Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64341

⸱

28 października 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Texas Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Streszczenie

Zrozumienie funkcji i mechanizmu toksyn tworzących pory (PFT) jest trudne, ponieważ komórki są odporne na uszkodzenia błony spowodowane przez PFT. Podczas gdy podejścia biofizyczne pomagają zrozumieć tworzenie się porów, często opierają się na podejściach redukcjonistycznych, w których brakuje pełnego zestawu lipidów i białek błonowych. Hodowane komórki ludzkie stanowią alternatywny system, ale ich złożoność i redundancja mechanizmów naprawczych utrudniają identyfikację konkretnych mechanizmów. Natomiast ludzki patogen pierwotniaka odpowiedzialny za leiszmaniozę skórną, Leishmania major, zapewnia optymalną równowagę między złożonością a znaczeniem fizjologicznym. L. major jest genetycznie podatny i może być hodowany do dużej gęstości in vitro, a każdy wpływ zaburzeń na infekcję można zmierzyć w ustalonych modelach mysich. Ponadto L. major syntetyzuje lipidy odmienne od ich ssaczych odpowiedników, co może zmieniać dynamikę błony. Te zmiany w dynamice błony można badać za pomocą PFT z najlepiej scharakteryzowanej rodziny toksyn, cytolizyn zależnych od cholesterolu (CDC). CDC wiążą się z ergosterolem w błonie Leishmania i mogą zabijać promastigoty L. major, co wskazuje, że L. major jest odpowiednim systemem modelowym do określania komórkowych i molekularnych mechanizmów funkcji PFT. W pracy opisano metody badania funkcji PFT u promastigotów L. major, w tym hodowlę pasożytów, narzędzia genetyczne do oceny podatności lipidów, testy wiązania błony i testy śmierci komórki. Testy te umożliwią szybkie wykorzystanie L. major jako potężnego systemu modelowego do zrozumienia funkcji PFT w szeregu ewolucyjnie zróżnicowanych organizmów i podobieństw w organizacji lipidów.

Wprowadzenie

Toksyny tworzące pory (PFT) to największa rodzina toksyn bakteryjnych1, ale mechanizmy, za pomocą których perforują i niszczą komórki, są słabo poznane. Najlepiej zbadaną rodziną toksyn tworzących pory są cytolizyny zależne od cholesterolu (CDC). CDC są głównie syntetyzowane przez bakterie Gram-dodatnie, w tym czynnik wywołujący martwicze zapalenie powięzi, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes wydziela streptolizynę O (SLO) CDC, która wiąże się ze sterolami w błonie komórkowej komórek gospodarza w postaci monomerów, oligomeryzów i wprowadza pory ~20-30 nm do błony1. Rola, jaką lipidy odgrywają w tym procesie, pozostaje słabo określona.

Jednym z podejść do badania interakcji lipid-CDC jest użycie chemicznie zdefiniowanych liposomów. Podczas gdy zdefiniowane liposomy dostarczają informacji o niezbędnych progach lipidów do podtrzymania wiązania toksyn i tworzenia porów3,4, nie podsumowują one w pełni funkcji komórkowych. Na przykład odtworzone liposomy nie mają asymetrii lipidowej gospodarzy ssaków i modyfikacji lipidów w odpowiedzi na toksyny5. Jedną z alternatyw dla liposomów jest użycie linii komórkowych ssaków. Chociaż te linie komórkowe są bardziej istotne fizjologicznie, istnieje duży stopień redundancji w mechanizmach wykrywania toksyn i oporności2. W związku z tym szlaki naprawcze wykorzystywane do opierania się CDC pozostają słabo określone. Warto zauważyć, że napływ Ca2+ jest głównym aktywatorem naprawy błony1. Za napływem Ca2+ zaangażowanych jest wiele ścieżek, w tym naprawa zależna od ceramidów6,7 i ścieżka naprawy zależna od MEK6. Szlaki te oddziałują z innymi efektorami białkowymi, w tym z endosomalnym kompleksem sortującym wymaganym do transportu (ESCRT)8 i annexins6,9,10. Analiza tych szlaków w komórkach ssaków jest trudna ze względu na redundancję, która utrudnia interpretację danych.

Jednym ze sposobów na zrównoważenie złożoności i prostoty w analizowaniu ścieżek naprawczych jest użycie prostszych organizmów, takich jak patogeny pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Leishmania sp. powoduje leiszmaniozę u ludzi i innych zwierząt. Leiszmanioza waha się od leiszmaniozy skórnej (samoograniczające się zmiany skórne) do śmiertelnej leiszmaniozy trzewnej (hepatosplenomegalia), w zależności od gatunku i innych czynników11. Leishmania major, czynnik wywołujący leiszmaniozę skórną, jest przenoszony na ludzi za pośrednictwem wektora muchy piaskowej i jest używany do zrozumienia funkcji Leishmania i infekcji12. Ponadto Leishmania sp. są digenic12. Występują jako wewnątrzkomórkowe pasożyty makrofagów ssaków określane jako amastigoty oraz jako swobodnie pływające, wiciowate promastigoty w muszkach piaskowych12. L. major promastigotes mogą być hodowane w pożywkach wzbogaconych surowicą, takich jak M199 do wysokiej gęstości13. Promastigoty są również genetycznie podatne; Istnieje wiele nokautów genów, w tym te ukierunkowane na szlaki biosyntezy lipidów13. Te nokauty mogą być oceniane pod kątem wzrostu i różnic w zakaźności i rozwoju zmian poprzez zakażenie myszy Balb/c13.

