Method Article

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

DOI:

10.3791/64475

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady chrząstki stawu kolanowego spowodowane urazem są częstym urazem stawu sportowego w klinice, a te wady powodują bóle stawów, zaburzenia ruchomości i ostatecznie chorobę zwyrodnieniową stawu kolanowego (kOA). Jednak skuteczność leczenia ubytków chrząstki, a nawet kOA, jest niewielka. Modele zwierzęce są ważne dla opracowywania leków terapeutycznych, ale istniejące modele wad chrząstki są niezadowalające. W pracy tej ustanowiono model ubytków chrząstki o pełnej grubości (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku ślimakowym kości udowej szczurów, a późniejsze zachowanie bólowe i zmiany histopatologiczne wykorzystano jako eksperymenty odczytowe. Po operacji obniżył się mechaniczny próg wycofania, utracono chondrocyty w uszkodzonym miejscu, zwiększono ekspresję metaloproteinazy macierzy MMP13 i zmniejszyła się ekspresja kolagenu typu II, co jest zgodne ze zmianami patologicznymi obserwowanymi w ubytkach chrząstki ludzkiej. Metodologia ta jest łatwa i prosta do wykonania oraz umożliwia obserwację kliniczną bezpośrednio po urazie. Co więcej, model ten może z powodzeniem naśladować kliniczne ubytki chrząstki, stanowiąc w ten sposób platformę do badania patologicznego procesu ubytków chrząstki i opracowywania odpowiednich leków terapeutycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chrząstka stawowa to wysoce zróżnicowana i gęsta tkanka składająca się z chondrocytów i macierzy zewnątrzkomórkowej1. Warstwa powierzchniowa chrząstki stawowej jest formą chrząstki szklistej, która ma gładką powierzchnię, niskie tarcie, dobrą wytrzymałość i elastyczność oraz doskonałą tolerancję na naprężenia mechaniczne2. Macierz zewnątrzkomórkowa składa się z kolagenu, proteoglikanu i wody, a kolagen typu II jest głównym składnikiem strukturalnym kolagenu, ponieważ stanowi około 90% całkowitego kolagenu3. Ponieważ w tkance chrzęstnej nie ma naczyń krwionośnych ani nerwów, nie ma ona zdolności do samonaprawy po urazie4. Dlatego ubytki chrząstki spowodowane urazem zawsze były nieuleczalną chorobą stawów w klinikach; Ponadto ta choroba stawów ma tendencję do dotykania młodych ludzi, a globalna częstość występowania rośnie5,6. Staw kolanowy jest najczęstszym miejscem występowania ubytków chrząstki, a ubytkom towarzyszą tutaj bóle stawów, dysfunkcja stawów i zwyrodnienie chrząstki stawowej, co ostatecznie prowadzi do choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego (kOA)7. Ubytki chrząstki stawu kolanowego stanowią obciążenie ekonomiczne i fizjologiczne dla pacjentów oraz poważnie wpływają na jakość życia pacjentów8. Choroba ta stanowi poważne i pilne wyzwanie kliniczne, które nie ma rychłych rozwiązań. Obecnie chirurgia jest podstawą leczenia ubytków chrząstki, ale jej długoterminowe wyniki pozostają niezadowalające9.

Kliniczne wady chrząstki ostatecznie prowadzą do kOA, dlatego modele zwierzęce kOA są powszechnie używane do patologicznego badania wad chrząstki i opracowywania leków. Stworzenie modeli zwierzęcych jest ważne dla zrozumienia patofizjologicznego procesu naprawy ubytków chrząstki, które można wykorzystać do obserwacji regeneracji chrząstki i zmian między chrząstką włóknistą a chrząstką szklistą10. Jednak powszechnie stosowane modele zwierzęce kOA, takie jak chirurgiczne modele przecięcia więzadła krzyżowego przedniego (ACLT), destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM), owariektomii (OVX) i Hulth, zwykle wymagają długoterminowego modelowania i pozwalają jedynie na oceny patologiczne i bólowe, co stwarza ograniczenia dla efektywności opracowywania leków11. Oprócz modeli chirurgicznych, modele chemiczne, takie jak monojodooctan (MIA) i wstrzyknięcie papainy, również powodują ubytki chrząstki, ale stopień wady nie może być dobrze kontrolowany, a warunki są dalekie od rzeczywistości klinicznej11. Kolizja to inne podejście do modelowania wad chrząstki u większych zwierząt, ale ta metoda zależy od użycia konkretnych instrumentów i jest rzadko stosowana12.

