Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64431

⸱

25 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Streszczenie

Borrelia składa się z trzech grup gatunków, tych z grupy boreliozy z Lyme (LB), znanej również jako B. burgdorferi sensu lato (s.l.) i niedawno przeklasyfikowanej na Borreliella, grupy nawrotowej gorączki (RF) Borrelia i trzeciej grupy krętków związanych z. Metody oparte na kulturach pozostają złotym standardem w laboratoryjnym wykrywaniu zakażeń bakteryjnych zarówno w badaniach, jak i pracach klinicznych, ponieważ hodowla patogenów z płynów ustrojowych lub tkanek bezpośrednio wykrywa replikujące się patogeny i dostarcza materiału źródłowego do badań. Krętki Borrelia i Borreliella są wybredne i wolno rosnące, a zatem nie są powszechnie hodowane do celów klinicznych; Jednak kultura jest niezbędna do badań. Protokół ten przedstawia metodologię i receptury wymagane do pomyślnej hodowli krętków LB i RF, w tym wszystkich uznanych gatunków z kompleksu B. burgdorferi s.l., w tym B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ikrętki RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis i B. miyamotoi. Podstawowym podłożem do hodowli krętków LB i RF jest pożywka Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II lub BSK-H), która niezawodnie wspomaga wzrost krętków w ustalonych kulturach. Aby móc hodować nowo wyizolowane izolaty Borrelia z próbek pochodzących od kleszczy lub gospodarza, w których początkowa liczba krętków jest niska w inokulum, preferowane jest zmodyfikowane podłoże Kelly-Pettenkofer (MKP). Pożywka ta wspomaga również wzrost B. miyamotoi. Sukces uprawy krętków RF zależy również w dużym stopniu od jakości składników.

Wprowadzenie

Borrelia to rodzaj bakterii krętkowych, który obejmuje trzy główne klady: grupę boreliozy z Lyme (LB), grupę z nawracającą gorączką (RF) i mniej dobrze scharakteryzowaną grupę, pozornie ograniczoną do. Taksonomia Borrelia zmienia się wraz z pojawieniem się metodologii molekularnych, które umożliwiają porównywanie genomu i proteomu, podobnie jak w przypadku większości innych grup taksonomicznych1,2,3,4,5,6,7. Grupa LB (zwana również grupą z boreliozą) jest tradycyjnie określana jako Borrelia burgdorferi sensu lato od jej najlepiej scharakteryzowanego członka Borrelia burgdorferi sensu stricto. W artykule użyto obecnie najczęściej używanej terminologii: LB, RF i grupy związanej z oraz opisano protokoły hodowli dla grup LB i RF.

Jak można się spodziewać po członku rodziny Spirochaetaceae, Borrelia może przyjąć charakterystycznie długi i cienki spiralny kształt, zwykle o długości 20-30 μm i szerokości 0,2-0,3 μm. Jednak komórki Borrelia są wysoce pleomorficzne i mogą przybierać wiele innych kształtów zarówno w hodowli, jak i in vivo1,8 w wyniku ich złożonej struktury komórkowej i genetycznej. W postaci krętkowej płaska morfologia fali sinusoidalnej wynika z jej osiowej endoflagelli obracającej się w przestrzeni peryplazmatycznej między błoną wewnętrzną i zewnętrzną. Ta struktura sprawia, że komórki są bardzo ruchliwe, a zewnętrzna błona zawiera białka, które umożliwiają komórce interakcję z tkankami gospodarza9,10. Ekspresja białek błony zewnętrznej jest ściśle regulowana i wpływa nie tylko na inwazję tkanek gospodarza, ale także na interakcję z układem odpornościowym gospodarza11. Ta złożona ekspresja genów umożliwia komórkom Borrelia przemieszczanie się między bardzo różnymi środowiskami gospodarzy kręgowców i wektorów bezkręgowców. Genom Borrelia jest niezwykły wśród prokariontów, składa się z chromosomu liniowego, a nie kołowego. Oprócz chromosomu liniowego gatunki Borrelia zawierają 7-21 plazmidów, niektóre liniowe, a niektóre okrągłe. Plazmidy zawierają większość genów wymaganych do adaptacji gospodarza i zjadliwości, a koliste plazmidy pochodzące z profagów są uważane za odpowiedzialne za większość poziomego przepływu genów między komórkami krętka12,13. Zgodnie z rolą w adaptacji gospodarza, niektórzy, być może wielu lub wszyscy, członkowie grupy boreliozy z Lyme tracą plazmidy w culture14. Najlepiej przebadany "przystosowany laboratoryjnie" szczep B. burgdorferi, B31, ma tylko siedem z dziewięciu plazmidów znalezionych w dzikich izolatach tego gatunku15. Podobnie, B. garinii traci plazmidy w culture16. Niektóre badania wykazały, że gatunki RF i B. miyamotoi zachowują plazmidy podczas hodowli14,17, ale ostatnie prace pokazują zmienione plazmidy i zakaźność przy długotrwałej hodowli in vitro18.

