Opisano protokół czułego i ilościowego wykrywania aktywności topoizomerazy 1 za pomocą testu zwiększonej aktywności enzymatycznej w toczeniu koła. Metoda pozwala na wykrycie aktywności topoizomerazy 1 z oczyszczonych składników lub ekstraktów komórkowych/tkankowych. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach związanych z wykrywaniem aktywności enzymatycznej.
Artykuł metodologiczny
Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki oparte na amplifikacji izotermicznej, takie jak amplifikacja toczącego się koła, zostały z powodzeniem wykorzystane do wykrywania kwasów nukleinowych, ilości białek lub innych istotnych cząsteczek. Metody te okazały się istotną alternatywą dla PCR lub ELISA do zastosowań klinicznych i badawczych. Co więcej, wykrycie ilości białka (za pomocą Western blot lub immunohistochemii) jest często niewystarczające, aby dostarczyć informacji do diagnozy raka, podczas gdy pomiar aktywności enzymu stanowi cenny biomarker. Pomiar aktywności enzymów pozwala również na diagnozę i potencjalne leczenie chorób przenoszonych przez patogeny. U wszystkich eukariontów topoizomerazy są kluczowymi enzymami wiążącymi DNA, biorącymi udział w kontroli stanu topologicznego DNA podczas ważnych procesów komórkowych i należą do ważnych biomarkerów rokowania i leczenia raka.
Przez lata, topoizomerazy były intensywnie badane jako potencjalny cel leków przeciwpasożytniczych i przeciwnowotworowych z bibliotekami naturalnych i syntetycznych związków małocząsteczkowych, które są badane co roku. W tym miejscu przedstawiono metodę amplifikacji tocznego koła, zwaną testem wykrywania aktywności enzymatycznej wzmocnionej okręgiem toczącym się (REEAD), która pozwala na ilościowy pomiar aktywności topoizomerazy 1 (TOP1) w prosty, szybki i bezżelowy sposób. Poprzez rozszczepienie i ligacjację specjalnie zaprojektowanego substratu DNA, TOP1 przekształca oligonukleotyd DNA w zamknięty okrąg, który staje się matrycą do amplifikacji koła tocznego, dając ~103 produkty powtarzalnego koła toczenia w tandemie. W zależności od włączenia nukleotydu podczas amplifikacji, istnieje możliwość różnych metod odczytu, od fluorescencji, przez chemiluminescencję, po kolorymetrię. Ponieważ każda ligacja rozszczepienia za pośrednictwem TOP1 generuje jeden zamknięty krąg DNA, test jest bardzo czuły i bezpośrednio ilościowy.
Wprowadzenie
Topoizomerazy należą do klasy enzymów modyfikujących DNA, a wiele z nich okazało się użytecznych jako biomarkery chorób ludzkich1,2,3,4,5,6. TOP1 bierze udział w rozwiązywaniu stresu topologicznego związanego z procesami komórkowymi, takimi jak replikacja DNA, transkrypcja genów, rekombinacja i segregacja chromosomów7. TOP1 może rozwiązywać zarówno ujemne, jak i dodatnie supercewki za pomocą mechanizmu, który polega na tworzeniu przejściowego jednoniciowego pęknięcia w DNA8,9. Po związaniu się z DNA, TOP1 pozycjonuje miejsce aktywne tyrozynę (Tyr723) do przeprowadzenia ataku nukleofilowego na szkielet fosfodiestru. Następnie generowany jest kompleks rozszczepienia TOP1-DNA z enzymem kowalencyjnie przyłączonym do końca 3' uszkodzonej nici DNA. Powoduje to uwolnienie naprężeń skrętnych, umożliwiając 5'-punktowemu zakończeniu rozszczepionego pasma obracanie się wokół nienaruszonego pasma. Wreszcie grupa hydroksylowa końca 5' wykonuje atak nukleofilowy na wiązanie 3'-fosfotyrozylowe. W rezultacie, TOP1 zostaje uwolniony, a szkielet DNA zostaje przywrócony8.
Opracowano kilka testów do badania etapów cyklu katalitycznego TOP1, w tym test relaksacyjny10, test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)11,12, testy rozszczepienia i ligacji DNA samobójstwa13,14, oraz test enzymów in vivo (ICE)15. Testy te mają jednak kilka ograniczeń, ponieważ są zależne od elektroforezy żelowej, która wymaga środków interkalujących DNA lub wymagają wysoce specjalistycznego szkolenia i sprzętu. Ponadto testy wymagają dużych ilości oczyszczonego enzymu TOP1 (od 1 do 5 ng w przypadku testu relaksacyjnego i od 50 do 200 ng w przypadku testu EMSA i testu rozszczepienia-ligacji) lub ekstraktów z co najmniej 106 komórek, aby działały optymalnie. W związku z tym opracowano wysoce czułą metodę, która umożliwia specyficzne wykrywanie aktywności TOP1 w surowych próbkach biologicznych i na poziomie pojedynczego zdarzenia katalitycznego, zwaną testem REEAD16.
