Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Camille  C. van Neste; Karlo A. Wiley; Serena W. Chang; Joseph Borrello; Irene C. Turnbull; Kevin D. Costa

doi:10.3791/64368

Artykuł metodologiczny

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64368

⸱

2 czerwca 2023

Camille C. van Neste¹ , Karlo A. Wiley¹ , Serena W. Chang¹ , Joseph Borrello¹ , Irene C. Turnbull¹ , Kevin D. Costa¹

¹Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Streszczenie

Niewydolność serca pozostaje główną przyczyną zgonów na całym świecie, tworząc pilne zapotrzebowanie na lepsze modele przedkliniczne ludzkiego serca. Inżynieria tkankowa ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań naukowych nad sercem; Hodowla komórek ludzkich in vitro eliminuje różnice międzygatunkowe modeli zwierzęcych, podczas gdy środowisko 3D bardziej przypominające tkanki (np. z macierzą zewnątrzkomórkową i sprzężeniem heterokomórkowym) symuluje warunki in vivo w większym stopniu niż tradycyjna dwuwymiarowa hodowla na plastikowych szalkach Petriego. Jednak każdy model systemu wymaga specjalistycznego sprzętu, na przykład specjalnie zaprojektowanych bioreaktorów i urządzeń do oceny funkcjonalnej. Ponadto protokoły te są często skomplikowane, pracochłonne i nękane awarią małych, delikatnych tkanek.

Ten artykuł opisuje proces generowania solidnego systemu modelowego ludzkiej tkanki serca (hECT) przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych do podłużnego pomiaru funkcji tkanek. Sześć hECT z liniową geometrią pasków jest hodowanych równolegle, przy czym każdy hECT jest zawieszony na parze słupków z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykrywających siłę przymocowanych do stojaków PDMS. Każdy post jest zwieńczony czarnym stabilnym modułem śledzenia słupków PDMS (SPoT), nową funkcją, która poprawia łatwość użytkowania, przepustowość, retencję tkanek i jakość danych. Kształt pozwala na niezawodne optyczne śledzenie ugięć słupków, zapewniając lepsze śledzenie siły drgania przy absolutnym aktywnym i pasywnym naprężeniu. Geometria nasadki eliminuje uszkodzenia tkanek spowodowane ześlizgiwaniem się hECT ze słupków, a ponieważ obejmują one drugi etap po wyprodukowaniu stojaka PDMS, SPoT można dodać do istniejących projektów opartych na PDMS bez większych zmian w procesie produkcji bioreaktora.

System służy do pokazania znaczenia pomiaru funkcji hECT w temperaturach fizjologicznych i pokazuje stabilną funkcję tkanki podczas pozyskiwania danych. Podsumowując, opisujemy najnowocześniejszy system modelowy, który odtwarza kluczowe warunki fizjologiczne w celu zwiększenia biowierności, wydajności i rygoru inżynieryjnych tkanek serca do zastosowań in vitro.

Wprowadzenie

Modele tkanek serca dostępne są w różnorodnym zakresie geometrii i konfiguracji do podsumowania różnych aspektów rodzimej niszy sercowej, które są trudne do osiągnięcia za pomocą tradycyjnej dwuwymiarowej hodowli komórek. Jedną z najczęstszych konfiguracji jest liniowy pasek tkankowy^, z elastycznymi kotwicami na każdym końcu, które indukują samoorganizację tkanki i zapewniają tkance zdefiniowane obciążenie wstępne oraz odczyt wynikowych sił skurczu^1,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹
^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷. Generowaną siłę można solidnie określić za pomocą optycznego śledzenia skracania tkanki i wykorzystując teorię wiązki sprężystej do obliczenia siły wynikającej ze zmierzonych ugięć i stałej sprężystości kotew^1,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,
²¹^,²²^,²⁵^,²⁶^,²⁸.

Jednak inżynieria tkanek serca to wciąż rozwijająca się dziedzina, a pewne wyzwania pozostają. Specjalistyczny sprzęt, taki jak wykonane na zamówienie bioreaktory i urządzenia do oceny funkcjonalnej, jest wymagany dla każdego systemu modelowego¹⁰^,²⁹^,³⁰^,³¹. Rozmiar i złożoność mikrośrodowiska tych konstruktów są często ograniczone przez niską przepustowość spowodowaną pracochłonnymi protokołami, dużą liczbą komórek i kruchością tkanek. Aby rozwiązać ten problem, niektóre grupy zwróciły się ku wytwarzaniu mikrotkanek zawierających tylko setki lub tysiące komórek, aby ułatwić wysokoprzepustowe testy, które są przydatne do odkrywania leków. Jednak ta zmniejszona skala komplikuje dokładną ocenę funkcji¹², eliminuje kluczowe aspekty natywnej niszy sercowej (takie jak gradienty dyfuzji składników odżywczych/tlenu i złożona architektura³⁶) i ogranicza ilość materiału dostępnego do późniejszej analizy molekularnej i strukturalnej (często wymagającej łączenia tkanek). Tabela 1 podsumowuje niektóre konfiguracje liniowych modeli pasków tkankowych w literaturze¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,9^,¹⁰^,¹¹^,^12,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,
²¹^,^22,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰.

. . . . . .

Grupa	Komórki na tkankę	Tkanki na płytkę	Format płyty	Funkcja kotwiczenia	Funkcjonalna metoda pozyskiwania danych	Wspólna kąpiel medialna?	Miernik funkcjonalny ment in situ?
Yoshida (ECT)³⁸	4 miliony	6	zmodyfikowana płytka 6-dołkowa*	przetwornik siły	bezpośredni pomiar siły	Nie	Nie
Chan (hESC-CM-ECTs)²⁶	310 tys	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	posty PDMS	bezpośredni pomiar siły	tak	Nie
Feinberg (dyn-EHT)¹⁶	1,5 miliona	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	przewód PDMS	kształt tkanki	Nie	tak
RADISIC (BioWire)^{39, 40}	110 tys	8		drut polimerowy	kształt przewodu	tak	tak
Costa (pojedynczy hECT)^{1, 2}	1-2 miliony	4**	10 cm szalka Petriego**	posty PDMS	odchylenie optyczne (śledzenie krawędzi/obiektów)	tak	tak
Costa (multi-hECT)^3–9	500 tys. 1 mln	6	6 cm szalka Petriego	posty PDMS	odchylenie optyczne (śledzenie krawędzi/obiektów)	tak	tak
Costa (multi-hECT W/ SPoT)	1 milion	6	6 cm szalka Petriego	Posty PDMS z czarnymi wersalikami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów)	tak	tak
Passier (EHT)¹⁷	245 tys	36	płytka 12-dołkowa	Posty PDMS z czarnymi wersalikami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów)	tak	tak
Vunjak-Novakovic^{13, 18}	1 milion	12	6 cm szalka Petriego	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi)	tak	tak
Vunjak-Novakovic (Milifilar)¹⁴	550 tys	6	niestandardowe 6-dołkowe danie	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (śledzenie obiektów); obrazowanie wapnia	Nie	tak
Eschenhagen (EHT)^{10, 19–21}	1 milion	12	płytka 12-dołkowa	Posty PDMS z wielkimi literami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi po ugięciu); obrazowanie wapnia	Nie	tak
Zandstra (CaMiRi)²²	25-150 tys	96 Rozdział 96	96-dołkowa płytka	Posty PDMS z hakami	odchylenie optyczne (wykrywanie krawędzi)	Nie	tak
Murry^{23, 24}	900 tys	24	24-dołkowa płytka	słupki PDMS z nakładkami, zintegrowany magnes	czujnik magnetyczny	Nie	tak
Rzesza (μTUG)^{11, 12, 25}	niezdefiniowany	Rozdział 156	156-dołkowe danie	słupki PDMS z nakładkami, zintegrowany magnes	śledzenie optyczne (koralik fluorescencyjny)	tak	tak

Tabela 1: Charakterystyka niektórych liniowo zaprojektowanych modeli tkanek serca w literaturze. Liniowe modele tkanek serca różnią się wielkością, przepustowością, projektami funkcji kotwiczenia i ułatwieniem wspólnych kąpieli w pożywce, a także wymaganiami dotyczącymi oddzielnego systemu kąpieli mięśniowej w celu charakterystyki funkcjonalnej. * Naukowcy wykorzystali dostępny na rynku inżynieryjny system tkankowy oparty na wymiarach standardowej płytki 6-dołkowej. ** System modułowy, w którym bioreaktory jednotkankowe są zakotwiczone w dowolnym plastikowym naczyniu hodowlanym w żądanej liczbie i miejscu.

Ten artykuł opisuje najnowszy protokół wytwarzania naszego uznanego modelu liniowej ludzkiej tkanki serca (hECT)1^,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁵^,²⁷ i metody oceny funkcji kurczliwości hECT. Każdy bioreaktor wielotkankowy mieści do sześciu hECT we wspólnej kąpieli i składa się z dwóch "stojaków" wykonanych z polidimetylosiloksanu z elastomeru silikonowego (PDMS) zamontowanych na sztywnej ramie polisulfonowej. Każda szafa PDMS zawiera sześć elastycznych, zintegrowanych słupków z czujnikiem siły o średnicy 0,5 mm i długości 3,25 mm, a razem dwa stojaki zapewniają sześć par słupków, z których każdy mieści jeden hECT. Odwrócenie bioreaktora pomaga przezwyciężyć wszelkie przeszkody w wizualizacji hECT od dołu spowodowane kondensacją wody z pożywki hodowlanej lub zniekształceniami menisku granicy faz powietrze-ciecz. Każde skurczenie hECT powoduje ugięcie zintegrowanych słupków końcowych, a optyczny pomiar sygnału ugięcia jest przetwarzany na śledzenie siły w funkcji czasu reprezentujące funkcję kurczenia się hECT¹^,^2,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁵^,²⁷. W porównaniu z bioreaktorami jednotkankowymi zwykle stosowanymi w przypadku tkanek tej wielkości, konstrukcja wielotkankowa poprawia przepustowość eksperymentalną i umożliwia badanie sygnalizacji parakrynnej między sąsiednimi tkankami o potencjalnie różnym składzie komórkowym. System ten został zweryfikowany w opublikowanych badaniach opisujących zastosowania w modelowaniu chorób⁴^,⁸, sygnalizacja parakrynna⁶^,⁷, hodowla heterokomórkowa⁵^,⁹ i terapeutyczne badania przesiewowe⁷^,⁹.