Podsumowując, istniejące modele kOA nie są idealne do badania patogenezy wad chrząstki lub opracowywania nowych leków, a potrzebny jest specyficzny i ustandaryzowany model dla wad chrząstki. W badaniu tym ustanowiono model ubytków chrząstki o pełnej grubości (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej u szczurów. Przeprowadzono obserwację ogólną, testy zachowania bólu i analizę histopatologiczną w celu oceny modelu. W przeciwieństwie do innych zwierzęcych modeli kOA, ten model ma niewielki wpływ na ogólny stan szczurów. To podejście do modelowania jest dostępne, można nim dobrze zarządzać i pomaga zrozumieć postęp od ubytków chrząstki do kOA oraz opracować skuteczne metody leczenia. Model ten może być również wykorzystany do testowania terapii, które zapobiegają kOA poprzez leczenie defektów w stawach przedzwyrodnieniowych stawów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Standardów Medycznych i Etyki Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Zhejiang, który jest zgodny z chińskim ustawodawstwem dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. W niniejszym badaniu wykorzystano 6-tygodniowe samce szczurów rasy Sprague-Dawley (SD) o wadze 150-180 g. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Opracowanie modelu pełnogrubych wad chrząstki u szczurów

  1. Po 1 tygodniu aklimatyzacji do nowego środowiska losowo i równo podziel szczury na dwie grupy (n = 8 szczurów/grupę). Szczury w grupie pozorowanej zostaną poddane operacji pozorowanej, podczas gdy szczury w grupie modelowej zostaną poddane eksperymentalnej operacji polegającej na wierceniu otworów w rowku bloczkowym kości udowej.
    UWAGA: Każda klatka musi być pokryta sterylną wyściółką z kolb kukurydzy (patrz tabela materiałów) w celu ochrony palców u nóg szczurów.
  2. Znieczulić szczury przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) pentobarbitalu sodu (40 mg / kg). Następnie delikatnie naciśnij palce u nóg szczurów, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie. Użyj maści weterynaryjnej na oczy szczurów, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Operacja na zwierzętach musi być wykonywana w dedykowanej sali operacyjnej przy użyciu autoklawowanych narzędzi chirurgicznych. Podczas operacji operatorzy muszą nosić czyste fartuchy laboratoryjne, maski na twarz, nakrycia głowy i sterylne rękawice. Umieść sterylne podkładki na obszarze operacyjnym i wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem. Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu.
  3. Umieść szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej, ogol lewą i prawą tylną kończynę i oczyść obszar stawu kolanowego mydłem chirurgicznym, a następnie naprzemiennie powidonowo-jodowym roztworem i alkoholem trzy razy w sterylnych warunkach. Umieść sterylną serwetę na szczurze i odsłoń tylko zdezynfekowany staw kolanowy.
  4. Wykonaj 1 cm nacięcie ostrzem skalpela (numer 11) w środku stawu kolanowego szczura od góry do dołu i przetnij torebkę stawową i ścięgno mięśnia czworogłowego uda wzdłuż przyśrodkowej krawędzi rzepki po powierzchownym rozwarstwieniu.
    UWAGA: Ścięgno mięśnia czworogłowego uda jest przyczepione do rzepki i kłykcia kości udowej podczas zgięcia stawu kolanowego13. Rowek widoczny w torebce stawowej to rowek bloczkowy kości udowej, a dystalny kłykieć kości udowej tworzy kłykcie przyśrodkowe i boczne.
  5. Obróć rzepkę na zewnątrz i zegnij kość piszczelową i strzałkową pod kątem 90°, aby w pełni odsłonić bloczek kłykcia kości udowej. Za pomocą wiertła okrągłego o średnicy 1,6 mm (patrz tabela materiałów) pionowo do powierzchni chrząstki z prędkością 4 000 obr./min przez 10 sekund, wykonać jeden ubytek chrząstki o pełnej grubości w rowku bloczkowym kości udowej o głębokości 0,1 mm.
    UWAGA: Używaj soli fizjologicznej z przerwami, aby zminimalizować uraz termiczny otaczającej tkanki kostnej podczas procedury wiercenia.
  6. Przetrzyj pole operacyjne wacikami nasączonymi 0,9% roztworem soli fizjologicznej, wymień rzepkę, utrzymuj kolano w pozycji wyprostowanej i zszyj nacięcie warstwa po warstwie niewchłanialnymi szwami 4-0 (patrz Tabela materiałów).
    1. Umieść zwierzęta na poduszkach grzewczych z leżeniem mostkowym, monitoruj je, aż się obudzą, a następnie włóż je z powrotem do klatek. Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie co 8 godzin trzy razy po operacji w celu złagodzenia bólu.
  7. Przetestuj zachowanie związane z bólem u wszystkich szczurów po 3 dniach, 10 dniach i 17 dniach po operacji, jak opisano w sekcji 2.

