Artykuł metodologiczny

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64365

⸱

10 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) mają ogromne znaczenie dla modelowania i terapii chorób serca u ludzi. Niedawno opublikowaliśmy opłacalną strategię masowej ekspansji hiPSC-CM w dwóch wymiarach (2D). Dwa główne ograniczenia to niedojrzałość komórek oraz brak trójwymiarowego (3D) rozmieszczenia i skalowalności w platformach wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, rozszerzone kardiomiocyty stanowią idealne źródło komórek do generowania 3D hodowli komórek serca i technik inżynierii tkankowej. Ten ostatni ma ogromny potencjał w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, zapewniając bardziej zaawansowany i fizjologicznie istotny HTS. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy zgodny z HTS z łatwą skalowalnością do generowania, konserwacji i analizy optycznej sferoid serca (CS) w formacie 96-dołkowym. Te małe CS są niezbędne do wypełnienia luki obecnej w obecnych modelach chorób in vitro i/lub generowaniu dla platform inżynierii tkankowej 3D. CS prezentują wysoce ustrukturyzowaną morfologię, rozmiar i skład komórkowy. Co więcej, hiPSC-CM hodowane jako CS wykazują zwiększoną dojrzałość i kilka cech funkcjonalnych ludzkiego serca, takich jak spontaniczne obchodzenie się z wapniem i aktywność skurczowa. Poprzez automatyzację całego przepływu pracy, od generowania CS po analizę funkcjonalną, zwiększamy odtwarzalność wewnątrz i między partiami, czego dowodem jest obrazowanie o wysokiej przepustowości (HT) i analiza obchodzenia się z wapniem. Opisany protokół umożliwia modelowanie chorób serca i ocenę efektów leku/terapii na poziomie pojedynczej komórki w złożonym środowisku komórkowym 3D w pełni zautomatyzowanym przepływie pracy HTS. Ponadto w badaniu opisano prostą procedurę długoterminowego przechowywania i biobankowania całych sferoidów, dając w ten sposób naukowcom możliwość stworzenia funkcjonalnego przechowywania tkanek nowej generacji. HTS w połączeniu z długoterminowym przechowywaniem znacząco przyczyni się do badań translacyjnych w szerokim zakresie dziedzin, w tym w odkrywaniu i testowaniu leków, medycynie regeneracyjnej i rozwoju spersonalizowanych terapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrycie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) dało bezprecedensowe możliwości badania rozwoju i chorób człowieka na poziomie komórkowym. W ciągu ostatniej dekady, korzystając z lekcji rozwojowych, opracowano różne protokoły zapewniające skuteczne różnicowanie hiPSC w kardiomiocyty (CM)1,2,3,4. Kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) mogą służyć jako źródło do modelowania genetycznie dziedziczonych chorób sercowo-naczyniowych (CVD), testowania bezpieczeństwa kardiologicznego dla nowych leków i strategii regeneracyjnych serca5,6,7,8. Pomimo ukierunkowanego różnicowania serca hiPSC, nieokreślona liczba CM pozostaje wyzwaniem w dziedzinie serca, ponieważ dojrzałe hiPSC-CM na ogół nie proliferują, a pierwotne komórki ludzkie nie są dostępne w dużych ilościach.

Niedawno opisaliśmy, że jednoczesna aktywacja sygnalizacji Wnt z hodowlą o niskiej gęstości komórek skutkowała masową odpowiedzią proliferacyjną (do 250-krotności) hiPSC-CMs9,10. Ta ekonomiczna strategia masowej ekspansji hiPSC-CM poprzez szeregowe pasażowanie w formacie kolby hodowlanej ułatwia standaryzację i kontrolę jakości dużej liczby funkcjonalnych hiPSC-CM. Dodatkowo, aby nadążyć za zapotrzebowaniem na duże partie hiPSC-CM od różnych dawców, opisano biobankowanie hiPSC-CMs10. Jednak monowarstwy kardiomiocytów osadzone w tych standardowych naczyniach hodowlanych nie są reprezentatywne dla złożonej struktury 3D obecnej w sercu. Co więcej, przeszkodą pozostaje niedojrzałość hiPSC-CM, w związku z czym nie udaje się naśladować biologicznego i fizjologicznego fenotypu środowiska sercowo-naczyniowego in vivo.

Nowatorskie modele 3D in vitro zostały opracowane, w których hiPSC-CM wykazują bliższe zachowania fizjologiczne, takie jak samoorganizacja11,12, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)13, enhanced maturation14,15,16, oraz zsynchronizowany skurcz17,18,19. Modele 3D zostały wykorzystane do odkrywania leków, testowania kardiotoksyczności leków, modelowania chorób, terapii regeneracyjnych, a nawet pierwszych badań klinicznych20,21,22,23,24. Jednym z najczęściej używanych modeli jest inżynieryjna tkanka serca (EHT) oparta na fibrynie, która wykazuje układ podobny do tkanki i kurczliwość serca13,17,25. Wcześniej wykazaliśmy, że EHT generowane z ekspandowanych hiPSC-CM wykazywały porównywalną kurczliwość do tych z nieekspandowanych hiPSC-CM, wykazując nienaruszoną funkcjonalność komórkową po rozszerzeniu9. Niemniej jednak, mimo że proces generowania EHT z hiPSC-CM jest dobrze ugruntowany, przewiduje się dalszy rozwój w zakresie ustanowienia platformy oceny HT. W tym przypadku szybkie generowanie dużej liczby samoagregujących sferoid serca (CS) w formacie 96-dołkowym pozwala na poprawę warunków 3D do celów wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS).

Ogólnie rzecz biorąc, zaletą CS jako hodowli komórek 3D jest ich wysoka powtarzalność i skalowalność. W szczególności CS w połączeniu z zrobotyzowaną obsługą próbek mogą standaryzować i automatyzować hodowlę CS, leczenie farmakologiczne i analizę o wysokiej zawartości20. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły do generowania CS o wysokiej czystości i jakości, które można skutecznie kriokonserwować i badać pod kątem funkcji serca, wykonując pomiary stanów nieustalonych Ca2+ za pomocą optycznego systemu akwizycji i analizy wapnia. Model ten zapewnia proste, ale potężne narzędzie do wykonywania przesiewów o wysokiej przepustowości na setkach do tysięcy sferoid17,18.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: hiPSC-CM użyte w tym badaniu zostały wygenerowane zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami hodowli hiPSC i różnicowania CM26,27. Opcjonalnie hiPSC-CM mogą być rozszerzane i kriokonserwowane jako ostatnio opublikowane przed uruchomieniem protokołu CS (sekcja 4)10.