W tym systemie, hECT są zaprojektowane tak, aby miały około 6 mm długości i 0,5 mm średnicy, aby ułatwić niezawodne optyczne śledzenie pomiarów siły przy niskim poziomie szumów. Co więcej, aspekty złożoności tkanek, takie jak gradienty dyfuzji i organizacja komórkowa, są zrównoważone możliwym do opanowania zapotrzebowaniem na 1 milion komórek na tkankę. W przypadku standardowej technologii kamer CCD, siły tak słabe jak 1 μN (reprezentujące mniej niż 5 μm po ugięciu) generują wyraźny sygnał, zapewniając, że nawet bardzo słaba funkcja skurczu, jak obserwowano w przypadku niektórych modeli choroby hECT, może być dokładnie zmierzona. Ułatwia to również szczegółową analizę krzywej siły drgania, umożliwiając w ten sposób analizę o wysokiej zawartości do 16 wskaźników kurczliwości⁴¹, w tym siły rozwiniętej, szybkości skurczu (+dF/dt) i relaksacji (−dF/dt) oraz zmienności szybkości uderzeń.

Ten protokół zaczyna się od instrukcji wytwarzania komponentów bioreaktora. Szczególną uwagę zwrócono na etapy mające na celu maksymalizację wydajności hECT, zmniejszenie technicznej zmienności funkcji tkanki oraz optymalizację jakości i głębokości oceny tkanki. Większość badań nad inżynierią tkanek serca nie podaje wskaźników utraty tkanek podczas produkcji i testów długoterminowych, chociaż jest to dobrze znane wyzwanie w tej dziedzinie i zmniejsza przepustowość i wydajność badań²⁷. Opisane tutaj metody inżynierii tkankowej zostały udoskonalone na przestrzeni lat, aby zapewnić utrzymanie wszystkich hECT w większości bioreaktorów (niezależnie od tego, w jaki sposób wykonane są stojaki PDMS). Jednak nawet utrata 5%-20% tkanek może znacząco wpłynąć na moc statystyczną, szczególnie w mniejszych eksperymentach ograniczonych liczbą dostępnych kardiomiocytów (np. z powodu wyzwań związanych z różnicowaniem niektórych chorych linii komórkowych⁴ lub ze względu na wysoki koszt zakupionych komercyjnie kardiomiocytów) lub przez warunki leczenia (np. ograniczona dostępność lub wysoki koszt różnych związków terapeutycznych).

Ten protokół opisuje produkcję stabilnych trackerów pocztowych (SPoT), nowej funkcji stojaków PDMS, które funkcjonują jako zaślepki na końcach słupków wykrywających siłę, które utrzymują hECTs²⁷. Pokazano, w jaki sposób geometria nasadki znacznie zmniejsza straty hECT spowodowane upadkiem lub zerwaniem słupków, otwierając w ten sposób nowe możliwości hodowli hECT o większej różnorodności sztywności i naprężeń, które są trudne do wyhodowania na niezamkniętych słupkach. Dodatkowo, SPoT zapewniają obiekt o wysokim kontraście, aby poprawić optyczne śledzenie skurczu hECT poprzez spójny i dobrze zdefiniowany kształt²⁷. Po tym następuje opis hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i różnicowania kardiomiocytów w oparciu o wcześniej opublikowane protokoły³^,⁴²^,⁴³ oraz wyjaśnienie wytwarzania hECT, hodowli i pomiarów funkcjonalnych.

Ten artykuł również porusza potrzebę pomiaru funkcji tkanek w temperaturze fizjologicznej. Ludzki mięsień sercowy (zdrowe i chore tkanki płodu, jak i dorosłego), a także tkanka serca wielu gatunków zwierząt (w tym szczurów, kotów, myszy, fretek i królików)⁴⁴^,⁴⁵, wykazuje wyraźny wzrost siły drgania dopasowanej do częstotliwości w temperaturach 28 °C-32 °C w porównaniu z temperaturą fizjologiczną - zjawisko znane jako inotropia hipotermiczna⁴⁵^,⁴⁶. Jednak wpływ temperatury na zmodyfikowaną funkcję tkanki mięśnia sercowego pozostaje niedostatecznie zbadany. Wiele najnowszych modeli tkanek serca dostępnych w literaturze zostało zaprojektowanych tak, aby można je było ocenić funkcjonalnie w temperaturze 37 °C w celu przybliżenia warunków fizjologicznych¹³^,¹⁴^,³⁷. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, zależny od temperatury wpływ na siłę generowaną przez zmodyfikowane tkanki serca nie był systematycznie badany. Protokół ten opisuje konstrukcję elektrody stymulującej, która minimalizuje straty ciepła podczas testowania, a także pozwala na włączenie izolowanego elementu grzejnego do zestawu do pomiarów funkcjonalnych, który może utrzymać hECT w temperaturze fizjologicznej bez uszczerbku dla sterylności²⁷. Następnie przedstawiamy niektóre z zaobserwowanych wpływów temperatury na funkcję hECT, w tym na wytworzoną siłę, częstotliwość spontanicznych dudnień, +dF/dt i −dF/dt. Podsumowując, niniejszy artykuł zawiera szczegóły wymagane do wytworzenia tego wielotkankowego systemu bioreaktora z czujnikiem siły do wytwarzania tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka i oceny ich funkcji skurczowej, a także przedstawiono zestaw danych, które stanowią podstawę do porównania pomiarów w temperaturze pokojowej i w temperaturze 37 °C²⁷.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym protokole wykorzystano zanonimizowaną linię iPSC, SkiPS 31.3 (pierwotnie przeprogramowaną z fibroblastów skóry zdrowego, 45-letniego mężczyzny)⁴⁷, co zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki badań z udziałem ludzi zwalniało procedurę z konieczności uzyskania specyficznej zgody Institutional Review Board. Wszystkie manipulacje z komórkami i hECT należy przeprowadzać w warunkach aseptycznych, w szafce bezpieczeństwa biologicznego klasy II z filtrem HEPA lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie niesterylne roztwory należy wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 µm, a wszystkie komórki i hECT przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy wilgotności względnej 95% i stężeniu 5% CO₂.

