Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Summary

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Abstract

Zrozumienie funkcji i mechanizmu toksyn tworzących pory (PFT) jest trudne, ponieważ komórki są odporne na uszkodzenia błony spowodowane przez PFT. Podczas gdy podejścia biofizyczne pomagają zrozumieć tworzenie się porów, często opierają się na podejściach redukcjonistycznych, w których brakuje pełnego zestawu lipidów i białek błonowych. Hodowane komórki ludzkie stanowią alternatywny system, ale ich złożoność i redundancja mechanizmów naprawczych utrudniają identyfikację konkretnych mechanizmów. Natomiast ludzki patogen pierwotniaka odpowiedzialny za leiszmaniozę skórną, Leishmania major, zapewnia optymalną równowagę między złożonością a znaczeniem fizjologicznym. L. major jest genetycznie podatny i może być hodowany do dużej gęstości in vitro, a każdy wpływ zaburzeń na infekcję można zmierzyć w ustalonych modelach mysich. Ponadto L. major syntetyzuje lipidy odmienne od ich ssaczych odpowiedników, co może zmieniać dynamikę błony. Te zmiany w dynamice błony można badać za pomocą PFT z najlepiej scharakteryzowanej rodziny toksyn, cytolizyn zależnych od cholesterolu (CDC). CDC wiążą się z ergosterolem w błonie Leishmania i mogą zabijać promastigoty L. major, co wskazuje, że L. major jest odpowiednim systemem modelowym do określania komórkowych i molekularnych mechanizmów funkcji PFT. W pracy opisano metody badania funkcji PFT u promastigotów L. major, w tym hodowlę pasożytów, narzędzia genetyczne do oceny podatności lipidów, testy wiązania błony i testy śmierci komórki. Testy te umożliwią szybkie wykorzystanie L. major jako potężnego systemu modelowego do zrozumienia funkcji PFT w szeregu ewolucyjnie zróżnicowanych organizmów i podobieństw w organizacji lipidów.

Introduction

Toksyny tworzące pory (PFT) to największa rodzina toksyn bakteryjnych¹, ale mechanizmy, za pomocą których perforują i niszczą komórki, są słabo poznane. Najlepiej zbadaną rodziną toksyn tworzących pory są cytolizyny zależne od cholesterolu (CDC). CDC są głównie syntetyzowane przez bakterie Gram-dodatnie, w tym czynnik wywołujący martwicze zapalenie powięzi, Streptococcus pyogenes². S. pyogenes wydziela streptolizynę O (SLO) CDC, która wiąże się ze sterolami w błonie komórkowej komórek gospodarza w postaci monomerów, oligomeryzów i wprowadza pory ~20-30 nm do błony¹. Rola, jaką lipidy odgrywają w tym procesie, pozostaje słabo określona.

Jednym z podejść do badania interakcji lipid-CDC jest użycie chemicznie zdefiniowanych liposomów. Podczas gdy zdefiniowane liposomy dostarczają informacji o niezbędnych progach lipidów do podtrzymania wiązania toksyn i tworzenia porów^3,4, nie podsumowują one w pełni funkcji komórkowych. Na przykład odtworzone liposomy nie mają asymetrii lipidowej gospodarzy ssaków i modyfikacji lipidów w odpowiedzi na toksyny⁵. Jedną z alternatyw dla liposomów jest użycie linii komórkowych ssaków. Chociaż te linie komórkowe są bardziej istotne fizjologicznie, istnieje duży stopień redundancji w mechanizmach wykrywania toksyn i oporności². W związku z tym szlaki naprawcze wykorzystywane do opierania się CDC pozostają słabo określone. Warto zauważyć, że napływ Ca²⁺ jest głównym aktywatorem naprawy błony¹. Za napływem Ca²⁺ zaangażowanych jest wiele ścieżek, w tym naprawa zależna od ceramidów^6,7 i ścieżka naprawy zależna od MEK⁶. Szlaki te oddziałują z innymi efektorami białkowymi, w tym z endosomalnym kompleksem sortującym wymaganym do transportu (ESCRT)⁸ i annexins^6,9^,10. Analiza tych szlaków w komórkach ssaków jest trudna ze względu na redundancję, która utrudnia interpretację danych.

Jednym ze sposobów na zrównoważenie złożoności i prostoty w analizowaniu ścieżek naprawczych jest użycie prostszych organizmów, takich jak patogeny pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Leishmania sp. powoduje leiszmaniozę u ludzi i innych zwierząt. Leiszmanioza waha się od leiszmaniozy skórnej (samoograniczające się zmiany skórne) do śmiertelnej leiszmaniozy trzewnej (hepatosplenomegalia), w zależności od gatunku i innych czynników¹¹. Leishmania major, czynnik wywołujący leiszmaniozę skórną, jest przenoszony na ludzi za pośrednictwem wektora muchy piaskowej i jest używany do zrozumienia funkcji Leishmania i infekcji¹². Ponadto Leishmania sp. są digenic¹². Występują jako wewnątrzkomórkowe pasożyty makrofagów ssaków określane jako amastigoty oraz jako swobodnie pływające, wiciowate promastigoty w muszkach piaskowych¹². L. major promastigotes mogą być hodowane w pożywkach wzbogaconych surowicą, takich jak M199 do wysokiej gęstości¹³. Promastigoty są również genetycznie podatne; Istnieje wiele nokautów genów, w tym te ukierunkowane na szlaki biosyntezy lipidów13. Te nokauty mogą być oceniane pod kątem wzrostu i różnic w zakaźności i rozwoju zmian poprzez zakażenie myszy Balb/c¹³.