Oprócz względnej łatwości hodowli Leishmania i zakresu nokautów biosyntezy lipidów, pasożyt ma prostszy genom niż ssaki. Najlepiej scharakteryzowanym gatunkiem Leishmania jest L. major, który ma wiele istniejących narzędzi genetycznych, takich jak mutanty z wadliwym metabolizmem lipidów14. Warto zauważyć, że wiele białek naprawczych jest nieobecnych. L. major nie ma dotychczas zidentyfikowanych homologów dla kluczowych białek naprawczych ssaków, takich jak aneksyny. Umożliwia to scharakteryzowanie ewolucyjnie zachowanych ścieżek naprawczych bez złożoności systemów ssaków. Jednak do tej pory nie scharakteryzowano ścieżek naprawczych w Leishmania. W tym samym czasie kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w naprawę, takie jak ścieżka MEK6, są zachowane w Leishmania sp.15,16, chociaż homologi muszą zostać zweryfikowane. Szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) jest dobrze zbadany u L. mexicana, gdzie przyczynia się do wewnątrzkomórkowego przeżycia i termostabilności w komórkach ssaków oraz kontroluje metacyklogenezę16. W Leishmania sp. scharakteryzowano 10 z 15 MAPKs17. Przewiduje się, że LmMAPK9 i LmMAPK13 będą najbardziej podobne do ERK1/2 ssaków na podstawie tożsamości w konserwatywnej sekwencji warg fosforylacji. Sekwencja warg fosforylacji jest TEY zarówno dla ssaków ERK1/2, jak i LmMAPK9 i LmMAPK13. Jednak osiem z MAPK Leishmania ma motyw fosforylacji TDY15. Co najmniej dwa homologi MEK zostały zidentyfikowane w Leishmania sp., LmxMKK18 i kinazie pokrewnej MEKK (MRK1)19. Sugeruje to, że spostrzeżenia zidentyfikowane w Leishmania mogą przekładać się na systemy ssaków. Tam, gdzie nie przekładają się one na systemy ssaków, stanowią cele terapeutyczne w leczeniu leiszmaniozy.

Aby wykorzystać promastigoty L. major do badania naprawy błon i interakcji z toksynami, potrzebne są techniki o średniej przepustowości. Chociaż obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości umożliwia wizualizację znakowanych białek i błon w czasie rzeczywistym, ma niską przepustowość i może nie mierzyć przeżycia komórek. Średnioprzepustowe testy żywotności obejmują wychwyt barwnika mierzony za pomocą cytometrii przepływowej, pomiar aktywności mitochondriów lub uwalnianie białek komórkowych, takich jak dehydrogenaza mleczanowa (LDH). W komórkach ssaków testy LDH nie mierzą ilościowo śmierci komórki20. Co więcej, testy populacyjne, takie jak uwalnianie LDH lub aktywność mitochondriów, nie pozwalają na solidną analizę jednokomórkową lub wieloparametryczną20. Natomiast testy oparte na cytometrii przepływowej umożliwiają wieloparametryczną analizę pojedynczych komórek20. Jednak testy te nie zostały zastosowane do zrozumienia biologii toksyn lub reakcji na toksyny u promastigotów L. major.

W tym badaniu, SLO jest używane jako narzędzie do zrozumienia perturbacji błony plazmatycznej sfingolipidowego mutanta zerowego L. major w dwóch różnych - pożywka M199 rutynowo używana do hodowli L. major promastigotes i prostszy bufor Tyrode. Opisano test cytometrii przepływowej o średniej przepustowości, który jest stosowany do generowania krzywych dawka-odpowiedź toksyny. Dane z testu cytometrii przepływowej są modelowane do krzywej logistycznej w celu określenia wartości LC50. Dzięki tym informacjom można określić sublityczną dawkę SLO, aby można było zwalidować przeciwciała MAPK za pomocą western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie odpowiednie wytyczne oraz standardowe praktyki mikrobiologiczne, zasady bezpieczeństwa i hodowli komórkowych zostały zastosowane przy użyciu i obchodzeniu się z patogenem RG2 Leishmania major oraz rekombinacyjnym DNA. Wszystkie eksperymenty z żywymi L. major przeprowadzono w komorze z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium z certyfikatem BSL-2. Prace były nadzorowane przez Institutional Biosafety Committee Uniwersytetu Texas Tech.

UWAGA: Z punktu widzenia bezpieczeństwa, żywe promastigoty L. major są patogenami grupy ryzyka 2. Należy je obsługiwać z zastosowaniem odpowiednich środków zabezpieczających, środków ostrożności oraz pod nadzorem Instytucjonalnego Komitetu Biobezpieczeństwa (IBC). Substancje toksyczne i chemikalia należy traktować zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi substancji toksycznych. W przypadku użycia toksyn rekombinowanych, do prac z rekombinowanym DNA może być wymagana zgoda i nadzór IBC.

