnym wysiewem na okrągłe płytki.

Ponieważ gęstość kolonii może wpływać na ich wzrost i kwantyfikację, zbadano wpływ gęstości CFU na końcowe zliczenia. Plamki zawierające od 2 do 25 kolonii nie wykazały różnic w końcowej liczbie w porównaniu z tradycyjną metodą na okrągłych płytkach (Rycina 2C). Plamki ze średnią liczbą 35 kolonii dawały wyniki nieco niższe niż kontrolne płytki z wysiewem powierzchniowym (Rycina 2C; p = 0.0017). Szczegółowa analiza zdjęć poszczególnych plamek wykazała, że odchylenie to wynikało z nakładania się kolonii w gęstych plamkach. Pomiary oparte na plamkach ze średnią liczbą 11 kolonii na plamkę dały stężenia najbliższe tym uzyskanym metodą wysiewu powierzchniowego (Rycina 2C; wysiewy powierzchniowe: średnia = 1 x 104.4 CFU; SD = 0.086 vs. plamki ze średnio 11 koloniami: średnia = 1 x 104.4 CFU; SD = 0.12, p = 0.42, test t Welcha).

Generowanie wysokiej jakości obrazów do kwantyfikacji przy użyciu specjalistycznej platformy fotograficznej z wykorzystaniem światła białego lub fluorescencji
Wysokoprzepustowe wysiewanie kropelkowe naturalnie generuje dużą liczbę obszarów docelowych, które muszą zostać dokładnie policzone. Wysokiej jakości fotografie mogą służyć do dokumentowania danych i ułatwiać liczenie CFU. Przy użyciu dostępnych komercyjnie materiałów opracowano solidną i prostą platformę fotograficzną (Rycina 3A). Aparat cyfrowy przymocowano do wspornika na górze specjalnie skonstruowanej obudowy świetlnej, nazwanej FluoroBox; aparat był skierowany bezpośrednio w dół, prostopadle do centrum płytki. Opcjonalnie, za pomocą suwaka filtra, przed obiektywem umieszczono kolorowy filtr emisyjny. Osłona świetlna zapobiegała odblaskom soczewki, blokując bezpośrednie światło z pasków LED znajdujących się poniżej. Paski LED oświetlały płytkę z boków, a nie z góry, aby uniknąć odblasków na powierzchni płytki. Oprócz światła białego zastosowano jednobarwne niebieskie i zielone diody LED w celu wzbudzenia odpowiednio zielonych i czerwonych białek fluorescencyjnych. Płytkę utrzymywano w miejscu za pomocą uchwytu na płytki w szufladzie, która była wyposażona w prowadnice, co ułatwiało wkładanie płytki. Kompletne projekty są dostępne w Pliku uzupełniającym 1 oraz Pliku uzupełniającym 2.

Wykonano zdjęcie płytki z koloniami Lp przy użyciu białych diod LED i kamery cyfrowej, aby wspomóc liczenie kolonii oraz rozróżnienie różnych kolorów i morfologii (Rycina 3B). Aby potwierdzić jednorodność natężenia oświetlenia, zmierzono natężenie tła agaru w różnych obszarach fotografii płytki (Rycina 3C). Aby wykazać, że kolonie można wyraźnie odróżnić od tła, zmierzono natężenie wzdłuż średnicy 10 różnych kolonii w różnych częściach płytki; stwierdzono, że było ono około ~300% wyższe niż tło (Rycina 3C). Płytkę zaszczepiono Lp z plazmidem wykazującym ekspresję fluorescencyjnego białka mCherry, a także niektórymi Lp, które nie zawierały plazmidu, w związku z czym kolonie były albo mCherry-dodatnie, albo mCherry-ujemne. Aby rozróżnić te dwa typy kolonii, płytkę sfotografowano tą samą kamerą przy użyciu zielonego światła LED (515-525 nm) i czerwonego filtra (Tiffen #29), co spowodowało fluorescencję kolonii mCherry-dodatnich (Rycina 3D). Różnicę w natężeniu między mCherry-dodatnimi a mCherry-ujemnymi określono ilościowo, mierząc natężenie w próbie kolonii (n = 10 kolonii). Kolonie mCherry-dodatnie wykazały natężenie o ~1 000% wyższe niż kolonie mCherry-ujemne (Rycina 3E). Kolonie Ai wykazujące ekspresję GFP oraz kolonie Ai bez fluorescencji sfotografowano przy użyciu niebieskich diod LED (465-475 nm) i zielonego filtra (Tiffen #58) (Rycina 3F). Kolonie GFP-dodatnie wykazały natężenie o 200% wyższe niż kolonie GFP-ujemne (Rycina 3G).