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych, roztworów i podwielokrotności

  1. Przygotuj podłoże podstawowe
    1. Zrównoważyć penicylinę-streptomycynę i pożywkę (RPMI 1640) do temperatury pokojowej (RT) i upewnić się, że całkowicie się rozmroziły. Zmieszać 500 ml pożywki i 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 8 tygodni; przed użyciem zrównoważyć do 37 °C.
  2. Przygotuj RPMI + B27
    1. Zrównoważyć suplement B27 i podłoże podstawowe do RT. Upewnij się, że suplement został całkowicie rozmrożony. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x B27. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni; przed użyciem zrównoważyć do 37 °C.
  3. Przygotowanie pożywek do ponownego powlekania hiPSC-CM
    1. Dodać związany z Rho, zwinięty inhibitor kinazy białkowej (ROCK) (stężenie końcowe 2 μM) i 10% zamiennik surowicy nokautującej (KSR) do pożywki RPMI + B27. W razie potrzeby dodać inhibitor ROCK bezpośrednio do pożywki RM. Nie przechowywać pożywek hodowlanych po ich uzupełnieniu.
  4. Przygotuj media do rozmrażania CM
    1. Dodać suplement diety na przeżycie komórek w stężeniu 1:100 (np. Revitacell) i 20% KSR do pożywki RPMI + B27 i zrównoważyć do 37 °C przed użyciem.
  5. Przygotuj suplement do dojrzewania
    1. Opisana wcześniej formuła pożywki do dojrzewania28 składa się z: 3 mM glukozy, 10 mM L-mleczanu, 5 mg/ml witaminy B12, 0,82 mM biotyny, 5 mM monohydratu kreatyny, 2 mM tauryny, 2 mM L-karnityny, 0,5 mM kwasu askorbinowego, 1x NEAA, 0,5% (w/v) albumax, 1x B27 i 1% KOSR. Aby przygotować jedną pełną butelkę (500 ml) suplementu do dojrzewania, należy wyjąć 65 ml z butelki DMEM bez glukozy i uzupełnić 2,7 g glukozy, 5,6 g L-mleczanu, 0,025 mg witaminy B12, 1 mg biotyny, 3,73 g monohydratu kreatyny, 1,25 g tauryny, 1,975 g L-karnityny, 0,7125 g kwasu askorbinowego, 50 ml NEAA, 12,5 g albumaksu i 5 ml penicyliny-streptomycyny.
    2. Przefiltrować przez sterylną jednorazową jednostkę filtrującą z membraną polieterosulfonową (PES) o porach 0,22 μm.
    3. Podwielokrotność na 45 ml (w celu przygotowania 500 ml pożywki dojrzewającej) lub 4,5 ml (w celu przygotowania 50 ml pożywki do dojrzewania). Przechowywać w temperaturze 20 °C do 6 miesięcy.
  6. Przygotowanie pożywki do dojrzewania
    1. Zrównoważ suplement B27, nokautujący SR, penicylinę-streptomycynę, suplement do dojrzewania28 i pożywkę DMEM bez glukozy w RT. Upewnij się, że suplement został całkowicie rozmrożony. Wymieszaj 435 ml pożywki DMEM bez glukozy z 10 ml suplementu 50x B27, 5 ml penicyliny-streptomycyny, 5 ml nokautującego SR i 45 ml suplementu do dojrzewania. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni; przed użyciem należy zachować równowagę w temperaturze 37 °C.
  7. Przygotuj jasne podłoże fluorescencyjne
    1. Zrównoważyć pożywkę penicyliny-streptomycyny i fluorobrytu DMEM w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że suplement jest całkowicie rozmrożony. Wymieszaj 500 ml pożywki fluorbritowej DMEM z 5 ml penicyliny-streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca; przed użyciem należy zachować równowagę w temperaturze 37 °C.
  8. Przygotuj niejonowy roztwór detergentu
    1. Wymieszaj 20% w/v niejonowego proszku do prania (np. F-127) z PBS. Filtrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy; przed użyciem zrównoważyć w temperaturze pokojowej.
  9. Przygotuj podłoże do barwienia wapnia
    1. Wymieszaj niejonowy roztwór detergentu (końcowe stężenie 0,04% v/v) i 0,1x barwnika wapniowego (np. Cal520 AM) w jasnym podłożu fluorowym. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodaj 10 μl Cal520 i 20 μl niejonowego roztworu detergentu. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Trzymaj roztwór w ciemności przed dodaniem do komórek.

2. Przygotowanie

  1. Przygotuj bufor permeabilizacyjny i blokujący: Ten bufor zawiera 10 ml PBS, 5% wag./v BSA i 0,3% v/v Triton-X-100.
  2. Przygotuj bufor do cytometrii przepływowej: Ten bufor zawiera 50 ml PBS, 1% wag./v BSA i 0,3% v/v Triton-X-100.
  3. Bufor do przemywania cytometrii przepływowej: Ten bufor zawiera 50 ml PBS i 1% wag./v BSA.
  4. Bufor do płukania sferoidów (SWB): Ten bufor zawiera 1 ml Triton-X-100, 2 ml 10% (w/v w DPBS) SDS i 2 g BSA w 1 l PBS.
    UWAGA: SWB można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  5. Przygotuj roztwór do zatapiania (ES): Aby przygotować 100 ml roztworu do zatapiania, zmieszaj 50 ml glicerolu z 9,09 ml dH2O, 1 ml buforu Tris (1 M, pH 8,0) i 200 μl EDTA (0,5 M). Dodaj 22,7 g fruktozy i mieszaj w temperaturze pokojowej w ciemności, aż się rozpuści. Gdy będzie klarowna, dodaj 22,2 g fruktozy i mieszaj, aż się rozpuści. Następnie dodać 15 g mocznika i mieszać aż do rozpuszczenia (przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności).
  6. Przygotuj bufor PBT (PBS z Tween-20). Ten bufor zawiera PBS/Tween-20 (0,1% v/v). Na 1 l PBS dodaj 1 ml Tween-20.

3. Przygotowanie małych cząsteczek

  1. Rozpuścić tiazowiwinę (inhibitor ROCK) w proszku w podwielokrotnościach 10 mM po 50 μl w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Chronić przed światłem.
  2. Przygotuj 2,5 mM porcje po 10 μl Cal-520 AM w DMSO i przechowuj je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Chronić przed światłem.

4. Generacja sferoidów serca

UWAGA: Dla większych ilości CS, zasiej do 1 miliona CM w 6-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu z 2 ml pożywki do ponownego powlekania hiPSC-CM. W badaniu tym wykorzystano co najmniej od 2 500 (2,5 tys. CS) do 20 000 (20 tys. CS) hiPSC-CM na dołek 96-dołkowej płytki.