Oprócz względnej łatwości hodowli Leishmania i zakresu nokautów biosyntezy lipidów, pasożyt ma prostszy genom niż ssaki. Najlepiej scharakteryzowanym gatunkiem Leishmania jest L. major, który ma wiele istniejących narzędzi genetycznych, takich jak mutanty z wadliwym metabolizmem lipidów¹⁴. Warto zauważyć, że wiele białek naprawczych jest nieobecnych. L. major nie ma dotychczas zidentyfikowanych homologów dla kluczowych białek naprawczych ssaków, takich jak aneksyny. Umożliwia to scharakteryzowanie ewolucyjnie zachowanych ścieżek naprawczych bez złożoności systemów ssaków. Jednak do tej pory nie scharakteryzowano ścieżek naprawczych w Leishmania. W tym samym czasie kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w naprawę, takie jak ścieżka MEK⁶, są zachowane w Leishmania sp.^15,16, chociaż homologi muszą zostać zweryfikowane. Szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) jest dobrze zbadany u L. mexicana, gdzie przyczynia się do wewnątrzkomórkowego przeżycia i termostabilności w komórkach ssaków oraz kontroluje metacyklogenezę¹⁶. W Leishmania sp. scharakteryzowano 10 z 15 MAPKs¹⁷. Przewiduje się, że LmMAPK9 i LmMAPK13 będą najbardziej podobne do ERK1/2 ssaków na podstawie tożsamości w konserwatywnej sekwencji warg fosforylacji. Sekwencja warg fosforylacji jest TEY zarówno dla ssaków ERK1/2, jak i LmMAPK9 i LmMAPK13. Jednak osiem z MAPK Leishmania ma motyw fosforylacji TDY¹⁵. Co najmniej dwa homologi MEK zostały zidentyfikowane w Leishmania sp., LmxMKK¹⁸ i kinazie pokrewnej MEKK (MRK1)¹⁹. Sugeruje to, że spostrzeżenia zidentyfikowane w Leishmania mogą przekładać się na systemy ssaków. Tam, gdzie nie przekładają się one na systemy ssaków, stanowią cele terapeutyczne w leczeniu leiszmaniozy.

Aby wykorzystać promastigoty L. major do badania naprawy błon i interakcji z toksynami, potrzebne są techniki o średniej przepustowości. Chociaż obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości umożliwia wizualizację znakowanych białek i błon w czasie rzeczywistym, ma niską przepustowość i może nie mierzyć przeżycia komórek. Średnioprzepustowe testy żywotności obejmują wychwyt barwnika mierzony za pomocą cytometrii przepływowej, pomiar aktywności mitochondriów lub uwalnianie białek komórkowych, takich jak dehydrogenaza mleczanowa (LDH). W komórkach ssaków testy LDH nie mierzą ilościowo śmierci komórki²⁰. Co więcej, testy populacyjne, takie jak uwalnianie LDH lub aktywność mitochondriów, nie pozwalają na solidną analizę jednokomórkową lub wieloparametryczną²⁰. Natomiast testy oparte na cytometrii przepływowej umożliwiają wieloparametryczną analizę pojedynczych komórek²⁰. Jednak testy te nie zostały zastosowane do zrozumienia biologii toksyn lub reakcji na toksyny u promastigotów L. major.

W tym badaniu, SLO jest używane jako narzędzie do zrozumienia perturbacji błony plazmatycznej sfingolipidowego mutanta zerowego L. major w dwóch różnych - pożywka M199 rutynowo używana do hodowli L. major promastigotes i prostszy bufor Tyrode. Opisano test cytometrii przepływowej o średniej przepustowości, który jest stosowany do generowania krzywych dawka-odpowiedź toksyny. Dane z testu cytometrii przepływowej są modelowane do krzywej logistycznej w celu określenia wartości LC₅₀. Dzięki tym informacjom można określić sublityczną dawkę SLO, aby można było zwalidować przeciwciała MAPK za pomocą western blot.

Protocol

Wszystkie odpowiednie wytyczne i standardowe praktyki mikrobiologiczne, bezpieczeństwa i hodowli komórkowych zostały zastosowane do stosowania i obchodzenia się z patogenem RG2 Leishmania major i rekombinowanym DNA. Wszystkie eksperymenty z żywym L. major przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium certyfikowanym przez BSL-2. Prace były nadzorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Technicznego w Teksasie.