Zautomatyzowane liczenie CFU na płytkach w metodzie kropelkowej przy użyciu niestandardowej wtyczki do programu ImageJ o nazwie Count-On-It
Same fotografie ułatwiają liczenie kolonii (np. poprzez przechowywanie danych, udostępnianie danych, powiększanie, nanoszenie nakładek, separację kolorów itp.). Jednak manualne liczenie i organizowanie wyników z setek kropelek może być żmudne, czasochłonne i podatne na różnice między badaczami w końcowych obliczeniach. Aby przyspieszyć proces liczenia i ustandaryzować powtarzalność wyników, opracowano specjalistyczną wtyczkę do programu ImageJ o nazwie Count-On-It (Rycina 4A). Wtyczka ta umożliwia dokładne, półautomatyczne liczenie CFU na płytkach agarowych. Użytkownik przygotowuje obrazy do liczenia, najpierw je przycinając i prostując za pomocą dodatkowej wtyczki Croptacular. Zdjęcia mogą być opcjonalnie przetwarzane wsadowo, a próg (threshold) może być dostosowany dla każdej płytki. Kilka innych opcji pozwala użytkownikowi zwiększyć dokładność liczenia płytek, w tym regulację długości fal świetlnych (obrazy RGB), ustawienie zakresu wielkości kolonii (w pikselach), zmianę maksymalnego współczynnika proporcji oraz dostosowanie wymiarów aktywnej siatki zaznaczeń. Count-On-It generuje tabelę wyników, w której każda płytka jest reprezentowana jako kolumna z liczbą CFU. Tworzy również potwierdzenie fotograficzne z naniesioną nakładką, aby wizualnie udokumentować wyniki liczenia i pomóc w manualnej korekcie błędów (Rycina 4B). Choć błędy się zdarzają, gdy porównano liczbę kolonii policzonych manualnie z liczbą kolonii policzonych przy użyciu tej wtyczki (Rycina 4C), zależność ta była zazwyczaj równoważna, a regresja liniowa między liczeniem manualnym a zautomatyzowanym wykazała nachylenie 0,95 przy dokładności powyżej 90% (R2 = 0,93), choć błąd wzrastał, gdy liczba kolonii przekroczyła 20.

Count-On-It można również wykorzystać do oddzielnego zliczania kolonii fluorescencyjnych dzięki funkcji fluorescencji w urządzeniu FluoroBox. Liczba kolonii mCherry-dodatnich (Rycina 4D) przy użyciu wtyczki oprogramowania w porównaniu z metodą ręczną wykazały R2 wynoszącej 0,92 (Rysunek 4E). Podobnie kolonie GFP-dodatnie (Rysunek 4F) policzone za pomocą wtyczki programowej w porównaniu z liczeniem ręcznym wykazały współczynnik R2 wynoszącej 0,90 (Rycina 4G). W obrębie pojedynczej próbki można odróżnić kolonie fluorescencyjne od niefluorescencyjnych, a wielkość i kształt kolonii mogą dodatkowo służyć do rozróżnienia poszczególnych subpopulacji (Rycina 4H-K). Zdjęcia potwierdzające stanowią zapis, który pozwala użytkownikowi na szybkie sprawdzenie dokładności obliczeń i ręczne poprawienie błędów. W Rysunek 4C,E,G,I,Kzdjęcia paragonów nie zostały wykorzystane do poprawy dokładności zliczania, aby czytelnicy mogli zapoznać się z surowym wynikiem metody. Przypadki takie jak w Rycina 4G, w przypadku którego ręczne przeliczenie dało wynik 1, a automatyczne 21, można szybko wykryć, korzystając z potwierdzeń fotograficznych. W tym przypadku odblask na krawędzi płytki utworzył plamy, które zostały policzone jako kolonie. Dla każdego przypadku użycia należy określić optymalne ustawienia wtyczki oprogramowania przed przystąpieniem do liczenia wysokoprzepustowego.