  1. Dla jednej płytki 96-dołkowej należy przygotować hodowlę komórkową zawierającą co najmniej 2 x 106 indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CMs)10.
  2. Gdy wyhodowane hiPSC-CM osiągną zbieg, dodaj 0,1 ml /cm2 sterylnego roztworu do odrywania serca (np. tryple) do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  3. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml mechanicznie rozdzielić komórki, przepłukując je 2 ml ciepłej pożywki podstawowej, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Potwierdź oderwanie za pomocą mikroskopu jasnego pola (4-krotne powiększenie); Komórki będą wyglądać na białe i mieć okrągły kształt.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do ponownego powlekania hiPSC-CM.
  6. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl mechanicznie zdysocjuj osad komórkowy. Roztwór wydaje się jednorodny po trzech lub czterech mieszaniach. Policz komórki. Przenieść odpowiednią ilość komórek w 100 μl pożywki do ponownego powlekania do każdej 96-dołkowej studzienki o bardzo niskim nasadce okrągłodennej.
  7. Umieść płytkę CS na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min w inkubatorze na 24 godziny. Ustaw warunki inkubatora na 37 °C, 5% CO2, 21% O2 i 90% wilgotności.
  8. Odessać 50 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 100 μl pożywki RPMI + B27 na studzienkę przez pierwsze 48 godzin
    UWAGA: Zawsze trzymaj 50 μl pożywki w płytce 96-dołkowej, aby uniknąć przypadkowego zachwycenia i pęknięcia sferoidu.
  9. Odessać 100 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 100 μl pożywki do dojrzewania do każdego dołka. Utrzymuj komórki w pożywce dojrzewającej i odświeżaj pożywkę co 2-3 dni.

5. Kriokonserwacja CS

UWAGA: CS mogą być kriokonserwowane do długoterminowego przechowywania. Kriokonserwację można przeprowadzać od 3 dnia po wytworzeniu CS. CS można kriokonserwować bezpośrednio w dołkach 96-dołkowej płytki lub jako zawiesinę CS w kriowialach.

  1. Wstępnie schłodzić talerz, umieszczając go na lodzie na 10 minut.
  2. Odwirować płytkę sferoidalną przez 3 minuty przy 70 x g.
  3. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 50 μl i dodać 200 μl lodowatej pożywki zamrażającej hiPSC do dołka.
    UWAGA: Zawiesinę CS należy utrzymywać na lodzie przez cały czas trwania zabiegu. W przypadku płytki 6-dołkowej ze sferoidami należy zamrozić jedną studzienkę w kriowialnym podłożu zamrażającym o pojemności 500 μl.
  4. Uszczelnij płytę folią uszczelniającą do płyty.
    UWAGA: Płytkę 96-dołkową należy przechowywać w pudełku styropianowym lub, jeśli nie jest dostępna, można wykonać formę silikonową, jak opisano w kroku 5.5.1.
  5. Aby zapewnić równomierną wymianę ciepła między płytą studzienkową a zamrażarką, ostrożnie umieść płytkę w styropianowym pudełku lub w silikonowej formie.
    1. Aby przygotować formę silikonową: Energicznie wymieszaj dwa składniki zestawu elastomeru silikonowego w stosunku 10:1. Usuń bąbelki roztworu za pomocą pompy próżniowej przez 15-20 minut. Następnie wlać roztwór do dolnej części płytki studzienki i usunąć pęcherzyki za pomocą pompy próżniowej przez 10 minut. Formę umieszczamy w piekarniku i utwardzamy w temperaturze 60 °C przez 8 godzin, aby uzyskać półelastyczny elastomer, który odkleja się od płytki.
  6. Zamrażać płytkę w temperaturze -80 °C przez minimum 4 godziny w pudełku styropianowym lub przygotowanej formie silikonowej.
  7. Przenieś płytkę do zbiornika z ciekłym azotem lub zamrażarki o temperaturze -150 °C w celu długotrwałego przechowywania.

6. Rozmrażanie sferoid serca

UWAGA: Nie rozmrażaj więcej niż jednej płytki na raz, aby zapewnić szybki proces rozmrażania.

  1. Przygotować 20 ml wstępnie podgrzanego podłoża podstawowego o temperaturze 37 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  2. Zebrać płytkę komórkową z CS z ciekłym azotem i umieścić ją w inkubatorze na 15 minut. Ustaw warunki inkubatora na 37 °C, 5% CO2 , 21% O2 i 90% wilgotności.
  3. Usunąć supernatant i pozostałości osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić każdą studzienkę w ciepłym podłożu podstawowym. Użyj 200 μl podłoża na dołek.
  4. Wirować przez 3 minuty przy 70 x g.
  5. Powtórz kroki 6.3 i 6.4.
  6. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostaną osady komórkowe i dodać 200 μl pożywki do rozmrażania CM do każdego dołka.
  7. Umieść płytkę CS na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 70 obr./min w inkubatorze na 24 godziny. Ustaw warunki inkubatora na 37 °C, 5% CO2 , 21% O2 i 90% wilgotności.
  8. Odessać 50 μl pożywki z każdej studzienki i dodawać 100 μl pożywki RPMI + B27 na dołek przez pierwsze 48 godzin.
  9. Odessać 100 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 100 μl pożywki do dojrzewania do każdego dołka. Utrzymuj komórki w pożywce do dojrzewania i odświeżaj pożywkę co 2-3 dni.

7. Ocena wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+

UWAGA: CS są w kulturze w sumie przez 3 tygodnie; 2 tygodnie przed zamrożeniem i 1 tydzień po rozmrożeniu. "Świeże" kontrole są dopasowane pod względem wieku.

  1. Po 1 tygodniu hodowli rozmrożone CS są optymalne do obrazowania optycznego w zakresie wapnia. Użyj barwnika wapniowego (np. Cal520AM), aby ocenić wychwyt i uwalnianie Ca2+ z komórek.
  2. Potraktuj je 100 μl pożywki z barwnikiem wapnia na dołek i inkubuj przez 60 minut w inkubatorze. Ustaw warunki inkubatora na 37 °C, 5% CO2, 21% O2 i 90% wilgotności.
    UWAGA: Cal520AM jest wrażliwy na światło. Wykonuj wszystkie procedury ładowania i eksperymenty w ciemności.
  3. Przygotuj system pozyskiwania i analizy wapnia.
    1. Włącz mikroskop, upewniając się, że opcja kontroli środowiska jest włączona.
    2. Dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła.
      UWAGA: W tym przypadku użyto mikroskopu Leica Thunder DMi8; Inne systemy mikroskopowe również mają zastosowanie, dopóki nie pozwolą na częstotliwość próbkowania powyżej 30 klatek na sekundę (fps).
  4. Nagraj wideo ze stałym strumieniem 2-10 pików w ciągu 10 sekund i skanuj po 96-dołkowej płytce, początkowo przesuwając się w lewo, a następnie w dół w sposób zygzakowaty, aby pokryć całą płytkę. Zmierz sygnał wapnia za pomocą lasera o długości fali 488 nm; Ustaw kontrast na czarne tło z jasnozielonym sygnałem podczas uwalniania wapnia.
  5. Po uzyskaniu stanów nieustalonychCa2+ należy przeanalizować dane za pomocą oprogramowania do analizy śladów fluorescencyjnych (np. CyteSeer, Vala Sciences) zgodnie z instrukcjami producenta.