UWAGA: Z punktu widzenia bezpieczeństwa, żywe L. major promastigotes są patogenami grupy ryzyka 2. Postępuj zgodnie z odpowiednimi zabezpieczeniami, środkami ostrożności i nadzorem ze strony Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC). Z substancjami toksycznymi i chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi substancji toksycznych. Jeśli stosowane są rekombinowane toksyny, może być konieczne zatwierdzenie i nadzór IBC nad pracami nad rekombinowanym DNA.

1. Uprawa i przygotowanie L. major promastigotes

1. Uzyskanie lub stworzenie i walidacja L. główne mutanty genetyczne zgodnie z wcześniejszym opisem przy użyciu rekombinacji homologicznej lub metod opartych na CRISPR^13,21. Użyj nokautów uzupełnionych genem dodanym z powrotem na plazmidzie, aby zapewnić specyficzność nokautu.
2. Hodowla dzikich typów L. major i spt2^- promastigotes w temperaturze 27 °C w kompletnym pożywce M199. Hodować episomalne komórki addbacku (spt2^-/+SPT2) w kompletnym M199 plus 10 μg/ml G418 (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów).
   UWAGA: Cała konfiguracja eksperymentalna obejmująca eksperymenty z głównymi komórkami L. musi być wykonana w komorze bezpieczeństwa biologicznego z certyfikatem BSL2.
3. Hoduj promastigoty w kompletnym M199 medium²², aż osiągną fazę logarytmiczną (2-8 x 10⁶ komórek/ml), zgodnie z ustaleniami L. główne testy krzywej wzrostu wykonane wcześniej²³. Zaplanuj 1 x 10⁵ komórek dla każdej studzienki pod kątem cytotoksyczności oraz 5 x 10⁵ komórek do kontroli barwienia. W przypadku western blot zaplanuj 2 x 10⁷ komórek na studzienkę.
   UWAGA: Przeprowadzić test cytotoksyczności z dwoma kontrpróbami technicznymi.
4. Aby sprawdzić prawidłową gęstość komórek, wymieszaj podwielokrotność (10-40 μl) promastigotów z równą objętością utrwalacza (3,7% paraformaldehydu w 1x PBS). Załadować 10 μl utrwalonej próbki na każdą stronę hemytometru.
   UWAGA: Formaldehyd jest toksyczną substancją chemiczną. Postępowanie jest zgodne z zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi niebezpiecznych chemikaliów.
5. Zliczanie komórek odbywa się za pomocą mikroskopu przy 20-krotnym powiększeniu. Policz wszystkie komórki w 25 małych kwadratach na środku hemacytometru. Powtórz te czynności dla kwadratów po obu stronach i uśrednij liczby.
   UWAGA: Jeśli różnica między liczbami wynosi >10, przelicz ponownie i uśrednij. Jeśli średnia liczba wynosi <10 lub >100, zmień rozcieńczenie i przelicz ponownie, a następnie oblicz gęstość hodowli, korzystając z następującego wzoru:
   (Eq 1)
   Na przykład, jeśli w 25 kwadratach znajduje się średnio 250 Leishmania, gęstość hodowli wynosi 5 x 10⁶ komórek/ml.
6. Po zliczeniu przenieść 5 x 10⁶ komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 1 500 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
7. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i krótko zawirować osad komórkowy. Dodaj 5 ml 1x PBS do tej samej probówki i umyj komórki, delikatnie odwracając 3-6x. Wirować przy 1 500 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
8. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić 5 x 10 6-komórkowe osady w 5 ml pożywki (np. M199 lub 1x bufor Tyrode) użytej do eksperymentów za pomocą pipety 5 ml w celu uzyskania końcowego stężenia 1 x 10⁶ komórek/ml.

