Artykuł metodologiczny

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

DOI:

10.3791/64323

⸱

18 sierpnia 2022

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe pochodzenia mieloidalnego, które utrzymują homeostazę w mikrośrodowisku mózgu i stały się kluczowym graczem w wielu chorobach neurologicznych. Badanie ludzkiego mikrogleju w zdrowiu i chorobie stanowi wyzwanie ze względu na niezwykle ograniczoną podaż komórek ludzkich. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące od ludzi mogą być wykorzystane do obejścia tej bariery. W tym miejscu pokazano, jak różnicować ludzkie iPSC w komórki podobne do mikrogleju (iMG) do eksperymentów in vitro. Te iMG wykazują oczekiwane i fizjologiczne właściwości mikrogleju, w tym morfologię podobną do mikrogleju, ekspresję odpowiednich markerów i aktywną fagocytozę. Ponadto dostarczono dokumentację dotyczącą izolowania i znakowania substratów synaptosomów pochodzących z ludzkich dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC (i3LMNs). Test obrazowania podłużnego na żywych komórkach służy do monitorowania pochłaniania ludzkich synaptosomów znakowanych barwnikiem wrażliwym na pH, co pozwala na badanie zdolności fagocytarnej iMG. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach, które badają biologię ludzkiego mikrogleju i jego wpływ na choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej są rezydującymi komórkami odpornościowymi w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają kluczową rolę w rozwoju OUN. Mikroglej jest również ważny w dorosłym mózgu dla utrzymania homeostazy i aktywnego reagowania na urazy i procesy chorobowe. Skumulowane dowody wskazują, że mikroglej jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy wielu chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych1,2. Chociaż obecna wiedza na temat biologii mikrogleju pochodzi głównie z modeli mysich, ostatnie badania wyjaśniły ważne różnice między mikroglejem mysim a ludzkim, podkreślając potrzebę opracowania technologii do badania genetyki i funkcji biologicznych ludzkiego mikrogleju3,4. Izolacja mikrogleju z wypreparowanej tkanki pierwotnej może poważnie zmodyfikować właściwości mikrogleju5, potencjalnie zakłócając wyniki uzyskane dla takich komórek. Ogólnym celem tej metody jest różnicowanie ludzkich iPSC na iMG, a tym samym zapewnienie systemu hodowli komórkowych do badania ludzkiego mikrogleju w warunkach podstawowych. Ponadto w niniejszym dokumencie uwzględniono test fagocytozy przy użyciu w pełni ludzkiego systemu modelowego jako środek do badania funkcjonalności iMG, zarówno jako środek kontroli jakości, jak i do oceny dysfunkcji iMG w kontekście choroby.

Ostatnio w literaturze pojawiło się wiele protokołów odróżniania mikrogleju od iPSC6,7,8,9,10. Potencjalne wady niektórych protokołów obejmują wydłużone lub długie okresy różnicowania, dodanie wielu czynników wzrostu i/lub złożone procedury eksperymentalne6,9,10. W tym miejscu zademonstrowano "przyjazną dla użytkownika" metodę różnicowania, która podsumowuje aspekty ontogenezy mikrogleju poprzez różnicowanie iPSC w komórki prekursorowe zwane prymitywnymi prekursorami makrofagów (PMPs)7,11. Pakiety PMP są generowane zgodnie z wcześniejszym opisem, z pewnymi optymalizacjami przedstawionymi w12. PMP naśladują niezależne od MYB makrofagi pochodzące z woreczka żółtkowego, które powodują powstawanie mikrogleju podczas rozwoju embrionalnego, atakując mózg przed zamknięciem bariery krew-mózg13. Aby ostatecznie rozróżnić PMP na iMG, zastosowaliśmy szybką i uproszczoną metodę monokultury opartą na protokołach Haenselera i wsp. oraz Brownjohna i wsp., z pewnymi modyfikacjami w celu wygenerowania wydajnej metody różnicowania mikrogleju, w której iMG silnie wyrażają markery wzbogacone w mikroglej7,8. Ta metoda różnicowania może być odtworzona w laboratoriach posiadających doświadczenie w hodowli iPSC i mających cele badawcze mające na celu zbadanie biologii mikrogleju przy użyciu systemu modelowego dla człowieka.

