Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu potrójnej hodowli komórkowej bariery krew-mózg na podstawie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów ludzkiego mózgu. Ten wielokomórkowy model nadaje się do badań dysfunkcji jednostek nerwowo-naczyniowych podczas udaru niedokrwiennego in vitro lub do badań przesiewowych kandydatów na leki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar niedokrwienny jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie, z ograniczonymi możliwościami terapeutycznymi. Neuropatologia udaru niedokrwiennego charakteryzuje się przerwaniem dopływu krwi do mózgu, co prowadzi do śmierci komórki i dysfunkcji poznawczych. W trakcie i po udarze niedokrwiennym dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) ułatwia postęp urazu i przyczynia się do słabej rekonwalescencji pacjenta. Obecne modele BBB obejmują przede wszystkim monokultury śródbłonka i podwójne kokultury z astrocytami lub perycytami.
Takie modele nie są w stanie w pełni naśladować dynamicznego mikrośrodowiska mózgu, co jest niezbędne do komunikacji między komórkami. Ponadto powszechnie stosowane modele BBB często zawierają unieśmiertelnione ludzkie komórki śródbłonka lub hodowle komórek pochodzenia zwierzęcego (gryzoni, świń lub bydła), które stanowią ograniczenia translacyjne. W artykule opisano nowatorski model BBB oparty na dobrze wstawionej, zawierający tylko pierwotne komórki ludzkie (komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, astrocyty i perycyty naczyń mózgowych), umożliwiający badanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu in vitro.
Wpływ deprywacji tlenu i glukozy (OGD) na integralność bariery został oceniony przez pasywną przepuszczalność, pomiary przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i bezpośrednią wizualizację niedotlenionych komórek. Prezentowany protokół oferuje wyraźną zaletę, naśladując środowisko międzykomórkowe BBB in vivo, służąc jako bardziej realistyczny model BBB in vitro do opracowywania nowych strategii terapeutycznych w warunkach niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.
Wprowadzenie
Udar mózgu jest jedną z głównych przyczyn zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie1. Częstość występowania udaru mózgu gwałtownie wzrasta wraz z wiekiem, podwajając się co 10 lat po ukończeniu 55 roku życia2. Udar niedokrwienny występuje w wyniku zakłócenia przepływu krwi w mózgu z powodu zdarzeń zakrzepowych i zatorowych, co obejmuje ponad 80% wszystkich przypadków udaru3. Nawet obecnie dostępnych jest stosunkowo niewiele opcji leczenia w celu zminimalizowania obumarcia tkanek po udarze niedokrwiennym. Terapie, które istnieją, są wrażliwe na czas i w konsekwencji nie zawsze prowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich linii komórkowych, materiałów, sprzętu i roztworów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie potrójnego modelu hodowli komórkowej BBB
- Wysiewanie perycytów
- Hodować HBVP w kolbach hodowlanych T75 z powierzchnią aktywowaną do adhezji komórek w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C aż do uzyskania konfluencji. Po osiągnięciu konfluencji odessać stare podłoże do perycytów i przemyć komórki 5 mL ciepłego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS). Odessać DPBS i odłąc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zbadać wpływ astrocytów i pericytów na funkcję barierową HBMEC, skonstruowano trójskładnikowy model hodowli komórkowej BBB na insertach do hodowli komórkowej (Rysunek 1A) wraz z monokulturą HBMEC oraz dwoma modelami kokultury jako kontrolami (Rysunek 1B). Kontrole kokultury dwuskładnikowej obejmowały kokulturę bezkontaktową HBMEC z HA oraz kokulturę kontaktową HBMEC z HBVP. Po 6 dniach kokultury wszystkie układy eksperymentalne poddano OGD przez 4 h. Integra.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy metodę tworzenia wiarygodnego modelu hodowli BBB z potrójnym śródbłonkiem komórek-perycytów-astrocytów do badania dysfunkcji BBB w warunkach udaru niedokrwiennego in vitro. Biorąc pod uwagę, że perycyty są najbliższymi sąsiadami komórek śródbłonka in vivo, HBVP są posiane na spodniej stronie wkładów studzienek w tym modelu16. Chociaż w tej konfiguracji brakuje bezpośredniej komunikacji międzykomórkowej między astrocytami a komórkami śródbłonka, ten układ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy ujawnili, że nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 i DA047157.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Transwell 24 mm z 0,4 i mikro; m Wkładka membrany poliestrowej z porami | Corning | 3450 | |
| 35 mm Naczynia ze szklanym dnem | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyty Medium | Science Cell | 1801 | |
| czynnika przyczepu | (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Strzykawka | BD | 309653 | |
| Obrazowanie BrainPhys Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium z serum i CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Probówki wirówkowe Corning 50 ml PP (stożkowe dno z nasadką CentriStar | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U bez obróbki szyjki | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-dołkowa płaska przezroczysta dolna mikropłytki polistyrenowe | Corning | 3340 | |
| Countes Szkiełka komory do liczenia komórek | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automatyczny licznik komórek | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Roztwór alkoholu izopropylowego | Fisher Naukowy | 04-355-71 | |
| Jednorazowe szalki Petriego | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Podłoże (bez glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej) | ThermoFisher | A14430-01 | Pożywka bez glukozy |
| DPBS (bez wapnia, bez magnezu) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Podłoże podstawowe do wzrostu komórek śródbłonka, bez czerwieni fenolowej, 500 ml | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Nabłonkowy woltomierz/omomierz (TEER) z elektrodami STX2 | World Precison Instruments | NC9792051 | Woltomierz nabłonkowy |
| Izotiocyjanian fluoresceiny– Dekstran (20 000 wag.) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Izotiocyjanian fluoresceiny– Dekstran (WT 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Mikroskop konfokalny | Zbiornik gazu Olympus | FV3000 | |
| (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg / ml roztwór w wodzie | ThermoFisher | H3570 | |
| Ludzkie astrocyty | Science Cell | 1800 | |
| Perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu Komórka naczyniowa Komórka | naczyniowa 1200 | ||
| Komora inkubatora hipoksji | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Odczynnik do hipoksji Image-iT | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Pierwotne mikronaczyniowe komórki śródbłonka ludzkiego mózgu | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Wytrząsarka z platformą kołyszącą, podwójna | VWR | 10860-658 | |
| STEMCELL Technologies | 27311 | ||
| Czytnik mikropłytek SpectraMax iD3 | Urządzenia molekularne | 75886-128 | |
| Filtr strzykawkowy, 25 mm, 0,22 μ m, PVDF, sterylne | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Płytki wielodołkowe (6 dołków) | Kolby do | ||
| TPP Kolby T-75 Kolby | MidSci | TP90075 | z aktywowaną powierzchnią do adhezji komórek |
| Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Destylowana woda | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Inkubator Uno Stage-Oko | Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
Bibliografia
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38(2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
