Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Camille  C. van Neste; Karlo A. Wiley; Serena W. Chang; Joseph Borrello; Irene C. Turnbull; Kevin D. Costa

doi:10.3791/64368

Artykuł metodologiczny

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

DOI:

10.3791/64368

⸱

2 czerwca 2023

Camille C. van Neste¹ , Karlo A. Wiley¹ , Serena W. Chang¹ , Joseph Borrello¹ , Irene C. Turnbull¹ , Kevin D. Costa¹

¹Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewydolność serca pozostaje główną przyczyną zgonów na całym świecie, tworząc pilne zapotrzebowanie na lepsze modele przedkliniczne ludzkiego serca. Inżynieria tkankowa ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań naukowych nad sercem; Hodowla komórek ludzkich in vitro eliminuje różnice międzygatunkowe modeli zwierzęcych, podczas gdy środowisko 3D bardziej przypominające tkanki (np. z macierzą zewnątrzkomórkową i sprzężeniem heterokomórkowym) symuluje warunki in vivo w większym stopniu niż tradycyjna dwuwymiarowa hodowla na plastikowych szalkach Petriego. Jednak każdy model systemu wymaga specjalistycznego sprzętu, na przykład specjalnie zaprojektowanych bioreaktorów i urządzeń do oceny funkcjonalnej. Ponadto protokoły te są często skomplikowane, pracochłonne i nękane awarią małych, delikatnych tkanek.

Ten artykuł opisuje proces generowania solidnego systemu modelowego ludzkiej tkanki serca (hECT) przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych do podłużnego pomiaru funkcji tkanek. Sześć hECT z liniową geometrią pasków jest hodowanych równolegle, przy czym każdy hECT jest zawieszony na parze słupków z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykrywających siłę przymocowanych do stojaków PDMS. Każdy post jest zwieńczony czarnym stabilnym modułem śledzenia słupków PDMS (SPoT), nową funkcją, która poprawia łatwość użytkowania, przepustowość, retencję tkanek i jakość danych. Kształt pozwala na niezawodne optyczne śledzenie ugięć słupków, zapewniając lepsze śledzenie siły drgania przy absolutnym aktywnym i pasywnym naprężeniu. Geometria nasadki eliminuje uszkodzenia tkanek spowodowane ześlizgiwaniem się hECT ze słupków, a ponieważ obejmują one drugi etap po wyprodukowaniu stojaka PDMS, SPoT można dodać do istniejących projektów opartych na PDMS bez większych zmian w procesie produkcji bioreaktora.

System służy do pokazania znaczenia pomiaru funkcji hECT w temperaturach fizjologicznych i pokazuje stabilną funkcję tkanki podczas pozyskiwania danych. Podsumowując, opisujemy najnowocześniejszy system modelowy, który odtwarza kluczowe warunki fizjologiczne w celu zwiększenia biowierności, wydajności i rygoru inżynieryjnych tkanek serca do zastosowań in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele tkanek serca dostępne są w różnorodnym zakresie geometrii i konfiguracji do podsumowania różnych aspektów rodzimej niszy sercowej, które są trudne do osiągnięcia za pomocą tradycyjnej dwuwymiarowej hodowli komórek. Jedną z najczęstszych konfiguracji jest liniowy pasek tkankowy^, z elastycznymi kotwicami na każdym końcu, które indukują samoorganizację tkanki i zapewniają tkance zdefiniowane obciążenie wstępne oraz odczyt wynikowych sił skurczu^1,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹
^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷. Generowaną siłę można solidnie określić za pomocą optycznego śledzenia skracania tkanki i wykorzystując teorię wiązki sprężystej do obliczenia siły wynikającej ze zmierzonych ugięć i stałej sprężystości kotew^1,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,
²¹^,²²^,²⁵^,²⁶^,²⁸.