2. Mechaniczny próg wycofania (MWT)

UWAGA: MWT obustronnej tylnej podeszwy szczurów zostało zmierzone za pomocą klasycznej metody pomiaru bólu włókna von Freya14.

  1. Umieść szczura w pojedynczej plastikowej komorze (17 cm x 11 cm x 13 cm) na platformie z siatki drucianej (patrz Tabela materiałów) i umieść podstawę z siatki drucianej 50 cm nad stołem. Zmierz MWT po 30 minutach adaptacji.
  2. Dociśnij filament von Freya (patrz Tabela Materiałów) prostopadle do podeszwowej powierzchni tylnej łapy każdego szczura i zegnij szczotkę na około 2 sekundy, omijając najgrubszą część środka tylnej łapy.
  3. Stopniowo zwiększaj masę bodźca od najniższych 4 g, aż do wystąpienia pozytywnej odpowiedzi (wycofanie łapy lub lizanie łapy).
    UWAGA: Przerwa między każdą stymulacją powinna być większa niż 1 minuta. MWT definiuje się jako trzy pozytywne odpowiedzi w pięciu stymulacjach; Zapisz masę bodźca w gramach.
  4. Obliczyć średnie wartości dla grup pozorowanych i modelowych zgodnie z zarejestrowaną minimalną masą bodźca w gramach.