1. Konstrukcja bioreaktora

Komponenty bioreaktora i wykonanie aluminiowego odlewu matrycy
UWAGA: Pliki wspomaganego projektowania komputerowego (CAD) znajdują się w Plik uzupełniający 1. Protokół można przerwać w dowolnym momencie pomiędzy tymi etapamiZaleca się zaangażowanie profesjonalnego mechanika do wykonania form matryc opisanych w tej sekcji, ponieważ wymagane są wysokie tolerancje (≤5 µm) oraz gładkie wykończenie są niezbędne dla uzyskania dokładnej geometrii słupka i prawidłowego pasowania wciskowego ramek z polisulfonu do podstawek z politetrafluoroetylenu (PTFE) (dążąc do ciasnego pasowania ciernego, lecz nie zbyt mocnego).
1. Przy użyciu frezarki z numerycznym sterowaniem (CNC) należy wyfrezować płytkę podstawy z PTFE zgodnie ze schematami w Rysunek 1AhECT zostaną utworzone w sześciu równomiernie rozmieszczonych dołkach (białe strzałki).
2. Przy użyciu frezarki CNC wykonaj z aluminium negatywową formę główną do statywu z polidimetylosiloksanu (PDMS) zgodnie ze schematami w Rycina 1Bz trzema wspornikami ramy (zielone gwiazdki). Wywiercić sześć równomiernie rozmieszczonych otworów (purpurowe groty strzałek) o średnicy 0,5 mm w celu utworzenia słupków z PDMS.
3. Za pomocą frezarki CNC wykonaj ramę bioreaktora z polisulfonu zgodnie ze schematami w Rycina 1CPodpory ramy (zielone gwiazdki) odpowiadają podporom ramy widocznym w odlewie statywu (Rycina 1B, zielone gwiazdki).
4. Przy użyciu frezarki CNC wykonaj aluminiowy uchwyt odlewniczy z aluminium zgodnie ze schematami w Rysunek 1DKażdy otwór zawiera trójkątną półkę (pomarańczowy trójkąt) o wysokości 0,25 mm, która tworzy przestrzeń martwą umożliwiającą przepływ PDMS przez otwory w odlewach stojaka z PDMS (Rysunek 1B, magenta groty strzałek).
Odlewanie stelaża z PDMS z aluminiowych form negatywowych
1. Korzystając z drukarki 3D wykorzystującej technologię modelowania osadzania stopionego termoplastu, wydrukuj dwa wsporniki aparatu do odlewania statywów z PDMS (Plik uzupełniający 1). Należy zastosować następujące ustawienia drukowania: a wysokość warstwy z 0,1 mm, a grubość ścianek/dna/góry z 1 mm, an gęstość wypełnienia z 90% z trójkątami, a temperatura drukowania z 230 °C, a temperatura płyty roboczej z 70 °C, oraz a obramowanie dla poprawy adhezji.
2. Umieść cztery aluminiowe negatywowe formy matrycowe w uchwycie do form (Rysunek 2AI) w taki sposób, aby otwory na słupki pokrywały się z wolną przestrzenią naprzeciwko trójkątnych półek (patrz Rysunek 1D). Owiń aparat prostokątnym kawałkiem arkusza silikonowego o grubości 0,5 mm (Rysunek 2B(białe strzałki) jako uszczelkę zapobiegającą wyciekowi płynnego PDMS i zacisnąć ją pomiędzy dwoma równoległymi wydrukowanymi w technologii 3D wspornikami za pomocą zacisku śrubowego.
3. Do płytkiego pojemnika dodać 0,5 ml utwardzacza PDMS do 5 ml bazy elastomeru PDMS (w stosunku 1:10, zgodnie z instrukcjami producenta) i intensywnie mieszać przez 5 min. Odgazować mieszaninę PDMS w komorze próżniowej, stosując silną próżnię (0,1–1 kPa) przez 20–60 min w temperaturze pokojowej lub do momentu zniknięcia pęcherzyków powietrza.
4. Wlej mieszaninę PDMS do aparatu odlewniczego, wypełniając go z nadmiarem, aby zapewnić całkowite pokrycie każdego otworu (Rycina 2AII). W razie potrzeby do korpusu statywów z PDMS należy dodać małe, kolorowe szklane kuleczki (Rysunek 2AII), po przeciwnej stronie niż ta z podporkami (Rycina 2B), w celu unikalnej identyfikacji każdego racka z PDMS. Umieścić aparat do odlewania z powrotem w komorze próżniowej (upewniając się, że znajduje się on w poziomie) i zastosować silną próżnię przez co najmniej 12 h. Pozostawić PDMS do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez około 48 h w miejscu wolnym od kurzu, aby zapewnić pełne utwardzenie i maksymalną wytrzymałość delikatnych słupków. Należy unikać używania piekarnika, ponieważ powoduje on odkształcenie komponentów wydrukowanych w technologii 3D.
  UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.
Usuwanie stelaża z PDMS z aluminiowych negatywowych form matrycowych
1. Zdejmij zacisk, wsporniki oraz arkusz silikonowy z aparatury do odlewania. Za pomocą nierdzewnej żyletki odetnij błonę PDMS znajdującą się na górze aparatury do odlewania i wsporników ramy, a następnie delikatnie oddziel palcami stabilizatory PDMS od ścianek uchwytu odlewniczego. Wsuń zaoblony koniec nierdzewnej żyletki w wolną przestrzeń między odlewem a uchwytem odlewniczym i podważ je, aby je rozdzielić (Rysunek 2CI, II), zapewniając, aby PDMS wypełniający przestrzeń martwą pozostał w uchwycie do odlewu (ponieważ jest on przymocowany do słupków). Za pomocą ostrego ostrza ze stali nierdzewnej odciąć pozostałe filmy PDMS oraz odciąć PDMS z przestrzeni martwej od końcówek słupków (Rysunek 2C III-V).
2. KROK KRYTYCZNYWyjmij statyw z PDMS z formy (Rycina 2D). Zaczynając od strony przeciwnej do słupków, palcami powoli oddzielaj stelaż z PDMS od formy, pracując naprzemiennie po obu stronach, aż słupki zostaną uwolnione z form matryc.
3. Powtarzaj poprzedni krok, aż wszystkie statywy PDMS i wszystkie słupki zostaną uwolnione. Użyj ostrej żyletki, aby odciąć pozostały nadmiar PDMS ze statywów. Wynikiem jest statyw PDMS (Rysunek 2E) z sześcioma nienaruszonymi słupkami (pomarańczowe groty strzałek) i kolorowymi koralikami (niebieska strzałka) służącymi do identyfikacji.
  UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
Wytwarzanie stabilnego trackera pozycji (SPoT)
1. Przy użyciu drukarki 3D wykorzystującej technologię modelowania przez osadzanie stopionych termoplastów (FDM), wydrukuj elementy aparatury odlewniczej SPoT (Plik uzupełniający 2 i Rycina 3AI, II). Użyj następujących ustawień drukowania: a wysokość warstwy z 0,1 mm, a grubość ścianki/dna/góry z 1 mm, an gęstość wypełnienia z 80% z trójkątami, a temperatura drukowania z 230 °C, a temperatura płyty roboczej z 70 °Coraz a obramowanie dla poprawy adhezji.
2. Należy zapewnić stabilne pasowanie wciskowe między wydrukowanymi w technologii 3D elementami, a także między kasetami z PDMS a trójramiennym uchwytem, i upewnić się, że kasety z PDMS przylegają ściśle, a słupki sięgają dna studni bez wyginania się. W razie potrzeby należy przyciąć lub opiłować plastik.
3. Do małej łódki ważkiej (lub podobnego małego, płytkiego pojemnika) dodać 0,5 ml czarnego PDMS części A oraz 0,5 ml części B (w stosunku 1:1, zgodnie z instrukcją producenta) i mieszać dokładnie do uzyskania jednolitego koloru. Odgazować wymieszany czarny PDMS w komorze próżniowej przy silnej próżni przez 20 min. Wylać odgazowany czarny PDMS na wydrukowaną w technologii 3D podstawę, aby wypełnić otwory, a następnie opukać, aby upewnić się, że nie pozostały pęcherzyki powietrza. Zdrapać z podstawy jak największą ilość nadmiaru PDMS.
4. Zamocuj trzypunktowy element na podstawie, a następnie umieść statywy z PDMS w rowkach trzypunktowego uchwytu (Rycina 3AII, turkusowy prostokąt), upewniając się, że końce słupków są zanurzone w czarnym PDMS w okrągłych studzienkach (Rycina 3B, C). Utwardzać czarny PDMS w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed kurzem przez 48 h.
  UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.
5. Wysuń trójramienny element, minimalizując naprężenia działające na słupki. Za pomocą małej pęsety zeskrob cienką warstwę czarnego PDMS otaczającą każdy SPoT; następnie wprowadź pęsetę zakrzywioną o cienkich końcówkach do otworu SPoT, aby odseparować go od wydrukowanej w technologii 3D podstawy (Rysunek 3D).
6. Obejrzyj SPoTs (Rycina 3E), a następnie za pomocą drobnych nożyczek typu Vannas odciąć resztki czarnej folii PDMS pozostałe po procesie odlewania, których nie usunięto w kroku 1.4.5. Upewnić się, że gotowe słupki mają odpowiednią długość, dopasowując statywy PDMS do ramy z polisulfonu, a następnie nasuwając całość na czarną płytkę podstawową (Rysunek 4A).
  UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
7. Połącz statywy z PDMS i zamocuj je w ramce za pomocą wypustek ramki (Rycina 4A). Autoklawować w worku z płytką podstawową z PTFE przez cykl trwający co najmniej 30 min (<122 °C aby zmniejszyć odkształcenia).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Komponenty bioreaktora hECT. (A) Widok z góry (lewo) i widok z boku (prawo) płytki podstawowej z PTFE z sześcioma równomiernie rozmieszczonymi studniami do formowania hECT (białe strzałki). (B) Widok z boku (lewo) i widok z góry (prawo) aluminiowych negatywowych form głównych dla stelaży z PDMS z sześcioma równomiernie rozmieszczonymi słupkami (purpurowe groty strzałek) i trzema szczelinami do mocowania do ramy bioreaktora (zielone gwiazdki). (C) Widok z boku (lewo) i widok z dołu (prawo) polisulfonowych ram dla stelaży z PDMS z trzema równomiernie rozmieszczonymi wspornikami ramy (zielone gwiazdki), odpowiadającymi wspornikom ramy w formie stelaża z PDMS (panel B). (D) Widok z góry (góra) i widok z boku (dół) aluminiowego uchwytu formy z czterema szczelinami na formy stelaży z PDMS, z których każda posiada trójkątną półkę o wysokości 0.25 mm (najlewsza półka zaznaczona na pomarańczowo). Rysunek zmodyfikowany na podstawie van Neste²⁷. Skróty: hECT = human engineered cardiac tissue; Ø = średnica; PTFE = polytetrafluoroethylene; PDMS = polydimethylsiloxane; R = promień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Wykonanie statywów z PDMS. (A) Wizualizacje CAD przedstawiają widok skośny aparatury do odlewania. (I) Negatywowa matryca statywu z PDMS jest wkładana do każdego z czterech gniazd uchwytu odlewniczego, przy czym otwory tworzące słupki z PDMS (magenta grot strzałki) są umieszczone nad wolną przestrzenią naprzeciwko trójkątnej półki (Rysunek 1D, pomarańczowy trójkąt). (II) PDMS jest wlewany do każdego otworu negatywowej matrycy. (III) Do nieutwardzonego PDMS dodaje się kolorowe koraliki jako system identyfikacji kodowany kolorami. (B) Zdjęcie przedstawiające zmontowaną aparaturę do odlewania statywów z PDMS, która jest zacisnięta z obu stron za pomocą dwóch wydrukowanych w technologii 3D wsporników mocowanych zaciskiem śrubowym i owinięta arkuszem silikonowym o grubości 0.5 mm (białe strzałki) w celu uszczelnienia zacisniętych boków. Kolorowe koraliki są rozmieszczone tak, aby nie zasłaniały otworów o średnicy 0.5 mm, z których tworzą się słupki (magenta grot strzałki). (C) Po utwardzeniu PDMS odlew jest usuwany z uchwytu odlewniczego. (I) Stępione stalowe ostrze do golenia lub podobne cienkie metalowe narzędzie jest wsuwane między odlew a uchwyt odlewniczy, aby podważyć odlew z uchwytu (II). (III) Błonka (turkusowe nawiasy) powstałe w wyniku przepływu PDMS przez otwory słupków przylegają do końcówek słupków i muszą zostać odcięte za pomocą ostrego ostrza (IV,V). (D) Statyw z PDMS jest oddzielany od odlewu. (E) Zdjęcia przedstawiające widok skośny (góra), boczny (środek) i dolny (dół) statywu z PDMS z zatopionym w korpusie szklanym koralikiem służącym do identyfikacji (niebieska strzałka). Końcówki słupków (pomarańczowe grot strzałki) zostały zaznaczone czarnym tuszem. Pasek skali = 1 cm. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy van Neste²⁷. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Fabrykacja SPoT. (A) Renderowania CAD wskazujące kluczowe wymiary (I) podstawy i (II) trójramiennego elementu oprzyrządowania do odlewania SPoT. Wymiary okrągłych form SPoT (AI, czarne strzałki) zostały ustalone na 0,2 mm głębokości x 1,2 mm średnicy, a każda z nich mieści czarny PDMS dla pojedynczego SPoT. Półka o wymiarach 11,1 mm x 27 mm widoczna w widoku z góry (AII, góra, turkusowy prostokąt) jest zagłębiona o 0,4 mm (jak widać w widoku z boku poniżej), aby utrzymać stelaż z PDMS na miejscu podczas utwardzania. (B) Renderowanie CAD pokazujące montaż aparatury do odlewania SPoT. (C) Zdjęcie zmontowanej aparatury do odlewania SPoT. (D) Po utwardzeniu PDMS trójramienne oprzyrządowanie jest wysuwane spod stelaży z PDMS, a SPoT są uwalniane z otworów za pomocą precyzyjnej pęsety. (E) Zdjęcia stelaża z PDMS bez (góra) i z (dół) SPoT. Wstawki pokazują powiększone widoki słupków. Paski skali = 1 cm (E), 2,5 cm (powiększone obrazy w E). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy van Neste²⁷. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; Ø = średnica; PDMS = polidimetylosiloksan; R = promień; SPoT = stable post tracker. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Hodowla komórek