2. Test cytotoksyczności

1. Przygotowanie eksperymentalne
   1. Oczyść toksynę zgodnie z wcześniejszym opisem²⁴ lub kup toksynę od sprzedawcy. Porcjować do podwielokrotności jednorazowego użytku i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
   2. Określ aktywność hemolityczną dla każdej toksyny za pomocą ludzkich czerwonych krwinek (patrz Tabela materiałów)²⁴.
      UWAGA: Aktywność hemolityczna jest używana, ponieważ kontroluje różnice w aktywności spowodowane oczyszczaniem, mutacjami itp. Wybór gatunku erytrocytów może zmieniać aktywność hemolityczną (np. pośrednia lizyna wymaga ludzkich czerwonych krwinek).
   3. Zaplanuj dwie kontrpróby techniczne dla każdego warunku, siedem rozcieńczeń dla krzywej dawka-odpowiedź oraz kontrolę bez toksyn.
      UWAGA: W przypadku promastigotów typu dzikiego (WT), spt2^- i spt2^-/+SPT2 można przetestować dwa zabiegi na jednej 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V. Na przykład można porównać wrażliwość na media (Rysunek 1). Zamiast płytki z dnem w kształcie litery V można użyć probówek do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml (patrz tabela materiałów). Ze względu na czasy akwizycji na cytometrze, nie zaleca się uruchamiania więcej niż jednej płytki na raz.
   4. Określ, który bufor testowy należy użyć w oparciu o wymagane warunki testowe i cel eksperymentu.
      UWAGA: W tym przykładzie porównano dwa testowe: M199 i bufor Tyrode'a uzupełniony barwnikiem żywotności jodkiem propidyny (PI). Cholesterol w surowicy będzie zakłócał aktywność CDC²⁴.
   5. Oblicz ilość potrzebnej toksyny na podstawie warunków i liczby leczonych genotypów. Upewnij się, że 50% specyficzna liza występuje w połowie krzywej rozcieńczenia.
      UWAGA: W przypadku CDC dwukrotne seryjne rozcieńczenie zapewni dobry zakres do późniejszego modelowania logistycznego. W przypadku spt2-promastigoty zalecanym rozcieńczeniem początkowym jest 4 000 HU/ml SLO. W przypadku stosowania toksyn nieaktywnych, zamiast nich można użyć masy odpowiadającej najwyższej dawce.
   6. Zaplanuj końcową objętość 200 μl na studzienkę i dodaj niewielką objętość (50-100 μl), aby uwzględnić błąd pipety.
      UWAGA: W przypadku trzech genotypów, z których każdy jest wykonywany w dwóch egzemplarzach, do seryjnego rozcieńczania będzie sześć próbek.
   7. Określ całkowitą ilość potrzebnej toksyny, korzystając z następującego wzoru:
      (Eq 2)
      gdzie ActivityMax jest najwyższym zastosowanym stężeniem (HU/ml); TotalFinalVolume oznacza całkowitą objętość (dla sześciu próbek, 200 x 6 + 100 = 1 300 μL); ActivityStock to aktywność zapasu toksyny (HU/ml); a VolStockToxin to potrzebna ilość zapasu toksyny.
   8. Przygotować wystarczający bufor testowy potrzebny do przeprowadzenia eksperymentu. Uzupełnij podłoże podstawowe barwnikiem żywotności i wszelkimi Ca²⁺ lub EGTA potrzebnymi do kontrolowania poziomów Ca²⁺. Wir do mieszania.
      UWAGA: Na przykład na każde 10 ml buforu Tyrode'a dodać 50 μl 2 mg/ml PI i 200 μl 100 mM CaCl₂, uzyskując końcowe stężenia odpowiednio 10 μg/ml i 2 mM.
   9. Upewnij się, że barwnik żywotności PI nie koliduje z żadnymi innymi używanymi sondami, takimi jak testy wiązania fluorescencyjnego przy użyciu toksyn sprzężonych z Cy5 lub AlexaFluor647^20,25.
   10. Zaplanuj rozcieńczenia toksyn, aby uzyskać 2x roztwór toksyny. Dodać bufor testowy do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i schłodzić na lodzie. Toksynę należy dodawać wyłącznie bezpośrednio przed rozpoczęciem oznaczania.
       UWAGA: W tym przykładzie 1,3 ml buforu testowego zostanie dodane do górnego rozcieńczenia, a 650 μl zostanie dodane do seryjnych rozcieńczeń w celu przygotowania 2x roztworu toksyny.
2. eksperyment
   1. Zarezerwować 0,5 ml przetworzonych promastigotów z kroku 1.8 w osobnej probówce jako "niebarwiona kontrola".
      UWAGA: Ta próbka zostanie użyta do ustawienia bramkowania na cytometrze przepływowym.
   2. Dodać 2 mg/ml PI do końcowego stężenia 10 μg/ml do pozostałych promastigotów. Wir przez 3 s.