Mikroglej pochodzący z iPSC stanowi biologicznie istotne źródło ludzkiego mikrogleju do eksperymentów in vitro i jest ważnym narzędziem do badania kanonicznych funkcji mikrogleju, w tym fagocytozy. Mikroglej to profesjonalne fagocyty mózgu i OUN, w których usuwają resztki komórek, zagregowane białka i zdegradowaną mielinę14. Mikroglej funkcjonuje również w przebudowie synaps poprzez pochłanianie synaps oraz w obronie przed zewnętrznymi infekcjami poprzez fagocytozę patogenów15,16. W tym protokole fagocytoza przez iMG jest oceniana przy użyciu ludzkich synaptosomów jako materiału do pochłonięcia iMG. W tym celu opisano opis izolowania synaptosomów pochodzących z ludzkich i3LMN. Ludzkie synaptosomy pochodzące z i3LMN są znakowane barwnikiem wrażliwym na pH, który pozwala na ilościowe określenie synaptosomów zlokalizowanych w przedziałach kwasowych podczas przetwarzania i degradacji fagosomów in vitro. Pokazano test fagocytozy przy użyciu mikroskopii żywych komórek do monitorowania dynamicznego procesu pochłaniania mikrogleju w czasie rzeczywistym. Ten funkcjonalny test stanowi podstawę do zbadania możliwych defektów fagocytozy mikrogleju w zdrowiu i chorobie przy użyciu kompletnego systemu ludzkiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole muszą być sterylne, a wszystkie kroki muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach. Wszystkie linie iPSC, a także podłoża do konserwacji i różnicowania są opisane w Tabeli Materiałów. Przedstawiona poniżej metoda różnicowania mikrogleju opiera się na wcześniej opublikowanych protokołach7,8,12 z nowymi modyfikacjami opisanymi w niniejszym dokumencie.

1. Różnicowanie mikrogleju

UWAGA: Przegląd protokołu jest podsumowany w Rysunek 1.