Metody oparte na kulturach pozostają złotym standardem w laboratoryjnym wykrywaniu infekcji bakteryjnych, zarówno w badaniach, jak i w pracy klinicznej14,17. Hodowla patogenów z płynów ustrojowych lub tkanek bezpośrednio wykrywa replikujące się patogeny i dostarcza materiału źródłowego do badań14,17. Protokół ten demonstruje metodologię i receptury wymagane do pomyślnego wyhodowania krętków z grupy LB, a także RF Borrelia i B. miyamotoi. Podstawowym podłożem do hodowli krętków Borrelia jest pożywka Barboura-Stoennera-Kelly'ego (BSK-II lub dostępna na rynku BSK-H), z antybiotykami lub bez nich w celu ograniczenia wzrostu zanieczyszczających prokariontów. To medium zostało zaadaptowane z medium pierwotnie używanego do obsługi RF Borrelia19, następnie zmodyfikowane przez Stoenner20, a następnie przez Barbour21. Od tego czasu opracowano wiele modyfikacji, z których każda ma wpływ na fizjologię bakterii, co może wpływać na wzrost, zakaźność i chorobotwórczości22. To podłoże niezawodnie wspiera wzrost krętków w uznanych kulturach i było używane do izolowania krętków od kleszczy, ssaków i próbek klinicznych23. Niedawno opracowana odmiana, zmodyfikowana pożywka Kelly'ego-Pettenkofera (MKP), może zapewnić lepszy sukces izolacji, morfologię i ruchliwość podczas izolowania nowych izolatów Borrelia od próbek środowiskowych, gdy liczba krętków obecnych w próbce dostępnej do wysiewu kultury jest niska23,24. We wszystkich przypadkach sukces uprawy zależy w decydującym stopniu od świeżo przygotowanego podłoża i użycia odpowiednich składników; Nie wszystkie komercyjne składniki dają wysokiej jakości podłoże. Zaszczepione kultury można wygodnie inkubować bez wstrząsania w konwencjonalnym inkubatorze o temperaturze 32-34 °C w obecności niewielkiej ilości resztkowego tlenu w otoczeniu. Krętki Borrelia są beztlenowcami, ale w naturze są narażone na wahania stężeń tlenu i dwutlenku węgla i reagują zmianami w ekspresji genów26,27,28,29. Tak więc ekspresja genów, wzrost i inne badania metaboliczne powinny kontrolować poziom tlenu i dwutlenku węgla za pomocą inkubatora kontrolowanego tlenem lub komory beztlenowej. W hodowli posiewy są sprawdzane co tydzień lub częściej pod kątem obecności krętków za pomocą mikroskopii ciemnego pola lub mikroskopii z kontrastem fazowym. Rozmazy hodowlane mogą być barwione za pomocą barwników srebra, immunohistochemii lub za pomocą fluorescencyjnie znakowanych szczepów29,30. PCR, a następnie sekwencjonowanie DNA to czuła i specyficzna metoda wykrywania i genetycznej identyfikacji lub potwierdzania gatunku Borrelia30,31,32,33.

Istnieje wiele drobnych odmian BSK-II, a niektóre są dostępne na rynku. Protokół opisany tutaj w sekcji 1 został zaadaptowany z Barbour (1984)21. Płynna pożywka MKP jest pożywką powstałą niedawno i jest opisana w punkcie 2. Jest on przygotowywany zgodnie z wcześniej zgłoszonym protokołem33,34, który, podobnie jak podłoże BSK, składa się z dwóch etapów: przygotowania podłoża podstawowego i przygotowania podłoża kompletnego. Pożywkę do hodowli bakterii Borrelia można przygotować z antybiotykami lub bez antybiotyków, jak opisano w punkcie 3; antybiotyki działają w celu zmniejszenia liczby bakterii skażających wprowadzanych podczas inokulacji próbkami klinicznymi lub środowiskowymi, jak opisano w sekcji 4; w przypadku inokulacji czystą kulturą Borrelia sp. antybiotyki mogą nie być potrzebne. Tworzenie długoterminowych zapasów Borrelia jest często ważne, a protokół w tym zakresie opisano w sekcji 5. W sekcji 6 opisano użycie tych pożywek do izolacji czystych klonów Borrelia sensu lato z próbek klinicznych lub środowiskowych. Możliwych jest kilka podejść36; Poniżej znajduje się jeden, który okazał się skuteczny. Pożywka galwaniczna używana w tym protokole jest modyfikacją podłoża do powlekania BSK-II37 i MKP medium34 (z surowicą króliczą zwiększoną do 10%38).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania z udziałem próbek pobranych od człowieka zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną odpowiedniego uniwersytetu i/lub placówki medycznej, a przed pobraniem próbek uzyskano pisemną świadomą zgodę od uczestników. Wszystkie badania z udziałem próbek pobranych od zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt. W stosownych przypadkach uzyskano zgody na pobieranie próbek z odkrycia.