1. Hodowla i przygotowanie promastigot L. major

  1. Należy pozyskać, lub przygotować i zwalidować, L. major mutanty genetyczne, zgodnie z wcześniejszymi opisami, otrzymane za pomocą rekombinacji homologicznej lub metod opartych na systemie CRISPR13,21Należy wykorzystać linie z nokautem uzupełnione o gen wprowadzony z powrotem na plazmidzie, aby zapewnić specyficzność nokautu.
  2. Hodsowla typu dzikiego L. major i spt2- promastigoty w stężeniu 27 °C w pełnej pożywce M199. Hodować komórki z przywróconym episomalnie genem (spt2-(+SPT2) w pełnej pożywce M199 plus 10 µg/mL G418 (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów).
    UWAGA: Cała konfiguracja eksperymentalna obejmująca doświadczenia z L. major prace z komórkami muszą być wykonywane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2.
  3. Hodować promastigoty w pełnej pożywce M19922 aż do osiągnięcia fazy logarytmicznej (2-8 x 106 komórek/ml), określone na podstawie L. major wcześniej przeprowadzone testy krzywej wzrostu23Plan 1 x 105 komórek do każdej studni w celu oceny cytotoksyczności, plus 5 x 105 komórki do kontroli barwienia. W przypadku western blot zaplanuj 2 x 107 liczba komórek na dołek.
    UWAGA: Test cytotoksyczności należy przeprowadzić w dwóch powtórzeniach technicznych.
  4. Aby zweryfikować prawidłową gęstość komórek, wymieszaj alikwot (10-40 µL) promastigotów równą objętością utrwalacza (3,7% paraformaldehydu w 1x PBS). Nałożyć 10 µL utrwalonej próbki na każdą stronę komory countingowej (hemacytommetru).
    OSTROŻNIE: Formaldehyd jest substancją toksyczną. Należy z nim obchodzić się zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi substancji niebezpiecznych.
  5. Wykonaj liczenie komórek przy użyciu mikroskopu z powiększeniem 20x. Policz wszystkie komórki znajdujące się w 25 małych polach w centrum komory countingowej (hemacytometru). Powtórz czynność dla pól po obu stronach, a następnie wyciągnij średnią z uzyskanych wyników.
    UWAGA: Jeśli różnica między wartościami liczbowymi wynosi >10, przelicz ponownie i wyciągnij średnią. Jeśli średnia liczba wynosi <10 lub >100, zmień stopień rozcieńczenia i przeprowadź ponowne przeliczenie, a następnie oblicz gęstość kultury, korzystając z następującego wzoru:
    Wzór na obliczanie liczby komórek w komorze countingowej; średnia, współczynnik rozcieńczenia i potęga dziesiątki. (Równanie 1)
    Na przykład, jeżeli średnio występuje 250 Leishmania w 25 polach gęstość hodowli wynosi 5 x 106 komórek/ml
  6. Po policzeniu przenieś 5 x 106 komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 1500 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej w celu odwirowania komórek.
  7. Odlej supernatant za pomocą pipety 10 ml i krótko wymieszaj osad komórkowy w wstrząsacze wirowej. Do tej samej probówki dodaj 5 ml 1x PBS i wypłucz komórki, delikatnie odwracając probówkę 3–6 razy. Wirować przy 1500 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej, aby odwirować komórki do postaci osadu.
  8. Odrzuć supernatant, używając pipety 10 ml, i resuspenduj 5 x 106 osad komórkowy w 5 ml pożywki (np. M199 lub 1x bufor Tyrode'a) stosowanej w eksperymentach za pomocą pipety 5 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml

2. Test cytotoksyczności

  1. Przygotowanie eksperymentalne
    1. Oczyścić toksynę zgodnie z wcześniejszym opisem24 lub zakupić ją od dostawcy. Rozdzielić na jednorazowe alikwoty i przechowywać w temperaturze −80 °C do 1 roku. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
    2. Wyznaczyć aktywność hemolityczną dla każdej toksyny z użyciem ludzkich erytrocytów (patrz Tabela materiałów)24.
      UWAGA: Aktywność hemolityczną stosuje się w celu skontrolowania różnic w aktywności wynikających z oczyszczania, mutacji itp. Wybór gatunku erytrocytów może zmienić aktywność hemolityczną (np. intermedylizyna wymaga ludzkich erytrocytów).
    3. Zaplanować dwa powtórzenia techniczne dla każdego warunku, siedem rozcieńczeń dla krzywej dawka-odpowiedź oraz kontrolę bez toksyny.
      UWAGA: W przypadku promastygot typu dzikiego (WT), spt2- oraz spt2-/+SPT2, można przetestować dwa zabiegi na jednej płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Na przykład można porównać wrażliwość na media (Rysunek 1). Zamiast płytki z dnem w kształcie litery V można użyć probówek mikrotytrujących o pojemności 1,2 mL (patrz Tabela materiałów). Ze względu na czas akwizycji na cytometrze nie zaleca się uruchamiania więcej niż jednej płytki jednocześnie.
    4. Wybrać odpowiedni bufor do analizy na podstawie wymaganych warunków testowych i celu eksperymentu.
      UWAGA: W tym przykładzie porównano dwa bufory do analizy: M199 oraz bufor Tyrode'a uzupełniony barwnikiem żywotności jodkiem propidium (PI). Cholesterol w surowicy będzie zakłócał aktywność CDC24.
    5. Obliczyć ilość potrzebnej toksyny na podstawie warunków i liczby traktowanych genotypów. Upewnić się, że 50% specyficznej lizy występuje w połowie krzywej rozcieńczeń.
      UWAGA: Dla CDC dwukrotne rozcieńczenie seryjne zapewni dobry zakres dla późniejszego modelowania logistycznego. Dla promastygot spt2- zalecanym rozcieńczeniem początkowym jest 4 000 HU/mL SLO. W przypadku stosowania nieaktywnych toksyn można zamiast tego użyć masy odpowiadającej najwyższej dawce.
    6. Zaplanować końcową objętość 200 µL na dołek i dodać niewielką objętość nadmiarową (50-100 µL), aby uwzględnić błąd pipetowania.
      UWAGA: Przy trzech genotypach, z których każdy jest wykonywany w duplikacie, będzie sześć próbek do rozcieńczenia seryjnego.
    7. Obliczyć całkowitą ilość potrzebnej toksyny, korzystając z następującego wzoru:
      Równanie do obliczania objętości roztworu zapasu toksyny, pokazujące zmienne dla aktywności i korekty objętości. (Eq 2)
      gdzie ActivityMax to najwyższe użyte stężenie (HU/mL); TotalFinalVolume to całkowita objętość (dla sześciu próbek, 200 x 6 + 100 = 1 300 µL); ActivityStock to aktywność zapasu toksyny (HU/mL); a VolStockToxin to objętość potrzebnego zapasu toksyny.
    8. Przygotować wystarczającą ilość buforu do analizy niezbędnego do eksperymentu. Uzupełnić podłoże podstawowe barwnikiem żywotności oraz dowolną ilością Ca2+ lub EGTA potrzebną do kontroli poziomu Ca2+. Wymieszać w wortexie.
      UWAGA: Na przykład na każde 10 mL buforu Tyrode'a dodać 50 µL PI w stężeniu 2 mg/mL oraz 200 µL CaCl2 w stężeniu 100 mM, co daje końcowe stężenia odpowiednio 10 µg/mL i 2 mM.
    9. Upewnić się, że barwnik żywotności PI nie koliduje z innymi używanymi sondami, np. w testach wiązania fluorescencyjnego z użyciem toksyn sprzężonych z Cy5 lub AlexaFluor64720,25.
    10. Zaplanować rozcieńczenia toksyny w celu przygotowania roztworu 2x. Dodać bufor do analizy do probówek wirówkowych 1,5 mL i schłodzić na lodzie. Toksynę dodać bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy.
      UWAGA: W tym przykładzie dla najwyższego rozcieńczenia dodano by 1,3 mL buforu do analizy, a dla rozcieńczeń seryjnych 650 µL, aby przygotować 2-krotny roztwór toksyny.
  2. Eksperyment
    1. Odstawić 0,5 mL przetworzonych promastygot z kroku 1.8 do oddzielnej probówki jako „kontrolę niebarwioną”.
      UWAGA: Próbka ta zostanie użyta do ustawienia bramkowania na cytometrze przepływowym.
    2. Dodać PI w stężeniu 2 mg/mL do końcowego stężenia 10 µg/mL do pozostałych promastygot. Wymieszać w vortexie przez 3 s.