  1. Hodowla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)
    UWAGA: Więcej szczegółów na temat technik hodowli iPSC można znaleźć gdzie indziej17.
    1. Rozmrażanie i konserwacja
      1. Przygotować pożywkę iPSC, podzielić pożywkę na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Podwielokrotności rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C i stosować przez okres do 1 tygodnia. Przed użyciem pozostaw podłoże w temperaturze otoczenia na co najmniej 1 godzinę.
      2. Pokryj dołki płytki 6-dołkowej, dodając 1 ml 10 μg/ml lamininy 521 rozcieńczonej w DPBS zawierającym wapń i magnez18. Przechowywać płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc. Po rozcieńczeniu należy przechowywać lamininę w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące.
      3. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho Y27632 (inhibitor ROCK), rozcieńczając go w sterylnej wodzie. Sporządzić jednorazowe porcje roztworu inhibitora ROCK i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
      4. Przygotować 0,5 mM EDTA, rozcieńczając roztwór podstawowy 0,5 M EDTA w DPBS.
      5. Aby rozmrozić fiolkę z zamrożonymi iPSC, należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż do całkowitego rozmrożenia. Natychmiast przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki iPSC. Wirować przy 500 × g przez 1 min.
      6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając powoli 1 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do ścianki probówki, aby uniknąć zakłóceń w pracy kolonii.
      7. Dodać 1,5 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do każdej z powlekanych studzienek i przenieść zawieszone kolonie kropla po kropli do studzienek zawierających pożywkę.
        UWAGA: Użyj 5-7 kropli z kroku 1.1.1.6 do konserwacji kultury, ale dostosuj optymalną gęstość wysiewu dla każdej linii iPSC.
      8. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia należy całkowicie zastąpić pożywkę, dodając świeżą pożywkę iPSC bez inhibitora ROCK.
      9. W celu konserwacji zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
        UWAGA: Komórki można utrzymywać bez zmiany pożywki przez 2 dni, jeśli zastosowana pożywka iPSC pozwala na elastyczny harmonogram karmienia. Zaleca się ograniczenie tego do jednego razu na przejście i tylko wtedy, gdy komórki są mniej niż w 50% zlewne.
    2. Dzielenie
      1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml DPBS (bez wapnia i magnezu).
      2. Aby usunąć komórki, dodaj 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej, aż krawędzie kolonii komórek oderwą się od powierzchni studzienki. Ponownie umyj komórki DPBS i dodaj 1 ml pożywki iPSC.
      3. Oddziel kolonie komórek, delikatnie zeskrobując je za pomocą podnośnika komórkowego. Zeskrob każdy obszar studni tylko raz, aby uniknąć zakłócania spokoju kolonii.
        UWAGA: Alternatywne metody usuwania kolonii ze studni można znaleźć gdzie indziej17.
      4. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml zebrać komórki i przenieść je kropla po kropli w stosunku 1:6 (komórki do podłoża) do wstępnie powlekanych studzienek (jak wspomniano w kroku 1.1.1.2) zawierających 1,5 ml pożywki iPSC.
  2. Różnicowanie iPSC do komórek podobnych do mikrogleju (iMG)
    UWAGA: Małe cząsteczki i czynniki wzrostu rozpuszcza się w sterylnie przefiltrowanej 0,1% albuminie surowicy bydlęcej w DPBS do stężenia podstawowego 1000 razy wyższego niż stężenie końcowe. Zaleca się różnicowanie iPSC na iMG we wczesnych pasażach. Zaleca się rutynowe kariotypowanie linii iPSC.
    1. Przygotować standardowy roztwór powłokowy
      1. Rozmrozić przez noc roztwór podstawowy odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
      2. Wstępne schładzanie mikrowirówek i końcówek pipet filtrujących w temperaturze 4 °C.
      3. Porcję 250 μl skoncentrowanego odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej umieścić w każdej probówce i natychmiast umieścić na lodzie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
      4. Aby przygotować roztwór powlekający, należy rozmrozić przez noc jedną z podwielokrotności odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie w temperaturze 4 °C.
      5. Dodaj 50 ml lodowatego DMEM-F12 zoptymalizowanego pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (określanych jako DMEM-F12) do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki i trzymaj ją na lodzie.
      6. Schłodzić końcówkę pipety o pojemności 1 ml, wielokrotnie pipetując lodowaty DMEM-F12 w górę i w dół, a następnie natychmiast użyć końcówki pipety, aby przenieść 250 μl odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej do stożkowej probówki zawierającej pożywkę DMEM-F12.
        UWAGA: Standardowy roztwór powlekający można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
    2. Tworzenie ciała zarodka (EB)
      1. Przygotować pożywkę EB, którą można utrzymywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.
      2. Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, należy rozdzielić kolonie, przemywając 1 ml DPBS i dodając 1 ml odczynnika dysocjacyjnego przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Usunąć kolonie za pomocą podnośnika komórkowego, wielokrotnie zeskrobując, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zebrać komórki i przenieść wszystko do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml DPBS.