Eksperyment z mikrobiomem muszek; schemat przedstawia homogenizację, rozcieńczanie i inkubację; wyniki: liczba CFU.
Rysunek 1: Test kolonizacji mierzy CFU u setek poszczególnych muszek z wykorzystaniem formatu płytki 96-dołkowej. (A) Graficzny przegląd testu kolonizacji i wysokoprzepustowej metody ilościowej opisanej w sekcji protokołu. (B) Obfitość Lactiplantibacillus plantarum (Lp) u muszek po teście kolonizacji mierzona w różnych warunkach przy użyciu wysokoprzepustowej metody ilościowej CFU. Muszki były przetrzymywane w tej samej fiolce przez 3 dni, a następnie homogenizowane i wysiewane (Unwashed), płukane w etanolu przed wysiewaniem (Washed), codziennie płukane i przenoszone (Transferred), codziennie przenoszone, a następnie przetrzymywane na sterylnym pożywce przed wysiewaniem (Post-Transferred) lub przetrzymywane w fiolkach z samą wodą przez 4 h (Cleared) (łącznie n = 724 muszek, 3 powtórzenia biologiczne i ok. 72 muszek na każdą grupę). (C) Ten sam test co w (B) przeprowadzono z użyciem Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 muszek). (D) Zawiesinę bakteryjną Lp przygotowano w PBS, a następnie wysiewano w celu policzenia CFU, lub najpierw homogenizowano metodą bead-beating, homogenizowano w połączeniu z muszką wolną od mikroorganizmów (GF) lub wstrząsano w homogenizatorze kulkowym bez kulek i bez muszki (n = 236 dołków z próbkami). (E) Żywotność Ai po homogenizacji testowano w ten sam sposób, co w (D) (n = 282 dołków z próbkami). Istotność statystyczną dla paneli (B-E) obliczono za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie parzystych testów suma rang Wilcoxona z korektą Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. Prostokąt reprezentuje rozstęp międzykwartylowy. Linia wskazuje medianę. Wąsy wskazują całkowity zakres. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ilościowe oznaczenie kolonii: konfiguracja robotyczna, szalka Petri z koloniami, wykres statystyczny wyników CFU/ml.
Rycina 2: Dokładność metody spot-plating na płytkach 96-dołkowych w wysokoprzepustowym ilościowym oznaczaniu CFU. (A) Metoda spot-plating z wykorzystaniem pipetora 96-kanałowego do naniesienia 2 µL na podłoża przygotowane w prostokątnych płytkach-tackach. (B) Płytka z agarem MRS z 96 plamkami kolonii Lp. (C) Stężenie zawiesiny Lp na podstawie liczby CFU z tradycyjnych okrągłych szalek (n = 24 płytki) w porównaniu do stężenia na podstawie liczby CFU z płytek spot-plating (n = 680 plamek) po rozcieńczeniach seryjnych i ułożeniu według średniej liczby kolonii na plamkę (policzono ok. 48 plamek dla każdego pojedynczego czynnika rozcieńczenia dla trzech powtórnych płytek). Każdy punkt danych reprezentuje dokładną liczbę kolonii na plamkę, natomiast każda kolumna reprezentuje średnią liczbę kolonii dla danego rozcieńczenia. Pozioma kropkowana linia wskazuje obliczoną liczbę CFU w hodowli, która została naniesiona na podłoże. Punkty z zielonym obrysem wyróżniają wyniki z tradycyjnych okrągłych szalek. Czerwone wypełnione punkty wyróżniają optymalną gęstość kolonii wynoszącą 11 CFU na plamkę 2 µL. Istotność statystyczną obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), porównując średnią każdej kolumny ze średnią kolumny kontrolnej dla metody siewu przelewowego z zastosowaniem poprawki Bonferroniego dla porównań wielokrotnych. Pole opisuje rozstęp międzykwartylny. Linia oznacza medianę. Wąsy wskazują całkowity zakres. **p < 0.01. ns = brak istotności statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu mikroskopii fluorescencyjnej i wykresy intensywności kolonii dla analizy ekspresji białek.
Rysunek 3: Platforma fotograficzna umożliwia uzyskiwanie mierzalnych obrazów płytek przy użyciu światła białego lub fluorescencji. (A) Przegląd konstrukcji FluoroBox. (B) Zdjęcie płytki z nakropionymi koloniami Lp wykonane w świetle białym. (C) Profil intensywności pojedynczych kolonii w świetle białym w porównaniu do intensywności tła (BKG) (n = 10 kolonii, linia przerywana oznacza odchylenie standardowe). (D) Zdjęcie tej samej płytki z nakropionymi koloniami co w (B), wykonane przy użyciu jednobarwnego zielonego światła i filtra czerwonego w celu wyselekcjonowania kolonii Lp pozytywnych pod kątem mCherry. (E) Profil intensywności pojedynczych kolonii ilustrujący różnicę między koloniami z emisją mCherry a koloniami bez tej emisji. (F) Zdjęcie płytki z nakropionymi koloniami Ai, z których niektóre posiadają znacznik GFP. (G) Profil intensywności pojedynczych kolonii ilustrujący różnicę między koloniami GFP-ujemnymi a GFP-dodatnimi. E, F, G: n = 10 kolonii dla każdego wykresu. Średnice kolonii wynoszą około 1,5 mm. Linia przerywana to SD. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Liczenie kolonii; analiza zautomatyzowana vs. ręczne liczenie; wyniki na wykresie; konfiguracja wysokoprzepustowa.