Jednak inżynieria tkanek serca to wciąż rozwijająca się dziedzina, a pewne wyzwania pozostają. Specjalistyczny sprzęt, taki jak wykonane na zamówienie bioreaktory i urządzenia do oceny funkcjonalnej, jest wymagany dla każdego systemu modelowego¹⁰^,²⁹^,³⁰^,³¹. Rozmiar i złożoność mikrośrodowiska tych konstruktów są często ograniczone przez niską przepustowość spowodowaną pracochłonnymi protokołami, dużą liczbą komórek i kruchością tkanek. Aby rozwiązać ten problem, niektóre grupy zwróciły się ku wytwarzaniu mikrotkanek zawierających tylko setki lub tysiące komórek, aby ułatwić wysokoprzepustowe testy, które są przydatne do odkrywania leków. Jednak ta zmniejszona skala komplikuje dokładną ocenę funkcji¹², eliminuje kluczowe aspekty natywnej niszy sercowej (takie jak gradienty dyfuzji składników odżywczych/tlenu i złożona architektura³⁶) i ogranicza ilość materiału dostępnego do późniejszej analizy molekularnej i strukturalnej (często wymagającej łączenia tkanek). Tabela 1 podsumowuje niektóre konfiguracje liniowych modeli pasków tkankowych w literaturze¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,9^,¹⁰^,¹¹^,^12,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,
²¹^,^22,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰.

. . . . . .

Grupa	Komórki na tkankę	Tkanki na płytkę	Format płyty	Funkcja kotwiczenia	Funkcjonalna metoda pozyskiwania danych	Wspólna kąpiel medialna?	Miernik funkcjonalny ment in situ?
Yoshida (ECT)³⁸	4 miliony	6	zmodyfikowana płytka 6-dołkowa*	przetwornik siły	bezpośredni pomiar siły	Nie	Nie
Chan (hESC-CM-ECTs)²⁶	310 tys	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	posty PDMS	bezpośredni pomiar siły	tak	Nie
Feinberg (dyn-EHT)¹⁶	1,5 miliona	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	przewód PDMS	kształt tkanki	Nie	tak
RADISIC (BioWire)^{39, 40}	110 tys	8		drut polimerowy	kształt przewodu	tak	tak
Costa (pojedynczy hECT)^{1, 2}	1-2 miliony	4**	10 cm szalka Petriego**	posty PDMS	odchylenie optyczne (śledzenie krawędzi/obiektów)	tak	tak
Costa (multi-hECT)^3–9	500 tys. 1 mln	6	6 cm szalka Petriego	posty PDMS	odchylenie optyczne (śledzenie krawędzi/obiektów)	tak	tak
Costa (multi-hECT W/ SPoT)	1 milion	6	6 cm szalka Petriego	Posty PDMS z czarnymi wersalikami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów)	tak	tak
Passier (EHT)¹⁷	245 tys	36	płytka 12-dołkowa	Posty PDMS z czarnymi wersalikami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów)	tak	tak
Vunjak-Novakovic^{13, 18}	1 milion	12	6 cm szalka Petriego	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi)	tak	tak
Vunjak-Novakovic (Milifilar)¹⁴	550 tys	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów); obrazowanie wapnia	Nie	tak
Eschenhagen (EHT)^{10, 19–21}	1 milion	12	płytka 12-dołkowa	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi po ugięciu); obrazowanie wapnia	Nie	tak
Zandstra (CaMiRi)²²	25-150 tys	96 Rozdział 96	96-dołkowa płytka	Posty PDMS z hakami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi)	Nie	tak
Murry^{23, 24}	900 tys	24	24-dołkowa płytka	słupki PDMS z nakładkami, zintegrowany magnes	czujnik magnetyczny	Nie	tak
Rzesza (μTUG)^{11, 12, 25}	niezdefiniowany	Rozdział 156	156-dołkowe danie	słupki PDMS z nakładkami, zintegrowany magnes	śledzenie optyczne (koralik fluorescencyjny)	tak	tak

Tabela 1: Charakterystyka niektórych liniowo zaprojektowanych modeli tkanek serca w literaturze. Liniowe modele tkanek serca różnią się wielkością, przepustowością, projektami funkcji kotwiczenia i ułatwieniem wspólnych kąpieli w pożywce, a także wymaganiami dotyczącymi oddzielnego systemu kąpieli mięśniowej w celu charakterystyki funkcjonalnej. * Naukowcy wykorzystali dostępny na rynku inżynieryjny system tkankowy oparty na wymiarach standardowej płytki 6-dołkowej. ** System modułowy, w którym bioreaktory jednotkankowe są zakotwiczone w dowolnym plastikowym naczyniu hodowlanym w żądanej liczbie i miejscu.