      UWAGA: Po dodaniu PI do przetworzonych promastigotów, komórki te mogą być używane tylko przez okres 2,5 godziny. Po 2,5 h komórki zaczynają obumierać, a wyniki stają się błędne.
   3. Dodaj 1 x 10⁵ (w 100 μl / basenik) przetworzonych promastigotach do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem V lub 1,2 ml probówek do mikromiareczkowania (Rysunek 1). Umieść stojak na talerze lub probówki na lodzie pod kątem około 45° od view. Pracę należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z Leishmania promastigotes.
   4. Dodać 100 μl buforu do oznaczania z PI do każdej kontroli bez toksyn (ostatni rząd). Sprawdzić, czy kontrolka została poprawnie dodana, identyfikując wizualnie probówki o całkowitej objętości 200 μl, które wydają się ciemniejsze.
   5. Usunąć porcje toksyn z temperatury −80°C, rozmrozić na lodzie i w razie potrzeby rozlać w sadzawce. Dodać objętość toksyny obliczoną w kroku 2.1.5 do najwyższego rozcieńczenia (przygotowanego w kroku 2.1.10). Następnie seryjnie rozcieńczyć toksynę (Rysunek 1). Pipetę w górę i w dół co najmniej 8 razy, aby zapewnić mieszanie.
      UWAGA: Wykonuj na lodzie, ponieważ CDC szybko dezaktywują się w temperaturze pokojowej.
   6. Zaczynając od najniższego stężenia toksyny, szybko dodaj 100 μl toksyny do odpowiedniego rzędu (Rysunek 1 i Rysunek 2) i kontynuuj, aż cała toksyna zostanie dodana do komórek.
   7. Uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po okresie inkubacji zapakować i przetransportować płytkę do cytometru przepływowego.
3. Akwizycja danych
   1. Skonfiguruj cytometr przepływowy (patrz tabela materiałów) i oprogramowanie do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta i zasadami obowiązującymi w obiekcie. Nie wykonuj procedury cytometrii przepływowej bez wcześniejszego przeszkolenia w zakresie cytometru.
      UWAGA: W tym przykładzie użyto 4-laserowego Attune NxT. PI zostało zebrane na kanale YL-1 (wzbudzone laserem 561 nm, przepuszczone przez 577 LP, odbite od 600 DLP i przefiltrowane przez pasmo 585/16), chociaż szerokie spektrum PI pozwala na zbieranie na innych kanałach.
   2. Korzystając z niebarwionej próbki promastygoty L. major, ustaw bramki dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz początkowe parametry fluorescencyjne w oparciu o wybrane barwniki.
   3. W razie potrzeby dołącz jeden dodatkowy parametr dla wykresów punktowych, aby sprawdzić autofluorescencję (np. "bez plam") (Rysunek 3).
      UWAGA: W tym przykładzie użyto kanału BL-1 (wzbudzany przez laser 488 nm, przepuszczany przez 495 DLP i 503 LP, odbijany od 555 DLP i filtrowany przez pasmo przepustowe 530/30).
   4. Używając pojedynczych barwionych kontroli, ustaw bramki dla barwnika żywotności (PI w tym badaniu) i wszelkich fluorescencyjnie znakowanych toksyn. Monitoruj rozproszenie do przodu w funkcji czasu dla mikrozatorów.
      UWAGA: PI słabo zabarwi wszystkie komórki powyżej niebarwionych kontrolek. Martwe komórki będą łatwe do oddzielenia, z przejściowo przepuszczalnymi komórkami pomiędzy populacjami.
   5. Uzyskaj >10 000 zdarzeń bramkowanych dla każdej próbki na cytometrze.
      UWAGA: Zaleca się odczytywanie od najbardziej czułego do najmniej wrażliwego, ale kolejność pobierania można odwrócić, aby określić wpływ kolejności odczytu na wyniki próbki.
   6. Zapisz dane i wyeksportuj je zgodnie z potrzebami do analizy.
4. Analiza danych
   UWAGA: W tym badaniu do analizy danych użyto programu Excel z wtyczką Solver (patrz Spis materiałów) (patrz Plik uzupełniający 1).
   1. Bramka całkowita, pojedyncza komórka L. główne promastigoty przez bramkowanie na przód i bok rozproszenia oraz czas w zależności od potrzeb (Rysunek 3). Użyj wysokości lub powierzchni zgodnie z zaleceniami dla cytometru przepływowego.
      UWAGA: W przypadku zastosowanego tutaj cytometru przepływowego zalecanym parametrem jest wysokość, a nie powierzchnia.
   2. Zidentyfikuj martwe komórki i zablokuj je jako "wysoki PI". Bramka komórek pośrednich jako "PI niska". Komórki o wysokim poziomie PI są martwymi komórkami, podczas gdy komórki o niskim poziomie PI są przejściowo przepuszczalne²⁶.