Rysunek 4: Precyzyjne liczenie płytek typu spot za pomocą wtyczki Count-On-It do programu ImageJ. (A) Zrzut ekranu okna konfiguracji wtyczki. (B) Wtyczka generuje potwierdzenie w celu dokumentacji liczenia i ułatwienia korekty błędów. Wstawka: Nałożona warstwa z liczbą policzonych kolonii dla każdego regionu typu spot; żółta obramówka wskazuje, że policzono pojedynczą kolonię, a czerwona, że policzono wiele kolonii. (C) Wykres przedstawiający liczbę kolonii policzonych ręcznie w porównaniu z liczbą kolonii policzonych za pomocą wtyczki (automatycznie) przy użyciu obrazu w białym świetle, gdzie każdy punkt na wykresie reprezentuje pojedynczy spot policzony ręcznie lub automatycznie (nachylenie dopasowania = 0.95, linia cyjanowa; linia 1:1 jest czerwoną linią przerywaną; R2 = 0.93, współczynnik korelacji Pearsona, p < 0.0001). (D) Obraz potwierdzenia z wtyczki, gdy kolonie mCherry-dodatnie zostały wybrane przy użyciu funkcji fluorescencji urządzenia photo box. (E) Wykres przedstawiający liczbę kolonii mCherry-dodatnich policzonych metodą ręczną w porównaniu z metodą zautomatyzowaną przy użyciu czerwonej fluorescencji (nachylenie dopasowania = 1.1, linia cyjanowa; linia 1:1 jest czerwoną linią przerywaną; R2 = 0.92, współczynnik korelacji Pearsona, p < 0.0001). Uwaga, że wartości odstające i błędy nie zostały skorygowane przy użyciu potwierdzeń analizy dla E,G,I,K. (F) Obraz potwierdzenia z wtyczki, gdy kolonie GFP-dodatnie zostały wybrane przy użyciu funkcji zielonej fluorescencji urządzenia photo box oraz wybranym kanale zielonym we wtyczce. (G) Wykres przedstawiający liczbę kolonii GFP-dodatnich policzonych metodą ręczną w porównaniu z metodą zautomatyzowaną przy użyciu zielonego oświetlenia fluorescencyjnego (nachylenie dopasowania = 1.1, linia cyjanowa; linia 1:1 jest czerwoną linią przerywaną; R2 = 0.90, współczynnik korelacji Pearsona, p < 0.0001). (H) Kolonie mCherry-dodatnie wybrane z mieszanych morfologii kolonii przy użyciu wysokiego progu fluorescencji we wtyczce. (I) Wykres przedstawiający liczbę kolonii mCherry-dodatnich policzonych metodą ręczną w porównaniu z metodą zautomatyzowaną przy użyciu czerwonego oświetlenia fluorescencyjnego (nachylenie dopasowania = 0.99; R2 = 0.91, współczynnik korelacji Pearsona, p < 0.0001). (J) Kolonie mCherry-ujemne wybrane z mieszanych morfologii kolonii przy użyciu niskiego progu fluorescencji. (K) Wykres przedstawiający liczbę kolonii mCherry-ujemnych policzonych metodą ręczną w porównaniu z metodą zautomatyzowaną, gdy próg intensywności został ustawiony w celu wybrania kolonii niefluorescencyjnych (nachylenie dopasowania = 1.1; R2 = 0.85, współczynnik korelacji Pearsona, p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Instrukcje montażu FluoroBox.Plik ten prowadzi czytelnika krok po kroku przez proces budowy skrzynki z kontrolowanym oświetleniem wykorzystanej w filmie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Akrylowy wycinek laserowy FluoroBox.Plik ten zawiera szablon do wycinania laserowego elementów akrylowych do pudła z kontrolowanym oświetleniem. Plik można przesłać do dostawcy usług cięcia akrylu laserem. Patrz Tabela materiałów w celu znalezienia dostawcy wykorzystanego w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Instrukcje do oprogramowania. Plik ten przeprowadza czytelnika krok po kroku przez proces instalacji i użytkowania oprogramowania Croptacular oraz Count-On-It dostarczonego wraz z niniejszym protokołem. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu 1: Kod do druku 3D tacki do pomiaru kulek (S1-bead-measurer.stl). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem 2: Wtyczka ImageJ do wycinania zdjęć płyt prostokątnych (Croptacular_.ijm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem 3: Wtyczka do wycinania zdjęć z płytek okrągłych (Circus_.ijm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem 4: Wtyczka do liczenia 96 plamek na płytce prostokątnej (Gridiron_.ijm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawione tutaj szczegółowe techniki umożliwiają >100-krotne zwiększenie liczby próbek, które można ocenić w eksperymencie zliczania CFU. Technika ta rozwija istniejące metody eksperymentów mikrobiomowych u Drosophila 12,35,36 poprzez wykorzystanie formatu 96-dołkowej płytki do oznaczania pojedynczych muszek. Ponadto stosuje bardziej wydajną metodę powlekania punktowego 19,31 oraz zautomatyzowany przepływ pracy z platformą fotograficzną i zliczania kolonii. Znaczenie tej metody dla Drosophila polega na standaryzacji eksperymentów do formatu płytki 96-dołkowej, co umożliwia jednoczesną obsługę dużej liczby kontrprób biologicznych z automatyzacją w celu osiągnięcia wysokoprzepustowej kwantyfikacji CFU.