UWAGA: Sukces kultury zależy w decydującym stopniu od jakości składników. Dostępna jest komercyjna pożywka BSK, która solidnie wspiera wzrost przystosowanych do badań laboratoryjnych czystych B. burgdorferi i gatunków pokrewnych, w przypadku których do wysiewu kultury można użyć inokulum o wysokiej dawce. W przypadku izolatów szczepów z pierwotnego materiału biologicznego preferowane i często konieczne jest świeżo przygotowane podłoże.

Borrelia sp. są znanymi lub podejrzewanymi patogenami, a nieprzebadane tkanki ludzkie lub zwierzęce również mogą stanowić zagrożenie biologiczne. Obchodzenie się z potencjalnie zakaźnym materiałem wymaga osobistego wyposażenia ochronnego i sterylnej techniki dla bezpieczeństwa badaczy. Dodatkowo podłoże jest tak bogate w składniki odżywcze, że kultura łatwo ulega zanieczyszczeniu. Do tych prac wymagany jest zasadniczo poziom bezpieczeństwa biologicznego 2, a wszystkie prace z Borrelia sp. lub próbkami powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Instrukcja wykonania podłoża BSK-II

  1. Przygotowanie kompletnego podłoża BSK-II
    1. Otrzymać odczynniki do przygotowania 1 l pożywki, jak pokazano w tabeli 1.
      UWAGA: Czystość BSA (lub jej brak) ma kluczowe znaczenie dla optymalnego wzrostu. W szczególności czystość BSA różni się zarówno w zależności od producenta, jak i partii. Zapoznaj się z Tabelą 2, aby zapoznać się z listą produktów cieszących się większym i mniejszym powodzeniem. Uzyskanie kilku próbek od różnych dostawców, przetestowanie ich pod kątem optymalnego wzrostu, a następnie zakup dużej ilości najlepszej partii jest skuteczną strategią łagodzenia tego problemu i wyprodukowania dobrego podłoża.
    2. Zacznij od rozpuszczenia BSA w zlewce, mieszając z wodą, co zajmie co najmniej pół godziny.
    3. Dodaj wszystkie suche chemikalia i pozwól im się rozpuścić. Następnie dodaj CMRL.
    4. W razie potrzeby dostosować pH pożywki BSK-II do 7,6 za pomocą 1 M NaOH.
    5. Dodać surowicę króliczą do pożywki BSK-II do stężenia 6%-10%. Filtruj sterylizować (wielkość porów 0,22 μm) pożywkę BSK-II. Wymagana ilość surowicy zależy od gatunku Borrelia. Stosować 6%-7% dla gatunków i szczepów RF oraz dla Borrelia burgdorferi sensu lato. Jeśli wzrost nie jest silny, dodaj do podłoża kolejne 1%-2% sterylnej surowicy króliczej.
    6. Zamrozić zapas pożywki BSK-II w 100 ml lub 400 ml podwielokrotności.
    7. W przypadku szczepów RF wymagana jest żelatyna. Dodać 100 ml 7% sterylnej żelatyny (lekko podgrzanej, aby umieścić ją w roztworze) do 400 ml pożywki BSK-II. Podgrzać BSK-II żelatyną w temperaturze 37 °C, aby żelatyna stopiła się przed zaszczepieniem kultury.
      UWAGA: Pożywkę można zamrozić (-20 °C) przed sterylizacją filtra i dodaniem surowicy króliczej i żelatyny (w przypadku krętków RF) lub po sterylizacji filtra i dodaniu surowicy (i żelatyny). Pożywka jest stabilna po długim zamrożeniu. W przypadku przechowywania w lodówce podłoże należy zużyć w ciągu 1 miesiąca. Gatunki RF najlepiej rosną ze świeżym podłożem, zwykle nie starszym niż 1 tydzień. Jeśli nie jest zamrożony, sprawdź wzrokowo jakość podłoża pod kątem zmętnienia. Wyrzuć pożywkę, która wydaje się być zanieczyszczona, wytrąca składniki lub w inny sposób wątpliwa.
    8. Jeżeli do pożywki mają być dodane antybiotyki, należy dodać je do świeżo przygotowanej pożywki lub wcześniej zamrożonych podwielokrotności; to drugie podejście jest bardziej elastyczne. Stosuj stężenia antybiotyków zgodnie z opisem Olivera i wsp.39.
    9. Podczas rozmrażania probówki z pożywką należy zważyć antybiotyki do sterylnych (autoklawowanych) probówek o pojemności 1,7 ml lub sterylnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml za pomocą wagi precyzyjnej. Przygotować roztwory podstawowe w następujący sposób: rozpuścić 25 mg amfoterycyny B w 10 ml DMSO, 20 mg fosfomycyny w 1 ml autoklawowanej wody destylowanej i 50 mg ryfampicyny w 1 ml DMSO.
    10. Filtrować, sterylizować (filtry strzykawkowe 0,2 μm) antybiotyki i przenosić je do nowej probówki o odpowiednim rozmiarze.
    11. Rozcieńczyć antybiotyki w stosunku 1:1000 pożywki, aby osiągnąć ich końcowe stężenie. Na 500 ml BSK dodać 0,5 ml roztworu podstawowego amfoterycyny B (2,5 mg/ml w DMSO), 0,5 ml roztworu podstawowego fosfomycyny (20 mg/ml w sterylnymH2O) i 0,5 ml roztworu podstawowego ryfampicyny (USA: ryfampicyna) (50 mg/ml w DMSO).
    12. Użyć pożywki lub podwielokrotności z dodatkiem antybiotyków i zamrozić w temperaturze -20 °C.
SkładnikówIlość (/L)
BSA frakcja V50 gramów
CMRL-1066 (10x)100 ml
Neopepton5 gramów
Hepes6 gramów
Kwas cytrynowy sól trisodowa dwuwodna0,7 gr
glukoza5 gramów
TC Drożdżanan2 gramów
Kwas pirogronowy (sól Na)0,8 gr
N-acetylo-D-glukozamina0,4 grama
Wodorowęglan sodu2,2 gr
Woda (wysoka czystość)900 ml