Ten artykuł opisuje najnowszy protokół wytwarzania naszego uznanego modelu liniowej ludzkiej tkanki serca (hECT)1^,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁵^,²⁷ i metody oceny funkcji kurczliwości hECT. Każdy bioreaktor wielotkankowy mieści do sześciu hECT we wspólnej kąpieli i składa się z dwóch "stojaków" wykonanych z polidimetylosiloksanu z elastomeru silikonowego (PDMS) zamontowanych na sztywnej ramie polisulfonowej. Każda szafa PDMS zawiera sześć elastycznych, zintegrowanych słupków z czujnikiem siły o średnicy 0,5 mm i długości 3,25 mm, a razem dwa stojaki zapewniają sześć par słupków, z których każdy mieści jeden hECT. Odwrócenie bioreaktora pomaga przezwyciężyć wszelkie przeszkody w wizualizacji hECT od dołu spowodowane kondensacją wody z pożywki hodowlanej lub zniekształceniami menisku granicy faz powietrze-ciecz. Każde skurczenie hECT powoduje ugięcie zintegrowanych słupków końcowych, a optyczny pomiar sygnału ugięcia jest przetwarzany na śledzenie siły w funkcji czasu reprezentujące funkcję kurczenia się hECT¹^,^2,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁵^,²⁷. W porównaniu z bioreaktorami jednotkankowymi zwykle stosowanymi w przypadku tkanek tej wielkości, konstrukcja wielotkankowa poprawia przepustowość eksperymentalną i umożliwia badanie sygnalizacji parakrynnej między sąsiednimi tkankami o potencjalnie różnym składzie komórkowym. System ten został zweryfikowany w opublikowanych badaniach opisujących zastosowania w modelowaniu chorób⁴^,⁸, sygnalizacja parakrynna⁶^,⁷, hodowla heterokomórkowa⁵^,⁹ i terapeutyczne badania przesiewowe⁷^,⁹.

W tym systemie, hECT są zaprojektowane tak, aby miały około 6 mm długości i 0,5 mm średnicy, aby ułatwić niezawodne optyczne śledzenie pomiarów siły przy niskim poziomie szumów. Co więcej, aspekty złożoności tkanek, takie jak gradienty dyfuzji i organizacja komórkowa, są zrównoważone możliwym do opanowania zapotrzebowaniem na 1 milion komórek na tkankę. W przypadku standardowej technologii kamer CCD, siły tak słabe jak 1 μN (reprezentujące mniej niż 5 μm po ugięciu) generują wyraźny sygnał, zapewniając, że nawet bardzo słaba funkcja skurczu, jak obserwowano w przypadku niektórych modeli choroby hECT, może być dokładnie zmierzona. Ułatwia to również szczegółową analizę krzywej siły drgania, umożliwiając w ten sposób analizę o wysokiej zawartości do 16 wskaźników kurczliwości⁴¹, w tym siły rozwiniętej, szybkości skurczu (+dF/dt) i relaksacji (−dF/dt) oraz zmienności szybkości uderzeń.

Ten protokół zaczyna się od instrukcji wytwarzania komponentów bioreaktora. Szczególną uwagę zwrócono na etapy mające na celu maksymalizację wydajności hECT, zmniejszenie technicznej zmienności funkcji tkanki oraz optymalizację jakości i głębokości oceny tkanki. Większość badań nad inżynierią tkanek serca nie podaje wskaźników utraty tkanek podczas produkcji i testów długoterminowych, chociaż jest to dobrze znane wyzwanie w tej dziedzinie i zmniejsza przepustowość i wydajność badań²⁷. Opisane tutaj metody inżynierii tkankowej zostały udoskonalone na przestrzeni lat, aby zapewnić utrzymanie wszystkich hECT w większości bioreaktorów (niezależnie od tego, w jaki sposób wykonane są stojaki PDMS). Jednak nawet utrata 5%-20% tkanek może znacząco wpłynąć na moc statystyczną, szczególnie w mniejszych eksperymentach ograniczonych liczbą dostępnych kardiomiocytów (np. z powodu wyzwań związanych z różnicowaniem niektórych chorych linii komórkowych⁴ lub ze względu na wysoki koszt zakupionych komercyjnie kardiomiocytów) lub przez warunki leczenia (np. ograniczona dostępność lub wysoki koszt różnych związków terapeutycznych).