      3. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki EB. Weź 10 μl komórek i rozcieńcz je w stosunku 1:1 błękitem trypanowym. Policz komórki za pomocą hemacytometru i na podstawie liczby komórek rozcieńczyć zapas komórek do końcowego rozcieńczenia 10 000 komórek na 100 μl. W przypadku posiewu komórek dodaj 100 μl rozcieńczonych komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki o niskiej przyczepności, okrągłodennej.
        UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 48 dołków z 96-dołkowej płytki można uzyskać z każdej 80% zlewającej się studzienki iPSC.
      4. Odwirować płytkę w temperaturze 125 × g przez 3 minuty i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 dni. Wykonaj zmianę połowy pożywki w dniu 2, używając pipety wielokanałowej i delikatnie zbierając 50 μl starej pożywki, a następnie dodając z powrotem 50 μl świeżej pożywki EB.
        UWAGA: W 4 dniu iPSC utworzą kuliste struktury komórkowe zwane EB, jak opisano w sekcji wyników. W razie potrzeby proces różnicowania EB może zostać przedłużony do 7 dni.
    3. Wytwarzanie prymitywnych prekursorów makrofagów (PMP)
      1. Przygotować pożywkę bazową PMP, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
      2. Pokryć studzienki na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml lodowatego roztworu powlekającego Matrigel i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny lub najlepiej przez noc.
      3. W 4 dniu różnicowania EB przenieś EB do studzienek pokrytych Matrigelem, zbierając EB za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml (za pomocą pipety). Pipetuj w górę i w dół raz lub dwa razy, aby usunąć EB z dołka. Trzymaj 6-dołkową płytkę pod kątem pochylonym, aby EB mogły osiąść na krawędzi studzienki.
        UWAGA: Dziewięć lub dziesięć EB można pokryć na jedną dobrze pokrytą.
      4. Gdy wszystkie EB się uspokoją, delikatnie odpipetuj i usuń starą pożywkę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, trzymając EB na krawędzi studzienki. Do każdej studzienki dodać 3 ml świeżo przygotowanej pożywki PMP complete. Równomiernie rozprowadź komórki w dołkach, ręcznie przesuwając płytkę z boku na bok i z tyłu do przodu. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      5. Nie naruszaj płytki przez 7 dni, aby EB mogły przymocować się do dna studni. Po tym czasie należy wykonać wymianę połowy podłoża za pomocą PMP complete medium.
        UWAGA: W tym momencie większość EB powinna być przymocowana do płyty. Wszystkie pływające EB można usunąć.
      6. Po 5-7 dniach sprawdź EB pod mikroskopem pola świetlnego przy 4-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że są przymocowane do dna studzienek. Zmień podłoże zgodnie z opisem w 1.2.3.5. W 21 dniu należy wykonać pełną wymianę pożywki z 3 ml PMP complete medium.
        UWAGA: Przodkowie szpiku unoszący się w pożywce mogą być widoczni w tym momencie. Komórki te należy wyrzucić podczas zmiany pożywki.
      7. W 28 dniu należy poszukać w supernatancie okrągłych komórek określanych jako PMP i zebrać pożywkę zawierającą PMP za pomocą pipety 10 ml i pipetora automatycznego. Uważaj, aby nie przeszkadzać EBs. Przenieść PMP i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i postępować zgodnie z opisem w kroku 1.2.4.
        UWAGA: Zazwyczaj PMP z tej samej linii iPSC można zebrać z pięciu dołków 6-dołkowej płytki i zebrać razem w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      8. Dodać 3 ml świeżej kompletnej pożywki PMP w celu dalszego utrzymania EB. Ponieważ PMP wyłaniają się z EB w sposób ciągły przez ponad 3 miesiące, należy je zbierać co 4-7 dni (nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na żółty), jak opisano w krokach 1.2.3.7 i 1.2.3.8.
        UWAGA: Chociaż PMP mogą być zbierane przez kilka miesięcy, mogą z czasem zmieniać swój fenotyp.
    4. Zróżnicowanie w stosunku do iMG
      1. Przygotować podłoże bazowe iMG (tabela materiałów), sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
      2. Po zebraniu PMP do stożkowej probówki o pojemności 15 ml odwirować je w temperaturze 200 × g przez 4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić PMP za pomocą 1-2 ml podłoża podstawowego iMG. Policz komórki za pomocą hemocytometru, pobierając małą porcję i rozcieńczając 1:1 błękitem trypanowym.
        UWAGA: 0,5-1,5 × 106 PMP są zwykle uzyskiwane co tydzień, w zależności od linii iPSC i wieku hodowli EB.
      3. Resztę komórek ponownie odwirować w temperaturze 200 × g przez 4 minuty. Rozcieńczyć PMP do pożądanego stężenia w taki sposób, aby komórki zostały posiane z gęstością ~105/cm2 na płytkach poddanych działaniu kultur komórkowych przy użyciu świeżo przygotowanej kompletnej pożywki iMG. Wykonuj zmianę połowy pożywki za pomocą świeżo przygotowanej pożywki iMG complete co 3-4 dni przez 10-12 dni, aby umożliwić końcowe różnicowanie.
        UWAGA: W tym momencie komórki powinny nabrać morfologii podobnej do mikrogleju. Aby potwierdzić zaangażowanie PMP w los mikrogleju, przeprowadza się analizę immunofluorescencyjną w celu potwierdzenia ekspresji markerów wzbogaconych w mikroglej, takich jak receptor purynergiczny P2RY12 i białko transbłonowe 119 (TMEM119)9.
      4. Aby zachować zdrowie i żywotność komórek, należy przeprowadzić wszystkie eksperymenty między 10 a 12 dniem różnicowania iMG.