      UWAGA: Po dodaniu PI do przetworzonych promastygot komórki te mogą być używane tylko przez okres 2,5 h. Po 2,5 h komórki zaczynają obumierać, a wyniki stają się błędne.
    3. Dodać 1 x 105 (w 100 µL/dołek) przetworzonych promastygot do każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V lub do probótek mikrotytrujących 1,2 mL (Rysunek 1). Umieścić płytkę lub statyw z probówkami na lodzie pod kątem około 45° względem obserwatora. Pracować w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy obsłudze promastygot Leishmania.
    4. Dodać 100 µL buforu do analizy z PI do każdej kontroli bez toksyny (ostatni rząd). Zweryfikować poprawność dodania kontroli poprzez wizualną identyfikację probówek o całkowitej objętości 200 µL, które mają ciemniejszy kolor.
    5. Wyjąć alikwoty toksyny z −80°C, rozmrozić na lodzie i połączyć w razie potrzeby. Dodać objętość toksyny obliczoną w kroku 2.1.5 do najwyższego rozcieńczenia (przygotowanego w kroku 2.1.10). Następnie wykonać rozcieńczenie seryjne toksyny (Rysunek 1). Pipetować w górę i w dół co najmniej 8 razy, aby zapewnić wymieszanie.
      UWAGA: Wykonywać na lodzie, ponieważ CDC szybko ulegają inaktywacji w temperaturze pokojowej.
    6. Zaczynając od najniższego stężenia toksyny, szybko dodać 100 µL toksyny do odpowiedniego rzędu (Rysunek 1 oraz Rysunek 2) i kontynuować, aż cała toksyna zostanie dodana do komórek.
    7. Uszczelnić płytkę taśmą uszczelniającą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Po okresie inkubacji zapakować i przetransportować płytkę do cytometru przepływowego.
  3. Akwizycja danych
    1. Ustawić cytometr przepływowy (patrz Tabela materiałów) i oprogramowanie do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta i zasadami placówki. Nie przeprowadzać procedury cytometrii przepływowej bez wcześniejszego przeszkolenia na urządzeniu.
      UWAGA: W tym przykładzie użyto 4-laserowego Attune NxT. Sygnał PI zbierano na kanale YL-1 (wzbudzanie laserem 561 nm, przejście przez 577 LP, odbicie od 600 DLP i filtrowanie przez filtr pasmowy 585/16), choć szerokie widmo PI pozwala na zbieranie danych na innych kanałach.
    2. Używając niebarwionej próbki promastygot L. major, ustawić bramki dla rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC) oraz początkowe parametry fluorescencji na podstawie wybranych barwników.
    3. Jeśli to pożądane, dodać jeden dodatkowy parametr do wykresów kropkowych w celu sprawdzenia autofluorescencji (np. „bez barwienia”) (Rysunek 3).
      UWAGA: W tym przykładzie użyto kanału BL-1 (wzbudzanie laserem 488 nm, przejście przez 495 DLP i 503 LP, odbicie od 555 DLP i filtrowanie via filtr pasmowy 530/30).
    4. Używając kontroli barwionych pojedynczo, ustawić bramki dla barwnika żywotności (PI w tym badaniu) i wszelkich toksyn znakowanych fluorescencyjnie. Monitorować rozproszenie przednie w funkcji czasu w celu wykrycia mikrozatorów.
      UWAGA: PI będzie słabo barwić wszystkie komórki powyżej kontroli niebarwionych. Martwe komórki będą łatwo odróżnialne, a komórki przejściowo permeabilizowane znajdą się pomiędzy populacjami.
    5. Zebrać >10 000 bramkowanych zdarzeń dla każdej próbki na cytometrze.
      UWAGA: Zaleca się odczyt od próbek najbardziej do najmniej wrażliwych, ale kolejność akwizycji można odwrócić, aby sprawdzić wpływ kolejności odczytu na wyniki próbek.
    6. Zapisać dane i wyeksportować je zgodnie z potrzebami do analizy.
  4. Analiza danych
    UWAGA: W tym badaniu do analizy danych użyto programu Excel z dodatkiem Solver (patrz Tabela materiałów) (patrz Plik uzupełniający 1).
    1. Wybrać całkowitą populację pojedynczych komórek promastygot L. major, bramkując na rozproszeniu przednim, bocznym i czasie w razie potrzeby (Rysunek 3). Użyć wysokości (height) lub pola (area) zgodnie z zaleceniami dla danego cytometru przepływowego.
      UWAGA: Dla cytometru użytego w tym badaniu zalecanym parametrem zamiast pola jest wysokość.
    2. Zidentyfikować i wyznaczyć martwe komórki jako „PI high”. Wyznaczyć komórki pośrednie jako „PI low”. Komórki PI high to komórki martwe, natomiast komórki PI low to komórki przejściowo permeabilizowane26.
      UWAGA: Komórki PI high zazwyczaj wykazują przesunięcie o 2-3 logarytmy względem komórek negatywnych.