Ten protokół opisuje produkcję stabilnych trackerów pocztowych (SPoT), nowej funkcji stojaków PDMS, które funkcjonują jako zaślepki na końcach słupków wykrywających siłę, które utrzymują hECTs²⁷. Pokazano, w jaki sposób geometria nasadki znacznie zmniejsza straty hECT spowodowane upadkiem lub zerwaniem słupków, otwierając w ten sposób nowe możliwości hodowli hECT o większej różnorodności sztywności i naprężeń, które są trudne do wyhodowania na niezamkniętych słupkach. Dodatkowo, SPoT zapewniają obiekt o wysokim kontraście, aby poprawić optyczne śledzenie skurczu hECT poprzez spójny i dobrze zdefiniowany kształt²⁷. Po tym następuje opis hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i różnicowania kardiomiocytów w oparciu o wcześniej opublikowane protokoły³^,⁴²^,⁴³ oraz wyjaśnienie wytwarzania hECT, hodowli i pomiarów funkcjonalnych.

Ten artykuł również porusza potrzebę pomiaru funkcji tkanek w temperaturze fizjologicznej. Ludzki mięsień sercowy (zdrowe i chore tkanki płodu, jak i dorosłego), a także tkanka serca wielu gatunków zwierząt (w tym szczurów, kotów, myszy, fretek i królików)⁴⁴^,⁴⁵, wykazuje wyraźny wzrost siły drgania dopasowanej do częstotliwości w temperaturach 28 °C-32 °C w porównaniu z temperaturą fizjologiczną - zjawisko znane jako inotropia hipotermiczna⁴⁵^,⁴⁶. Jednak wpływ temperatury na zmodyfikowaną funkcję tkanki mięśnia sercowego pozostaje niedostatecznie zbadany. Wiele najnowszych modeli tkanek serca dostępnych w literaturze zostało zaprojektowanych tak, aby można je było ocenić funkcjonalnie w temperaturze 37 °C w celu przybliżenia warunków fizjologicznych¹³^,¹⁴^,³⁷. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, zależny od temperatury wpływ na siłę generowaną przez zmodyfikowane tkanki serca nie był systematycznie badany. Protokół ten opisuje konstrukcję elektrody stymulującej, która minimalizuje straty ciepła podczas testowania, a także pozwala na włączenie izolowanego elementu grzejnego do zestawu do pomiarów funkcjonalnych, który może utrzymać hECT w temperaturze fizjologicznej bez uszczerbku dla sterylności²⁷. Następnie przedstawiamy niektóre z zaobserwowanych wpływów temperatury na funkcję hECT, w tym na wytworzoną siłę, częstotliwość spontanicznych dudnień, +dF/dt i −dF/dt. Podsumowując, niniejszy artykuł zawiera szczegóły wymagane do wytworzenia tego wielotkankowego systemu bioreaktora z czujnikiem siły do wytwarzania tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka i oceny ich funkcji skurczowej, a także przedstawiono zestaw danych, które stanowią podstawę do porównania pomiarów w temperaturze pokojowej i w temperaturze 37 °C²⁷.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

This protocol used a de-identified iPSC line, SkiPS 31.3 (originally reprogrammed using dermal fibroblasts from a healthy 45 year old male)⁴⁷, and was, thus, exempt from specific Institutional Review Board approval, in concordance with the institution's human research ethics committee guidelines. Perform all the cell and hECT manipulation in aseptic conditions in a HEPA-filtered class II biological safety cabinet or laminar flow work bench. Sterilize all the non-sterile solutions by filtration through a 0.22 µm filter, and maintain all the cells and hECTs in an incubator at 37 °C, 95% relative humidity, and 5% CO₂.