Hodowla iPSC
UWAGA: Różne linie komórkowe mogą wymagać dostosowania rozcieńczenia i częstotliwości pasażowania oraz/lub miareczkowania dodatków do pożywki.
1. Płytkę 6-dołkową przeznaczoną do hodowli komórek pokryć zakwalifikowaną macierzą błony podstawnej (rozcieńczoną w stosunku 1:1 w pożywce DMEM/F12 [Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution] zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min. Przygotować 500 mL pożywki do hodowli iPSC zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie dodać 5 mL roztworu zapasowego penicyliny-streptomycyny (10 000 IU/mL do 10 000 µg/mL).
2. Aby przeprowadzić pasaż iPSC, odessać pożywkę z dołków i wypłukać każdy dołek raz 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dodać 1 mL roztworu do dysocjacji iPSC na dołek i inkubować w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 1 min.
3. Odessać roztwór do dysocjacji iPSC i inkubować komórki w temperaturze 37 °C (bez pożywki) przez 5 min. Dodać 1 mL 2 µM thiazovivinu w pożywce do iPSC, aby zneutralizować roztwór do dysocjacji iPSC.
4. Za pomocą pipety serologicznej 2 mL rozbić kolonie na skupki liczące około 10 komórek i wypłukać każdy dołek dodatkowymi 1 mL 2 µM thiazovivinu w pożywce do iPSC. Dodać 2 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki nowo pokrytej macierzą błony podstawnej (krok 2.1.1).
5. Po 24 h usunąć pożywkę i dodać świeżą pożywkę do iPSC (bez thiazovivinu). Karmić iPSC co 48 h 2 mL pożywki do iPSC lub co 72 h 4 mL pożywki. Przesiać komórki w rozcieńczeniu 1:6 podczas pasażowania co 3 dni lub gdy osiągną 80% konfluencji.
  UWAGA: Różne linie komórkowe mogą wymagać dostosowania rozcieńczenia i częstotliwości pasażowania.
Różnicowanie kardiomiocytów
1. Rozpocząć różnicowanie, gdy monowarstwy iPSC osiągną 80%–90% konfluencji.
2. Przygotować pożywkę do różnicowania, dodając 10 mL suplementu B27 bez insuliny oraz 5 mL roztworu zapasowego penicyliny-streptomycyny do 500 mL pożywki RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640). Przygotować pożywkę do utrzymania kardiomiocytów, dodając 10 mL suplementu B27 i 5 mL roztworu zapasowego penicyliny-streptomycyny do 500 mL RPMI 1640.
  UWAGA: Pożywkę do różnicowania i pożywkę do utrzymania kardiomiocytów można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
3. Dzień 0: Wypłukać komórki 1 mL DMEM/F12, a następnie dodać 2 mL 10 µM CHIR99021 i rozcieńczoną macierz błony podstawnej w pożywce do różnicowania.
4. Dzień 1: Po 24 h lub gdy konfluencja komórek spadnie poniżej 70%, wypłukać komórki 1 mL DMEM/F12, dodać 2 mL pożywki do różnicowania i inkubować przez 48 h.
5. Dni 3–4: Wypłukać komórki 1 mL DMEM/F12 i dodać 2 mL 5 µM IWR-1 w pożywce do różnicowania. Powtórzyć w dniu 4.
6. Dni 5–6: Wypłukać komórki 1 mL DMEM/F12 i dodać 2 mL pożywki do różnicowania. Powtórzyć w dniu 6.
7. Dni 7–10: Wypłukać komórki 1 mL DMEM/F12 i dodać 2 mL pożywki do utrzymania kardiomiocytów. Powtórzyć co 24 h.
8. Dzień 11+: Wymieniać pożywkę na 4 mL świeżej pożywki do utrzymania kardiomiocytów co 48–72 h. Odessać i pipetować powoli, aby uniknąć uszkodzenia intensywnie bijących monowarstw.

3. Hodowla hECT

Pozyskiwanie kardiomiocytów
1. Pozyskaj monowarstwy kardiomiocytów do wykonania hECT od 8 do 60 dni po indukcji różnicowania. Przewidywana liczba komórek to 2-5 milionów na studzienkę.
  UWAGA: Jeśli komórki nie zaczęły bić do 10. dnia, różnicowanie prawdopodobnie nie powiodło się. Intensywnie bijące monowarstwy często odrywają się po 11-15 dniach różnicowania i zagęszczają w gęste tkanki. Zaleca się wykorzystanie lub ponowne wysianie takich komórek w tym czasie.
2. Przepłucz każdą studzienkę z kardiomiocytami 2x za pomocą 2 mL PBS. Dodaj 1 mL 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej. Inkubuj w 37 °C przez 5-10 min, aż komórki staną się okrągłe i będą odrywać się po lekkim stuknięciu w płytkę.
3. Do każdej studzienki dodaj 1 mL 10% FBS w pożywce do utrzymania kardiomiocytów, aby zneutralizować dysocjację. Delikatnie pobierz monowarstwy za pomocą końcówki pipety serologicznej 5 mL i przenieś do probówki stożkowej 50 mL, aby rozbić osad w grudki po 10-20 komórek.
4. Wymieszaj zawiesinę komórkową poprzez odwracanie probówki stożkowej, a następnie przenieś 10 µL komórek do 10 µL błękitu trypanu. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub szklanego hemocytometru. Odpowiednio rozdziel zawiesinę komórkową, jeśli nie wszystkie komórki zostaną wykorzystane lub jeśli część z nich jest odłożona do cytometrii przepływowej.
  UWAGA: Na tym etapie można dodać komórki pomocnicze (np. fibroblasty).
5. Wirowarkuj komórki przy 250 × g przez 5 min. Natychmiast odessij jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego, i przechowuj na lodzie. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas przebywania komórek w osadzie.
Tworzenie hECT
1. Użyj objętości podanych w Tabeli 2 i dostosuj je do liczby komórek w osadzie, tak aby każde hECT zawierało 1 milion komórek. Po każdym kroku mieszaj, pipetując powoli, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
  UWAGA: Kroki 3.2.2-3.2.3 należy wykonywać w warunkach ochrony przed bezpośrednim światłem, ponieważ niektóre składniki są światłoczułe.
2. Przygotuj roztwór kolagenu typu 1 o stężeniu 2,9 g/mL w mikroprobówce 1,7 mL, dodając 13,442 µL wody destylowanej, 4,4 µL 10x PBS oraz 0,638 µL 1M NaOH. Dodaj 25,52 µL roztworu stokowego kolagenu 5 mg/mL i powoli wymieszaj.
3. Przygotuj mieszankę macierzy pozakomórkowej (ECM mix z Tabeli 2): Dodaj 5,5 µL roztworu HEPES 0,2 N o pH 9, a następnie 5,5 µL 10x MEM. Mieszaj dokładnie, aż do uzyskania jednolitego, jasnocżółtego lub jasnoróżowego koloru. Przenieś 35,2 µL roztworu ECM mix do osadu komórkowego i dodaj 4,4 µL macierzy błony podstawnej.
4. Otwórz autoklawowaną torebkę z częściami bioreaktora (krok 1.4.7, Rycina 4A). Nosząc rękawiczki wysterylizowane 70% etanolem, wyjmij czarną płytkę bazową z torebki autoklawowej i umieść ją w szalce 60 mm studzienkami do góry. Powoli pipetuj 44 µL mieszaniny komórkowej do każdej studzienki, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby użyj pipety, aby usunąć pęcherzyki wprowadzone podczas pipetowania lub powstałe z powodu hydrofobowości PTFE. Uzupełnij objętość hECT tak, aby powierzchnia cieczy była zrównana z krawędzią studzienki (Rycina 4BI).
5. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek i wyjmij ramkę z polisulfonu z prowadnicami PDMS z torebki autoklawowej. Opuść ramkę na płytkę bazową tak, aby końce ramki pasowały do rowków na końcach płytki bazowej (Rycina 4BII, III). Przed umieszczeniem w szalce 60 mm sprawdź bioreaktor, aby upewnić się, że wszystkie słupki są proste, a ramka nie jest przechylona.
6. Dodaj 1 mL 10% FBS w pożywce do utrzymania kardiomiocytów do szalki 60 mm (uważając, aby nie naruszyć hECT), aby zwiększyć wilgotność w szalce podczas zestalania hECT. Umieść szalkę 60 mm bez pokrywki w wysokiej szalce 100 mm (wysokość 20 mm), przykryj pokrywką od szalki 100 mm i wprowadź bioreaktor do inkubatora 37 °C, 5% CO₂, aby umożliwić kolagenowi utworzenie żelu z zawieszonymi komórkami.
7. Po 2 h wyjmij szalkę z inkubatora. Dodaj 13 mL 10% FBS w pożywce do utrzymania kardiomiocytów, przechylając szalkę, aby ułatwić przepływ pożywki między płytką bazową PTFE a prowadnicami PDMS.
8. Obejrzyj bioreaktor z boku, aby upewnić się, że między hydrofobowymi powierzchniami płytki bazowej PTFE a prowadnicami PDMS nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a następnie wprowadź szalkę z powrotem do inkubatora. Jeśli uwięzione jest powietrze, przechyl bioreaktor poza pożywkę, aby pęcherzyk pękł, i powoli go opuść, lub użyj mikropipety z końcówką do nakładania żelu, aby odessać powietrze, uważając, aby nie naruszyć słupków.
Usuwanie płytki bazowej
1. Sprawdź zagęszczenie hECT przez szczelinę w ramce. W ciągu 24-96 h hECT zagęszczają się i stają się bardziej nieprzezroczyste (Rycina 4CI-III). Gdy pojawi się widoczna szczelina między hECT a ścianką płytki bazowej (Rycina 4CII), wykonaj dwie wymiany połowy objętości pożywki, aby zmienić ją na pożywkę do utrzymania kardiomiocytów bez FBS. Usuń płytkę bazową, gdy hECT zagęszczą się o co najmniej 30% w porównaniu do pierwotnej średnicy (Rycina 4CIII). Napełnij szalkę 60 mm zawierającą bioreaktor pożywką do utrzymania kardiomiocytów, aż ciecz zrówna się z krawędzią szalki, i dodaj 14 mL do nowej szalki 60 mm.
2. KROK KRYTYCZNY: Nosząc sterylne rękawiczki, odwróć bioreaktor w szalce tak, aby płytka bazowa znalazła się na górze (Rycina 4BIV). Sprawdź, czy nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza, jak w kroku 3.2.8. Powoli podnieś płytkę bazową, utrzymując ją w poziomie (Rycina 4BV).
3. Jeśli podczas usuwania płytki bazowej hECT odpadnie, ale pozostanie na płytce, użyj sterylnej zakrzywionej pęsety precyzyjnej, aby przenieść hECT z płytki bazowej do szalki 60 mm. Użyj pęsety, aby skierować koniec hECT w stronę słupka. Użyj drugiej pęsety, aby unieruchomić słupek i przełożyć go przez otwór w hECT. W razie potrzeby powtórz czynność dla drugiego słupka.
4. Gdy wszystkie hECT zostaną przymocowane do słupków, przenieś ramkę z hECT do nowej szalki 60 mm i umieść ramkę słupkami skierowanymi w dół (Rycina 4BVI). Sprawdź bioreaktor, aby upewnić się, że hECT pozostają na słupkach tuż nad SPoTs.
5. Jeśli hECT został przesunięty przez napięcie powierzchniowe do podstawy słupków, ustabilizuj ramkę za pomocą sterylnej zakrzywionej pęsety. Wsuń drugą pęsetę przez szczelinę w ramce, trzymając ją zamkniętą. Gdy końcówka pęsety zostanie opuszczona poniżej prowadnic PDMS, obróć ją tak, aby dotarła do słupka, i za pomocą zamkniętych końcówek delikatnie popchnij hECT w stronę końca słupka, aż spocznie on na SPoT (Rycina 4BVI, wstawka).
Utrzymanie hECT
1. Wymieniaj połowę objętości pożywki na pożywkę do utrzymania kardiomiocytów co 24-48 h (po 2 tygodniach hodowli częstotliwość można zmniejszyć do dwóch razy w tygodniu).
2. Gdy hECT wykażą skupiska spontanicznych skurczów (zazwyczaj do 3. dnia) oraz skoordynowane bicie z widocznym odchyleniem słupka do 5. dnia, rozpocznij pomiary funkcjonalne i powtarzaj je tak często, jak jest to pożądane.
  UWAGA: hECT, które nie rozpoczęły skoordynowanego bicia do 7. dnia, prawdopodobnie w ogóle tego nie zrobią.