Tabela 1: Skład 1 L podłoża BSK-II.

źródłoPrzydatności
Serva GmbH, Heidelberg, Niemcytak
Proliant Biologicals, Boone IA, Stany Zjednoczonetak
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma-Aldrich), St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneNie

Tabela 2: Źródła BSA i przydatność dla podłoża BSK-II.

2. Instrukcja tworzenia MKP

  1. Przygotowanie podłoża podstawowego
    1. Ostrożnie zważyć i rozpuścić wszystkie sproszkowane składniki, jak podano poniżej w tabeli 3, w 3/4 końcowej objętości ddH2O (ok. 750 ml), mieszając aż do całkowitego rozpuszczenia, co zajmuje ~1 godzinę.
    2. Po całkowitym rozpuszczeniu dostosuj pH za pomocą NaOH do 7,6, a objętość do 1000 ml, a następnie wysterylizuj przez filtrację (filtr 0,22 μm).
      UWAGA: Pożywka podstawowa może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Przygotowanie kompletnej pożywki MKP
    1. Wymieszać wszystkie składniki wymienione w Tabeli 4 w sterylny sposób; wysterylizować żelatynę w autoklawie i obchodzić się w sterylny sposób. Pracuj w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego i używaj sterylnej przefiltrowanej surowicy.
    2. Podwielokrotność MKP w probówkach o pojemności 50 ml. Umieścić jedną małą porcję w temperaturze 33 °C na kilka dni, a następnie sprawdzić pod mikroskopem ciemnego pola pod kątem braku zanieczyszczeń.
      UWAGA: Przechowywać MKP complete w temperaturze +4 °C nie dłużej niż 1 miesiąc i nie zamrażać. Całe podłoże można dodatkowo sterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm.
SkładnikówIlość (/L)
CMRL-1066 (10x bez glutaminy)100 ml (w płynie) / 9,7 g/l w proszku
Neopepton3 gramów
Hepes6 gramów
Kwas cytrynowy0,7 gr
glukoza3 gramów
Kwas pirogronowy0,8 gr
N-acetyloglukozamina0,4 grama
Wodorowęglan sodu2 gramów

Tabela 3: Skład 1 L podstawowej pożywki MKP (Modified Kelly-Pettenkofer).

szt. szt.
SkładnikówIlość (ml)
Podłoże podstawowe500
7% żelatyna (w H2O) (świeżo autoklawowana, ale nie gorąca)100
Surowica królicza36
35% powierzchni ciała17,5

Tabela 4: Skład kompletnego podłoża MKP (zmodyfikowanego Kelly'ego-Pettenkowera).