Platforma 96-dołkowa pokazuje, że zwiększona częstotliwość transferu i "oczyszczanie" przejściowych bakterii powoduje znaczne zmniejszenie zarówno średniej liczebności, jak i zmienności między próbkami (Figura 1B, C), co dowodzi rygorystyczności tego ulepszonego protokołu. Jednym z ograniczeń much żyjących w jednym pomieszczeniu jest poziomy transfer bakterii między muchami. Proponowanym rozwiązaniem jest trzymanie much pojedynczo w formacie 96-dołkowej płytki, takiej jak Whole Animal Feeding Flat38.

Chociaż nie zaobserwowano znacznego zmniejszenia obciążenia bakteryjnego, gdy muchy były myte w etanolu, muchy te były trzymane w obecności bakterii zewnętrznych tylko przez 3 dni. Przetrzymywanie przez dłuższy czas może pozwolić na akumulację większego obciążenia bakteryjnego39. Dlatego nadal zaleca się mycie w etanolu.

Przeniesienie much do płytki 96-dołkowej jest krytycznym pierwszym krokiem do skonfigurowania przepływu pracy (rysunek 1A). Po umyciu much rozprowadza się je pojedynczo do studni. Wykres płytowy jest przydatny na tym etapie, aby zanotować, jakie warunki występują w każdym dołku i dodać wszelkie notatki, takie jak "mucha została utracona". Homogenizacja to kolejny krytyczny krok z kilkoma ważnymi zastrzeżeniami. Bakterie przeżywają proces homogenizacji w obecności muchy (ryc. 1D,E) i przypuszczalnie zasada ta jest również prawdziwa, gdy bakterie znajdują się w jelicie muchy. Jednak bakterie są również zabijane, gdy są homogenizowane w samych płytkach do ubijania, co pokazuje, że homogenizacja może zabić komórki bakteryjne w pewnych okolicznościach, co może być ważne, jeśli na przykład homogenizuje się wypreparowane jelita. Warto zauważyć, że utrata CFU podczas homogenizacji zależy od liczby CFU w próbce, a strata jest minimalna, gdy stosuje się ~105 CFU na studzienkę. Dalsze zachowanie CFU można osiągnąć, zatrzymując homogenizację w połowie i schładzając płytkę na lodzie.

Homogenizacja była wykonywana przez 5 minut w tym protokole w oparciu o eksperymenty kontrolne, w których znana liczba CFU została zmieszana z muchą wolną od zarazków, co zadziałało empirycznie w przypadku bakterii muchowych. Mniejsze dudnienie powodowało obecność większych części muchy, co zakłócało pipetowanie, podczas gdy znacznie dłuższy czas homogenizacji wynoszący ~10 minut sprawił, że liczba CFU była bardziej zróżnicowana. Zaobserwowano, że mniejsza objętość i kątowy kształt stożkowych studzienek płytkowych zmniejszają efektywność ubijania kulek w porównaniu z cylindrycznymi probówkami o pojemności 2 ml. Możliwych jest wiele wariantów tego ogólnego podejścia, w tym szczepy bakterii, który pojemnik do bicia koralików, które koraliki i jaki genotyp muchy są używane. Indywidualne przypadki użytkowników muszą korzystać z kontroli pozytywnych, aby ustalić swoje podejście.

Metodę posiewu punktowego zastosowano w specyficzny sposób: rozcieńczenia 1:2 L . plantarum WF w PBS namierzono na płytki MRS i inkubowano w temperaturze 30 °C przez 2 dni (można zastosować krótsze czasy inkubacji w celu uzyskania mniejszych rozmiarów kolonii). Metoda ta wymaga pewnych początkowych inwestycji w sprzęt, przede wszystkim ubijak do kulek i pipet 96-kanałowy (rysunek 2A), który jest niezbędny zarówno w przypadku serii rozcieńczeń, jak i powlekania punktowego. Dostępne są jednak tańsze opcje, w tym 96-dołkowy replikator płytkowy z kołkami szczelinowymi. Seria rozcieńczeń jest krytycznym krokiem, który wpływa na dokładność wyników zliczania CFU. Jeśli chodzi o tryby awaryjne, możliwe jest zatkanie końcówek pipet częściami muchowymi lub szklanymi kulkami, a końcówki pipet nie uszczelniają się prawidłowo na pipetorze lub ulegają uszkodzeniu z innego powodu. Wszystkie te problemy powodują niedoszacowanie dotkniętych odwiertów i powinny być monitorowane. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednie mieszanie na każdym etapie serii rozcieńczania. Każde rozcieńczenie należy dokładnie wymieszać, umieszczając płytkę na wytrząsarce do płytek lub pipetując w górę i w dół 15-20 razy, co służy również do przepłukania końcówek. Poprzez nacieranie od najbardziej rozcieńczonej do najmniej rozcieńczonej płytki, końcówki mogą być ponownie użyte w całej serii rozcieńczeń. Przy rozcieńczeniach 1:2 liczenie jest dokładne w zakresie 2-25 kolonii, obejmującym rząd wielkości (rysunek 2C). Dlatego rozcieńczenia 1:10 oszczędzają czas i materiały. Inną zmienną, którą można wykorzystać, jest czas inkubacji, który można dostosować tak, aby wytwarzał mniejsze kolonie, a tym samym zwiększał zakres policzalnych miejsc, zapobiegając łączeniu się sąsiednich kolonii.