8. Analizy cytometrii przepływowej zdysocjowanych sferoid serca

UWAGA: W tym badaniu, cytometria przepływowa została użyta do określenia żywotności CS przed i po procesie rozmrażania.

  1. Zebrać CS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby uniknąć uszkodzenia sferoidalnego, i odwirować przez 3 minuty przy 70 x g. Odessać supernatant i dodać 1 ml PBS.
  2. Wirować przez 3 minuty przy 200 x g. Odessać supernatant i oddzielić CS, dodając 1 ml roztworu odrywającego serce (np. tryple). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  3. Używając pipety o pojemności 5 ml, mechanicznie zdysocjuj komórki, przepłukując je 2 ml podłoża podstawowego, aż pojedyncze komórki będą widoczne podczas obserwacji pod mikroskopem.
  4. Wirować przez 3 minuty przy 200 x g.
  5. Odessać supernatant i utrwalić CM za pomocą 200 μl 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wirować przez 3 minuty przy 200 x g. Odessać supernatant i dodać 1 ml PBS.
    UWAGA: Punkt pauzy: Stałe hiPSC-CM mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
  7. Przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS i odwirować przez 3 minuty przy 200 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić 1 x 105 komórek w 50 μl buforu permeabilizacyjnego.
  8. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  9. W celu analizy immunofluorescencyjnej cytometrii przepływowej wykonaj kroki 8.9.1-8.9.4.
    1. Zawiesić komórki w buforze cytometrii przepływowej (50 μl) zawierającym przeciwciało przeciwko α-aktyninie w rozcieńczeniu 1:300. W innej probówce FACS ponownie zawiesić 1 x 105 komórek w buforze cytometrii przepływowej (50 μl) z odpowiednią kontrolą izotypu (np. mysia IgM FITC, izotyp κ [rozcieńczenie 1:200]). Podobnie, ponownie zawiesić 1 x 105 komórek w 50 μl buforu cytometrii przepływowej w celu kontroli ujemnej.
    2. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 2,5 ml buforu do cytometrii przepływowej i odwirowywać komórki przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C; odrzucić supernatant i powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.
    4. Zawiesić komórki w 50 μl buforu cytometrii przepływowej za pomocą przeciwciała drugorzędowego kozła-anty-myszy (rozcieńczenie 1:300).
      UWAGA: Umieść probówkę w ciemności, ponieważ roztwór przeciwciała drugorzędowego jest wrażliwy na światło.
  10. W celu sprawdzenia żywotności jodkiem propidyny (PI) dodać 150 μl PI na próbkę (1:1 000) i inkubować przez 15 min.
    UWAGA: Umieść rurkę w ciemności, ponieważ roztwór PI jest wrażliwy na światło.
  11. Wyreguluj bramki zgodnie ze standardową strategią bramkowania, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1 i przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

9. Barwienie immunofluorescencyjne całych sferoid 3D

UWAGA: Ten protokół jest oparty na protokole obrazowania 3D całych organoidów w wysokiej rozdzielczości po znakowaniu immunofluorescencyjnym, który został wcześniej opublikowany29 i dostosowany do sferoid sercowych. Podczas zabiegu wszystkie końcówki pipet i rurki stożkowe mogą być pokryte 1% wag./v BSA-PBS, aby zapobiec przywieraniu sferoid do tworzyw sztucznych. Aby pokryć materiały, zanurz je w 1% BSA-PBS. Należy uważać, aby nie uszkodzić sferoid za pomocą pipety o pojemności 5 ml, unikając uszkodzeń mechanicznych.