      UWAGA: Komórki o wysokiej liczbie PI zazwyczaj wykazują przesunięcie o 2-3 logarytmy od komórek ujemnych.
   3. Eksportuj dane do programu Excel. Uzyskaj nazwę/identyfikator próbki i wartość %PI high, aby określić zabijanie.
      UWAGA: Jeśli zastosowano toksyny fluorescencyjne, potrzebna będzie mediana intensywności fluorescencji (MFI) żywych, przejściowo przepuszczalnych i ujemnych populacji. %PI niski może być eksportowany w celu przejściowej przepuszczalności.
   4. Określ średni poziom %PI dla każdego warunku między dwoma kontrpróbami technicznymi.
      UWAGA: Jeśli dla toksyn fluorescencyjnych potrzebna jest średnia MFI, należy ją również obliczyć.
   5. Oblicz %specyficzną lizę od wysokiego %PI, korzystając z następującego wzoru^24,25:
      (Eq 3)
      gdzie PIhighxpt jest wysokim %PI dla warunku doświadczalnego; a PIhighctl to wysoki %PI dla kontroli bez toksyn.
   6. Wykres %specyficznej lizy w stosunku do stężenia toksyny dla krzywej dawka-odpowiedź (Rysunek 4).
   7. Uporządkuj krzywą dawka-odpowiedź w programie Excel na potrzeby modelowania logistycznego. Uwzględnij stężenie toksyny i średnią %swoistą lizę wraz ze szczegółami eksperymentalnymi i/lub obliczeniami surowego %PI (Tabela 2).
   8. Sprawdź, czy dodatek Solver jest włączony.
      UWAGA: Aby włączyć dodatek Solver w klasycznej wersji programu Excel, przejdź do pozycji Opcje > plików > Dodatki i zaznacz pole wyboru Solver. Uruchom ponownie program Excel.
   9. Oznacz cztery kolejne kolumny jako "modelowane", "reszty", "parametry" i "wartości parametrów". Sprawdzić, czy pierwsze kolumny odpowiadają parametrom doświadczalnym, stężeniu toksyny i %swoistej lizie (tabela 2).
   10. W kolumnie "parameters" dodaj następujące parametry: L, k, c, SUM i LC50. Zainicjuj parametry L, k i c, wprowadzając następujące wartości w kolumnie "wartości parametrów": 100, 0,05, 1 000.
   11. W kolumnie "modelowane" utwórz model logistyczny przy użyciu następującej formuły:
       (Eq 4)
       Ustaw L, k i c w komórkach zawierających te parametry w kolumnie "wartości parametrów".
       Ustaw x na komórkę zawierającą stężenie toksyny.
       UWAGA: Dla tabeli 2, komórki G4, formuła jest następująca: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
   12. Zastosuj to równanie do wszystkich wartości %specyficznej lizy, z wyjątkiem kontroli bez toksyn.
   13. W kolumnie "resztki" oblicz kwadrat różnicy między modelowaną liczbą a rzeczywistą lizą właściwą, korzystając z następującego równania:
       (Równanie 5)
       gdzie y oznacza eksperymentalną lizę %specyficzną; a m oznacza odpowiednią wartość w kolumnie "Modelowane" obliczoną w krokach 2.4.10-2.4.11.
   14. W kolumnie "Wartości parametrów" obok pozycji "SUMA" zsumuj wszystkie wartości w kolumnie reszt.
   15. W kolumnie "Wartości parametrów" obok "LC50" zainicjuj równanie, aby obliczyć LC₅₀ na podstawie wyznaczonych wartości. To jest rozwiązanie równania 4 dla x, gdy m = 50,
       (Eq 6)
       W przypadku tabeli 2 formuła programu Excel jest następująca: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4
   16. Otwórz dodatek Solver na karcie Dane. Wybierz Ustawiony cel, który ma być komórką zawierającą sumę obliczonych reszt. Ustaw wartość Min.
   17. Zmienianie komórek zmiennych dla wartości parametrów L, k i c.
       UWAGA: Solwer może zachowywać się lepiej, jeśli opcja "Ustaw zmienne nieograniczone jako nieujemne" jest zaznaczona.
   18. W przypadku ujemnych wartości k zmodyfikuj korektor 4 i korektor 6, rozkładając -1 na czynniki pierwsze z k, aby zmienić k na dodatnie. Użyj metody rozwiązywania nieliniowego GRG. Kliknij przycisk Rozwiąż.
   19. Sprawdź krzywą i upewnij się, że LC₅₀ jest automatycznie obliczany przy użyciu korektora 6 (Tabela 2). Sprawdź dopasowanie, przedstawiając graficznie zarówno % specyficzną lizę, jak i modelowanie w stosunku do stężenia toksyn.
       UWAGA: Można to również sprawdzić, obliczając R² dla krzywej.