1. Bioreactor fabrication

Bioreactor components and aluminum master cast fabrication
NOTE: Computer-aided design (CAD) files are provided in Supplementary File 1. The protocol may be paused anywhere between these steps. It is recommended to enlist a professional machinist to manufacture the master molds described in this section, as high tolerances (≤5 µm) and a smooth finish are required for accurate post geometry and for proper press-fitting of the polysulfone frames to the polytetrafluoroethylene (PTFE) baseplates (aiming for a snug friction fit, but not too tight).
1. Using a computer numerical control (CNC) mill, machine the baseplate out of PTFE according to the schematics in Figure 1A. The hECTs will be formed in the six evenly spaced wells (white arrows).
2. Using a CNC mill, machine the polydimethylsiloxane (PDMS) rack negative master cast out of aluminum according to the schematics in Figure 1B, with three frame supports (green asterisks). Drill six evenly spaced holes (magenta arrowheads) of 0.5 mm in diameter for creating the PDMS posts.
3. Using a CNC mill, machine the bioreactor frame out of polysulfone according to the schematics in Figure 1C. The frame supports (green asterisks) correspond to the frame supports seen in the rack cast (Figure 1B, green asterisks).
4. Using a CNC mill, machine the aluminum cast holder out of aluminum according to the schematics in Figure 1D. Each slot contains a triangular shelf (orange triangle) that is 0.25 mm tall to provide a dead space for the PDMS to flow through the holes in the PDMS rack casts (Figure 1B, magenta arrowheads).
Casting of the PDMS rack from the aluminum negative masters
1. Using a thermoplastic fused deposition modeling 3D printer, print two PDMS rack casting apparatus brackets (Supplementary File 1). Use the following print settings: a layer height of 0.1 mm, a wall/bottom/top thickness of 1 mm, an infill density of 90% with triangles, a printing temperature of 230 °C, a build plate temperature of 70 °C, and a brim for adhesion.
2. Place four aluminum negative master casts in the cast holder (Figure 2AI) such that the post holes align with the dead space opposite the triangle shelves (see Figure 1D). Wrap the apparatus in a rectangular piece of 0.5 mm thick silicone sheeting (Figure 2B, white arrows) as a gasket to prevent leakage of the liquid PDMS and clamp it between two parallel 3D printed brackets using a screw clamp.
3. Add 0.5 mL of PDMS curing agent to 5 mL of PDMS elastomer base (1:10 ratio, as per the manufacturer's instructions) in a shallow container, and mix vigorously for 5 min. Degas the PDMS mixture in a vacuum chamber, and apply a strong vacuum (0.1-1 kPa) for 20-60 min at room temperature or until bubbles disappear.
4. Pour the PDMS mixture onto the casting apparatus, overfilling to ensure the complete coverage of each slot (Figure 2AII). If desired, add small, colored glass beads to the body of the PDMS racks (Figure 2AII), opposite the side with the posts (Figure 2B), for the unique identification of each PDMS rack. Return the casting apparatus to the vacuum chamber (ensuring it is horizontally level), and apply a strong vacuum for at least 12 h. Allow the PDMS to cure at room temperature for about 48 h away from dust to enable the complete curing and maximum strength of the delicate posts. Avoid using an oven as this warps the 3D-printed components.
  NOTE: The protocol can be paused here.
PDMS rack removal from the aluminum negative master casts
1. Remove the clamp, brackets, and silicone sheeting from the casting apparatus. Using a stainless-steel razor blade, trim away the PDMS film on top of the casting apparatus and frame supports, and gently use fingers to separate the PDMS racks from the sides of the cast holder. Insert a blunted stainless-steel razorblade into the dead space between the cast and the cast holder, and pry them apart (Figure 2CI, II), ensuring that the PDMS filling the dead space remains with the cast holder (as this is attached to the posts). Using a sharp stainless-steel blade, cut away the remaining PDMS films, and cut the dead-space PDMS from the tips of the posts (Figure 2C III-V).
2. CRITICAL STEP: Free the PDMS rack from the cast (Figure 2D). Beginning with the side opposite the posts, use fingers to slowly separate the PDMS rack from the cast, working on alternate sides until the posts are free of the master casts.
3. Repeat the previous step until all the PDMS racks and all the posts are freed. Use a sharp razor blade to trim away any remaining excess PDMS from the racks. The result is a PDMS rack (Figure 2E) with six intact posts (orange arrowheads) and colored beads (blue arrow) for identification.
  NOTE: The protocol can be paused here.
Stable post tracker (SPoT) fabrication
1. Using a thermoplastic fused deposition modeling 3D printer, print the components of the SPoT casting apparatus (Supplementary File 2 and Figure 3AI, II). Use the following print settings: a layer height of 0.1 mm, a wall/bottom/top thickness of 1 mm, an infill density of 80% with triangles, a printing temperature of 230 °C, a build plate temperature of 70 °C, and a brim for adhesion.
2. Ensure a secure press fit between the 3D-printed pieces, as well as between the PDMS racks and the three-pronged jig, and confirm that the PDMS racks fit snugly with the posts just reaching the bottoms of the wells without being bent. Trim/file the plastic if necessary.
3. Add 0.5 mL of black PDMS part A to 0.5 mL of part B (1:1 ratio, as per the manufacturer's instructions) to a small weighing boat (or a similar small, shallow container), and mix thoroughly until uniform in color. Degas the mixed black PDMS in a vacuum chamber under a strong vacuum for 20 min. Pour the degassed black PDMS onto the 3D-printed base to fill