  1. Zebrać CS w powlekanej probówce o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 5 ml. Sferoidy są widoczne gołym okiem. Zbierz ~ 20-50 sferoid na kombinację przeciwciał. Wirować przez 3 minuty przy 70 x g i odessać supernatant.
  2. Ostrożnie ponownie zawiesić sferoidy w 1 ml lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml.
  3. Utrwalać w temperaturze 4 °C przez 45 min. Po 20 minutach delikatnie ponownie zawiesić sferoidy za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml. To wyrównuje fiksację między wszystkimi sferoidami.
  4. Dodaj 10 ml lodowatego PBS do probówki i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 70 x g przez 3 min.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, powlekanie końcówek i rurek stożkowych na ogół nie jest potrzebne, ponieważ CS nie przyklejają się do końcówki po zamocowaniu.
  5. Zablokuj CS poprzez ponowne zawieszenie osadu w lodowatym SWB (200 μl SWB na studzienkę) i przenieś sferoidy na 24-dołkową płytkę do hodowli zawiesiny.
    UWAGA: CS z jednej dużej pastylki można podzielić na wiele dołków, aby wykonać różne barwienia. Użyj ~ 20-50 CS na kombinację przeciwciał.
  6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 15 minut.
  7. Dodać 200 μl SWB do pustej studzienki, aby służyła jako studzienka referencyjna .
    UWAGA: Do barwienia immunofluorescencyjnego można również użyć płytek 48- lub 96-dołkowych w celu zmniejszenia zużycia przeciwciał. Jednak wyniki barwienia i prania można zmniejszyć ze względu na mniejszą objętość na studzienkę.
  8. Pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie płytki, pozostawiając płytkę przechyloną pod kątem 45° na 5 minut.
  9. Usuń SWB, pozostawiając CS w 200 μl SWB (użyj studzienki referencyjnej, aby oszacować minimalną objętość 200 μl).
  10. Dodać 200 μl SWB z pierwszorzędowymi przeciwciałami 2x skoncentrowanymi (np. ɑ-aktynina [1:200] i troponina T [1:200]) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, kołysząc/wstrząsając (40 obr./min na wytrząsarce poziomej).
  11. Następnego dnia dodaj 1 ml SWB do każdej studzienki.
  12. Pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie płytki, pozostawiając płytkę pod kątem 45° na 5 minut.
  13. Wyjmij SWB, pozostawiając 200 μl w płytce. Dodaj 1 ml SWB i myj przez 2 godziny, powoli kołysząc/potrząsając.
  14. Powtórz kroki 9.12 i 9.13 jeszcze dwa razy.
  15. Pozwól CS osiąść na dnie płytki, pozostawiając płytkę przechyloną pod kątem 45° na 5 minut. Usuń SWB, pozostawiając 200 μl w każdym dołku
  16. Dodać 200 μl SWB z przeciwciałami drugorzędowymi, przeciwciałami sprzężonymi i barwnikami o 2x skoncentrowanym działaniu (np. DAPI [1 μg/mL], mouse-AF488 [1:500], rabbit-AF568 [1:500]) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności, powoli kołysząc/potrząsając.
  17. Następnego dnia powtórz kroki 9.12 i 9.13 jeszcze dwa razy.
  18. Ostrożnie przenieś CS do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj w tempie 70 x g przez 3 minuty.
  19. Usunąć jak najwięcej SWB, pipetując, nie przerywając CS.
  20. Dodać roztwór do zatapiania (ES; co najmniej 50 μl, w temperaturze pokojowej) za pomocą końcówki o pojemności 200 μl z odciętym końcem, delikatnie zawiesić, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  21. W międzyczasie utwórz kwadratowy pojemnik na szklanym szkiełku z lakierem do paznokci lub uszczelniaczem silikonowym.
  22. Odetnij koniec końcówki o pojemności 200 μl i przenieś CS w ES na środek kwadratowego pojemnika.
  23. Umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Aby zmniejszyć pęcherzyki powietrza, najpierw umieść szkiełko nakrywkowe po jednej stronie, a następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe z jednej strony na drugą, aż pod powierzchnią nie będzie uwięzionego powietrza, a następnie zwolnij szkiełko nakrywkowe.
  24. Delikatnie dociśnij wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić je z lakierem do paznokci lub silikonowym uszczelniaczem.
  25. Pozostaw zjeżdżalnię na noc w RT. Następnego dnia preparat jest gotowy do obrazowania.
    UWAGA: Optyczne oczyszczanie przez ES może powodować niewielkie skurczenie się tkanki. Nie może to jednak wpływać na ogólną morfologię CS. W tym miejscu można wstrzymać proces barwienia, przechowując szkiełka w temperaturze 4 °C (przez co najmniej 1 tydzień) lub w temperaturze -20 °C (przez co najmniej 6 miesięcy).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pokazany w Rysunek 1A opisuje generowanie CS z poprzednio rozbudowanych hiPSC-CMs. CS uzyskują strukturę 3D w 1 dniu po wysiewie na płytkach okrągłodennych o bardzo niskim mocowaniu i mogą być hodowane przez okres do 6 tygodni (Rysunek 1B). Jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, większość komórek w 3-tygodniowych CS wykazywała ekspresję białek sarkomerowych, takich jak α-aktynina i troponina T, i wykazywała regularną organizację sarkomeru (Figura 1C). W celu ilościowego określenia komórek dodatnich α-aktyniny przeprowadzono analizę cytometrii przepływowej. Zgodnie z wynikami immunofluorescencji, dane z cytometrii przepływowej wykazały porównywalnie wysokie poziomy α-aktyniny zarówno w dniu 0 (76,9% ± 16,6%), jak i w 3-tygodniowych CS (71,1% ± 22,7%) (Rysunek 1D), co wskazuje na stały i wysoce czysty skład komórkowy podczas hodowli. Stwierdzono zwiększoną ekspresję genów serca dla połączeń (GJA1, JPH2 i PKP2), desmosomów (DES) i mitochondriów (ATP5A) w sferoidach pochodzących z hiPSC-CM (dzień 42) w porównaniu z hiPSC-CM hodowanymi w 2D przez 90 dni (Figura 1E). Ekspresja tych genów jest cechą charakterystyczną interakcji i dojrzewania komórka-komórka30.

Następnie, właściwości funkcjonalne CS, a mianowicie szybkość bicia i obsługa Ca2+, były oceniane w różnych punktach czasowych (Rysunek 2). Parametry przejściowe wapnia, takie jak czas narastania, czas szczytu, czas zaniku i czas trwania przejściowego wapnia (CTD90), oceniano zgodnie z Rysunek 2A,B. Odsetek pokonanych CS jest podobny w ciągu pierwszych 3 tygodni po generacji, ale znacznie spadł w 6 tygodniu (Wk6) CS (Rysunek 2C). Współczynnik dudnień został znacznie zmniejszony w Wk3 w porównaniu do Wk1 i, podobnie jak procent pokonanych CS, dramatycznie spadł w Wk6 (Rysunek 2D). W Wk6 zaobserwowano pogorszenie CS, co może wyjaśniać spadek zarówno szybkości dudnienia, jak i liczby dudnień CS. Pomiar parametrów przejściowych wapnia wykazał znacznie wyższą wartość szczytową w Wk2 (Rysunek 2E), podczas gdy czas narastania, czas zaniku i CTD90 były znacznie zwiększone w Wk3 w porównaniu do Wk1 (Rysunek 2F-H). Podsumowując, wyniki te pokazują, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM są funkcjonalnie optymalne około 2. i 3. tygodnia po pogeneracji.

Rysunek 3 pokazuje wpływ wielkości sferoidy na szybkość dudnienia i obchodzenie się z wapniem. CS zostały wygenerowane przez wysiewanie 2,5 x 104, 5 x 104, 10 x 104 i 20 x 104 hiPSC-CM w studzience z 96-dołkową płytką, co daje w sumie 24 CS / dołki na warunek (Rysunek 3A). Zgodnie z oczekiwaniami, rozmiar sferoidy zwiększał się wraz ze wzrostem liczby używanych komórek, od 178 ± 36 μm do 351 ± 65 μm (Rysunek 3A, prawy panel). Stan nieustalony Ca2+ mierzono w 3-tygodniowych CS przy czterech różnych gęstościach wysiewu (Rysunek 3B). Pomiary pokonywania CS wykazały, że tylko około 50% CS o mniejszym rozmiarze (2,5 tys. i 5 tys. CS) było bitych, podczas gdy odsetek CS o większych rozmiarach (10 tys. i 20 tys. CS) był znacznie wyższy (około 85%) (Rysunek 3C). Podobny wskaźnik dudnienia (około 28 uderzeń na minutę) wykazano w przypadku 5K, 10K- i 20K-CS, który był znacznie wyższy w porównaniu do 2,5K-CS (Rysunek 3D). Wartości szczytowe obrazów wapnia były podobne we wszystkich badanych warunkach ( Rysunek 3E), jednak czas narastania (Rysunek 3F), czas zaniku (Rysunek 3G) i CTD90 (Rysunek 3H) były znacznie zwiększone w większych rozmiarach CS (10 tys. i 20 tys. CS) w porównaniu z mniejszymi (2,5 tys. i 5 tys. CS). Podsumowując, wyniki te pokazują, że sferoidy pochodzące z hiPSC-CM są optymalne do badań przesiewowych w zakresie obchodzenia się z wapniem, gdy stosuje się gęstość wysiewu między 10 tys. a 20 tys. hiPSC-CM / studzienkę.