3. Analiza białek promastigoty L. major z protoksynami

1. Przygotować L. major promastigotes zgodnie z opisem w sekcji 1.
2. Ponownie zawiesić 2 x 10⁷ WT, spt2^- i spt2^-/+SPT2 L. głównych promastigotów w 2 ml żądanego buforu testowego za pomocą pipety o pojemności 5 ml (np. M199 bez surowicy). Dodać toksynę do końcowego stężenia sublitycznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   UWAGA: Na przykład sublityczna dawka SLO dla spt2-promastigoty wynosi 500 HU/ml.
3. Uwzględnij inne genotypy i kontrole niezawierające toksyn.
4. Odwirować promastigoty w stężeniu 1 500 x g przez 10 minut, aby otopić komórki. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Szybko przeprowadź zamkniętą rurkę zawierającą osad komórkowy trzy razy po nieregularnej powierzchni, takiej jak kratka szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby rozbić osad komórkowy.
   UWAGA: Granulka komórkowa jest prawie niewidoczna gołym okiem.
5. Rozpuść 1x bufor do próbek SDS-PAGE z 2-merkaptoetanolem bezpośrednio przed użyciem i podgrzewaj do temperatury 95 °C przez 10 minut przed dodaniem do osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórek w gorącym buforze próbki 1x SDS-PAGE i dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół. Podgrzewać zawieszone osady komórkowe w 1x buforze do próbek w temperaturze 95 °C przez 10 min.
   UWAGA: Po rozpuszczeniu w buforze próbki, w razie potrzeby należy przechowywać próbki przez długi czas w temperaturze -20 °C.
6. Przygotuj żel rozdzielczy. Odgazować wszystkie składniki z wyjątkiem nadsiarczanu amonu (APS) i TEMED przez 15 minut.
7. Dodaj APS i TEMED bezpośrednio przed odlaniem żelu. Ostrożnie pokryj żel rozdzielczy wodą. Pozostawić rozdzielczy żel do polimeryzacji, ~30-45 min.
8. Zdekantować wodę i przygotować żel do układania. Dodaj żel do układania, uważając, aby nie powstały bąbelki. Włóż grzebień z odpowiednią liczbą dołków i pozostaw do polimeryzacji na 5 minut. Monitoruj polimeryzację za pomocą resztek żelu do układania w stosy.
9. Złóż żel do uruchomienia SDS-PAGE i dodaj bufor zbiornika do komory.
10. Załadować 10 μl każdej próbki do dołka lub 8 μl drabinki białkowej. Uruchomić pod napięciem 180 V, aż próbki wejdą do żelu rozdzielczego, a następnie zmniejszyć napięcie do ~160 V i uruchomić do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie się ~0,5 cm od krawędzi płytki.
    UWAGA: Czas potrzebny na dotarcie próbek do dna może wynosić od 1 do 1,5 godziny. Czas ten można wydłużyć poprzez zmniejszenie napięcia. Nigdy nie zmniejszaj napięcia do zera. Wyższe napięcia mogą zwiększyć "uśmiechnięcie" żelu i pęknięcie płytek.
11. Przenieść żel do barwnika Coomassie (w celu barwienia białek) lub do 1x buforu transferowego (w przypadku western blotting). W przypadku barwienia Coomassie bejcuj przez noc, a następnie odbarwiaj, zobrazuj i wysusz.
12. W przypadku western blot należy przygotować system transferowy zgodnie z instrukcjami producenta.
13. Do transferu na mokro użyj zimnego bufora transferowego 1x i wstępnie zmoczonych podkładek, bibuły filtracyjnej i nitrocelulozy. W przypadku zastosowanego tutaj systemu Bio-rad Protean III (patrz Tabela Materiałów) bibuła filtracyjna może być przycięta do wymiarów 10 cm x 7,5 cm. Przyciąć nitrocelulozę o wymiarach 9 cm x 6,75 cm.
    UWAGA: Nitroceluloza jest wysoce łatwopalna. Unikaj otwartego ognia i innych potencjalnych źródeł zapłonu.
14. Rozłóż kasetę transferową z podkładkami, bibułą filtracyjną i nitrocelulozą. Rozwałkuj pęcherzyki powietrza. Ostrożnie dodaj żel.
15. Dodaj bibułę filtracyjną i rozwałkuj pęcherzyki powietrza. Dodaj podkładkę, zamknij kasetę i włóż do uchwytu we właściwej orientacji (upewnij się, że nitroceluloza jest skierowana w stronę czerwonego zacisku). Dodaj mieszadło i okład z lodu z boku, a następnie uzupełnij zbiornik zimnym buforem transferowym 1x. Przesył przy napięciu 110 V przez 90 min.
    UWAGA: Ciepło wytwarzane podczas przenoszenia może niekorzystnie wpływać na przenoszenie. Aby zapewnić dobry transfer, zawsze używaj zimnego bufora transferowego 1x.
16. Usunąć nitrocelulozę i zabarwić roztworem Ponceau przez ~5 min. Spłukać ultraczystą wodą. Zaznacz drabinkę białkową ołówkiem i przytnij plamę w razie potrzeby. Odbarwić plamę za pomocą resztek bufora transferu.
    UWAGA: Pąsek może być wielokrotnie używany.
17. Zablokować nitrocelulozę w 25 ml 5% BSA w 1x TBST w 4 °C, wstrząsając, przez noc. Następnie odrzuć roztwór blokujący i dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (1:1,000) w 1% BSA w 1x TBST. Wstrząsnąć w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe może być zachowane w temperaturze -20 °C i kilkakrotnie użyte.
18. Myć nitrocelulozę 3x po 10 min w 1x TBST wstrząsając. Wyrzuć płukanie i dodaj 10 ml przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP (1:10 000) w 1% BSA w 1x TBST. Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Myć nitrocelulozę 3x po 10 min w 1x TBST wstrząsając.
19. Odczynnik ECL należy przygotować bezpośrednio przed obrazowaniem nitrocelulozy. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy zdekantować TBST i dodać odczynnik ECL do nitrocelulozy. Wstrząsaj przez 1 minutę. Wyobraź sobie żel.

Results

Zwiększona wrażliwość promastigoty na SLO w buforze Tyrode'a w porównaniu do M199<br /> Czułość SLO promastigotów L. major porównano między różnymi testowymi. Promastigoty typu dzikiego, spt2^- i spt2^-/+SPT2 prowokowano SLO w bezsurowicy M199 lub buforze Tyrode'a uzupełnionym 2 mM CaCl₂ przez 30 minut przed analizą na cytometrze przepływowym. Odpowiednimi pasożytami do analizy były pojedyncze komórki identyfikowane za pomocą profili rozpros...