3. Hodowla Borrelii, z antybiotykami lub bez

  1. Wszystkie etapy eksperymentalne należy wykonać w sterylnych warunkach pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zdezynfekuj powierzchnię i wszystkie materiały 70% etanolem i natychmiast przenieś je do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Sterylizuj UV wszystkie materiały niebiologiczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5 minut przed rozpoczęciem pracy.
  2. Użyj możliwie najświeższego podłoża.
  3. Aby rozpocząć hodowlę, należy wstępnie podgrzać podłoże (33 °C - 37 °C) w inkubatorze. W razie potrzeby zastosuj potrząsanie.
    UWAGA: W zależności od objętości podłoża ten krok może potrwać kilka godzin.
  4. Dodać ~1 ml rozmrożonej kultury Borrelia z glicerolu lub podobnego bulionu, uprzednio przechowywanego w temperaturze -80 °C i rozmrożonego w temperaturze pokojowej (RT), gdy tylko stanie się płynny, do 5-15 ml wstępnie podgrzanej pożywki BSK. Zaszczepić kulturę do małej objętości (5-15 ml BSK) za pomocą dostępnych w handlu szklanych lub plastikowych fiolek z zakrętkami. Napełnij probówki prawie do pełna, aby uzyskać atmosferę mikro- lub beztlenową. Zamknij szczelnie rurki; w przypadku hodowli w ten sposób CO2 nie jest potrzebny.
  5. Hodować gatunki RF (i B. persica) w temperaturze 37 °C w inkubatorze bez mieszania i mieszania. Uprawiać gatunki B. burgdorferi sensu lato w temperaturze 33-34 °C.
  6. Monitoruj wzrost kultury Borrelia za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii ciemnego pola przy powiększeniu 200x-400x (Rysunek 3). Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, wymieszaj kulturę za pomocą pipety serologicznej lub, dla większej ilości, wymieszaj za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml podczas pipetowania w górę iw dół.
    UWAGA: Borrelia jest najbardziej widoczna przy większym powiększeniu (200X-400X), ale najlepiej policzalne przy 200-krotnym powiększeniu na hemocytometrze40. Ruch i morfologia Borrelia wskazują na obecność tych bakterii.
  7. Aby określić ilościowo wzrost bakterii, policz kilka (10) pojedynczych małych kwadratów w szesnastopolowym układzie siatki obszaru zliczania po obu stronach hemocytometru i średniej. Pomnóż średnią liczbę komórek na mały kwadrat przez współczynnik konwersji odpowiedni dla hemocytometru używanego do określenia liczby komórek na ml.
  8. Monitoruj wzrost bakterii w odstępach 1-2 dniowych. Wykładniczy wzrost Borrelia zależy od żywotności i gęstości komórek i może trwać 1 tydzień lub dłużej w temperaturze 34 °C. Rozcieńczyć kultury fazy wykładniczej w stosunku 1:2 lub 1:4 pożywką w probówce o pojemności 1,7 ml przed załadowaniem do hemocytometru. Przy określaniu liczby komórek należy uwzględnić odpowiednio uwzględniony współczynnik rozcieńczenia. Po użyciu spryskać powierzchnie i hemocytometr rozcieńczonym wybielaczem (10%) i/lub 70% etanolem.
    UWAGA: Borrelia rośnie wykładniczo, gdy stężenie komórek wynosi 1-5 x 107 komórek/ml. W tym zakresie komórki dobrze rosną.
  9. Rozszerzona hodowla zuboży składniki odżywcze i zmieni pH podłoża, dlatego wymagana jest hodowla. W sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieść 1/10 objętości kultury do nowej probówki i napełnić ją nową pożywką (świeżą podwielokrotnością tej samej pożywki, która została użyta do wyhodowania poprzedniego pasażu). Optymalna jest rozcieńczenie 1:10. Jeśli objętość kultury ma zostać zmieniona, należy odpowiednio dostosować ilość inokulum i kontynuować inkubację. Liczba przejść zwiększa się z każdą zmianą medium.
  10. W celu ekstrakcji DNA lub izolacji komórek Borrelia, należy odwirować fazę wykładniczą Borrelia przez 10 minut przy 4000 x g w celu osadzenia bakterii. Usunąć sklarowany osad do odpowiednich odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Przetworzone bakterie w granulkach należy przetworzyć za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA lub ponownie zawiesić bakterie w odpowiednim podłożu do zamierzonego eksperymentu.
  11. Pod koniec każdej manipulacji wysterylizuj cały sprzęt etanolem i promieniowaniem UV, w zależności od sprzętu. Zbierz odpady płynne, w tym nadmiar kultur, do butelki na odpady i dodaj wybielacz do końcowego stężenia 10%. Umieść tę butelkę w temperaturze -80 °C przed wyrzuceniem. Alternatywnie, sterylizuj płynne odpady i kulturę bez wybielacza lub alkoholu przez autoklawowanie.

4. Długoterminowe przechowywanie kultur Borrelia

  1. Przygotowanie bulionu glicerolowego z hodowli Borrelia
    1. Weź ~1,8 ml porcji kultur fazowych wykładniczych, stężenia komórek ~107-10 8 komórek/ml i dodaj sterylny glicerol do końcowego stężenia 10% (stężenia 5%-20% działają).
    2. Umieścić w 2 ml zakręcanych fiolkach kriogenicznych. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Utrzymuj zapas z co najmniej 10 tubkami każdego szczepu w zamrażarce.
  2. Alternatywna receptura przechowywania w celu wytworzenia zapasu glicerolu do trwałego przechowywania
    1. Wymieszaj 2/3 kultury Borrelia z 1/3 15% glicerolu w bulionie z Brucelli. Użyj 2,8 g bulionu z brucelozy rozpuszczonego w 100 ml ddH2O, który był sterylnie przefiltrowany (0,22 μm).
    2. Przechowywać zapas glicerolu w próbkach w temperaturze od -70 °C do -80 °C.