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z powyższym protokołem, kardiomiocyty zostały wygenerowane ze zdrowej linii iPSC używanej wcześniej przez naszą grupę⁹^,¹⁵ i przetworzone na hECT po 8-61 dniach w hodowli. Rysunek 9A pokazuje reprezentatywne obrazy hECT widziane od dołu, które zostały utworzone bez (na górze) i z (na dole) SPoT. Pomiary funkcjonalne wykonano w temperaturze pokojowej (23 °C) i w temperaturze fizjologicznej (36 °C) między 37 dniami a 52 dniami p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W literaturze opublikowano wiele liniowych modeli tkanek serca, z których część opisano w tabeli 1. Niektóre modele obejmują bezpośredni pomiar siły działającej na tkankę, ale zazwyczaj wymagają one przeniesienia konstruktu do oddzielnej kąpieli mięśniowej³⁸. Większość modeli jest projektowana z tkankami trwale zakotwiczonymi na obu końcach, najczęściej do słupków PDMS 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.D.C. jest współzałożycielem i dyrektorem naukowym Novoheart oraz posiada udziały w holdingu Medera Biopharmaceutical. Novoheart nie przyczynił się do finansowania, planowania ani realizacji tego badania; jednak wyniki badania mogą mieć potencjalny wpływ finansowy na Novoheart i Medera. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Timothy'emu Cashmanowi za wcześniejsze prace nad tą metodą. Badanie to było finansowane przez National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 i K01 HL133424) oraz Międzynarodowy Program Sieci Doskonałości Fundacji Leducq (CURE-PLaN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut ze stali nierdzewnej o średnicy 0,25 mm 304	McMaster Carr	6517K61
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco	25200056
1,7 ml mikroprobówek	Axygen	MCT-175-C
10 cm (20 mm wysokości)	Corning	353003
10 ml Pipeta serologiczna	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	rozcieńczyć 1:10 w sterylnej wodzie destylowanej
10X Zmodyfikowany Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μ L Mikropipeta	Eppendorf	3123000055
200 μ L Końcówki do mikropipet	VWR	76322-150
5 ml Pipeta serologiczna	Drummond	6-000-005
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	Falcon	352070
6 cm szalka Petriego	Corning	353002
6-watowy podwójny oświetlacz LED na gęsiej szyi	AmScope	LED-6W
Płytki 6-dołkowe	Corning	353046
Lustro kątowe 90 stopni	Edmund Optics	45-594
Akrylowy klej wiążący	SCIGRIP	#4
Regulowany podnośnik 10 cm x 10 cm	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminium 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Obiektyw	Worki autoklawe ZEISS	1020-863
	Propper	21002
B-27 suplement	ThermoFisher	17504044
B-27 suplement (bez insuliny)	ThermoFisher	A1895601
Wirówka stołowa	Eppendorf	5810 R
ABS	Ultimaker		2,85 mm szeroki
bydlęcy Kolagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II
	estreetplastics 1002502436		o grubości 6,25 mm
	Haas	VF-1
Przewodzące pręty grafitowe	McMaster Carr	1763T33
Mikroskop preparacyjny	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Etanol	Fisher Scientific	A4094	Rozcieńczyć do 70% w wodzie
EVE Automatyczny licznik komórek	NanoEntek	E1000
EVE Szkiełko do liczenia komórek	NanoEntek	EVS-050
Płodowa surowica bydlęca	Technologies	10438026
Drobno zakrzywione kleszcze	Fine Science Tools	11253-25
Forma Seria II Inkubator CO2 z płaszczem wodnym	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "inkubator". Z filtrem HEPA klasy 100
Oprogramowanie Fusion360	Autodesk		AKA "Oprogramowanie CAD"Szklany
hemocytometr	Reichert	1475	o głębokości 0,1 mm
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
