Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe pochodzenia mieloidalnego, które utrzymują homeostazę w mikrośrodowisku mózgu i stały się kluczowym graczem w wielu chorobach neurologicznych. Badanie ludzkiego mikrogleju w zdrowiu i chorobie stanowi wyzwanie ze względu na niezwykle ograniczoną podaż komórek ludzkich. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące od ludzi mogą być wykorzystane do obejścia tej bariery. W tym miejscu pokazano, jak różnicować ludzkie iPSC w komórki podobne do mikrogleju (iMG) do eksperymentów in vitro. Te iMG wykazują oczekiwane i fizjologiczne właściwości mikrogleju, w tym morfologię podobną do mikrogleju, ekspresję odpowiednich markerów i aktywną fagocytozę. Ponadto dostarczono dokumentację dotyczącą izolowania i znakowania substratów synaptosomów pochodzących z ludzkich dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC (i3LMNs). Test obrazowania podłużnego na żywych komórkach służy do monitorowania pochłaniania ludzkich synaptosomów znakowanych barwnikiem wrażliwym na pH, co pozwala na badanie zdolności fagocytarnej iMG. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach, które badają biologię ludzkiego mikrogleju i jego wpływ na choroby.
Wprowadzenie
Mikroglej są rezydującymi komórkami odpornościowymi w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają kluczową rolę w rozwoju OUN. Mikroglej jest również ważny w dorosłym mózgu dla utrzymania homeostazy i aktywnego reagowania na urazy i procesy chorobowe. Skumulowane dowody wskazują, że mikroglej jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy wielu chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych1,2. Chociaż obecna wiedza na temat biologii mikrogleju pochodzi głównie z modeli mysich, ostatnie badania wyjaśniły ważne różnice między mikroglejem mysim a ludzkim, podkreślając potrzebę opracowania technol....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole muszą być sterylne, a wszystkie etapy muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych. Wszystkie linie iPSC, a także pożywki do utrzymania i różnicowania, są opisane w Tabeli materiałów. Metoda różnicowania mikrogleju przedstawiona poniżej opiera się na wcześniej opublikowanych protokołach7,8,12 z nowymi modyfikacjami opisanymi w niniejszym opracowaniu.
1. Różnicowanie mikrogleju
UWAGA: Przegląd proto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wygenerować iMG zgodnie z niniejszym protokołem, ważne jest rozpoczęcie procesu od niezróżnicowanych iPSC wykazujących zwartą morfologię kolonii z wyraźnie zarysowanymi krawędziami (Rycyna 2A). Dysocjowane iPSC utrzymywane zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej tworzenia EB będą tworzyć sferyczne agregaty, zwane EB, których rozmiar będzie wzrastać do 4. dnia różnicowania (Rycyna 2B). Po zebraniu EB i wysianiu ich w odpowiednich warunkach do generowania PMP, pr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół różnicowania zapewnia skuteczną metodę uzyskiwania komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z iPSC w ciągu ~6-8 tygodni o wysokiej czystości i wystarczającej wydajności do przeprowadzenia eksperymentów immunofluorescencyjnych i innych testów, które wymagają większej liczby komórek. Protokół ten pozwolił uzyskać do 1 × 106 iMG w ciągu 1 tygodnia, co pozwala na ekstrakcję białek i RNA oraz odpowiednie dalsze analizy (np. RNASeq, qRT-PCR, western blot, spektrometria mas). To powiedziaws.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Michaelowi Wardowi za dostarczenie linii iPSC WTC11 hNIL do różnicowania neuronów ruchowych oraz Jackson Laboratories za dostarczenie linii B03 iPSC klonu KOLF2.1J WT używanej do różnicowania mikrogleju. Dziękujemy również Dorothy Schafer za jej wsparcie podczas wdrażania protokołów, Anthony'emu Giampetruzziemu i Johnowi Landersowi za pomoc w systemie obrazowania żywych komórek, a także Haydenowi Gaddowi za jego wkład techniczny podczas poprawek oraz Jonathanowi Jungowi za współpracę w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience z UMASS Chan Medical School oraz Angel Fund, Inc.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciała do analizy immunofluorescencyjnej | |||
| anti-IBA1 przeciwciało królika | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 rozcieńczenie |
| anty-P2RY12 przeciwciało królika | Sigma-Aldrich | HPA014518 | rozcieńczenie 1:50 |
| przeciwciało anty-TMEM119 królika | Sigma-Aldrich | HPA051870 | rozcieńczenie |
| 1:100Przeciwciała do analizy Western blot | |||
| -β-tubulina przeciwciało królika | Abcam | ab6046 | 1:500 rozcieńczenie |
| anty-synaptofizyny (SYP) przeciwciało królika | Abclonal | A6344 | 1:1,000 rozcieńczenie |
| anty-PSD95 mysie przeciwciało | Millipore | MAB1596 | 1:500 rozcieńczenie |
| boranowy bufor Składniki | |||
| Kwas borowy (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Chlorek sodu (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Tetraboran sodu (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Materiały do hodowli komórkowych | |||
| 6-dołkowe płytki | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μ m Sitka do komórek | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Hodowla tkankowa | CELLTREAT | 229620 | |
| Podnośnik komórek, podwójny koniec, płaskie ostrze i Wąskie ostrze, sterylne | CELLTREAT | 229305 | |
| 96-dołkowa płytka o niskiej przyczepności | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-dołkowa wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem i zmodyfikowaną powierzchnią | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Zmodyfikowana powierzchniowo płytka hodowlana Multiwell | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-dołkowa przezroczysta płaska Dolna mikropłytka | Corning | 353872 | |