5. Izolacja krętków od źródeł środowiskowych lub klinicznych

UWAGA: W przypadku izolowania materiału od ludzi, zwierząt lub środowiska, należy uzyskać odpowiednio certyfikat etyki badawczej, opieki nad zwierzętami lub ekologiczny.

  1. Uprawa Borrelia z kleszczy twardych
    1. Zbieraj dorosłe samice, samce i/lub kleszcze nimfalne.
    2. Wysterylizuj powierzchniowo wszystkie próbki kleszczy, zanurzając je w 70% etanolu na 2 minuty i susząc na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozbij pojedynczo na kilka kawałków za pomocą sterylnego skalpela. Umieść kawałki w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1,5 ml pożywki, uzupełnionej antybiotykami.
    3. Inkubować kultury w temperaturze 34 °C i sprawdzać obecność krętków za pomocą mikroskopii ciemnego pola lub mikroskopii z kontrastem fazowym dwa razy w tygodniu przez pierwsze 2 tygodnie, a następnie co tydzień przez 6 tygodni (częściej w przypadku krętków RF). Próbki dodatnie dla kultur subkulturowych w 5 ml tego samego podłoża.
      UWAGA: Zanieczyszczone kultury można do pewnego stopnia oczyścić przez filtrację za pomocą filtra 0,2 μm; Do całkowitego usunięcia zanieczyszczenia mogą być wymagane antybiotyki.
  2. Hodowla Borrelia z próbek krwi
    UWAGA: Próbka krwi powinna być pobrana przez wykwalifikowanego lekarza, lekarza weterynarii lub pracownika naukowego, w zależności od źródła materiału. Mniej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej powinno upłynąć między próbką
    usunięcie i przybycie do laboratorium.
    1. Uzyskać 10 ml krwi zebranej do szklanych probówek do pobierania krwi z kwaśnym roztworem dekstrozy cytrynianu (ACD; "żółta góra") jako antykoagulantu. Pozostaw w temperaturze pokojowej. Zaleca się, aby między pobraniem krwi a inokulacją upłynęło mniej niż 24 godziny.
    2. Odwirować krew z antykoagulantem przez 10 minut przy 200-400 x g, aby oddzielić osocze od komórek krwi.
    3. Delikatnie wyjąć osocze z probówki i zaszczepić 1 ml osocza w 5 ml podgrzanej pożywki MKP. MKP można suplementować antybiotykami. Inkubuj kultury w temperaturze 33 °C z codzienną kontrolą wzrokową i cotygodniową mikroskopią ciemnego pola lub mikroskopią z kontrastem fazowym, aż do zauważenia wzrostu borrelii (częściej w przypadku RF Borrelia), co może potrwać do 9 tygodni.
      UWAGA: W przypadku stosowania większych lub mniejszych objętości inokulacji, należy zachować stosunek 1:5 inokulantu do średniej. Używaj surowicy lub osocza, a nie krwi pełnej.
  3. Hodowla Borrelia z biopsji skóry
    1. Powierzchniowo wysterylizuj biopsję skóry (najlepiej kostkę o wymiarach 3 mm x 3 mm x 3 mm, tj. 70% etanolu i nadtlenku wodoru). Umieścić próbkę z biopsji w soli fizjologicznej.
      UWAGA: Próbka biopsji powinna być pobrana przez wykwalifikowanego lekarza, lekarza weterynarii lub pracownika naukowego, w zależności od źródła materiału. Mniej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej powinno upłynąć między pobraniem próbki a przybyciem do laboratorium.
    2. Pokrój próbkę na dwa do sześciu mniejszych kawałków za pomocą sterylnej żyletki na sterylnej szklanej szalce Petriego, zanurzonej w soli fizjologicznej. Przenieść wszystkie próbki i ~1 ml soli fizjologicznej, w której przechowywano biopsję skóry, do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki uzupełnionej antybiotykami i inkubować w temperaturze 33 °C.
    3. W przypadku nadmiernego rozrostu bakterii skażających, dodać antybiotyki, jak w kroku 1.1.10 powyżej, lub dodając dwie tabletki sulfametoksazolu (23,75 mg; końcowe stężenie 5 mg/ml) + trimetoprim (1,25 mg; 0,25 mg/ml) lub Bactrim (minimalne stężenie hamujące >128 μg/ml), dwie tabletki amikacyny (2 x 30 μg; końcowe stężenie 12 μg/ml), oraz dwie tabletki fosfomycyny (2 x 200 μg; końcowe stężenie 80 μg/ml).
      UWAGA: We wszystkich przypadkach należy pamiętać o pozostaniu poniżej minimalnego stężenia hamującego tego antybiotyku dla gatunku Borrelia, dla którego próbuje się wyhodować 41,42,43.
    4. Jeśli posiew jest dodatni dla Borrelia, trzymaj posiew przez dodatkowe 3-4 dni lub do momentu, gdy ilość Borrelia osiągnie 10+ krętków w polu mikroskopowym przy użyciu obiektywu 40X. Utwórz zapas glicerolu do trwałego przechowywania.