Komponent	Objętość (μL)
woda destylowana₂O	13.442	roztwór kolagenu o stężeniu 2,9 mg/mL	"mieszanina ECM"	końcowa mieszanina komórek hECT
NaOH 1N	0.638
PBS 10x	4.4
stok kolagenu 5 mg/ml	25.52
0,2 N HEPES o pH 9	5.5
10x MEM	5.5
Objętość mieszaniny ECM do przeniesienia do osadu komórkowego	35.2
Objętość Matrigelu	4.4

Tabela 2: Odczynniki hECT. Składniki należy dodawać w podanej kolejności i przechowywać w lodzie.

figure-protocol-4
Rycina 4: Montaż bioreaktora i wytwarzanie hECT. (A) (I) Dwie prowadnice z PDMS (lewa, jasnoniebieska) dopasowane do ramy z polisulfonu (prawa, beżowa). (II) Płyta bazowa z PTFE (czarna, lewa) jest następnie dopasowywana do ramy (prawa) w taki sposób, aby każda para słupków pasowała do wgłębienia w płycie bazowej. (B) (I) Do każdego z sześciu wgłębień płyty bazowej dodaje się 44 µL zawiesiny kardiomiocytów w macierzy zewnątrzkomórkowej opartej na kolagenie. (II,III) Ramę z prowadnicami z PDMS dociska się do płyty bazowej. Po 1-4 dniach hECT można usunąć z płyty bazowej. (IV) Najpierw bioreaktor zostaje odwrócony, a następnie (V) płyta bazowa zostaje podniesiona z ramy. (VI) Widok z boku bioreaktora z sześcioma hECT. Wstawka: powiększony widok pokazujący położenie hECT na słupkach względem SPoTs (wstawka). (C) Rendering CAD pokazujący trzy poziomy zagęszczenia hECT ([I] niski, [II] średni oraz [III] wysoki) widziane przez szczelinę w ramie z polisulfonu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy van Neste²⁷. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; PDMS = polidimetylosiloksan; PTFE = politetrafluoroetylen; SPoT = stabilny marker słupka (stable post tracker); hECT = ludzka inżynieryjna tkanka serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Sprzęt do stymulacji hECT

Osłona dla podgrzewanego stolika
1. Za pomocą wycinarki laserowej wytnij elementy akrylowej osłony izolacyjnej z przezroczystej płyty akrylowej o grubości 0,635 cm (Supplementary File 3): po jednym elemencie z ryc. 5A-D oraz po dwa elementy z ryc. 5E, F.
2. Złóż części (B), (C), (D) oraz jedną z części (E) z ryc. 5 i połącz je za pomocą kleju do akrylu, jak pokazano na ryc. 5GI. Przymocuj górny panel (ryc. 5GII), odczekaj kilka godzin do utwardzenia kleju, a następnie wsuń podgrzewany stolik do wnętrza osłony (ryc. 5GIII).
3. Po zamontowaniu osłony użyj taśmy, aby zabezpieczyć wkładki pomiędzy nóżkami podgrzewanego stolika, a następnie dodaj przedni panel (ryc. 5GIV), aby dokończyć montaż (ryc. 5GV).
Wytwarzanie elektrod grafitowych
1. Za pomocą piły taśmowej potnij grafitowe pręty o grubości 6,25 mm i szerokości 25 mm na bloki o długości 35 mm; następnie przetnij każdy blok wzdłuż po linii krzywej tak, aby każda elektroda miała wysokość 13-16 mm na jednym końcu i 8-10 mm na drugim. Wywierć dwa otwory o średnicy 0,7 mm w górnym rogu (ryc. 6AI). Wypoleruj elementy ręcznikami papierowymi i poddaj sonikacji w wodzie przez 20 min w celu usunięcia pyłu grafitowego. Upewnij się, że elektrody są klinowo osadzone między ściankami szalki a bioreaktorem o szerokości 25 mm, aby zapewnić stałą odległość między elektrodami (ryc. 6AII).
2. Przewlecz stalowy drut o długości 150 mm i średnicy 0,25 mm przez otwory w elektrodach i zegnij go tak, aby opierał się o krawędź szalki 60 mm i opasowywał ścianki szalki 100 mm, umożliwiając zamknięcie pokrywy (ryc. 6AII).
3. Oczyszczaj elektrody poprzez moczenie w wodzie destylowanej przez 1-2 h po każdym użyciu w celu usunięcia zaabsorbowanego medium, pozostaw do wyschnięcia na noc, a następnie wysterylizuj w autoklawie w temperaturze 132 °C przez 30 min. Przed rozpoczęciem pomiarów umieść jedną elektrodę po każdej stronie bioreaktora (ryc. 6AII). Ułóż druty w taki sposób, aby pokrywa szalki 100 mm mogła zostać zamknięta, a następnie umieść bioreaktor w inkubatorze w celu równoważenia.

figure-protocol-5
Rycina 5: Akrylowa obudowa do izolacji podgrzewanego szklanego stolika. Obrazy CAD przedstawiające kluczowe wymiary elementów akrylowej obudowy zaprojektowanej dla szklanego stolika. (A) Górny panel posiada wycięcie o wymiarach 27 cm x 18,5 cm, aby umożliwić umieszczenie naczynia bioreaktora na elemencie grzejnym. Pomarańczowe prostokąty w narożnikach wskazują sugerowane rozmieszczenie małych podkładek, aby zapewnić przestrzeń między górną częścią obudowy a elementem grzejnym. (B) Dolna część obudowy posiada dwa wycięcia umożliwiające wsunięcie nóg podgrzewanego stolika (zielone gwiazdki). (C&D) Dwa panele boczne pasują pod element górny. (D) Lewy panel boczny zawiera wycięcie o wymiarach 3 cm x 0,3 cm (wstawka) na przewód zasilający stolika. (E) Długie panele pasują do przodu i tyłu. (F) Wstawki są dodawane w celu wypełnienia luk po umieszczeniu stolika wewnątrz. (G) (I) Panele boczne i tylny są mocowane do części dolnej, a następnie (II) dodawany jest panel górny. (III) Szklany stolik jest wsuwany do obudowy (purpurowe strzałki). (IV) Wstawki są mocowane między nogami stolika, a tylna część pasuje do otworu, aby zamknąć obudowę. (V) Złożony zestaw obudowy. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy van Neste²⁷. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; R = promień; Ø = średnica. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-6
Rycina 6: Akwizycja danych dotyczących skurczu hECT. (A) (I) Zdjęcia elektrod wyciętych z prętów grafitowych. Purpurowe strzałki wskazują otwory do mocowania drutów ze stali nierdzewnej. Pasek skali = 1 cm. (II) Widok ukośny (lewo) i widok z góry (prawo) przedstawiające rozmieszczenie elektrod grafitowych w bioreaktorze. Elektrody wypełniają przestrzeń między 25 mm szerokością bioreaktora a ścianką naczynia, aby zapewnić stałą odległość między elektrodami. Druty są zgięte, aby umożliwić zamknięcie pokrywy naczynia. (B) Zdjęcie układu do stymulacji hECT wewnątrz laminarno-przepływowej komory czystej – cały sprzęt jest umieszczony na stole wibroizolacyjnym w celu redukcji szumów wibracyjnych pochodzących z komory czystej. Bioreaktor (purpurowy grot strzałki) spoczywa na płaszczowym stoliku grzewczym, oświetlonym od góry źródłem światła LED. Mikroskop sekcyjny jest skierowany poziomo na lustro ustawione pod kątem prostym (pomarańczowa gwiazdka), aby umożliwić obserwację bioreaktora od dołu, i jest wyposażony w kamerę CCD (lewo). Turkusowy nawias wskazuje łaźnię wodną do ciągłego monitorowania temperatury w celu przekazywania informacji zwrotnej do kontrolera stolika grzewczego w pętli zamkniętej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy van Neste²⁷. Skróty: hECT = ludzka inżynieryjna tkanka serca; LED = dioda emitująca światło. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