2. Test fagocytozy przy użyciu ludzkich synaptosomów pochodzących z neuronów ruchowych

  1. Różnicowanie dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego (i3LMN)
    UWAGA: Linia WTC11 ze stabilną insercją kasety indukowanego czynnikiem transkrypcyjnym hNIL zawierającej czynniki transkrypcyjne neurogeniny-2 (NGN2), wysepki-1 (ISL1) i LIM homeobox 3 (LHX3) do locus bezpiecznej przystani CLYBL została użyta do procesu różnicowania, jak opisano wcześniej17. Linia iPSC została utrzymana zgodnie z opisem w kroku 1.1.1, ale z warunkami powlekania opisanymi w kroku 1.2.1. Do hodowli iPSC można użyć dowolnego odczynnika do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej, które będą wykorzystywane do różnicowania neuronów, ponieważ laminina 521 nie jest wymagana. Wszystkie media są równoważone do temperatury otoczenia przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
    1. Pokryj 10-centymetrowe szalki 5 ml standardowego roztworu do powlekania, jak opisano w kroku 1.2.1.
      UWAGA: Tutaj użyto 3-4 naczyń o średnicy 10 cm dla każdego wariantu.
    2. Przygotuj podłoże Induction Base, sterylny filtr i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
    3. Przygotuj pożywkę Neuron, sterylny filtr i przechowuj ją w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
    4. Przygotować bufor boranowy, mieszając 100 mM kwasu borowego, 25 mM tetraboranu sodu i 75 mM chlorku sodu w sterylnej wodzie. Dostosuj pH do 8,5 i sterylnie przefiltruj.
    5. Gdy iPSC osiągną 80% konfluencji, przemyj komórki DPBS i usuń kolonie, dodając 0,5 mM EDTA.
      UWAGA: Na każde 10 cm naczynie zwykle wystarczają dwie studzienki.
    6. Inkubować komórki przez 4-5 minut w temperaturze otoczenia. Usuń EDTA i dodaj 3 ml DMEM/F12 z HEPES do każdej studzienki.
    7. Zeskrob komórki za pomocą podnośnika do komórek i użyj pipety 10 ml, aby usunąć komórki z dna studzienki, delikatnie pipetując w górę iw dół 2-3 razy.
    8. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty.
    9. Zawiesić komórki w 3 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK i policzyć je za pomocą hemacytometru.
    10. Płytka 1,5 × 106 iPSC w wstępnie powlekanym naczyniu o średnicy 10 cm z 12 ml pożywki iPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK.
    11. Następnego dnia usuń pożywkę i umyj komórki DPBS. Dodać 12 ml świeżo przygotowanej pożywki Complete Induction w celu wywołania ekspresji czynników transkrypcyjnych.
    12. W dniu 2 pokryj 10 cm szalki 5 ml roztworu powlekającego neurony przygotowanego z równymi objętościami 0,1 mg/ml poli-D-lizyny i 1 mg/ml poli-L-ornityny rozcieńczonej w buforze boranowym. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    13. W dniu 3 umyj naczynia pokryte sterylną wodą 3x, całkowicie odessaj wodę i pozostaw naczynia do wyschnięcia, przechylając talerze i pozostawiając je częściowo odkryte w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 1 godzinę w temperaturze otoczenia.
    14. Po całkowitym wyschnięciu naczyń pokryj je 6 ml pożywki Complete Induction uzupełnionej 15 μg/ml lamininy i 40 μM BrdU przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Leczenie BrdU jest zalecane w celu wyeliminowania komórek aktywnych mitotycznie i tym samym zwiększenia czystości kultur neuronalnych. Wpływ BrdU na zdrowie neuronów jest minimalny.
    15. Potraktuj różnicujące się komórki 3 ml odczynnika dysocjacyjnego na 10 cm naczynie i inkubuj przez 3-4 minuty w temperaturze otoczenia.
    16. Dodać 6 ml DPBS do płytki bez usuwania odczynnika dysocjacyjnego i odpipetować komórki w roztworze w górę iw dół 4-5 razy pipetą 10 ml w celu dysocjacji komórek.
    17. Zebrać zawiesinę komórkową i przepuścić ją przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 1 ml indukcyjnej pożywki bazowej, aby przepłukać sitko.
    18. Odwirować komórki w temperaturze 300 × g przez 5 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki do pełnej indukcji zawierającej 40 μM BrdU.
    19. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Umieścić około 2,5 × 106 komórek na 10 cm w naczyniach wstępnie powlekanych, rozcieńczając komórki w 6 ml pożywki Complete Induction zawierającej 40 μM BrdU bez usuwania roztworu powlekającego dodanego w kroku 2.1.14.
    20. W 4 dniu odessać pożywkę, przemyć komórki 1x DPBS i dodać świeżą pożywkę Complete Induction zawierającą 40 μM BrdU.
    21. W 6 dniu odessać pożywkę, przemyć komórki 1x DPBS i dodać pożywkę Neuron uzupełnioną 1 μg/ml lamininy.
    22. W 9 dniu zmień 1/3 pożywki, zastępując ją świeżą pożywką Neuron uzupełnioną 1 μg/ml lamininy.
    23. Utrzymuj i3LMN przez dodatkowe 25 dni, wykonując zmiany o połowę pożywki za pomocą pożywki Neuron uzupełnionej świeżym 1 μg/ml lamininy co 3-4 dni.
      UWAGA: W tym punkcie czasowym i3LMN powinny prezentować morfologię neuronów z długimi procesami. Neurony mają również tendencję do tworzenia skupisk lub skupisk komórek. Bardziej szczegółowy opis tego, jak sprawdzić rozróżnienie i3LMN, można znaleźć gdzie indziej17.
  2. Oczyszczanie i znakowanie synaptosomów
    UWAGA: Utrzymuj sterylne warunki i wykonuj wszystkie czynności wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Przemyći 3 LMN dwukrotnie za pomocą DPBS.