Następnie oceniliśmy wpływ kriokonserwacji na żywotność i funkcję CS. Przed analizą rozmrożone CS utrzymywano w kulturze przez 1 tydzień (Rysunek 4A). Jak wykazano zarówno w testach żywotności komórek cytometrii przepływowej (Figura 4B), jak i Calcein-AM (Rysunek 4C), kriokonserwacja nie wpłynęła na żywotność komórek w CS. Dodatkowo, rozmrożone CS wykazywały podobne poziomy ekspresji białek sarkomerowych w porównaniu ze świeżymi, dopasowanymi wiekowo CS (Rysunek 4D). Dane te wskazują, że CS mogą być skutecznie kriokonserwowane w celu późniejszej analizy funkcji serca i wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Na koniec, aktywność dudnienia i obchodzenie się z Ca2+ zostały zmierzone zarówno w świeżych, jak i kriokonserwowanych CS (Rysunek 5). Procent pokonania CS mierzono w różnych punktach czasowych po rozmrożeniu, odpowiednio po 2, 5 i 7 dniach. Podczas gdy większość świeżych CS wykazywała aktywność bicia w czasie, wyraźnie widać, że kriokonserwowane CS potrzebowały do 1 tygodnia hodowli, aby odzyskać swoją aktywność bicia (Rysunek 5B). Nie zaobserwowano znaczącej zmiany w szybkości bicia rozmrożonych CS w porównaniu ze świeżymi; jednak nie zaobserwowano spontanicznej aktywności dudnienia w niektórych zamrożonych CS (Rysunek 5C). Chociaż wartości pików były znacznie zmniejszone w zamrożonych/rozmrożonych CS w porównaniu ze świeżymi (Rysunek 5D), nie zaobserwowano znaczących zmian w czasie narastania, czasie rozpadu i CTD90 zamrożonych/rozmrożonych CS w porównaniu ze świeżymi (Rysunek 5E-G). Dane te wskazują, że po rozmrożeniu ważne jest, aby pozwolić CS zregenerować się w inkubatorze przez co najmniej 1 tydzień przed pomiarem aktywności dudnienia i stanu przejściowegoCa2+.

Razem wzięte, te wyniki pokazują, że kriokonserwacja sferoidów pochodzących z hiPSC-CM zachowuje żywotność kardiomiocytów, strukturę sarkomeryczną i ich cechy funkcjonalne, takie jak spontaniczna aktywność dudnienia i przetwarzanie wapnia. W związku z tym sferoidy pochodzące z hiPSC-CM stanowią odpowiedni model do dokładnego podsumowania elektrofizjologii serca in vitro.