6. Izolacja monoklonalnych populacji krętków B. burgdorferi sensu lato i B. miyamotoi z kultur płynnych poprzez uprawę na podłożach stałych

  1. Do przygotowania płytek należy podgrzać 300 ml kompletnej pożywki 1,5X MKP (bez żelatyny). Podgrzej również 200 ml 1,7% agarozy (autoklawizowanej w wodzie dejonizowanej, przechowywanej w temperaturze pokojowej i podgrzewanej w kuchence mikrofalowej przed użyciem) do 55 °C. Wymieszaj oba płyny.
  2. Odpipetować 15 ml tej mieszaniny do każdej z 16 głębokich szalek Petriego, aby uzyskać dolną warstwę agaru.
  3. Pozostałą część podłoża należy zatrzymać w temperaturze 55 °C w łaźni wodnej.
    UWAGA: Borrelia jest mieszana z wierzchnią warstwą agarozy.
  4. Najpierw określ ilościowo gęstość kultury Borrelia za pomocą hemocytometru i rozcieńcz do pożądanej gęstości w płynnym podłożu.
    UWAGA: 500, 200, 100 i 50 krętków na płytkę działa dobrze.
  5. Po zestaleniu się dolnych płytek dodać 10 ml pozostałej mieszaniny agarozy do 15 ml probówki zawierającej odpowiednią liczbę krętków.
  6. Wylej zawiesinę na dolną agarozę na oznaczoną szalkę Petriego.
    UWAGA: Ponieważ krętki Borrelia są wrażliwe na wysoką temperaturę, należy zadbać o to, aby bakterie nie były wystawione na działanie temperatury 55 °C przez dłuższy czas; Wlej górny agar natychmiast po dodaniu go do komórek bakteryjnych w pożywce.
  7. Po całkowitym zestaleniu się płytek zamknij szalki Petriego i umieść je do góry nogami w temperaturze 34-35 °C w 2,5% CO2,
    UWAGA: Kolonie pojawią się 1 tydzień po posiewie, jeśli zabieg się powiedzie.
  8. Aby przesiać i namnażać poszczególne kolonie, wybierz pojedyncze kolonie z płytek i umieść je w 1,5 ml zmodyfikowanego płynnego MKP lub innej odpowiedniej pożywki w sterylnych probówkach hodowlanych o pojemności 2 ml.
  9. Inkubować kultury w temperaturze 34 °C i badać na obecność krętków za pomocą mikroskopii ciemnego pola lub mikroskopii fazowej. Użyj tych kultur do analizy lub zapasów, wykonanych zgodnie z powyższym opisem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Borrelia pożywki BSK i MKP oraz ich warianty to bogate pożywki hodowlane, których składniki muszą być przygotowywane i sterylizowane sekwencyjnie. Prawidłowo przygotowana pożywka BSK powinna mieć kolor czerwono-pomarańczowy i być klarowna (Rysunek 1). Mętność i wytrącanie osadu, które utrzymują się po ogrzaniu, wskazują na problematyczne składniki, błędy w przygotowaniu pożywki lub kontaminację; taką pożywkę najlepiej zutylizować. Jeśli do BSK oraz MKP dodano żelatynę, pożywka w tem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Laboratoryjna hodowla bakterii jest trampoliną do badań. O głębokiej przewadze, jaką daje zdolność do hodowli, świadczy trwająca ponad sto lat walka, która dopiero niedawno zakończyła się sukcesem, z hodowlą Treponema pallidum, krętka, który jest czynnikiem etiologicznym kiły44. Krętki Borrelia są również wyzwaniem dla kultury, ale kultura jest możliwa 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Kanadyjską Radę Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz Kanadyjską Fundację Choroby z Lyme (AB i VL), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (SB, M-LF i IN), PROJEKT TAČR GAMA 2 - "Wsparcie weryfikacji potencjału aplikacji 2.0 w Centrum Biologii CAS" (TP01010022) (MG i NR), oraz przez grant z Ministerstwa Zdrowia Republiki Czeskiej NV19-05-00191 (MG i NR). Dziękujemy S. Vranjesowi (2021, Rudenko lab) za zdjęcie na rysunku 4 i J. Thomasowi-Ebbettowi (2021, Lloyd lab) za zdjęcia na rysunku 5. Dziękujemy wszystkim badaczom, którzy przyczynili się do rozwoju tej dziedziny i przepraszamy tych, których prac nie mogliśmy zacytować ze względu na ograniczenia przestrzenne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,7 mlVWR87003-294Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
0,2  &mikro; m Sterylny filtr strzykawkowy VWR28145-501Pozycja standardowa - każdy dostawca wykona
10 &mikro; Barierowa końcówka do pipet LNeptunBT10XLS3Standardowa pozycja - każdy dostawca wykona
pipety serologiczne 10 ml Celltreat229011BStandardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
1000 &mikro; Końcówka do pipety barierowej LNeptuneBT1000.96Standardowa pozycja - każdy dostawca wykona
probówkę 15 mlCelltreat188261Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
20 i mikro; Końcówka do pipety barierowej LNeptuneBT20Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
20 ml sterylnej strzykawki BD309661Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
200 &mikro; Końcówka do pipet barierowych LNeptuneBT200Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
25 ml probówek hodowlanych z zakrętkąFisher Scientific14-933CStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
pipety serologiczne 25 mlCelltreat229025BStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
3 ml sterylnej strzykawkiBD309657Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
35% BSA SigmaA-7409Źródło jest ważne - patrz uwaga
Pipety serologiczne 5 ml Celltreat229006BStandardowy przedmiot - każdy dostawca wykona
tubkę 50 mlCelltreat229421Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona
szklane probówki MKP o pojemności 6,5 ml SchottSchott Nr. 26 135 115Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
AmikacineSigmaPHR1654Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
Amfoterycyna BSigmaA9528-100MGPozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
Bactrim / rimethoprim / sulfametoksazolSigmaPHR1126-1GPozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
bulion BBL Brucella BD211088Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoLabconco302419100Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Probówki do pobierania krwi (żółta góra - ACD)Fisher ScientificBD  Szklane probówki do pobierania krwi Vacutainer z kwaśnym roztworem cytrynianu i dekstrozy (ACD)Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
BSK-H Medium [w 6% surowicy króliczej] Darlynn biologsBB83-500Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
wirówkę Eppendorfmodel 5430Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Kwas cytrynowy TrisodiumDihydrateSigmaC-8532 100 gStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
CMRLGibco BRL21540 500 mLStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
CMRL-1066Gibco21-510-018Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Rurki kriogeniczne (Nalgene)Fisher Scientific5000-0020Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
Deep Petri z pierścieniem do układania w stos 100 mm i razy; 25 mmSigmaP7741Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
Cyfrowy inkubatorVWRmodel 1545Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
DMSOThermoFisherD12345Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
Filtry do sterylizacji filtraMilipory 0,22 mu; m Membrana GPExpressPLUSSCGPU05REStandardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
ŻelatynaDifco BD214340 500 gStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Szklane probówki hodowlaneFisher Scientific99449-20Standardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
GlukozaSigmaG-7021 1 kgStandardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
GlycerolSigmaG5516Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona
Hemafuge (Hematocrit & Wirówka immunohematologiczna )LabwissenModel 3220Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
HEPESSigma H-3784 100 gStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
N-acetyloglucoseamineSigma A-3286 25 gPozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
NeopeptoneDifco  BD211681 500 gStandardowa pozycja - każdy dostawca zrobi
Neubauer HematocytometerSigma Z359629Standardowy przedmiot - każdy dostawca wykona
mikroskop z kontrastem fazowym Standardowy przedmiot Leitz- każdy dostawca wykona
PhosphomycinSigmaP5396-1GStandardowy przedmiot - każdy dostawca wykona
PhosphomycineSigmaP5396Standard pozycja - każdy dostawca wykona
PipetboyIntegraStandardowa pozycja - każdy dostawca wykona
Precyzyjna waga standardowaOHAUSmodel TS200SStandardowy przedmiot - dowolny dostawca zrobi
Kwas pirogronowy (Na sól)SigmaP-8574 25 gStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Surowicę królika Gibco16-120-032Źródło jest ważne 
Serum dla królika SigmaR-4505  100 mLŹródło jest ważne 
RyfampicynaSigmaR3501-1GStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Wodorowęglan soduSigmaS-5761        500 gStandardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
Sufametaxazol SigmaPHR1126Standardowy przedmiot - każdy dostawca zrobi
TC YeastolateDifco  BD255752 100 gPozycja standardowa - zrobi to każdy dostawca
Pipety transferoweVWR470225-044Pozycja standardowa - każdy dostawca zrobi
TrimethoprimSigmaPHR1056Standardowy przedmiot - każdy dostawca to zrobi

Bibliografia

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54(2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432(2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397(2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268(2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587(2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089(2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622(2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309(2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090(2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188(2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153(2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127(2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66(2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865(2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16(2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926(2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766(2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638(2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386(2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87(2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33(2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554(2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Hodowla Borreliahodowla krętkówpodłoże BSK-IIzmodyfikowane podłoże Kelly’ego-Pettenkoferaizolacja z kleszczymikroskopia fazowo-kontrastowamikroskopia w ciemnym poluinterakcja gospodarz-patogen
Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.