| Odczynniki do dysocjacji komórek | |||
| Accutase | Odczynniki | 25058CI | stosowane do różnicowania dolnych neuronów ruchowych |
| Odczynnik TrypLE | Technologies | 12-605-010 | odczynniki dysocjacyjne stosowane do różnicowania mikrogleju |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Odczynniki do | ||
| Coating do hodowli komórkowych | |||
| Matrigel GFR Matryca membranowa | Corning™ | 354230 | Określany jako odczynnik do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej |
| CellAdhere Laminin-521 | Technologia STEMCELL | 77004 | Określany jako laminina 521 |
| Poli-D-lizyna | Sigma | P7405 | Rozpuszcza się do 0,1 mg / ml w buforze boranowym |
| Poly-L-Ornityna | Sigma | P3655 | Rozpuścić do 1 mg/ml w buforze boranowym |
| Składniki pożywki iPSC | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | Do przygotowania pożywki iPSC wymieszać składniki do 1x |
| Składniki podłoża EB | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | stężenie końcowe 50 ng/mL |
| iPSC media | stężenie końcowe 1x | ||
| Inhibitor ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | stężenie końcowe 10 &mikro; M |
| SCF | PeproTech | 300-07 | stężenie końcowe 20 ng/ml |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | stężenie końcowe 50 ng/mL |
| Składniki podłoża bazowego PMP | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | stężenie końcowe 1x |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Gibco | 15140122 | stężenie końcowe 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | stężenie końcowe 1x |
| Składniki pożywki kompletnej PMP | |||
| 55 mM 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | stężenie końcowe 55 &mikro; M |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | stężenie końcowe 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | stężenie końcowe 100 ng/mL |
| PMP podłoże bazowe | stężenie końcowe 1x | ||
| Składniki podłoża bazowego iMG | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | stężenie końcowe 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | stężenie końcowe 1x |
| suplement N2, 100x | Gibco | 17502-048 | stężenie końcowe 1x |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Gibco | 15140122 | stężenie końcowe 100 U/mL |
| Składniki pożywki complete iMG | |||
| 55 mM 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | stężenie końcowe 55 &mikro; M |
| IL-34 | PeproTech lub Biologend | 200-34 lub 577904 | stężenie końcowe 100 ng/mL |
| iMG podłoże bazowe | stężenie końcowe 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | stężenie końcowe 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | stężenie końcowe 50 ng/mL |
| Składniki indukcyjnej pożywki bazowej | |||
| DMEM/F12 z HEPES | Gibco | 11330032 | stężenie końcowe 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | stężenie końcowe 1x |
| suplement N2, 100x | Gibco | 17502-048 | final koncentracja 1x |
| Aminokwasy endogenne (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | stężenie końcowe 1x |
| Składniki kompletnego podłoża indukcyjnego | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | stężenie końcowe 0,2 μ M i rozpuścić odczynnik podstawowy do 2 mM w etanolu 1:1 i DMSO |
| Doksycyklina | Sigma | D9891 | stężenie końcowe 2 μ g/ml i rozpuścić odczynnik podstawowy do 2 mg/ml w DPBS |
| em>Indukcyjne podłoże bazowe | stężenie końcowe 1x | ||
| inhibitor ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | stężenie końcowe 10 μ M |
| Składniki Neuron media | |||
| B-27 Plus System hodowli neuronów | Gibco | A3653401 | stężenie końcowe 1x do pożywki i suplementacji |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | stężenie końcowe 1x |
| suplement N2, 100x | Gibco | 17502-048 | stężenie końcowe 1x |
| Aminokwasy endogenne (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | stężenie końcowe 1x |
| iPSC linie użyte w tym badaniu | |||
| KOLF2.1J: WT klon B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome | |||
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Odczynnik do ekstrakcji białek synaptycznych | Thermo Scientific | 87793 | Określany jako odczynnik do lizy komórek do izolacji synaptosomów |
| < silny> barwniki do testu fagocytozy< / silny> | |||
| Odczynnik NucBlue Live Ready | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, ester sukcynimidylowy | ThermoFisher Scientific | P36600 | Określany jako barwnik wrażliwy na pH |
| < silny > Inne odczynniki do hodowli komórkowych< / silny> | |||
| Trypan Blue, 0,4% roztwór | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Rozpuścić do 40 mM w sterylnej wodzie |
| Cytochalazyna D | Sigma | stężenie końcowe 10 i mikro; M | |
| DPBS z wapniem i magnezem | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS bez wapnia i magnezu | Corning | 21-031-CV | Określany jako DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Określany jako DMEM-F12 zoptymalizowany pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych |
| Białko myszy Laminin, naturalne | 23017015 Gibco | Określane jako laminina | |
| Oprogramowanie i sprzęt | |||
| Wirówka | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytacja 5 obrazowanie żywych komórek czytnik | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | wersja 3.03 | |
| Multi-Therm | Heat-Shake Benchmark | określa się jako wytrząsarkę rurową | |
| Sonikator wodny | Elma | Mode Transsonic 310 |
Bibliografia
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