figure-results-1
Rysunek 1: Generowanie sferoid serca. (A) Schematyczne przedstawienie ukierunkowanego różnicowania serca opartego na Wnt, późniejszej ekspansji hiPSC-CM i generowania CSs. Utworzone za pomocą biorender.com. (B) Obrazy w jasnym polu w różnych punktach czasowych hodowli CS. Podziałka skali, 200 μm. Wk oznacza tydzień. (C) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne dla sercowych białek sarkomerycznych α-aktynina i troponina T w 3-tygodniowych CSs. Immunofluorescencja: Hoechst (niebieski), α-aktinina (zielony) i troponina T (czerwony). Podziałka skali, 200 μm. Powiększony, scalony obraz po prawej stronie przedstawia organizację sarkomerową. Pasek skali, 50 μm. (D) Kwantyfikacja cytometrii przepływowej komórek dodatnich α-aktyniny przed (dzień 0) i 3 tygodnie po utworzeniu CSs. (n = 14-23 na warunek. (E) RT-qPCR przeprowadzony na hiPSC-CM hodowanych przez 90 dni (2D) i próbkach sferoidalnych hodowanych przez 42 dni w celu ustalenia poziomów ekspresji różnych genów serca związanych z połączeniami komórkowymi, włóknami pośrednimi i mitochondriami. (n = 1-3 partie). Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. NS (nieistotne) obliczone za pomocą niesparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Szybkość bicia i obchodzenie się z wapniem w CS w różnych tygodniach po generacji. (A) Przykłady parametrów przejściowych wapnia obliczonych przez algorytm analizy Vala sciences w oprogramowaniu Cyteseer. (B) Reprezentatywne przejściowe ślady wapnia i obrazy poklatkowe CS w różnych punktach czasowych (tygodniach) po pogeneracji. Podziałka skali, 200 μm. (C) Kwantyfikacja przebiegu w czasie spontanicznego dudnienia jest wyrażona jako procent uderzeń CS. (D) Szybkość dudnienia CS w czasie hodowli. (E-H) Kwantyfikacja stanów przejściowych wapnia pokazująca wartość szczytową, czas narastania, czas rozpadu i CTD90. Przedstawione dane są średnimi ± SD. Kontrpróby biologiczne = trzy, kontrpróby techniczne = odpowiednio 38, 50, 66 i 7. *p < 0,05, p < 0,001; jednoczynnikowa ANOVA, po której następuje test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Skróty; CTD = przejściowy czas trwania wapnia, Wk = tydzień, CSs = sferoidy ludzkiego serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Szybkość dudnienia i obsługa wapnia w CS generowanych przy użyciu różnych gęstości wysiewu komórek. (A) Obrazowanie w jasnym polu (po lewej) i pomiary wielkości (po prawej) CS wygenerowanych przy użyciu różnych liczb hiPSC-CM. Pasek skali, 200 μm. (B) Reprezentatywne ślady przejściowe wapnia i obrazy poklatkowe 2,5K-20K-CS. (C,D) Procent pokonania i współczynnik pokonania 2,5K-20K-CSs. (E-H) Wartość szczytowa, czas narastania, czas zaniku i CTD90 w 2.5K-20K-CS. Dane są średnie ± SD. Kontrpróby biologiczne = trzy, kontrpróby techniczne = 28-39. *p < 0,05, p < 0,001; jednoczynnikowa ANOVA, po której następuje test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Skróty: CTD = przejściowy czas trwania wapnia, Wk = tydzień, k = x 1,000 komórek, CSs = sferoidy serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Wpływ kriokonserwacji na żywotność i strukturę sferoid serca. (A) Schematyczne przedstawienie generowania CS, późniejszego biobankowania i rozmrażania. (B) Badanie żywotności komórek cytometrii przepływowej zarówno w świeżych, jak i kriokonserwowanych CS. Jako kontrolę pozytywną zastosowano leczenie 10% roztworem Triton-X przez 5 minut. (n = 4 na warunek). Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. p < 0,001; jednoczynnikowa ANOVA, po której następuje test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. (C) Test żywotności komórek Calcein-AM w świeżych i rozmrożonych CS po 7 dniach hodowli (n = 15-17 na warunek, p < 0,001, za pomocą sparowanego testu t; pasek skali, 200 μm). (D) Reprezentatywne barwienie jasnym polem (po lewej) i immunofluorescencją dla ekspresji α-aktyniny i troponiny T w świeżych i rozmrożonych CSs. Immunofluorescencja: Hoechst (niebieski), α-aktinina (zielony) i troponina T (czerwony). Scalone zdjęcia po prawej stronie pokazują prążki sarkomeru w CSs. Pasek skali, 50 μm. Skróty: X = dzień rozmrażania wyboru, PI = jodek propidyny, Cal-AM = kalceina-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Przejściowe stany wapnia w świeżych i rozmrożonych CS. (A) Reprezentatywne ślady przejściowe wapnia i obrazy poklatkowe CS przed krioprezerwacją i 1 tydzień po rozmrożeniu. (B) Procent bicia świeżych i mrożonych/rozmrożonych sferoid serca. Słupki reprezentują poszczególne eksperymenty. (C) Szybkość bicia świeżych i mrożonych/rozmrożonych sferoid serca. (D-G) Kwantyfikacja parametrów przejściowych wapnia: wartość szczytowa, czas narastania, czas zaniku i CTD90. Dane są średnie ± SD. *p < 0,05, p < 0,001; jednoczynnikowa ANOVA, po której następuje test wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Skróty; CTD = przejściowy czas trwania wapnia, CSs = sferoidy serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywne strategie bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania dla α-aktyninowo-dodatnich hiPSC-CM w czystej populacji w porównaniu z kontrolą negatywną i kontrolą izotypu. Liczba analizowanych komórek dodatnich pod względem α-aktyniny wynosi 25 x 105. Skróty; SSC = rozproszenie boczne, PI+ = dodatni jodek propidyny. (B) Reprezentatywna strategia bramkowania do analizy żywotności zarówno w przypadku świeżych, rozmrożonych, kontroli dodatniej (Triton-X), jak i kontroli ujemnej (niebarwionych). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrywanie leków nasercowych jest utrudnione przez poleganie na modelach zwierzęcych i komórkowych innych niż ludzie, o niewystarczającej przepustowości i wierności fizjologicznej, aby dokładnie wykonywać odczyty. Biologia hiPSC-CM w połączeniu z oprzyrządowaniem HT i sondami fizjologicznymi może potencjalnie ponownie wprowadzić modele ludzkie do najwcześniejszych etapów modelowania chorób serca i odkrywania leków. Opracowaliśmy metodę generowania tkanki serca 3D, która wytwarza wysokiej jakości i funkcjonalne CS w celu optymalnego modelowania chorób serca i platformy badań przesiewowych leków. Ponadto połączenie technologii sferoidowej w systemach bioreaktorów 3D do przemysłowej produkcji pojazdów elektrycznych stanowi niezbędny krok w kierunku klinicznego przełożenia terapii opartej na pojazdach elektrycznych. Opisana tutaj metoda opiera się na kilku kluczowych czynnikach i jest wariantem istniejących protokołów 9,10,28,29. Metody te obejmują: 1) generowanie trójwymiarowych konstruktów tkankowych, 2) optymalną liczbę komórek i czas przed badaniem przesiewowym, 3) poprawę czułości i wysokiej przepustowości narzędzi oraz 4) możliwość zamrożenia sferoid przed jakąkolwiek analizą funkcjonalną. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych protokołów, proponowany protokół opisuje generowanie do 1500 sferoid dziennie i przydatność dla HTS. Konwencjonalna analiza stu związków w dawkach 6 x 0,5 log dla 10 powtórzeń przy użyciu istniejących 96-dołkowych systemów obrazowania wapnia lub 24-dołkowych multipleksowanych zmodyfikowanych tkanek serca wymaga około 500 milionów do 3 miliardów hiPSC-CM31,32. Proponowane zastosowanie sprawia, że badania przesiewowe serca są mniej kosztowne i efektywne czasowo w porównaniu z konwencjonalnymi systemami, ponieważ 96-dołkowe płytki wymagały tylko 10% gęstości wysiewu w porównaniu z opisaną metodą. Co więcej, w porównaniu z poprzednimi protokołami, takimi jak metoda wiszącej kropli, generowanie sferoid przez samoagregację w płytkach o bardzo niskim mocowaniu umożliwia wysokiej jakości zautomatyzowane obrazowanie pojedynczych mikrotkanek33.

Ten mały model 3D naśladuje biologiczny i fizjologiczny fenotyp środowiska sercowo-naczyniowego in vivo . Jak wykazano wcześniej, stany przejściowe wapnia dramatycznie zwiększają się w trójwymiarowych konstruktach tkanki serca w porównaniu z jednowarstwowymi hodowlami komórkowymi2D 34.

Następnie odkryliśmy, że gęstość siewu i właściwy czas hodowli są również kluczowymi czynnikami dla udanego badania przesiewowego CS. Zagęszczenie 10K-20K hiPSC-CM na sferoidę i badanie przesiewowe między 2-3 tygodniami po potworzeniu były optymalne, podczas gdy zbyt małe lub zbyt stare sferoidy wykazują zaburzone obchodzenie się z wapniem (ryc. 2 i ryc. 3). Dlatego ważne jest, aby utrzymać jak najbardziej stałą gęstość wysiewu, ponieważ wielkość wpływa na parametry funkcjonalne. Ponadto, chociaż ta metoda optyczna zapewnia dobre wyniki dla żywych kultur 3D jako całej tkanki, uzyskanie danych w obrębie większych sferoid na poziomie (sub)komórkowym jest wyzwaniem bez polegania na czasochłonnych metodach histologicznych. Ostatnio opublikowano kilka podejść, w których zastosowano "optycznie oczyszczanie", które umożliwia pozyskiwanie całych sferoid 3D z możliwością ilościowego oznaczania markerów w pojedynczych komórkach. W tym przypadku dostosowaliśmy 3-dniowy protokół od zbierania CS do analizy obrazu, który jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania 3D przy użyciu mikroskopii konfokalnej29 (ryc. 1C i ryc. 4D).