5. Pomiary funkcjonalne hECT

Przygotowanie stanowiska do stymulacji serca
1. Włącz podgrzewany stolik do 39.5 °Cor ustawić sprzęt do stymulacji w stole wibroizolacyjnym wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza zgodnie z Rycina 6BZamontuj stereomikroskop na statywie ramieniu i skieruj go na lustro ustawione pod kątem prostym (Rysunek 6B, pomarańczowa gwiazdka) umieszczony na podnośniku laboratoryjnym pod szklanym stołem, aby umożliwić obserwację bioreaktora od dołu. Do mikroskopu przymocuj szybką kamerę CCD i podłącz ją do komputera. Naświetlaj układ światłem UV przez 15 min w celu sterylizacji przestrzeni roboczej.
2. Umieść bioreaktor (Rycina 6B, magenta grot strzałki) na podgrzewanym stoliku z płaszczem grzewczym, oświetlonym od góry dwugłowicowym źródłem światła LED z gęsimi szyjami (szyje lamp LED można przymocować bezpieczniej do jednostki głównej niż w przypadku lamp światłowodowych). Aby zminimalizować dodatkowe zakłócenia, należy upewnić się, że sprzęt do stymulacji rozstawiony na stole wibracyjnym (oraz sam stół) nie dotyka żadnej części laminarnej komory przepływowej.
3. Umieść na podgrzewanym stole drugą szalkę 60 mm wypełnioną uprzednio ogrzaną wodą, znajdującą się wewnątrz szalki 100 mm (Rysunek 6B, turkusowy uchwyt) i wyposażyć w sondę temperatury do ciągłego monitorowania temperatury. W razie potrzeby dostosować ustawienia temperatury podgrzewanego stolika, aby utrzymać temperaturę naczynia referencyjnego na poziomie 36-37 °C.
4. Ustaw powiększenie mikroskopu na 1,5x (lub inne pożądane powiększenie, które pozwoli na wizualizację całej hECT z odpowiednią rozdzielczością).
Regulacja ustawień kamery
1. Otwórz oprogramowanie kamery. Zmień rozmiar obrazu w celu maksymalnego przycięcia pola widzenia, tak aby wciąż widoczny był cały hECT. Pozwala to na maksymalizację prędkości kamery.
2. Ustaw wskaźnik wychwytu Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 90 klatek na sekundęDostosuj czas ekspozycji i pozycja źródła światła aby zoptymalizować jednorodność warunków oświetlenia w całym polu widzenia i maksymalnie zwiększyć kontrast SPoTs.
Konfiguracja oprogramowania do akwizycji
1. Włącz stymulator impulsów prostokątnych i podłącz go do komputera. Dostosuj ustawienia w celu podania impulsy dwufazowe z an amplituda z 12 V oraz a czas trwania z 5 ms.
2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych, a następnie otwórz "AutomatedPostTracking3.vi" plik (Plik uzupełniający 4). Po załadowaniu kliknij w biała strzałka na lewa strona paska narzędzi w celu zainicjowania programu (Rysunek 7A).
3. skalibrować oprogramowanie, używając szklanego hemocytometru na podgrzewanym stoliku. Na pasku narzędzi (Rycina 7B), kliknij narzędzie linii narysowanie linii przez 1 mm podziałki hemocytometru (nie pokazano). W Kalibracja odległości (piksele/mm) pudełko (Rycina 7C), ustaw Długość referencyjna (mm) do 1a następnie kliknij w Oblicz przycisk
4. Zmierz pole przekroju poprzecznego hECT, wykorzystując narzędzie linii aby narysować linię w poprzek szerokości tkanki. Kliknij w 1 w Pole przekroju poprzecznego (mm^2) pudełko (Rycina 7D) w celu obliczenia powierzchni (zakładając cylindryczną geometrię liniowych pasków tkanki, zgodnie z ustaleniami w literaturze)¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,
  ²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,³⁷^,³⁸). Powtórz czynność w różnych częściach hECT i zapisz wartości przypisane do dwóch pozostałych przycisków w polu. Wyjściowy plik z tabelą danych raportuje średnią z tych trzech wartości w celu obliczenia średnicy tkanki.
charakterystyka funkcjonalna hECT
1. Upewnij się, że końcówki pipet są w polu ostrości. Włącz przełącznik progowy (Rysunek 7E), a następnie przesunąć suwak (Rysunek 7F) aż do momentu, gdy SPoTs (Rycina 7G) są wyraźnie odgraniczone i nie zmieniają kształtu podczas kurczenia się hECT.
2. Użyj narzędzie prostokąta aby obrysować prostokątem jeden ze SpoT-ów (Rycina 7, zielony prostokąt), a następnie kliknij w Zestaw 1 przycisk wewnątrz Granice słupków pudełko (Rysunek 7H) aby ustawić pozycję prostokąta wokół SPoT, zapewniając, że SPoT w każdym momencie pozostaje w obrębie granicy prostokąta. Powtórz czynność dla drugiego posta i zapisz wynik w Zestaw 2.
3. Dostosuj ustawienia rozmiaru obiektu (Rycina 7I) aby zapobiec śledzeniu mniejszych obiektów przez program. Należy upewnić się, że liczba śledzonych obiektów w każdym prostokącie pozostaje stałaInterfejs (Rycina 7J) przedstawia zmierzoną w czasie rzeczywistym odległość między śledzonymi obiektami. Należy wykorzystać ten wykres do monitorowania poziomu szumów.
4. Wybierz katalog do zapisu plików (Rycina 7K). Dane z różnych dni należy przechowywać w oddzielnych folderach. Wybrać aktualny Numer tkanki, a następnie wpisz wszelkie uwagi w polu Komentarze pudełko
5. Pod Częstotliwość stymulacji (Hz) nagłówek (Rysunek 7L), wskazać zakres częstotliwości pożądany (Min i Maksymalny), oraz pożądany Odstęp do przejścia od wartości minimalnej do maksymalnej. W przypadku stopniowania hECT w całym ich zakresie wychwytywania, należy przetestować różne częstotliwości stopniowania, aby znaleźć najniższa częstotliwość przy którym a stosunek bodźca do piku 1:1 zostanie osiągnięte, a następnie należy kontynuować zwiększenie częstotliwość do tego czasu stosunek został utraconyZmierz funkcja spontaniczna poprzez wybór dowolnego zakres częstotliwości (np. 0.01 Hz do 0.01 Hz) i utrzymując wyjście stymulatora impulsów prostokątnych wyłączone.
6. W polach po prawej stronie wybierz żądane Czas wiązania (s) (odstęp czasu po ustawieniu częstotliwości, w którym dane nie są rejestrowane), aby umożliwić hECT dostosowanie się do nowej częstotliwości stymulacji. Określ Czas rejestracji (s) i Napięcie stymulacji (V)Uruchom program, klikając w Uruchom program przycisk (Rysunek 7M).
  UWAGA: Wyniki są zapisywane automatycznie w wybranym katalogu. Po każdym pomiarze należy zauważyć, że skrypt wyświetla transformację Fouriera danych (Rycina 7N), gdzie piki odpowiadają wykrytej częstotliwości dudnienia.
7. W razie potrzeby należy przeprowadzić "Wyznaczanie progu pobudzenia" program do wyznaczania minimalnego napięcia wymaganego do stymulacji hECT w polu widzenia (Rysunek 7O). W razie potrzeby obliczyć maksymalne i minimalne ugięcia słupków (Rycina 7P).

figure-protocol-7
Rycina 7: Interfejs akwizycji danych po ugięciu. (A) Przycisk do uruchomienia oprogramowania. (B) Pasek narzędzi zawierający narzędzie linii i prostokąta, odpowiednio do pomiaru długości oraz zaznaczania obiektów. (C) Sterowniki kalibracji odległości. (D) Narzędzia do pomiaru pola przekroju poprzecznego hECT w trzech różnych punktach. (E) Przełącznik progowania i (F) suwak do konwersji strumienia wideo na obrazy o wysokim kontraście w czasie rzeczywistym. (G) SPoT widoczny w oknie podglądu. (H) Narzędzia do zaznaczania SPoT-ów. (I) Suwak do filtrowania obiektów według rozmiaru. (J) Wykres pokazujący zmierzoną w czasie rzeczywistym odległość między śledzonymi obiektami. (K) Opcje wyboru katalogu zapisu plików wyjściowych. (L) Opcje ustawiania zakresu częstotliwości, odstępu częstotliwości, czasu nagrywania oraz czasu pomiędzy nagraniami dla programu śledzenia słupków (M). (N) Wykres reprezentujący transformatę Fouriera krzywej ugięcia z ostatniego zapisanego nagrania. (O) Program do wyznaczania minimalnego napięcia wymaganego do stymulacji hECT. (P) Program do obliczania maksymalnego i minimalnego ugięcia słupków. Skróty: hECT = human engineered cardiac tissue; SPoT = stable post tracker. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

6. Pomiary statiwu z PDMS

Odległości w stanie nieobciążonym
1. Przed wykonaniem hECT zamontuj odpowiednią parę rusztowań PDMS na ramie. Użyj zestawu do pomiaru kroku oraz oprogramowania opisanego w kroku 5.1 dla pomiarów funkcjonalnych. Wybierz stacjonarne SPoTs na końcach słupków.
2. W razie potrzeby dostosuj źródło światła i/lub próg progowania, aby zredukować szum do wartości <2 µm. Zapisz średnią wartość y rejestrowaną na żywo, wskazaną na wykresie, w arkuszu kalkulacyjnym.
Wysokości słupków i wysokość hECT
1. Z zestawu do pomiaru kroku opisanego w kroku 5.2 usuń lustro kątowe i podgrzewany stolik. Umieść bioreaktor bezpośrednio na podnośniku laboratoryjnym, aby uzyskać widok boczny bioreaktora.
2. Otwórz oprogramowanie kamery. Dostosuj czas naświetlania oraz położenie źródła światła, aby zoptymalizować jednorodność warunków oświetlenia w całym polu widzenia i zmaksymalizować widoczność słupków.
3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych, a następnie otwórz plik „PostMeasurement_PB3.vi” (Plik uzupełniający 5). Po jego załadowaniu kliknij białą strzałkę po lewej stronie paska narzędzi, aby zainicjować program.
4. Zkalibruj oprogramowanie za pomocą szklanego hemocytometru. Kliknij narzędzie linii na pionowym pasku narzędzi po lewej stronie okna podglądu i narysuj linię obejmującą 1 mm oznaczeń hemocytometru. W polu Distance calibration (pixels/mm) w dolnym lewym rogu ekranu ustaw Reference length (mm) na 1, a następnie kliknij przycisk Calculate .
5. Poniżej pól kalibracji, w polu Tissue Number , wprowadź pożądany numer tkanki (do identyfikacji). Ustaw ostrość kamery na lewym słupku hECT i wybierz Left w polu Post Side.
6. Użyj narzędzia linii , aby narysować linię od podstawy słupka (góra) do wierzchołka SPoTs (dół), a następnie zapisz pomiar, klikając Measure Post Ht.
7. Narysuj linię od podstawy słupka do dalszej krawędzi hECT i zapisz ją, klikając Measure Tissue Top Ht. Narysuj linię od podstawy słupka do bliższej krawędzi hECT i zapisz ją, klikając Measure Tissue Base Ht.
8. W tym momencie obróć bioreaktor, aby zmierzyć wysokość prawego słupka. Wybierz opcję right post , aby zapisać te same pomiary. Kliknij przycisk Add , aby uzupełnić arkusz kalkulacyjny zmierzonymi wartościami i automatycznie obliczyć średnią wysokość hECT, która zostanie wykorzystana w kroku 7.
9. Po zakończeniu rejestrowania wysokości tkanek kliknij przycisk Save, aby zapisać wartości w pliku tekstowym.