3. Analiza histopatologiczna i immunohistochemiczna

  1. Po 17 i 56 dniach od operacji znieczulij szczury pentobarbitalem sodu w dawce 40 mg/kg i poświęć wszystkie szczury, pobierając krew z serca. Odizoluj kolana, przecinając kość w środkowej części kości udowej i środkowej kości piszczelowej, a następnie wypreparuj otaczającą tkankę mięśniową. Usuń stawy kolanowe do analizy histologicznej.
  2. Utrwalić stawy kolanowe w 20 ml 10% roztworu paraformaldehydu przez 48 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie odwapnić je 20 ml 10% roztworu EDTA w wytrząsarce orbitalnej przez 8 tygodni w temperaturze 4 °C. Zmieniaj roztwór EDTA codziennie.
  3. Przytnij staw kolanowy, aby pasował do rozmiaru pudełka do zatapiania. Zanurz odwodnione stawy kolanowe w 100% parafinie15.
  4. Umieść zatopione w parafinie stawy kolanowe na uchwycie mikrotomu, wyreguluj kąt i przytnij próbkę parafiny ostrzem, aż powierzchnia będzie płaska.
  5. Ustawić grubość plastrów parafiny na 3 μm i spłaszczyć plastry w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C.
  6. Przyklej plastry na szkiełkach szkiełkowych, umieść je w maszynie do pieczenia w temperaturze 45 °C (patrz Tabela Materiałów) do wyschnięcia i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  7. Deparafinowanie i ponowne nawodnienie: Plastry należy odparafinować w piecu w temperaturze 60 °C przez 4 godziny, a następnie umieszczać plastry kolejno w 100% ksylenie (trzy razy), 100% etanolu (dwa razy), 95% etanolu, 80% etanolu i 75% etanolu przez 5 minut za każdym razem.
  8. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
    1. Odwoskuj, nawodnij i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    2. Plastrach barwić 0,5% hematoksyliną (patrz tabela materiałów) przez 3 minuty i myć plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastra nie będzie pozostałości hematoksyliny.
    3. Zanurz plastry w 1% alkoholu kwasu solnego na 3 s i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    4. Namocz plastry w 1% wodzie amoniakalnej przez 10 s i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    5. Plamić plastry eozyną (patrz Tabela materiałów) przez 1 minutę i myć plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości eozyny.
    6. Zanurz plastry w 95% etanolu, 100% etanolu i 100% ksylenie (trzy razy) kolejno na 1 minutę za każdym razem.
    7. Dodaj kroplę neutralnej żywicy (patrz Tabela materiałów) do każdego plasterka i uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym.
  9. Barwienie Safranin O/Fast Freen (SO)
    1. Odwoskuj, nawodnij i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    2. Plastraj plastry 0,05% Fast Green (patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty i myj plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości Fast Green.
    3. Zanurz plastry w 1% roztworze kwasu octowego na 10 s i myj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    4. Plamić plastry 2,5% SO (patrz Tabela Materiałów) przez 2 minuty, a następnie umyć plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości SO.
    5. Zanurz plastry w 95% etanolu, 100% etanolu i 100% ksylenie (trzy razy) kolejno na 1 minutę za każdym razem.
    6. Dodaj kroplę neutralnej żywicy do każdego plasterka i zamknij go szkiełkiem nakrywkowym.
  10. Barwienie błękitem toluidynowym (TB)
    1. Odwoskuj, nawodnij i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    2. Zanurz plastry w 1% roztworze TB (patrz tabela materiałów) na 2 minuty i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości błękitu toluidynowego.
    3. Zanurz plastry w 95% etanolu, 100% etanolu i 100% ksylenie (trzy razy) kolejno na 1 minutę za każdym razem.
    4. Dodaj kroplę neutralnej żywicy do każdego plasterka i zamknij go szkiełkiem nakrywkowym.
  11. Barwienie Massona
    1. Odwoskuj, nawodnij i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    2. Dodawać kroplami roztwór Bouina (patrz Tabela Materiałów) do plastrów, barwić je w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i myć wodą podwójnie destylowaną, aż zniknie żółty kolor na powierzchni plastrów.
    3. Plamić plastry błękitem celestytowym (patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty i myć plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości błękitu celestytu.
    4. Plamić plastry hematoksyliną przez 3 minuty i myć plastry podwójnie destylowaną wodą, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości hematoksyliny.