Wysokiej jakości zdjęcie płyty jest niezbędne, ponieważ staje się ono surowymi danymi źródłowymi, na podstawie których analizowane są CFU i mogą być archiwizowane w nieskończoność. FluoroBox przeznaczony jest do wykonywania zdjęć płytek o jednolitym natężeniu światła, co minimalizuje odblaski na powierzchni agaru. Dodatkowo konstrukcja jest w stanie selektywnie fotografować kolonie fluorescencyjne za pomocą jednokolorowych diod LED i kolorowych filtrów fotograficznych (ryc. 3A). Konstrukcja zestawu takiego jak FluoroBox, z kontrolowanym oświetleniem i ustawieniami kamery, może znacznie zwiększyć powtarzalność obrazów CFU, co jest ważne dla automatycznej analizy. Morfologie kolonii, intensywność fluorescencji oraz wpływ czasu lub gęstości na wzrost kolonii to tylko niektóre z właściwości, które można analizować za pomocą zdjęć. Pudełko na zdjęcia można zbudować bez kolorowych filtrów i jednokolorowych świateł, jeśli nie są używane bakterie fluorescencyjne, co zmniejsza koszty i złożoność. Inne lampki wzbudzenia i filtry emisyjne mogą być zastąpione tymi zalecanymi tutaj, jeśli laboratorium używa innego fluoroforu. Aparat, który jest połączony z tabletem przez Wi-Fi za pomocą aplikacji, jest przydatny zarówno ze względu na funkcję automatycznej migawki, aby zapobiec drganiom, jak i ułatwić przesyłanie danych. Obrazy można przesyłać do tabletu, a następnie do laptopa za pomocą oprogramowania do bezprzewodowego przesyłania plików. Zalecane kamery z tymi możliwościami są wskazane w Tabeli materiałów.

Count-On-It to wtyczka napisana w ImageJ. Zautomatyzowane oprogramowanie do liczenia CFU dzieli obraz płytki na jednolitą 96-dołkową siatkę, zlicza kolonie w każdej komórce siatki i grupuje wyniki w prostym arkuszu kalkulacyjnym. Ponieważ zawsze występują różnice w położeniu siatki punktowej na płycie i na zdjęciu, użytkownik musi ręcznie dostosować siatkę do zdjęcia za pomocą wtyczki Croptacular. Pomaga to również wykluczyć obszary w pobliżu krawędzi płyty, które są odblaskami. Ustawienie progu jest kluczem do uzyskania najdokładniejszej liczby CFU na obrazie. Jeśli próg zostanie ustawiony zbyt wysoko, kolonie połączą się; Jeśli próg zostanie ustawiony zbyt nisko, rodziny zostaną wykluczone. Po ustawieniu progu makro stosuje rozmycie gaussowskie w celu zmiękczenia krawędzi i zmniejszenia aliasingu, filtr zlewiska dzieli nakładające się kolonie, a plamy są zliczane przy użyciu analizowania cząstek.

Czasami zagęszczenie kolonii jest zbyt duże w danym miejscu. Count-On-It zapewnia sposób na poradzenie sobie z tym. Aby oszacować liczbę kolonii w komórce siatki z częściowo połączonymi koloniami, najpierw przyjmuje się średnią powierzchnię okrągłej plamy z całej płytki jako średnią C. Następnie obszar plamy A1 jest dzielony przez średnią powierzchnię okrągłej plamy A1/Cśredniej. Ta liczba jest zaokrąglana do najbliższej liczby całkowitej i jest to szacunkowa liczba kolonii w plamie. Ta funkcja jest jednym z powodów, dla których próg może mieć wpływ na wyniki zliczania: względna średnia powierzchnia kolonii w porównaniu z scalonym obszarem blob będzie się różnić w zależności od tego, jak próg wpłynął na scalone plamy.

Przedstawione metody mają kilka ograniczeń. Należą do nich m.in. konieczność posiadania sprzętu do dokładnego dozowania płynnych mediów z płytek 96-dołkowych. To wyposażenie, zarówno 96-kanałowy pipetor, jak i narzędzie do replikatora z rowkiem, może kosztować tysiące dolarów. Istnieją tańsze alternatywy, ale są mniej dokładne. Automatyczne liczenie za pomocą Count-On-It również wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Na przykład, jeśli dwa typy kolonii w populacji mieszanej zostały rozdzielone na podstawie samego rozmiaru, zliczanie kropelek nie byłoby w stanie przypisać kolonii do odpowiedniego typu. W takim przypadku miejsca z plamami musiałyby zostać wyeliminowane z liczenia. Dalsze różnicowanie kolonii na podstawie morfologii byłoby cennym rozszerzeniem metody, która nie jest obecnie stosowana. Stosowanie selektywnych pożywek, w tym specyficznych dla szczepu składników odżywczych i antybiotyków, upraszcza potrzebę złożonej analizy obrazu.