Discussion

W niniejszej pracy opisano metody badania mechanizmów molekularnych i funkcji PFT, wykorzystując ludzki patogen Leishmania major jako system modelowy. Opracowano średnioprzepustowy test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru żywotności pojedynczych komórek. Żywotność jest ilościowa na poziomie populacji, ponieważ wartości LC₅₀ można obliczyć na podstawie krzywej dawka-odpowiedź przy użyciu modelowania logistycznego. Jako dowód słuszności zasady, zastosowano test cytometrii przep...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2 ml probówki do mikromiareczkowania (Marsh)	Fisher	02-681-376	Test cytotoksyczności
1,5 ml probówka do mikrowirówek	Fisher	05-408-129	Rozcieńczenia toksyn
15 ml probówka wirówkowa	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	Do przechowywania komórek i pożywek
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher	BP399	Do przetwarzania komórek
3% H2O2	Walmart  (Fayetteville, AR)	Nie dotyczy	dla ECL
5x M199	Cell-gro	11150067	Podstawowa pożywka wzrostowa dla L. major promastigoty
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Baker		Do hodowli komórek w sterylnych warunkach
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher	BP1605-100	Frakcja V dopuszczalna czystość
CaCl2	Fisher	BP510-100	Stężenie zapasów 100 mM
Wirówka	Thermo Fisher	Heraeus Megafuge 40R	Do granulowania komórek z hodowli
Cy5 Pakiet barwników monoreaktywnych	Cytiva (Marlborough, MA)	PA25031	Etykieta fluoroforowa dla toksyn
Cyfrowa sucha kąpiel	Benchmark	BSH1002	Do denaturacji próbek białek
EGTA	Amresco	0732-100G	Stężenie zapasów 0,5 M
Excel	Microsoft (Redmond, VA)		Analiza danych oprogramowanie
Cytometr przepływowy (4-laserowy Attune NxT)Cytometr	Fisher		do akwizycji danych
FlowJo	BD (Ashland, OR)		Oprogramowanie
Formaldehyd	Fisher	BP531-500	Utrwalacz do liczenia komórek
G418	Fisher	BP673-1	Środek selekcyjny do komórek
Hellmanex III	Sigma	Z805939	Rozcieńczony 1:4 do czyszczenia cytometru
Hemacytometr	Fisher	0267151B	Do liczenia komórek
Ludzkie krwinki czerwone	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	Aby potwierdzić aktywność toksyny Wiadro
			na lód
Mikroskop świetlny	Nikon	Eclipse 55i	Do wizualizacji komórek
Nitroceluloza	Fisher	88018	Do sondowania białka za pośrednictwem przeciwciał
Pipetory i końcówki	Avantor VWR		Do dozowania odczynników
Zasilanie	Bio-Rad		Do uruchamiania SDS-PAGE i transferów
Jodek propidyny	Biotium	40016	Stężenie zapasowe 2 mg/ml w wodzie
Drabinka białkowa	Bio-Rad	161-0373	Do oznaczania masy cząsteczkowej białek
SDS-PAGE Running Aparatura (Mini Protean III)	Bio-Rad	165-3302	Do rozdzielania białek na podstawie ich wielkości
Taśma uszczelniająca	R& D	DY992	Do uszczelniania płytek z komórkami
Streptolizyna O C530A wstawka			Sklonowana do wektora pBAD-gIII (Odniesienie: 7)
Streptolizyna Toksyna O C530A	Laboratoryjnie oczyszczona		Aktywność specyficzna  4,34 x 105 HU/mg
Wahliwy wirnik kubełkowy	Thermo Fisher	75003607	Do odwirowania komórek Płytka
V z dnem	Greiner Bio-one	651206	Do oznaczania cytotoksyczności
Vortex	Benchmark	BV1000	Do mieszania komórek
System obrazowania Western blot (Chemi-doc)	Bio-Rad		Do wizualizacji białek za pomocą Western Blot
Aparat do przenoszenia Western Blot (Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	Transfer białka do nitrocelulozy
Bibuła filtracyjna Whatman	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	Stosowana w przenoszeniu białek do nitrocelulozy
przeciwciało
Anti-ERK	Technologie sygnalizacji komórkowej	Kot# 9102S	Królik (rozcieńczenie 1:1000)
Przeciwciało anty-lipofosfoglikan (LPG)	CreativeBioLabs	Cat# WIC79.3	(1: 1000)
przeciwciała anty-MEK		Kot# 9122L	Królik (1:1000)
Anty-mysi IgG, koniugat HRP	Jackson Immunoresearch	Kot#715-035-151	Osioł (1:10000)
Przeciwciało anty-fosphoERK	Technologie sygnalizacji komórkowej	Kot# 9101S	Królik (1:1000)
przeciwciała anty-pMEK		Kot# 9121S	Królik (1:1000)
Anty-królicze IgG, koniugat HRP	Jackson Immunoresearch	Kot#711-035-152	Osioł (1:10000)
Przeciwciało antytubulinowe	Sigma	Cat# T5168	Mysz (1: 2000)
Leishmania major Genotypy			Odniesienie: 13
Addback episomalny (spt2-/+SPT2)			Δ spt2::HYG/Δ spt2: PAC/+pXG-SPT2
Podjednostka 2 palmitoilotransferazy serynowej nokaut (spt2-)			Δ spt2::HYG/Δ spt2::P AC
Typ dziki (WT)			LV39 klon 5 (Rho/SU/59/P)