    5. Zanurz plastry w kwaśnym etanolu na 5 s i umyj je wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    6. Plastry barwić puksem (patrz Tabela Materiałów) przez 10 minut, a następnie myć plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości puksyny.
    7. Zanurz plastry w kwasie fosfomolibdenowym (patrz Tabela Materiałów) na 10 minut, następnie zanurz je w roztworze gruźlicy na 5 minut i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną, aż na powierzchni plastrów nie będzie pozostałości gruźlicy.
    8. Zanurz plastry w roztworze słabego kwasu na 2 minuty i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    9. Zanurz plastry w 95% etanolu, 100% etanolu i 100% ksylenie (trzy razy) kolejno na 1 minutę za każdym razem.
    10. Dodaj kroplę neutralnej żywicy do każdego plasterka i zamknij go szkiełkiem nakrywkowym.
  12. Obserwuj wszystkie plastry pod mikroskopem w podwójnie ślepej próbie, aby określić stopień zwyrodnienia chrząstki stawowej zgodnie z systemem punktacji Mankina16.
  13. Immunohistochemia
    1. Rutynowo odwoskuj i ponownie nawodnij plastry, a następnie umyj plastry PBS przez 2 minuty.
    2. Zanurz plastry w roztworze cytrynianu sodu i umieść je w piekarniku o temperaturze 60 °C na 4 godziny w celu naprawy antygenu. Umyj plastry PBS trzy razy po 3 minuty każdy.
    3. Zanurz plastry w 0,3% roztworze Triton X-100 na 10 minut i umyj plastry dwukrotnie PBS za każdym razem przez 3 minuty.
    4. Zablokuj endogenną aktywność peroksydazy, dodając 3% roztwórH2O2w metanolu w temperaturze pokojowej przez 30 min. Umyj plastry dwukrotnie PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    5. Inkubować skrawki z 5% surowicą kozią w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązanie. Umyj plastry dwukrotnie PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    6. Dodać 100 μl rozcieńczonych PBS przeciwciał pierwszorzędowych (anty-col1, 1:50; anty-col3, 1:50; anty-col2, 1:100; i anty-MMP13, 1:100; patrz tabela materiałów) do każdej warstwy i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C. Za każdym razem myć plastry dwukrotnie PBS przez 3 minuty.
    7. Inkubować każdą cząstkę ze 100 μl rozcieńczonego PBS (1:100) przeciwciała drugorzędowego (koziego anty-królika lub koziego anty-myszy, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umyj plastry dwukrotnie PBS przez 3 minuty za każdym razem.
    8. Dodać 100 μl roztworu roboczego 3,3'-diaminobenzydyny (DAB, patrz tabela materiałów) do każdego plasterka.
    9. Obserwuj i zapisuj czas pojawiania się brązowego koloru pod mikroskopem; reakcja chromogenna zmienia miejsca epitopów na brązowe17. Pozostałe próbki należy traktować z zachowaniem tego samego zarejestrowanego czasu reakcji.
    10. Gdy plastry zbrązowieją, umyj je dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną przez 3 minuty za każdym razem.
    11. Ponownie zabarwiaj plastry hematoksyliną przez 1 minutę i myj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    12. Zanurz plastry w kwasie solnym na 3 sekundy i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    13. Namocz plastry w 1% wodzie amoniakalnej przez 10 s i umyj plastry wodą podwójnie destylowaną przez 2 minuty.
    14. Zanurz plastry w 95% etanolu, 100% etanolu i 100% ksylenie (trzy razy) kolejno na 1 minutę za każdym razem.
    15. Dodaj kroplę neutralnej żywicy do każdego plasterka i zamknij go szkiełkiem nakrywkowym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy stworzono szczurzy model FTCD, wiercąc otwory w rowku bloczkowym kości udowej i wykrywając późniejsze zachowanie bólowe i zmiany histopatologiczne. Jak pokazano na Rysunek 1, 3 dni po modelowaniu, w porównaniu z grupą pozorowaną, MWT szczurów w grupie modelowej był znacznie zmniejszony, co sugeruje hiperalgezję spowodowaną przez FTCD. Po 17 dniach od modelowania próg mechanicznego wycofania szczurów w grupie modelowej pozostał na niskim poziomie, co wskazuje, że uczulenie na ból ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym opisano model zwierzęcy do naśladowania klinicznych wad chrząstki poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów (rysunek uzupełniający 1). Po uszkodzeniu chrząstki zwiększa się pobudliwość lub reaktywność obwodowych nocyceptorów, co może skutkować obniżeniem progu bólu i zwiększeniem reakcji na stymulację18. W badaniach przedklinicznych modelowanie ubytków chrząstki u różnych gatunków zwierząt zawsze powodowało ból