Utrzymywanie eksperymentów z muszkami owocowymi na 96-dołkowych płytkach zwielokrotnia liczbę próbek i warunków, które można przetestować w jednym eksperymencie, i może ułatwić wysokoprzepustowe badania przesiewowe w fenotypach asocjacji bakterii Drosophila. Przewidujemy, że metodę tę można rozszerzyć o zastosowanie selektywnych pożywek do różnicowania wielu szczepów bakterii w złożonych mieszaninach. Metoda nie ogranicza się do badania mikrobiomu much. Kwantyfikacja CFU jest powszechna w wielu zastosowaniach mikrobiologii, od liczby bakterii z grupy coli w wodzie pitnej po identyfikację patogenów. Przedstawiony tutaj system powlekania CFU umożliwia przeprowadzanie przesiewów o wysokiej przepustowości, a także zautomatyzowane pozyskiwanie, przetwarzanie, przechowywanie i dostarczanie wyników.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dr Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper i członkowie laboratorium Ludington wnieśli cenny wkład w rozwój tego protokołu. Finansowanie zostało zapewnione przez 2032985 grantowy NSF IOS, grant DP5OD017851 NIH, grant Carnegie Institution of Canada oraz Carnegie Institute for Science's Endowment.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ubijanie i powlekanie punktowe
Fly FiolkiGenesee32-121autoklawowalne
Korki do fiolek Genesee59-201autoklawowalny
aplikator ręczny3M3M PA1
ZgrzewarkaEppendorf5390
Mini-Beadbeater 96BioSpec1001
Mini-BeadBeater Koraliki do szkła młynkowego, 0,5 mmBioSpec 
MPS 1000 Mini PCR Plate SpinnerLabnetLI-CF-P1000
Półautomatyczny pipeter Rainin BenchSmart 9630296705Mettler Toledosą tańsze opcje, w tym szczelinowe narzędzie do szpilek 96-dołkowych firmy VP Scientific
TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR z półspódniczką, prosta spódnica, naturalnaUSA scientific1402-9220Musi być polipropylenowy do zgrzewarki
Folia termozgrzewalna Thermal Bond4titude4ti-0591Utrzymuj sterylną
tacę Płyta, 128 x 85 mm, Polistyren, SterylneSPL Life Sciences31001Do wykonywania prostokątnych płytek agarowych
< mocny>Konstrukcja Photoboxa
¼ "-20 X ½ ” (X2)AmazonASIN: B07BP1WR3HAby przymocować wspornik kamery. Marka nie jest ważna. Każda śruba 1/4 "-20 1/2" działa.
¼ "-20 x ½ ” Nakrętka łącznika AmazonUPC: 799862376780nakrętka kołpakowa lub śruba łącząca. Służy do mocowania gumek recepturek na uchwycie talerza. Marka nie jest ważna.
¼ "-20 x ¾ ” (X3)AmazonASIN: B003QZSZY4Do uchwytu na talerz. Marka nie jest ważna.
1/8" x ½ ” podkładkaAmazonUPC: 611982484599Podkładka do nakrętek kołpakowych na zewnątrz pudełka. Marka nie jest ważna. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.
18 Gauge Wire - Dwużyłowy przewód zasilający - 18 AWG Przewód zasilający – 10ftSuperbrightleds.comWP18-2
22-10 AWG Czerwona nakrętka drutu - WN-R2210 – Ilość 4Superbrightleds.comWN-R2210
22-18 AWG 3/16 cala żeńskie złącze wciskane - 22-18 AWG – Ilość 3Superbrightleds.comSCFP-2218
4-calowe bezlutowe złącze zworkowe zaciskowe - 8mm Jednokolorowe taśmy LED - Ilość 3Superbrightleds.comSBL-MA2P-8-2 4-calowy
adapter pigtailowy bez - 8mm jednokolorowe taśmy LED – Ilość 3Superbrightleds.comSBL-MA2P-8-1 
Uchwyt szuflady 6"AmazonASIN: B07Z331P99Każdy uchwyt szuflady powinien działać.
6" Prowadnice do szufladBtibpseUPC: 712243424979Przyciąć gumowe korki z cichym domykaniem na suwakach szuflady.
8-32 x ½ ” Nakrętki kołpakowe (x4)AmazonASIN: B00HYLZB98Mocuje prowadnicy szuflady na zewnątrz pudełka. Marka nie jest ważna. Nylon nie uszkodzi akrylu. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.
8-32 x ½ ” nylonowe (x4)AmazonASIN: B07KX9T7NFDo mocowania prowadnic szuflad. Marka nie jest ważna. Każda śruba lub śruba maszynowa spełniająca specyfikacje działa. Nylon nie uszkodzi akrylu i pozwala przeciąć równo z nakrętką. Przed przymocowaniem pomaluj farbą w sprayu, aby stopić ją z akrylem.
Klej akrylowySCIGRIPEan: 7844908489337SCIGRIP Weld-On #4 Klej, pint i przyspawana butelka z aplikatorem z igłą
Czarne opaski kablowe - 10 sztuk - 4 cale długości Superbrightleds.comCT-B04-10
Uchwyt L do aparatuWLPREOE, Vikerer, NiemarkowyASIN: B09X46YKQZWspornik powinien być "odwrócony" od zamierzonej konfiguracji, tak aby kamera znajdowała się "na zewnątrz" L. Niektóre wsporniki są dwuczęściowe i pozwalają na tę alternatywną konfigurację, niektóre nie, będziesz potrzebować takiego, który można obrócić. Powinien również mieć otwory 1/4" do mocowania. WLPREOE, Vikerer, niemarkowy. Jako przykład podano numer identyfikacyjny seryjny Amazon.
Aparat z serii Canon T do opcji tetheringu LUBCanon, Panasonic, Sony, Nikon itp.1894C002Dobrym rozwiązaniem są aparaty z serii Canon Ti, które można podłączyć do komputera. Do użytku ze standardowym obiektywem kitowym 18-55 mm. Używane opcje są zalecane od Canon T5 do T7 (obecny model).
Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / ft - Niebieska - 2 metrySuperbrightleds.comSTN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / stopę - Zielony – 2 metrySuperbrightleds.comSTN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Jednokolorowa taśma LED o niestandardowej długości - Taśma świetlna z serii Eco - 24 V - IP20 - 250 lm / ft - Naturalna biel 4000K – 2 metry Superbrightleds.comSTN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Wiertarka z ¼ ", 1/8" Wiertła Black& Decker‎ BDCDD12PKMarka nie jest ważna.
Płaska farba w sprayu,  2X Ultra-MatteRustoleum331182Pomaluj wnętrze wszystkiego PŁASKIEGO na czarno. Marka nie jest ważna.
Laserowo wycinane ściany akryloweBig Blue Sawwww.bigbluesaw.comUżyj załączonego pliku PDF, usuń wszystkie wycięcia w górnej części, z wyjątkiem żądanego otworu na aparat 
Zasilacz impulsowy LED Mean Well - seria LPV Zasilacz LED z pojedynczym wyjściem 20-100 W - 24 V DC - 20 Watt Superbrightleds.comLPV-20-24
Panasonic ZS100 do połączenia Wi-Fi z telefonem, tabletem lub komputeremCanon, Panasonic, Sony, Nikon itp.DMC-ZS100K AparatyPanasonic można bezprzewodowo podłączyć do komputera w celu przesyłania danych i opcji zdalnej migawki. Używane opcje są dobre.
SzybkozłączkaNeewer Aluminium 50mm Szybkozłączka QR Clamp 3/8 cala z 1/4 calaASIN: B07417F21DDodaj to do wspornika, aby aparat można było łatwo zdjąć w celu wymiany filtrów kolorów. Jako przykład podano numer identyfikacyjny seryjny Amazon.
Gumki, różne rozmiaryBAZIC ProductsAlliance Rubber 26649Gumki pasują do uchwytu na talerz. Marka nie jest ważna.
Podstawy montażowe do opasek kablowych przykręcanych/samoprzylepnych - podstawa 3/4 cala – Ilość 4Superbrightleds.comCTMB-20
SPST Okrągły przełącznik kołyskowy - bez diody LED – Ilość 3Superbrightleds.comRRS-SP
Filtr Tiffen 29 (czerwony) 72 mm Tiffen72R29
Filtr Tiffen 58 (zielony) 72 mmTiffen7258
Software
ImageJ64https://imagej.net/downloadsNie dotyczybezpłatnie. Wystarczy zacytować: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fidżi: platforma open source do analizy obrazów biologicznych. Metody natury, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSXAppleN/APosiada przydatną funkcję zmiany nazwy partii w Finderze, aby zmienić nazwę grupy zdjęć, aby ułatwić organizowanie i analizowanie w Count-on-it.
UnixBSDN/A(wersja 64-bitowa) Windows (64-bitowa
MicrosoftN/Awersja 64-bitowa
11079105 Dostępne ) ()

Bibliografia

  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
  3. Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  5. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  6. Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).
  7. D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892(2018).
  8. Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).
  9. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).
  10. Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).
  11. Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
  12. Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).
  13. Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
  14. Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
  15. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  16. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110(2018).
  17. Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
  18. Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  19. Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
  20. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  21. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
  22. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  23. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6(2014).
  24. Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
  25. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  26. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
  27. Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
  28. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
  29. Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).
  30. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
  31. Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
  32. Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).
  33. Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
  34. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  35. Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
  36. Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
  37. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  38. Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
  39. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Jednostki tworz ce kolonieautomatyczne liczenie CFUanaliza mikrobiomu jelitowegohomogenizacja muchmetoda posiewu kropelkowegowtyczka ImageJwykrywanie kolonii fluorescencyjnychwysokoprzepustowa mikrobiologia
Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.