z kwalifikacją hESC	Corning	354277	AKA "matryca membrany podstawnej". Przechowywać w zamrożonych porcjach
Szybka kamera CCD	PixelLINK	P7410
Mikroskop odwrócony	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10-krotny obiektyw z kontrastem fazowym
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Czysta ławka z przepływem laminarnym	NuAire	NU-201-330	niezbędny do analizy funkcjonalnej hECT
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i i procesor, procesor 2,8 GHz, 16 GB pamięci RAM
Maszyna do cięcia laserowego	Epilog	Helix 24
Zestaw słuchawkowy z powiększeniem	ExcelBlades	70020	Zalecany do kroków wymagających precyzyjnych manipulacji
Matlab	Mathworks	w wersji 2019b lub nowszej	AKA "analiza danych oprogramowanie"
Nożyczki Micro Vannas, ostrze 3 mm	WPI Instruments	501839
Statyw do mikroskopu	Olympus	SZ2-STU1
Roztwór podstawowy penicyliny-streptomycyny	ThermoFisher	15140122	10 000 j.m./ml penicyliny; 10 000 μ g/ml streptomycyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez kationów dwuwartościowych	Sigma Aldrich	P3813	Rozcieńczony w wodzie destylowanej do stężeń 1X i 10X
Kontroler pipet	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Oprogramowanie aparatu"
Polisulfon	McMaster Carr	86735K73	półprzezroczysty kolor bursztynowy
Politetrafluoroetylen (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	, formowany
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "Media dysocjacyjne iPSC"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Folia silikonowa	SMI produkcja		błyszcząca, grubość 0,02, twardość 40
Rozmiar 10/0 Niebieskie, zielone, czerwone i żółte szklane koraliki nasienne	Kolor Michaela		powinien wytrzymać
Szpatułka	Fisher Scientific	14-373	służąca do mieszania PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Ostrza do golenia ze stali nierdzewnej	GEM	62-0179-CTN	preferowane w stosunku do stali nierdzewnej ze względu na niższą twardość
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "Pożywka hodowlana iPSC"
Sterylna woda destylowana	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 - Elastomer silikonowy Encapsulant 0,9 kg Zestaw	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA Polidimethylsiloxane (PDMS)
Sylgard 184 - Elastomer silikonowy bezbarwny 1 lb Zestaw	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB	ZESTAW AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Podgrzewany stage z kontrolowaną temperaturą	Okolab	H401-HG-SMU	Ustaw wysokość do 10 cm
Termoplastyczna drukarka 3D	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Komora próżniowa	Bel-Art Parts	F42027-0000
Mini piła taśmowa o zmiennej prędkości	Micro-Mark	82203
Miniaturowa wiertarka o zmiennej prędkości	Micro-Mark	82959
Wibracje Stół izolacyjny	Labconco	3618000
Łodzie wagowe	VWR	10803-140
Zacisk stołowy do cylindra Talon	VWR	97035-528	AKA zacisk śrubowy

Przezroczysta folia akrylowa Labconco 3430009 Pionowy młyn CNC Life do autoklawowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447(2016).
Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373(2019).
Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214(2022).
Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919(2020).
Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931(2019).
Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14(2020).
Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Tagi

Engineered Cardiac Tissues Bioreactor Design Human Heart Model Induced Pluripotent Stem Cells Tissue Engineering PDMS Racks Stable Post Tracker Optical Tracking Force Measurement Paracrine Signaling

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Tagi

Powiązane artykuły