    3. Wyeksportować dane do programu Excel. Pobrać nazwę/ID próbki oraz %PI high, aby określić stopień uśmiercania.
      UWAGA: W przypadku użycia toksyn fluorescencyjnych konieczne będzie wyznaczenie mediany intensywności fluorescencji (MFI) dla populacji żywych, przejściowo permeabilizowanych i negatywnych. W celu oceny przejściowej permeabilizacji można wyeksportować %PI low.
    4. Wyznaczyć średni %PI high dla każdego warunku pomiędzy dwoma powtórzeniami technicznymi.
      UWAGA: Jeśli dla toksyn fluorescencyjnych wymagana jest średnia MFI, należy ją również obliczyć.
    5. Obliczyć %specyficznej lizy na podstawie %PI high, korzystając z następującego wzoru24,25:
      Wzór na %specyficznej lizy: (obliczenie %lizy), stosowany w ocenie wydajności lizy komórek. (Eq 3)
      gdzie PIhighxpt to %PI high dla warunku eksperymentalnego, a PIhighctl to %PI high dla kontroli bez toksyny.
    6. Nanieść %specyficznej lizy w funkcji stężenia toksyny dla krzywej dawka-odpowiedź (Rysunek 4).
    7. Zorganizować krzywą dawka-odpowiedź w programie Excel do modelowania logistycznego. Uwzględnić stężenie toksyny i średni %specyficznej lizy wraz ze szczegółami eksperymentu i/lub surowymi obliczeniami %PI high (Tabela 2).
    8. Upewnić się, że dodatek Solver jest włączony.
      UWAGA: Aby włączyć Solver w wersji stacjonarnej programu Excel, należy przejść do Plik > Opcje > Dodatki i zaznaczyć pole Solver. Ponownie uruchomić program Excel.
    9. Oznaczyć cztery kolejne kolumny jako „modeled” (modelowane), „residuals” (rezydua), „parameters” (parametry) i „parameter values” (wartości parametrów). Zweryfikować, czy pierwsze kolumny odpowiadają parametrom eksperymentalnym, stężeniu toksyny i %specyficznej lizie (Tabela 2).
    10. Dodać następujące parametry w kolumnie „parameters”: L, k, c, SUM oraz LC50. Zainicjować parametry L, k i c, wpisując w kolumnie „parameter values” następujące wartości: 100, 0,05, 1 000.
    11. W kolumnie „modeled” stworzyć model logistyczny za pomocą następującego wzoru:
      Równanie wzrostu logistycznego; model statyczny; wzór do dopasowania danych w analizie badawczej. (Eq 4)
      Przypisać L, k i c do komórek zawierających te parametry w kolumnie „parameter values”.
      Przypisać x do komórki zawierającej stężenie toksyny.
      UWAGA: Dla Tabeli 2, komórki G4, wzór wygląda następująco: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
    12. Zastosować to równanie do wszystkich wartości %specyficznej lizy z wyjątkiem kontroli bez toksyny.
    13. W kolumnie „residuals” obliczyć kwadrat różnicy między liczbą modelowaną a rzeczywistą specyficzną lizą, korzystając z następującego równania:
      Wzór na obliczenie rezyduów, residual=(y-m)^2, związany z analizą błędów w dopasowaniu danych. (Eq. 5)
      gdzie y to eksperymentalna %specyficzna liza, a m to odpowiadająca jej wartość w kolumnie „modeled” obliczona w krokach 2.4.10-2.4.11.
    14. W kolumnie „parameter values” obok „SUM” zsumować wszystkie wartości w kolumnie rezyduów.
    15. W kolumnie „parameter values” obok „LC50” wprowadzić równanie do obliczenia LC50 z wyznaczonych wartości. Jest to rozwiązanie równania 4 dla x przy m = 50.
      Wzór na obliczenie LC50 dla analizy danych dawka-odpowiedź. (Eq 6)
      Dla Tabeli 2 formuła w programie Excel wygląda następująco: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4
    16. Otworzyć Solver z karty Dane. W polu Ustaw cel wybrać komórkę zawierającą obliczoną sumę rezyduów. Ustawić na Min.
    17. Zmienić komórki zmiennych dla wartości parametrów L, k i c.
      UWAGA: Solver może działać lepiej, jeśli opcja „Uczyń zmienne nieograniczone nieujemnymi” pozostanie zaznaczona.
    18. W przypadku ujemnych wartości k, zmodyfikować równanie 4 i równanie 6, wyłączając −1 przed k, aby zmienić k na dodatnie. Użyć metody rozwiązywania GRG nieliniowej. Kliknąć Rozwiąż.
    19. Sprawdzić krzywą oraz czy LC50 jest automatycznie obliczane zgodnie z równaniem 6 (Tabela 2). Zweryfikować dopasowanie, wykreślając graficznie zarówno %specyficznej lizy, jak i model w funkcji stężenia toksyny.
      UWAGA: Można to również sprawdzić, obliczając R2 dla krzywej.