Wreszcie, wraz ze wzrostem liczby zastosowań 3D tkanek serca i zastosowań komercyjnych, rośnie zapotrzebowanie na długoterminowe przechowywanie i biobankowanie dostosowane do potrzeb pacjenta od różnych dawców. Kriokonserwacja to skuteczna strategia generowania płytek HTS z wielu partii w czasie. Zamrażanie hiPSC-CM zostało opisane wcześniej i nie różni się od innych typów hodowanych komórek 10,35,36. Ostatnio opisano podejścia do zamrażania płytek z komórkami 2D37. W tym przypadku stwierdziliśmy, że zestaw do krioprezerwacji PSC jest najbardziej optymalnym warunkiem w porównaniu z trzema innymi (dane nie pokazane) i użyliśmy tego podłoża do wydajnego zamrażania sferoid. Po krioprezerwacji, żywotność pozostaje wysoka (ryc. 4B,C), ale wpływa to na właściwości elektrofizjologiczne CS i wymagany jest okres inkubacji po rozmrożeniu. Rzeczywiście, 1 tydzień po rozmrożeniu CS wykazywały spontaniczną aktywność bicia i radzenie sobie z wapniem. Opisano jednak, że świeże i odzyskane hiPSC-CM nie zawsze wykazują identyczne właściwości molekularne i fizjologiczne38. Ograniczenie to należy wziąć pod uwagę, gdy kriokonserwowane hiPSC-CM są używane do oceny odczytów serca wywołanych lekiem. Co więcej, chociaż skutecznie modulujemy liczbę komórek na sferoidę i optymalny czas obrazowania przejściowego wapnia, sferoidy serca można poprawić, mieszając komórki kardiomiocytów pochodzące z hiPSC z komórkami śródbłonka, fibroblastami, połączeniami komórka-komórka i matrycami zewnątrzkomórkowymi, takimi jak chitozan, kolagen IV, fibronektyna, matrigel lub laminina, naśladując środowisko serca in vivo 39, Lokal mieszkalny 40. Ogólnie rzecz biorąc, proponujemy protokół krok po kroku, aby skutecznie generować CS, które są odpowiednie do dalszych zastosowań, takich jak modelowanie chorób i badania przesiewowe leków HT.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować firmie VALA sciences za pakiet oprogramowania Cyteseer i optymalizację automatycznej analizy 3D wapnia. Pragniemy podziękować za wsparcie grantowe od fundacji PLN (RM). P.A.D. i F.S. są wspierane przez CUREPLaN Leducq. Projekt J.P.G.S. jest wspierany przez program H2020-EVICARE (#725229) Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC). J.W.B. jest wspierany przez UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship oraz CVON-Dosis Young Talent Grant; Holenderska Fundacja Kardiologiczna (CVON-Dosis 2014-40). N.C. jest wspierany przez program grawitacyjny "Materials Driven Regeneration" Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (RegmedXB #024.003.013) oraz działania Marie Skłodowska-Curie (umowa o grant RESCUE #801540). V.S.-P. jest wspierany przez Fundusz Sojuszu (UMCU, UU, TU/e). Projekt A.v.M. jest finansowany ze środków UE w ramach finansowanego ze środków UE projektu BRAVE (H2020, ID:874827)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płyta wisząca Corning 3738
96 dołków Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateCorningCLS3474-24EA
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
Przeciwciało anty-&alfa;-aktyninowe (sarkomeryczne)Sigma-AldrichA7811Rozcieńczenie: 1:200
Przeciwciało przeciw sercowej troponinie T (ab45932)Abcamab45932Rozcieńczenie: 1:200
Kwas askorbinowy Sigma-AldrichA8960
B-27 suplement Thermo Fisher Scientific17504-044
BiotynaSigma-AldrichB4639
Surowica bydlęca frakcja albuminy frakcji V (BSA)Roche10735086001
Cal-520, AM Abcamab171868
Mikroskop konfokalnyLeica DMi8 
Oprogramowanie mikroskopu konfokalnego Leica Las X
Tubki stożkowe 15 mlGreiner Bio-One5618-8271
Monohydrat kreatyny Sigma-AldrichC3630
DAPI Thermo Fisher ScientificD3571Stężenie: 1 &mikro; g/mL
DMEM bez glukozy Thermo Fisher Scientific11966025
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Fruktoza Sigma-Aldrich76050771.05
GlukozaSigma-AldrichG7021
Wysięgnikglicerolowy76050771.05
Kozia anty-mysia Alexa Fluor 488InvitrogenA11029Rozcieńczenie: 1:500
Koza anty-królik Alexa Fluor 568InvitrogenA11011Rozcieńczenie: 1:500
Wytrząsarka poziomaIKA4003000
Ludzkie indukowane pluripotencjalne linie komórek macierzystych(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)CVI-273 (kontrola 1)
Ludzkie indukowane pluripotencjalne linie komórek macierzystychNiemcy 141 (kontrola 2) 144 (kontrola 3)
Kwas solny (HCl) Ajax Firechem265.2.5L-PL10 M roztwór podstawowy,
Kontrola izotypu, mysz FITC IgM κ izotypBD556652
Wymiana surowicy KnockOut Thermo Fisher Scientific10828Ochrona przed światłem
L-karnitynaSigma-AldrichC0283
System wapniowo-kurczliwości miocytówLeica Grzmot, DMi8
Aminokwasy endogenne (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140
Roztwór paraformaldehydu 4% w 1x PBS, pH 7,0– 7.6Santa CruzSC281692Niebezpieczny
PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023
Penicylina/streptomycyna membranowych Thermo Fisher Scientific15140
PESCorning 
Roztwór do barwienia PI/RNazyInvitrogenF10797Rozcieńczenie: 1:1000
Pluronic  F-127Sigma-AldrichP2443
Zestaw do kriokonserwacji PSCThermo Fisher ScientificA2644601
RevitaCellThermo Fisher ScientificA2644501
RPMI 1640 średni Thermo Fisher Scientific11875
Zestaw elastomerów silikonowychSYLGARD184
Roztwór dodecylosiarczanu sodu (10%)Sigma-Aldrich71736
L-mleczan soduSigma-Aldrich71718
TaurynaSigma-AldrichT0625
Tris Fisher Naukowe 
Triton X-100MerckX100-1LNiebezpieczny
roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
TrypLE Select Enzyme (10x)Thermo Fisher ScientificA1217701
Tween-20 Sigma-AldrichP1379
Mocznik Sigma-Aldrich51456
Witamina B12Sigma-AldrichV6629
Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor kinazy Rho)Tocris 1254Chronić przed światłem
System filtrów próżniowych 43109711486631

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134(2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178(2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813(2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043(2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334(2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142(2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229(2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464(2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228(2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30(2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799(2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135(2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066(2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168(2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cardiac SpheroidsHigh Throughput ScreeningInduced Pluripotent Stem CellsCardiac Disease Modeling3D Cell CultureCalcium Handling AnalysisCardiac BiobankingOptical ImagingCryopreservation ProtocolCardiomyocyte Maturation

Powiązane artykuły