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Zhejiang Natural Science Foundation (grant numer LQ20H270009), Natural Science Foundation of China (granty numer 82074464 i 82104890), Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (numery grantów 2020ZA039, 2020ZA096 i 2022ZB137) oraz Medical Health Science and Technology Project Komisji Zdrowia Prowincji Zhejiang (numer grantu 2016KYA196).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,3 '-diaminozydyna  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Sp. z o.o.ZLI-9019Barwnik do barwienia IHC
Przeciwciało anty-kolagenowe IIINovusNB600-594Przeciwciało pierwszorzędowe dla
przeciwciała IHC Anti-Collagen IIAbcam (UK)34712Przeciwciało pierwszorzędowe dla
przeciwciała IHC Anti-Collagen INovusNB600-408Przeciwciało pierwszorzędowe dla roztworu IHC
BouinShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381Barwnik do barwienia Masson
Celestite blueShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381Barwnik do barwienia
wyściółki z kolb kukurydzy Masson  Xiaohe Technology Co., Sp. z o.o. Ściółka dla zwierząt 
EosinSigma-Aldrich861006Barwnik do barwienia HE
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Barwnik do barwienia SO
Przeciwciało anty-mysie kozyZSGQ-BIO (Pekin, Chiny)PV-9002Przeciwciało drugorzędowe dla
przeciwciała przeciw królikowi IHC GoatZSGQ-BIO (Pekin, Chiny)PV-9001Przeciwciało drugorzędowe dla
hematosylinySigma-AldrichH3163Barwnik do barwienia HE
MassonShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381Barwnik do barwienia Masson
MicrodrillRwd Life Science Co., Ltd78001Sprzęt do chirurgii
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)69926Podstawowe przeciwciało dla IHC
Modułowe centrum zatapiania tkanekThermo Fisher Scientific (USA)EC 350Wyprodukuj bloki parafiny
Neutralna żywicaHangzhou Zhengbo Biotechnologia Co., Sp. z o.o.ZLI-9555Uszczelka do
niewchłanialnego szwuHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.4-0Sprzęt do operacji
Pentobarbital sodowy Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Sp. z o.o.WBBTN5GZnieczulony
zwierzęcy kwas fosfomolibdynowy Szanghaj Yuanye Technology Co., Sp. z o.o.R20381Barwnik do barwienia Masson
Ponceau fuchsinShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381Barwnik do barwienia Masson
Mikrotomy obrotowe i przesuwneThermo Fisher Scientific (USA)HM325Precyzyjne sekcje parafinowe
Safranin-OSigma-AldrichS2255Barwnik do barwienia SO
Ostrze skalpelaShanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.11Sprzęt do operacji
Roztwór cytrynianu sodu (20x)Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.Pobieranie antygenuHK1222
szczurów IHC Sprague Dawley (SD)  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.SDExperimental animal
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Japonia)Procesor infiltracji próżniowej
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640Barwnik do barwienia gruźlicy
Von Frey filamentUGO Basile (Włochy) 37450-275Sprzęt do oznaczania MWT
Platforma z siatki drucianej Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.Aparatura do oznaczania MWT
IHC IHC dla

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065(2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245(2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288(2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639(2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37(2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422(2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cartilage DefectsFull Thickness CartilageRat ModelKnee Joint InjuryFemoral CondylePain BehaviorHistopathological StainingChondrocyte LossType II CollagenMatrix Metalloproteinase MMP13

Related Articles