3. Analiza białek promastygot L. major poddanych działaniu toksyny

  1. Przygotować promastigoty L. major zgodnie z opisem w sekcji 1.
  2. Resuspendować 2 x 107 promastigot L. major typu WT, spt2- oraz spt2-/+SPT2 w 2 mL odpowiedniego buforu do analizy, używając pipety 5 mL (np. M199 bez surowicy). Dodać toksynę do końcowego stężenia sublizującego i inkubować w 37 °C przez 30 min.
    UWAGA: Przykładowo, sublizująca dawka SLO dla promastigot spt2- wynosi 500 HU/mL.
  3. Uwzględnić inne genotypy oraz kontrole bez toksyny.
  4. Odwirować promastigoty przy 1,500 x g przez 10 min w celu osadzenia komórek. Usunąć nadsącz za pomocą pipety 10 mL. Zamkniętą probówkę z osadem komórkowym szybko przesunąć trzy razy po nierównej powierzchni, np. po kratce dygestorium z laminarem, aby rozbić osad komórkowy.
    UWAGA: Osad komórkowy jest niemal niewidoczny gołym okiem.
  5. Przygotować 1x bufor do próbek SDS-PAGE z 2-merkaptoetanolem bezpośrednio przed użyciem i podgrzać do 95 °C przez 10 min przed dodaniem do osadu komórkowego. Resuspendować osad komórkowy w gorącym 1x buforze do próbek SDS-PAGE i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Podgrzać resuspendowany osad komórkowy w 1x buforze do próbek w 95 °C przez 10 min.
    UWAGA: Po solubilizacji w buforze do próbek próbki można przechowywać długotrwale w −20 °C, jeśli jest to wymagane.
  6. Przygotować żel rozdzielający. Odgazować wszystkie składniki z wyjątkiem persiarczanu amonu (APS) i TEMED przez 15 min.
  7. Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed odlewaniem żelu. Ostrożnie przykryć żel rozdzielający warstwą wody. Pozostawić żel rozdzielający do spolimeryzowania na około 30-45 min.
  8. Odlać wodę i przygotować żel koncentrujący. Dodać żel koncentrujący, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Włożyć grzebień z odpowiednią liczbą studzienek i pozostawić do spolimeryzowania na 5 min. Monitorować polimeryzację, używając pozostałości żelu koncentrującego.
  9. Złożyć żel do prowadzenia SDS-PAGE i dodać bufor do komory.
  10. Nanieść 10 µL każdej próbki na studzienkę lub 8 µL drabinki białkowej. Prowadzić elektroforezę przy 180 V, aż próbki wejdą w żel rozdzielający, a następnie zmniejszyć napięcie do około 160 V i prowadzić do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie się około 0,5 cm od krawędzi płyty.
    UWAGA: Czas dotarcia próbek do dołu może wynosić od 1 do 1,5 h. Czas ten można wydłużyć, zmniejszając napięcie. Nigdy nie należy zmniejszać napięcia do zera. Wyższe napięcia mogą zwiększać efekt „uśmiechu” żelu i powodować pękanie płyt.
  11. Przenieść żel do barwnika Coomassie (do barwienia białek) lub do 1x buforu do transferu (do western blottingu). W przypadku barwienia Coomassie barwić przez noc, a następnie odbarwić, obrazować i wysuszyć.
  12. W przypadku western blottingu przygotować system transferu zgodnie z instrukcjami producenta.
  13. W przypadku transferu mokrego użyć zimnego 1x buforu do transferu i uprzednio zwilżyć gąbki, papier filtrujący oraz nitrocelulozę. Dla systemu Bio-rad Protean III (patrz Tabela materiałów) użytego w tym protokole, papier filtrujący można dociąć do wymiarów 10 cm x 7,5 cm. Nitrocelulozę dociąć do 9 cm x 6,75 cm.
    UWAGA: Nitroceluloza jest wysoce łatwopalna. Unikać otwartego ognia i innych potencjalnych źródeł zapłonu.
  14. Ułożyć kasetę do transferu z gąbkami, papierem filtrującym i nitrocelulozą. Wywolić pęcherzyki powietrza. Ostrożnie włożyć żel.
  15. Dodać papier filtrujący i wywolić pęcherzyki powietrza. Dodać gąbkę, zamknąć kasetę i włożyć do uchwytu w odpowiedniej orientacji (upewnić się, że nitroceluloza jest skierowana w stronę czerwonego terminala). Dodać mieszadło magnetyczne i wkład chłodzący z boku, a następnie dopełnić zbiornik zimnym 1x buforem do transferu. Przeprowadzić transfer przy 110 V przez 90 min.
    UWAGA: Ciepło generowane podczas transferu może negatywnie wpływać na jego przebieg. Aby zapewnić prawidłowy transfer, zawsze należy używać zimnego 1x buforu do transferu.
  16. Wyjąć nitrocelulozę i barwić roztworem Ponceau przez około 5 min. Płukać wodą ultrapure. Zaznaczyć drabinkę białkową ołówkiem i przyciąć blot w razie potrzeby. Odbarwić blot, używając pozostałego buforu do transferu.
    UWAGA: Roztwór Ponceau można wykorzystywać wielokrotnie.
  17. Blokować nitrocelulozę w 25 mL 5% BSA w 1x TBST w 4 °C z wytrząsaniem przez noc. Następnie odlać roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe (1:1,000) w 1% BSA w 1x TBST. Wytrząsać w 4 °C przez noc.
    UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe można przechowywać w −20 °C i wykorzystywać wielokrotnie.
  18. Przemyć nitrocelulozę 3x przez 10 min każdorazowo w 1x TBST z wytrząsaniem. Odlać bufor do mycia i dodać 10 mL przeciwciała wtórnego sprzężonego z HRP (1:10,000) w 1% BSA w 1x TBST. Wytrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przemyć nitrocelulozę 3x przez 10 min każdorazowo w 1x TBST z wytrząsaniem.
  19. Przygotować odczynnik ECL bezpośrednio przed obrazowaniem nitrocelulozy. Bezpośrednio przed obrazowaniem odlać TBST i dodać odczynnik ECL do nitrocelulozy. Wytrząsać przez 1 min. Obrazować żel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwiększona wrażliwość promastigot na SLO w buforze Tyroide'a w porównaniu do M199
Wrażliwość promastigot L. major na SLO porównano w różnych buforach do analizy. Promastigoty typu dzikiego, spt2- oraz spt2-/+SPT2 poddano działaniu SLO w bezserwatkowym M199 lub buforze Tyroide'a uzupełnionym o 2 mM CaCl2 przez 30 min przed analizą za pomocą cytometru przepływowego. Jako odpowiednie do analizy pasożyty zidentyfikowano pojedyncze komórki na pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano metody badania mechanizmów molekularnych i funkcji PFT, wykorzystując ludzki patogen Leishmania major jako system modelowy. Opracowano średnioprzepustowy test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru żywotności pojedynczych komórek. Żywotność jest ilościowa na poziomie populacji, ponieważ wartości LC50 można obliczyć na podstawie krzywej dawka-odpowiedź przy użyciu modelowania logistycznego. Jako dowód słuszności zasady, zastosowano test cytometrii przep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Praca ta była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia grant R21AI156225 dla PAK i KZ (co-I) oraz R01AI139198 dla KZ (co-I). CH pragnie podziękować Wydziałowi Nauk Biologicznych za asystenturę dydaktyczną świadczoną w czasie tego badania.