    2. Dodaj 2 ml lodowatego odczynnika do lizy komórek w celu wyizolowania synaptosomów, inkubuj na lodzie przez 2 minuty i mocno zeskrob neurony.
    3. Przenieść lizat do wielu mikroprobówek o pojemności 2 ml (~1,5 ml lizatu na probówkę) i odwirować przy 1 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Utrzymuj rurki na lodzie przez cały czas trwania tej procedury.
    4. Zebrać supernatant (odrzucić osad) i odwirować w temperaturze 15 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zachować i ponownie zawiesić osad zawierający synaptosomy o podobnej objętości (jak oryginalny lizat) 5% DMSO w DPBS.
      UWAGA: Synaptosomy można natychmiast znakować fluoroforem lub przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    5. Wykonać test białka kwasu bicunchoninowego (BCA) dla wszystkich probówek, aby ocenić całkowitą wydajność białka w preparacie synaptosomów.
      UWAGA: Można zastosować inne testy do pomiaru stężenia białka. Całkowity uzysk białka uzyskany z różnych preparatów został zamieszczony w tabeli 1 jako odniesienie. Zaleca się wykonanie analizy western blot preparatu synaptosomu w celu potwierdzenia obecności białek presynaptycznych i postsynaptycznych. W tym przypadku marker presynaptyczny, synaptofizyna (SYP) i marker postsynaptyczny, białko gęstości postsynaptycznej 95 (PSD95) zostały wybrane do analizy western blot, jak opisano wcześniej19.
    6. Przygotować roztwór 100 mM wodorowęglanu sodu w wodzie, dostosować pH do 8,5 i sterylnie przefiltrować.
    7. Rozpuścić 1 mg liofilizowanego proszku użytego barwnika wrażliwego na pH w 150 μl DMSO. Przygotować podwielokrotności jednorazowego użytku i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    8. Odwirować synaptosomy w temperaturze 15 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Rozcieńczyć do 1 mg synaptosomów w 100 μl 100 mM roztworu wodorowęglanu sodu.
    10. Aby oznaczyć synaptosomy, dodaj 1 μl odtworzonego barwnika wrażliwego na pH na 1 mg synaptosomów i przykryj reakcję folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny za pomocą shakera z rurką.
    11. Dodać 1 ml DPBS do probówki i odwirować znakowane synaptosomy w temperaturze 15 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Usunąć supernatant i wykonać cztery dodatkowe płukania zgodnie z opisem w kroku 2.2.11.
    13. Po ostatnim płukaniu i odwirowaniu należy usunąć supernatant w jak największym stopniu, nie naruszając osadu i ponownie zawiesić znakowane synaptosomy za pomocą 5% DMSO w DPBS w objętości odpowiadającej pożądanemu stężeniu (tutaj stosuje się 0,7 μg/μL). Przygotować jednorazowe porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C. Należy unikać ekspozycji na światło znakowane synaptosomy.
  3. Test fagocytozy żywej komórki
    1. Płytkę 20-30 × 104 PMP na 96-dołkowe płytki w 100 μl kompletnej pożywki iMG i obserwować proces różnicowania przez 10 dni, jak wskazano w kroku 1.2.4.
    2. W dniu testu należy przygotować roztwór do barwienia jądrowego, dodając 1 kroplę barwnika jądrowego dla żywych komórek do 2 ml podłoża podstawowego iMG.
    3. Usunąć 40 μl pożywki z każdego dołka z płytki 96-dołkowej i dodać 10 μl roztworu do barwienia jądrowego za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny.
    4. Rozmrozić znakowane synaptosomy na lodzie i delikatnie sonikować za pomocą sonikatora wodnego przez 1 minutę. Natychmiast przenieś synaptosomy z powrotem do lodu. Rozcieńczyć znakowane synaptosomy w kompletnej pożywce iMG w stosunku 1 μl synaptosomów na 50 μl pożywki.
      UWAGA: Stężenie synaptosomu jest zależne od testu i może wymagać optymalizacji. Aby utrzymać stosunkowo niski procent (tj. 0,1% lub mniej) DMSO w pożywce, zaleca się, aby nie dodawać więcej niż 2 μl synaptosomów na studzienkę.
    5. Jako kontrolę negatywną, należy wstępnie potraktować niektóre studzienki cytochalazyną D, aby zahamować polimeryzację aktyny, a tym samym fagocytozę. Przygotować roztwór 60 μM cytochalazyny D w kompletnym pożywce iMG. Dodać 10 μl tego roztworu do każdej studzienki dla końcowego stężenia 10 μM i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
    6. Wyjąć płytkę z inkubatora i inkubować w temperaturze 10 °C przez 10 minut. Utrzymać płytkę na lodzie i dodać 50 μl pożywki zawierającej synaptosomy przygotowanej w sposób opisany w kroku 2.3.4.
    7. Odwirować płytkę o masie 270 × g przez 3 minuty w temperaturze 10 °C i utrzymywać płytkę na lodzie do momentu uzyskania zobrazowania.
  4. Akwizycja i analiza obrazowania
    1. Włóż płytkę do czytnika obrazowania na żywych komórkach i wybierz studzienki do analizy.
    2. Wybierz obiektyw o powiększeniu 20x.
    3. Dostosuj ostrość, intensywność diody elektroluminescencyjnej (LED), czas integracji i wzmocnienie kanałów jasnego pola i niebieskiego (4',6-diamidino-2-fenyloindol [DAPI]). Fluorescencja synaptosomów powinna być znikoma w początkowym punkcie czasowym. Aby skupić się na kanale czerwonym (RFP), użyj kanału jasnego pola jako odniesienia. Czas integracji i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od eksperymentu; użyj tych ustawień początkowych dla kanału czerwonego: LED: 4, czas integracji: 250 i wzmocnienie: 5.