7. Przetwarzanie danych funkcjonalnych przy użyciu niestandardowych skryptów analitycznych

W edytorze arkusza kalkulacyjnego uzupełnij plik podsumowujący, korzystając z szablonu (Supplementary File 6). Użyj wartości post length (długości słupka) i average tissue height (średniej wysokości tkanki) uzyskanych w krokach 6.2. Upewnij się, że w pliku podsumowującym ujęto wszystkie hECT, dla których dane znajdują się w folderze. Nazwij plik „summary #.csv”, gdzie # oznacza liczbę dni trwania eksperymentu.
UWAGA: Funkcjonalne dane hECT muszą znajdować się w oddzielnych folderach zgodnie z dniem eksperymentu.
Upewnij się, że folder zawierający skrypty AnalyzeLogsGUI (Supplementary File 7) oraz folder z nagraniami hECT zostały dodane do ścieżki dostępu (path).
Otwórz oprogramowanie do analizy danych. Po lewej stronie paska katalogów kliknij przycisk Browse for folder, aby przejść do folderu nadrzędnego, który zawiera zarówno folder AnalyzeLogsGUI, jak i funkcjonalne dane hECT. W panelu bocznym Current Window kliknij prawym przyciskiem myszy na tych folderach, wybierz Add to Path | Add Selected Folders and Subfolders.
Otwórz plik „AnalyzeLogsGui_SC.m”. W karcie Edytora naciśnij przycisk Run i poczekaj, aż w nowym oknie pojawi się graficzny interfejs użytkownika (GUI).
1. W polu Log Selection (Rycina 8AI) kliknij przycisk Select Directory i przejdź do folderu zawierającego funkcjonalne dane hECT. Z menu rozwijanego Tissue wybierz hECT przeznaczone do przetworzenia.
2. W polu Data Inputs (Rycina 8AII) wprowadź w polu Diastolic Distance odległość między słupkami bez obciążenia, zarejestrowaną w krokach 6.1. W polu Post Radius (mm) wprowadź wartość 0.25.
3. W polu Analysis Constraints (Rycina 8AIII) wybierz frequencies to omit (częstotliwości do pominięcia) w analizie lub wybierz specific frequencies to include (konkretne częstotliwości do uwzględnienia, oddzielone przecinkami). Start time (czas rozpoczęcia) i end time (czas zakończenia) są domyślnie ustawione odpowiednio na 0 i −1, aby przetworzyć pełną długość nagrań. W razie potrzeby zmień te wartości, aby przyciąć nagrania.
4. Zmień filter parameters (parametry filtru) (Rycina 8AIV), takie jak Polynomial Order (rząd wielomianu) i Frame Size (rozmiar ramki), aby zmienić level of smoothing (poziom wygładzania) podczas procesu filtrowania, oraz suwak Peak Detection Threshold, aby ustawić minimum peak size (minimalną wielkość piku), która zostanie rozpoznana przez skrypty.
  UWAGA: Skrypt zawiera opcję Spike Removal , która ucina wysokie piki spowodowane artefaktami; nie jest to jednak zalecane, ponieważ zmienia to kształt skurczów. Artefakty należy usuwać zamiast tego poprzez przycinanie nagrania (Rycina 8AIII).
5. Użyj dodatkowych opcji (Rycina 8AV) dla dodatkowych wyników analizy danych: Post deflection analysis w celu uruchomienia dodatkowego algorytmu wykrywania pików, Autoscale y-axis on zoom plots do automatycznej regulacji osi na krzywej siły skurczu (Rycina 8B), Save force-trace curves do zapisania każdej figury siły skurczu w pliku .fig oraz Save force-time data do zapisania współrzędnych x i y przefiltrowanych danych wykreślonych na figurze krzywej siły skurczu.
6. Kliknij Run Analysis , aby wygenerować plik .txt zawierający atrybuty krzywej siły skurczu (Supplementary File 8) uśrednione dla całego nagrania.

figure-protocol-8
Rycina 8: Obliczenia krzywej siły skurczu (twitch force). (A) Uruchomienie pliku „AnalyzeLogsGUI.m” w oprogramowaniu do przetwarzania danych otwiera okno GUI. (I) Pole Log Selection pozwala użytkownikowi wybrać katalog zawierający folder z danymi funkcjonalnymi hECT. Pole Day Num jest automatycznie wypełniane z tytułu pliku podsumowującego utworzonego w kroku 7.1 protokołu. hECT do przetworzenia wybiera się za pomocą menu rozwijanego Tissue. (II) Pole Data Inputs zawiera informacje o parze słupków PDMS, które wspierają hECT, takie jak odległość bez obciążenia (uzyskana w kroku 6.1 protokołu) i promień słupka (0,25 mm). (III) Pole Analysis Constraints pozwala użytkownikowi wybrać częstotliwości, które należy pominąć lub uwzględnić, oraz przyciąć nagrania. (IV) Pole filter parameters zawiera opcje wyboru sposobu filtrowania surowej krzywej siły skurczu. Polynomial Order oraz Frame Size zmieniają poziom wygładzania podczas procesu filtrowania. Suwak Peak Detection Threshold określa minimalną wielkość piku, która zostanie rozpoznana przez skrypty. Opcja Spike Removal ucina wysokie piki spowodowane artefaktami. (V) Dodatkowe opcje obejmują Post deflection analysis, która uruchamia dodatkowy algorytm detekcji piku, Autoscale y-axis on zoom plots, która działa na krzywej siły skurczu, Save force-trace curves, która zapisuje wykresy siły skurczu, oraz Save force-time data, która zapisuje wykreślone dane siły skurczu w czasie. (B) Przykład krzywej siły skurczu z 30 s nagrania hECT stymulowanego z częstotliwością 1 Hz, wygenerowany przez GUI z panelu A. Czerwona krzywa siły skurczu przedstawia siłę przefiltrowaną zgodnie z parametrami w AIV, nałożoną na surową krzywą siły skurczu (krzywa ciemnoniebieska, pojawia się po wybraniu opcji Show unfiltered data w AV). Skróty: hECT = ludzka inżynieryjna tkanka serca; GUI = graficzny interfejs użytkownika; PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z powyższym protokołem, kardiomiocyty wygenerowano z linii zdrowych iPSC, która była wcześniej wykorzystywana przez nasz zespół⁹^,¹⁵ i wytworzono z nich hECT po 8–61 dniach hodowli. Rysunek 9A przedstawia reprezentatywne obrazy hECT oglądanych od dołu, które zostały stworzone bez (góra) i z (dół) SPoTs. Pomiary funkcjonalne wykonano w temperaturze pokojowej (23 °C) oraz w temperaturze fizjologicznej (36 °C) między 37...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W literaturze opublikowano wiele liniowych modeli tkanek serca, z których część opisano w tabeli 1. Niektóre modele obejmują bezpośredni pomiar siły działającej na tkankę, ale zazwyczaj wymagają one przeniesienia konstruktu do oddzielnej kąpieli mięśniowej³⁸. Większość modeli jest projektowana z tkankami trwale zakotwiczonymi na obu końcach, najczęściej do słupków PDMS 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

K.D.C. jest współzałożycielem i dyrektorem naukowym Novoheart oraz posiada udziały w holdingu Medera Biopharmaceutical. Novoheart nie przyczynił się do finansowania, planowania ani realizacji tego badania; jednak wyniki badania mogą mieć potencjalny wpływ finansowy na Novoheart i Medera. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Timothy'emu Cashmanowi za wcześniejsze prace nad tą metodą. Badanie to było finansowane przez National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 i K01 HL133424) oraz Międzynarodowy Program Sieci Doskonałości Fundacji Leducq (CURE-PLaN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut ze stali nierdzewnej o średnicy 0,25 mm 304	McMaster Carr	6517K61
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco	25200056
1,7 ml mikroprobówek	Axygen	MCT-175-C
10 cm (20 mm wysokości)	Corning	353003
10 ml Pipeta serologiczna	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	rozcieńczyć 1:10 w sterylnej wodzie destylowanej
10X Zmodyfikowany Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μ L Mikropipeta	Eppendorf	3123000055
200 μ L Końcówki do mikropipet	VWR	76322-150
5 ml Pipeta serologiczna	Drummond	6-000-005
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	Falcon	352070
6 cm szalka Petriego	Corning	353002
6-watowy podwójny oświetlacz LED na gęsiej szyi	AmScope	LED-6W
Płytki 6-dołkowe	Corning	353046
Lustro kątowe 90 stopni	Edmund Optics	45-594
Akrylowy klej wiążący	SCIGRIP	#4
Regulowany podnośnik 10 cm x 10 cm	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminium 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Obiektyw	Worki autoklawe ZEISS	1020-863
	Propper	21002
B-27 suplement	ThermoFisher	17504044
B-27 suplement (bez insuliny)	ThermoFisher	A1895601
Wirówka stołowa	Eppendorf	5810 R
ABS	Ultimaker		2,85 mm szeroki
bydlęcy Kolagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Szafka bezpieczeństwa biologicznego klasy II
	estreetplastics 1002502436		o grubości 6,25 mm
	Haas	VF-1
Przewodzące pręty grafitowe	McMaster Carr	1763T33
Mikroskop preparacyjny	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Etanol	Fisher Scientific	A4094	Rozcieńczyć do 70% w wodzie
EVE Automatyczny licznik komórek	NanoEntek	E1000
EVE Szkiełko do liczenia komórek	NanoEntek	EVS-050
Płodowa surowica bydlęca	Technologies	10438026
Drobno zakrzywione kleszcze	Fine Science Tools	11253-25
Forma Seria II Inkubator CO2 z płaszczem wodnym	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "inkubator". Z filtrem HEPA klasy 100
Oprogramowanie Fusion360	Autodesk		AKA "Oprogramowanie CAD"Szklany
hemocytometr	Reichert	1475	o głębokości 0,1 mm
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
z kwalifikacją hESC	Corning	354277	AKA "matryca membrany podstawnej". Przechowywać w zamrożonych porcjach
Szybka kamera CCD	PixelLINK	P7410
Mikroskop odwrócony	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10-krotny obiektyw z kontrastem fazowym
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Czysta ławka z przepływem laminarnym	NuAire	NU-201-330	niezbędny do analizy funkcjonalnej hECT
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i i procesor, procesor 2,8 GHz, 16 GB pamięci RAM
Maszyna do cięcia laserowego	Epilog	Helix 24
Zestaw słuchawkowy z powiększeniem	ExcelBlades	70020	Zalecany do kroków wymagających precyzyjnych manipulacji
Matlab	Mathworks	w wersji 2019b lub nowszej	AKA "analiza danych oprogramowanie"
Nożyczki Micro Vannas, ostrze 3 mm	WPI Instruments	501839
Statyw do mikroskopu	Olympus	SZ2-STU1
Roztwór podstawowy penicyliny-streptomycyny	ThermoFisher	15140122	10 000 j.m./ml penicyliny; 10 000 μ g/ml streptomycyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez kationów dwuwartościowych	Sigma Aldrich	P3813	Rozcieńczony w wodzie destylowanej do stężeń 1X i 10X
Kontroler pipet	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Oprogramowanie aparatu"
Polisulfon	McMaster Carr	86735K73	półprzezroczysty kolor bursztynowy
Politetrafluoroetylen (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	, formowany
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "Media dysocjacyjne iPSC"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Folia silikonowa	SMI produkcja		błyszcząca, grubość 0,02, twardość 40
Rozmiar 10/0 Niebieskie, zielone, czerwone i żółte szklane koraliki nasienne	Kolor Michaela		powinien wytrzymać
Szpatułka	Fisher Scientific	14-373	służąca do mieszania PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Ostrza do golenia ze stali nierdzewnej	GEM	62-0179-CTN	preferowane w stosunku do stali nierdzewnej ze względu na niższą twardość
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "Pożywka hodowlana iPSC"
Sterylna woda destylowana	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 - Elastomer silikonowy Encapsulant 0,9 kg Zestaw	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA Polidimethylsiloxane (PDMS)
Sylgard 184 - Elastomer silikonowy bezbarwny 1 lb Zestaw	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB	ZESTAW AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Podgrzewany stage z kontrolowaną temperaturą	Okolab	H401-HG-SMU	Ustaw wysokość do 10 cm
Termoplastyczna drukarka 3D	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Komora próżniowa	Bel-Art Parts	F42027-0000
Mini piła taśmowa o zmiennej prędkości	Micro-Mark	82203
Miniaturowa wiertarka o zmiennej prędkości	Micro-Mark	82959
Wibracje Stół izolacyjny	Labconco	3618000
Łodzie wagowe	VWR	10803-140
Zacisk stołowy do cylindra Talon	VWR	97035-528	AKA zacisk śrubowy