Agencje finansujące nie odegrały żadnej roli w opracowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; ani w decyzji o publikacji wyników. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących. Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratoriów Keyela i Zhanga za ich krytyczną recenzję manuskryptu. Autorzy dziękują College of Arts and Sciences Microscopy za korzystanie z urządzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2 ml probówki do mikromiareczkowania (Marsh)Fisher02-681-376Test cytotoksyczności
1,5 ml probówka do mikrowirówekFisher05-408-129Rozcieńczenia toksyn
15 ml probówka wirówkowa Avantor VWR (Radnor, PA)89039-666Do przechowywania komórek i pożywek
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)FisherBP399Do przetwarzania komórek
3% H2O2 Walmart  (Fayetteville, AR)Nie dotyczydla ECL
5x M199Cell-gro11150067Podstawowa pożywka wzrostowa dla L. major promastigoty
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoBakerDo hodowli komórek w sterylnych warunkach
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)FisherBP1605-100Frakcja V dopuszczalna czystość
CaCl2FisherBP510-100Stężenie zapasów 100 mM
WirówkaThermo Fisher Heraeus Megafuge 40RDo granulowania komórek z hodowli
Cy5 Pakiet barwników monoreaktywnychCytiva (Marlborough, MA)PA25031Etykieta fluoroforowa dla toksyn
Cyfrowa sucha kąpielBenchmarkBSH1002Do denaturacji próbek białek
EGTAAmresco0732-100GStężenie zapasów 0,5 M
ExcelMicrosoft (Redmond, VA)Analiza danych oprogramowanie
Cytometr przepływowy (4-laserowy Attune NxT)CytometrFisherdo akwizycji danych
FlowJoBD (Ashland, OR)Oprogramowanie
FormaldehydFisherBP531-500Utrwalacz do liczenia komórek
G418FisherBP673-1Środek selekcyjny do komórek
Hellmanex IIISigmaZ805939Rozcieńczony 1:4 do czyszczenia cytometru
HemacytometrFisher0267151BDo liczenia komórek
Ludzkie krwinki czerwoneZen-bio (Durham, NC)SER-10MLRBCAby potwierdzić aktywność toksyny Wiadro
na lód
Mikroskop świetlnyNikonEclipse 55iDo wizualizacji komórek
NitrocelulozaFisher88018Do sondowania białka za pośrednictwem przeciwciał
Pipetory i końcówkiAvantor VWRDo dozowania odczynników
ZasilanieBio-RadDo uruchamiania SDS-PAGE i transferów
Jodek propidynyBiotium40016Stężenie zapasowe 2 mg/ml w wodzie
Drabinka białkowaBio-Rad161-0373Do oznaczania masy cząsteczkowej białek
SDS-PAGE Running Aparatura (Mini Protean III)Bio-Rad165-3302Do rozdzielania białek na podstawie ich wielkości
Taśma uszczelniającaR& DDY992Do uszczelniania płytek z komórkami
Streptolizyna O C530A wstawkaSklonowana do wektora pBAD-gIII (Odniesienie: 7)
Streptolizyna Toksyna O C530ALaboratoryjnie oczyszczonaAktywność specyficzna  4,34 x 105 HU/mg
Wahliwy wirnik kubełkowyThermo Fisher 75003607Do odwirowania komórek Płytka
V z dnemGreiner Bio-one651206Do oznaczania cytotoksyczności
VortexBenchmarkBV1000Do mieszania komórek
System obrazowania Western blot (Chemi-doc)Bio-RadDo wizualizacji białek za pomocą Western Blot
Aparat do przenoszenia Western Blot (Mini Protean III)Bio-Rad170-3930Transfer białka do nitrocelulozy
Bibuła filtracyjna WhatmanGE Healthcare Life Sciences3030-700Stosowana w przenoszeniu białek do nitrocelulozy
przeciwciało
Anti-ERKTechnologie sygnalizacji komórkowej Kot# 9102SKrólik (rozcieńczenie 1:1000)
Przeciwciało anty-lipofosfoglikan (LPG)CreativeBioLabs Cat# WIC79.3(1: 1000)
przeciwciała anty-MEK Kot# 9122LKrólik (1:1000)
Anty-mysi IgG, koniugat HRPJackson Immunoresearch Kot#715-035-151Osioł (1:10000)
Przeciwciało anty-fosphoERKTechnologie sygnalizacji komórkowej Kot# 9101SKrólik (1:1000)
przeciwciała anty-pMEK Kot# 9121SKrólik (1:1000)
Anty-królicze IgG, koniugat HRPJackson Immunoresearch Kot#711-035-152Osioł (1:10000)
Przeciwciało antytubulinoweSigmaCat# T5168Mysz (1: 2000)
Leishmania major Genotypy  Odniesienie: 13
Addback episomalny (spt2-/+SPT2)Δ spt2::HYG/Δ spt2: PAC/+pXG-SPT2
Podjednostka 2 palmitoilotransferazy serynowej nokaut (spt2-)Δ spt2::HYG/Δ spt2::P AC 
Typ dziki (WT)LV39 klon 5 (Rho/SU/59/P)
plazmidowa Mysz Technologie sygnalizacji komórkowej Technologie sygnalizacji komórkowej

Bibliografia

  1. Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531(2020).
  2. Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
  3. Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
  4. Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
  5. Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
  6. Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
  7. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
  8. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136(2014).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
  10. Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
  11. Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
  12. Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
  13. Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
  14. Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
  15. Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
  16. Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
  17. Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968(2011).
  18. Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. Protein kinase involved in flagellar-length control. Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).
  19. Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
  20. Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
  21. Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095(2017).
  22. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  23. Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602(2019).
  24. Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227(2012).
  25. Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
  26. Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
  27. Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
  28. Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprawa błonycytolizyny zależne od cholesterolucytometria przepływowatest żywotności komórekrozcieńczanie seryjnebarwienie jodkiem propidialnymknockout SPT2dynamika błony plazmatycznej
Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.