    4. Wybierz liczbę pojedynczych płytek, które mają zostać pozyskane w montażu na studnię (zdobądź 16 kafelków w środku studni, obrazując w ten sposób około 5% całkowitej powierzchni studni). Ustaw temperaturę na 37 °C i żądany przedział czasu dla obrazowania.
      UWAGA: W tym badaniu obrazy były rejestrowane co 1 - 2 godziny przez okres do 16 godzin.
    5. Otwórz oprogramowanie do analizy.
      1. Otwórz eksperyment zawierający obrazy. Kliknij ikonę Redukcja danych.
      2. W menu wybierz opcję Imaging Stitching (Łączenie obrazowania) w obszarze Imaging Processing (Przetwarzanie obrazu), aby utworzyć kompletny obraz z pojedynczych kafelków 4 x 4 w montażu z parametrami opisanymi w Tabeli 2.
      3. Po utworzeniu zszytych obrazów zdefiniuj próg intensywności, korzystając z kanałów DAPI i RFP dla tych obrazów. Otwórz obraz i kliknij Analizuj; w obszarze Analiza wybierz pozycję Analiza komórkowa, a następnie w obszarze Kanał detekcji wybierz zszyty obraz w kanałach DAPI lub RFP. Przejdź do zakładki Maska podstawowa i liczba i ustal wartość progową oraz wartości rozmiaru obiektu, które prawidłowo wybierają jądra komórkowe w kanale DAPI lub sygnał synapsomów w kanale RFP. Powtarzaj proces z różnymi obrazami, aż parametry, które można zastosować do całego eksperymentu, zostaną zoptymalizowane.
        UWAGA: Sugerowane wartości znajdują się w tabeli 2.
      4. Aby policzyć liczbę jąder, przejdź do menu Redukcja danych, a następnie w obszarze Analiza obrazu wybierz opcję Analiza komórkowa. Przejdź do zakładki Maska podstawowa i liczba i w obszarze Kanał wybierz obrazy zszyte DAPI i użyj parametrów opisanych w Tabeli 2.
      5. Przejdź do karty Obliczone metryki i wybierz pozycję Liczba komórek. Aby uzyskać obszar sygnału synaptosomu, przejdź do menu Redukcja danych i w obszarze Analiza wybierz Analiza komórkowa.
      6. Przejdź do karty Maska podstawowa i liczba, a następnie w obszarze Kanał wybierz obrazy zszyte w zapytaniu ofertowym i użyj parametrów wyszczególnionych w Tabeli 2.
      7. Przejdź do zakładki Metryki obliczeniowe i wybierz opcję Obszar sumy obiektów. W zakładce Redukcja danych kliknij OK i pozwól oprogramowaniu przeanalizować wszystkie pozyskane obrazy.
      8. Wyeksportuj wartości Suma powierzchni obiektu i Liczba komórek dla każdego punktu czasowego. Podziel obszar sumy obiektów przez liczbę komórek, aby obliczyć znormalizowany obszar na punkt czasu. W przypadku porównywania wielu terapii lub genotypów oblicz wskaźnik fagocytozy za pomocą równania (1):
        figure-protocol-1 (1)
      9. Zapisz wyniki i zintegruj dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wygenerować iMG za pomocą tego protokołu, ważne jest, aby zacząć od niezróżnicowanych iPSC, które wykazują zwartą morfologię kolonii z dobrze zdefiniowanymi krawędziami (Rysunek 2A). Zdysocjowane iPSC utrzymywane zgodnie z opisem w sekcji tworzenia EB utworzą sferyczne agregaty, zwane EB, które będą rosły do 4 dnia różnicowania (Rysunek 2B). Po zebraniu i posianiu EB w odpowiednich warunkach do wytworzenia PMP, przyczepiają się one do płytek pokrytych Matrigelem, a warstwa komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół różnicowania zapewnia skuteczną metodę uzyskiwania komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z iPSC w ciągu ~6-8 tygodni o wysokiej czystości i wystarczającej wydajności do przeprowadzenia eksperymentów immunofluorescencyjnych i innych testów, które wymagają większej liczby komórek. Protokół ten pozwolił uzyskać do 1 × 106 iMG w ciągu 1 tygodnia, co pozwala na ekstrakcję białek i RNA oraz odpowiednie dalsze analizy (np. RNASeq, qRT-PCR, western blot, spektrometria mas). To powiedziaws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Michaelowi Wardowi za dostarczenie linii iPSC WTC11 hNIL do różnicowania neuronów ruchowych oraz Jackson Laboratories za dostarczenie linii B03 iPSC klonu KOLF2.1J WT używanej do różnicowania mikrogleju. Dziękujemy również Dorothy Schafer za jej wsparcie podczas wdrażania protokołów, Anthony'emu Giampetruzziemu i Johnowi Landersowi za pomoc w systemie obrazowania żywych komórek, a także Haydenowi Gaddowi za jego wkład techniczny podczas poprawek oraz Jonathanowi Jungowi za współpracę w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience z UMASS Chan Medical School oraz Angel Fund, Inc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała do analizy immunofluorescencyjnej
anti-IBA1 przeciwciało królikaWako Chemical USANC92883641:350 rozcieńczenie
anty-P2RY12 przeciwciało królikaSigma-AldrichHPA014518rozcieńczenie 1:50
przeciwciało anty-TMEM119 królikaSigma-AldrichHPA051870rozcieńczenie
1:100Przeciwciała do analizy Western blot
-β-tubulina przeciwciało królikaAbcamab60461:500 rozcieńczenie
anty-synaptofizyny (SYP) przeciwciało królikaAbclonalA63441:1,000 rozcieńczenie
anty-PSD95 mysie przeciwciałoMilliporeMAB15961:500 rozcieńczenie
boranowy bufor Składniki
Kwas borowy (100 mM)SigmaB6768
Wodorowęglan sodu (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Chlorek sodu (75 mM)Sigma  S7653
Tetraboran sodu (25 mM)Sigma221732
Materiały do hodowli komórkowych
6-dołkowe płytkiGreiner Bio-One657160