Przezroczysta folia akrylowa Labconco 3430009 Pionowy młyn CNC Life do autoklawowania

Bibliografia

Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB Journal. 28 (2), 644-654 (2014).
Cashman, T. J., et al. Construction of defined human engineered cardiac tissues to study mechanisms of cardiac cell therapy. Journal of Visualized Experiments. (109), e53447(2016).
Stillitano, F., et al. Genomic correction of familial cardiomyopathy in human engineered cardiac tissues. European Heart Journal. 37 (43), 3282-3284 (2016).
Mayourian, J., et al. Experimental and computational insight into human mesenchymal stem cell paracrine signaling and heterocellular coupling effects on cardiac contractility and arrhythmogenicity. Circulation Research. 121 (4), 411-423 (2017).
Mayourian, J., et al. therapeutic paracrine modulation of cardiac excitation-contraction coupling. Circulation Research. 122 (1), 167-183 (2018).
Mayourian, J., et al. Exosomal microRNA-21-5p mediates mesenchymal stem cell paracrine effects on human cardiac tissue contractility. Circulation Research. 7 (122), 933-944 (2018).
Turnbull, I. C., et al. Cardiac tissue engineering models of inherited and acquired cardiomyopathies. Methods in Molecular Biology. 1816, 145-159 (2018).
Murphy, J. F., et al. Adult human cardiac stem cell supplementation effectively increases contractile function and maturation in human engineered cardiac tissues. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 373(2019).
Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human engineered heart tissue. Nature Protocols. 12 (6), 1177-1197 (2017).
Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
Ramade, A., Legant, W. R., Picart, C., Chen, C. S., Boudou, T. Microfabrication of a platform to measure and manipulate the mechanics of engineered microtissues. Methods in Cell Biology. 121, 191-211 (2014).
Ronaldson-Bouchard, K., et al. Engineering of human cardiac muscle electromechanically matured to an adult-like phenotype. Nature Protocols. 14 (10), 2781-2817 (2019).
Tamargo, M. A., et al. milliPillar: A platform for the generation and real-time assessment of human engineered cardiac tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (11), 5215-5229 (2021).
Ceholski, D. K., et al. CXCR4 and CXCR7 play distinct roles in cardiac lineage specification and pharmacologic β-adrenergic response. Stem Cell Research. 23, 77-86 (2017).
Bliley, J. M., et al. Dynamic loading of human engineered heart tissue enhances contractile function and drives a desmosome-linked disease phenotype. Science Translational Medicine. 13 (603), (2021).
Ribeiro, M. C., et al. A new versatile platform for assessment of improved cardiac performance in human-engineered heart tissues. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 214(2022).
Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
Mannhardt, I., et al. Human engineered heart tissue: Analysis of contractile force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
Mannhardt, I., et al. Blinded contractility analysis in hiPSC-cardiomyocytes in engineered heart tissue format: Comparison with human atrial trabeculae. Toxicological Sciences. 158 (1), 164-175 (2017).
Saleem, U., et al. Force and calcium transients analysis in human engineered heart tissues reveals positive force-frequency relation at physiological frequency. Stem Cell Reports. 14 (2), 312-324 (2020).
Thavandiran, N., et al. Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Scientific Reports. 10 (1), 6919(2020).
Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
Bose, P., Huang, C. Y., Eyckmans, J., Chen, C. S., Reich, D. H. Fabrication and mechanical properties measurements of 3D microtissues for the study of cell-matrix interactions. Methods in Molecular Biology. 1722, 303-328 (2018).
Zhang, W., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (hESC-CMs) in 3D collagen matrix: Effects of niche cell supplementation and mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 49, 204-217 (2017).
van Neste, C. Advances in bioreactor design and multi-dimensional analysis for assessing maturation phenotype of human engineered cardiac tissues. PhD thesis. Icahn School of Medicine at Mount Sinai. , New York. https://www.prouest.com/docview/2722362863 (2022).
Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
Salazar, B. H., Cashion, A. T., Dennis, R. G., Birla, R. K. Development of a cyclic strain bioreactor for mechanical enhancement and assessment of bioengineered myocardial constructs. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (4), 533-545 (2015).
Putame, G., et al. Application of 3D printing technology for design and manufacturing of customized components for a mechanical stretching bioreactor. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 3957931(2019).
Akintewe, O. O., Roberts, E. G., Rim, N. -G., Ferguson, M. A. H., Wong, J. Y. Design approaches to myocardial and vascular tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, 389-414 (2017).
Chen, G., et al. Phospholamban as a crucial determinant of the inotropic response of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes and engineered 3-dimensional tissue constructs. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (1), 193-202 (2015).
Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
Beauchamp, P., et al. 3D co-culture of hiPSC-derived cardiomyocytes with cardiac fibroblasts improves tissue-like features of cardiac spheroids. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 14(2020).
Campostrini, G., et al. functional analysis and applications of isogenic three-dimensional self-aggregating cardiac microtissues from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 16 (4), 2213-2256 (2021).
Swiatlowska, P., Iskratsch, T. Tools for studying and modulating (cardiac muscle) cell mechanics and mechanosensing across the scales. Biophysical Reviews. 13 (5), 611-623 (2021).
Zhao, Y., et al. Engineering microenvironment for human cardiac tissue assembly in heart-on-a-chip platform. Matrix Biology. 85-86, 189-204 (2020).
Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSC-derived engineered cardiac tissues. Methods in Molecular Biology. 2320, 171-180 (2021).
Wang, E. Y., et al. Biowire model of interstitial and focal cardiac fibrosis. ACS Central Science. 5 (7), 1146-1158 (2019).
Zhao, Y., et al. A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling. Cell. 176 (4), 913-927 (2019).
Lee, E. K., et al. Machine learning of human pluripotent stem cell-derived engineered cardiac tissue contractility for automated drug classification. Stem Cell Reports. 9 (5), 1560-1572 (2017).
Batalov, I., Feinberg, A. W. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells using monolayer culture. Biomarker Insights. 10, 71-76 (2015).
Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
Penefsky, Z. J., Buckley, N. M., Litwak, R. S. Effect of temperature and calcium on force-frequency relationships in mammalian ventricular myocardium. Pflugers Archiv. 332 (4), 271-282 (1972).
Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2001).
Kanaya, N., Gable, B., Wickley, P. J., Murray, P. A., Damron, D. S. Experimental conditions are important determinants of cardiac inotropic effects of propofol. Anesthesiology. 103 (5), 1026-1034 (2005).
Galende, E., et al. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. Cellular Reprogramming. 12 (2), 117-125 (2010).
Wacker-Gussmann, A., Strasburger, J. F., Cuneo, B. F., Wakai, R. T. Diagnosis and treatment of fetal arrhythmia. American Journal of Perinatology. 31 (7), 617-628 (2014).
Federmann, M., Hess, O. M. Differentiation between systolic and diastolic dysfunction. European Heart Journal. 15, 2-6 (1994).
Knight, W. E., et al. Maturation of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes enables modeling of human hypertrophic cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 16 (3), 519-533 (2021).
Ma, Z., et al. Contractile deficits in engineered cardiac microtissues as a result of MYBPC3 deficiency and mechanical overload. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 955-967 (2018).
de Lange, W. J., et al. Human iPSC-engineered cardiac tissue platform faithfully models important cardiac physiology. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 320 (4), H1670-H1686 (2021).
Hiranandani, N., Varian, K. D., Monasky, M. M., Janssen, P. M. L. Frequency-dependent contractile response of isolated cardiac trabeculae under hypo-, normo-, and hyperthermic conditions. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1727-1732 (2006).
Puglisi, J. L., Bassani, R. A., Bassani, J. W., Amin, J. N., Bers, D. M. Temperature and relative contributions of Ca transport systems in cardiac myocyte relaxation. The American Journal of Physiology. 270 (5), H1772-H1778 (1996).
Puglisi, J. L., Yuan, W., Bassani, J. W., Bers, D. M. Ca(2+) influx through Ca(2+) channels in rabbit ventricular myocytes during action potential clamp: Influence of temperature. Circulation Research. 85 (6), e7-e16 (1999).
Li, R. A., et al. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials. 163, 116-127 (2018).
Sharma, A., et al. Biomanufacturing in low Earth orbit for regenerative medicine. Stem Cell Reports. 17 (1), 1-13 (2022).
Strauss, D. G., Wu, W. W., Li, Z., Koerner, J., Garnett, C. Translational models and tools to reduce clinical trials and improve regulatory decision making for QTc and proarrhythmia risk (ICH E14/S7B updates). Clinical Pharmacology & Therapeutics. 109 (2), 319-333 (2021).
Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

to:

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Tagi

Konstrukcja bioreaktora model ludzkiego serca indukowane pluripotencjalne kom rki macierzyste in ynieria tkankowa stela e z PDMS stabilny tracker s upka ledzenie optyczne pomiar si y sygnalizacja parakrynowa

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Tagi

Powiązane artykuły