40 μ m Sitka do komórek  Falcon352340
100 mm x 20 mm Hodowla tkankowaCELLTREAT229620
Podnośnik komórek, podwójny koniec, płaskie ostrze i Wąskie ostrze, sterylneCELLTREAT229305
96-dołkowa płytka o niskiej przyczepnościCorning7007
Primaria 24-dołkowa wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem i zmodyfikowaną powierzchniąCorning353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Zmodyfikowana powierzchniowo płytka hodowlana MultiwellCorning353846
Primaria 96-dołkowa przezroczysta płaska Dolna mikropłytkaCorning353872
Odczynniki do dysocjacji komórek
Accutase  Odczynniki25058CIstosowane do różnicowania dolnych neuronów ruchowych
Odczynnik TrypLETechnologies12-605-010odczynniki dysocjacyjne stosowane do różnicowania mikrogleju
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Odczynniki do
Coating do hodowli komórkowych
Matrigel GFR Matryca membranowaCorning™354230Określany jako odczynnik do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej
CellAdhere Laminin-521Technologia STEMCELL77004Określany jako laminina 521
Poli-D-lizynaSigmaP7405Rozpuszcza się do 0,1 mg / ml w buforze boranowym
Poly-L-OrnitynaSigma  P3655Rozpuścić do 1 mg/ml w buforze boranowym
Składniki pożywki iPSC
  mTeSR Plus KitSTEMCELL Technology100-0276Do przygotowania pożywki iPSC wymieszać składniki do 1x
Składniki podłoża EB
BMP-4Fisher ScientificPHC9534stężenie końcowe 50 ng/mL
iPSC mediastężenie końcowe 1x
Inhibitor ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822stężenie końcowe 10 &mikro; M
SCFPeproTech300-07stężenie końcowe 20 ng/ml
VEGFPeproTech100-20Astężenie końcowe 50 ng/mL
Składniki podłoża bazowego PMP
GlutaMAXGibco35050061stężenie końcowe 1x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122stężenie końcowe 100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988stężenie końcowe 1x
Składniki pożywki kompletnej PMP
55 mM 2-merkaptoetanolGibco21985023stężenie końcowe 55 &mikro; M
IL-3PeproTech200-03stężenie końcowe 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25stężenie końcowe 100 ng/mL
PMP podłoże bazowestężenie końcowe 1x
Składniki podłoża bazowego iMG
Advanced DMEM/F12Gibco12634010stężenie końcowe 1x
GlutaMAXGibco35050061stężenie końcowe 1x
suplement N2, 100xGibco17502-048stężenie końcowe 1x
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122stężenie końcowe 100 U/mL
Składniki pożywki complete iMG
55 mM 2-merkaptoetanolGibco21985023stężenie końcowe 55 &mikro; M
IL-34PeproTech lub Biologend200-34 lub 577904stężenie końcowe 100 ng/mL
iMG podłoże bazowestężenie końcowe 1x
M-CSFPeproTech300-25stężenie końcowe 5 ng/mL
TGF-βPeproTech100-21stężenie końcowe 50 ng/mL
Składniki indukcyjnej pożywki bazowej
DMEM/F12 z HEPESGibco11330032stężenie końcowe 1x
GlutaMAXGibco35050061stężenie końcowe 1x
suplement N2, 100xGibco17502-048final koncentracja 1x
Aminokwasy endogenne (NEAA), 100xGibco11140050stężenie końcowe 1x
Składniki kompletnego podłoża indukcyjnego
Compound ECalbiochem565790stężenie końcowe 0,2 μ M i rozpuścić odczynnik podstawowy do 2 mM w etanolu 1:1 i DMSO
DoksycyklinaSigmaD9891stężenie końcowe 2 μ g/ml i rozpuścić odczynnik podstawowy do 2 mg/ml w DPBS
em>Indukcyjne podłoże bazowestężenie końcowe 1x
inhibitor ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822stężenie końcowe 10 μ M
Składniki Neuron media
B-27 Plus System hodowli neuronówGibcoA3653401stężenie końcowe 1x do pożywki i suplementacji
GlutaMAXGibco35050061stężenie końcowe 1x
suplement N2, 100xGibco17502-048stężenie końcowe 1x
Aminokwasy endogenne (NEAA), 100xGibco11140050stężenie końcowe 1x
iPSC linie użyte w tym badaniu
KOLF2.1J: WT klon B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Synaptosome
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific Pierce23227
dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Odczynnik do ekstrakcji białek synaptycznychThermo Scientific87793Określany jako odczynnik do lizy komórek do izolacji synaptosomów
< silny> barwniki do testu fagocytozy< / silny>
Odczynnik NucBlue Live ReadyInvitrogen  R37605
pHrodo Red, ester sukcynimidylowyThermoFisher Scientific  P36600Określany jako barwnik wrażliwy na pH
< silny > Inne odczynniki do hodowli komórkowych< / silny>
Trypan Blue, 0,4% roztwórAMRESCO INCK940-100ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Rozpuścić do 40 mM w sterylnej wodzie
Cytochalazyna DSigmastężenie końcowe 10 i mikro; M
DPBS z wapniem i magnezemCorning21-030-CV
DPBS bez wapnia i magnezuCorning21-031-CVOkreślany jako DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012Określany jako DMEM-F12 zoptymalizowany pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
Białko myszy Laminin, naturalne23017015 GibcoOkreślane jako laminina
Oprogramowanie i sprzęt
WirówkaEppendorfModel 5810R
Cytacja 5 obrazowanie żywych komórek czytnikBiotek
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekwersja 3.03
Multi-ThermHeat-Shake Benchmarkokreśla się jako wytrząsarkę rurową
Sonikator wodnyElmaMode Transsonic 310
anti dysocjacyjne Corning Life hodowli komórkowych 15575020<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

r nicowanie mikroglejutest synaptosom wbarwienie immunofluorescencyjneWestern blotchoroby neurodegeneracyjne

Powiązane artykuły