Tutaj prezentowany jest protokół do wykrywania aktywności TOP1 za pomocą testu REEAD16. Schematyczne przedstawienie testu jest przedstawione w Rysunek 1. Specjalnie zaprojektowana siatka silikonowa jest przymocowana do funkcjonalnego szkiełka w celu stworzenia zestawu wielofunkcyjnego szkła z szkiełkiem, zwanego wellmaker w poniższym (Rysunek 1A). Następnie następuje sprzężenie zmodyfikowanego 5'-aminowym startera z funkcjonalnymi grupami NHS w dołkach szkiełka (Rysunek 1B). Reakcja rozszczepienia i ligacji, w której pośredniczy TOP1, przekształca określony substrat DNA w zamknięty okrąg. Substrat specyficzny dla TOP1 (Rysunek 1C) spontanicznie składa się w kształt hantli zawierający dwuniciową łodygę i dwie jednoniciowe pętle. Jedna z pętli jest uzupełnieniem gruntu zakotwiczonego w powierzchni. Obszar łodygi zawiera preferowane miejsce rozszczepienia TOP1 trzy podstawy przed końcem 3' i zwis 5'-hydroksylowy. Cyrkularyzację substratu można osiągnąć za pomocą ekstraktu komórkowego/tkankowego (Rysunek 1C) lub rekombinowanego, oczyszczonego TOP1 (Rysunek 1D).
Gdy substrat jest rozszczepiany przez TOP1, enzym staje się przejściowo związany z końcem 3', a fragment trójzasadowy dyfunduje, pozwalając zwisowi 5' na wyżarzanie się do podłoża i ułatwiając ligację za pośrednictwem TOP1. Podwiązanie powoduje cyrkularyzację substratu, a następnie dysocjację TOP1. Zamknięty okrąg jest hybrydyzowany z zakotwiczonym powierzchniowo starterem (Rysunek 1E) i jest używany jako matryca do izotermicznego wzmacniania tocznego koła tocznego (RCA) za pośrednictwem polimerazy phi29, która może wykonywać RCA z przemieszczeniem nici, dając 103 powtarzające się produkty tandemowe. Podczas kroku RCA można włączyć nukleotydy znakowane fluorescencyjnie (Rysunek 1F) lub sprzężone z biotyną (Rysunek 1G)17. Włączenie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów pozwala na wykrycie RCP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera fluorescencyjnego. Alternatywnie, przeciwciało antybiotynowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (Rysunek 1H) może wiązać biotynylowane nukleotydy, umożliwiając w ten sposób wykrywanie produktów zwijanego koła (RCP) przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) lub poprzez konwersję 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) do wykrywalnego koloru. RCA podąża za liniową kinetyką reakcji, dzięki czemu test REEAD jest bezpośrednio ilościowy, ponieważ jeden RCP reprezentuje pojedynczą reakcję rozszczepienia-podwiązania, w której pośredniczy TOP1. Tutaj pokazano, że test ten może być stosowany do wykrywania aktywności TOP1 jako oczyszczonego rekombinowanego enzymu lub ekstrahowanego z surowych próbek oraz jako narzędzie do badań przesiewowych leków anty-TOP1.
Protokół
UWAGA: Znajdź listę wymaganych kompozycji, sprzętu i innych materiałów w Tabeli materiałów.
1. Hodowla komórkowa
- Hoduj preferowane komórki w odpowiednim podłożu i hoduj je zgodnie z instrukcjami. Na przykład hoduj Caco2, komórki pochodzące z gruczolakoraka jelita grubego, w pożywce Minimal Essential Medium (MEM) uzupełnionej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodowle komórkowe należy przechowywać w wilgotnym inkubatorze (5%CO2/95% atmosfera powietrza w temperaturze 37 °C). Umieść komórki w kolbach do hodowli tkankowych i dziel co 3 dni, aby utrzymać komórki na poziomie 70% zgrywania.
- Zebrać komórki z 70% zlewającej się kolby przez traktowanie trypsyną (0,25% trypsyna, 0,02% roztwór EDTA) i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS, aby dostosować stężenie komórek do 0,5 × 106 komórek / probówkę. Wirować z prędkością 200 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant.
UWAGA: Ogniwa używane do REEAD muszą być świeże i przechowywane na lodzie. Wyniki uzyskane za pomocą komórek Caco2 zostały niedawno opublikowane17. Test został przetestowany na różnych liniach komórkowych, w tym na komórkach pochodzących z raka okrężnicy, piersi, płuc i szyjki macicy18,19,20,21,22,23, ale może być używany ze wszystkimi surowymi próbkami biologicznymi zawierającymi TOP1, takimi jak tkanki, krew i ślina.
2. Przygotowanie funkcjonalnych slajdów
- Przymocuj specjalnie zaprojektowaną silikonową siatkę izolacyjną do funkcjonalnej zjeżdżalni, tworząc w ten sposób studnię. Dociśnij silikon, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza (patrz Rysunek 1A).
- Przygotować mieszaninę 5 μM 5'-aminowego primera w 1x buforze wydruku. Dodać 4 μl mieszaniny do każdej studzienki i umieścić studnię w komorze hybrydyzacyjnej z nasyconym NaCl w temperaturze od 15 °C do 25 °C, chroniąc przed światłem.
UWAGA: Komorę hybrydyzacyjną można łatwo wykonać za pomocą pudełka z końcówkami do pipet wypełnionego nasyconym NaCl. Hybrydyzacja trwa minimum 16 h i maksimum 72 h. Zobacz sekwencję startera 5'-aminowego w Rysunek 1B. Szkiełka są funkcjonalizowane grupami NHS, aby umożliwić wiązanie oligonukleotydów modyfikowanych amino.
3. Generowanie zamkniętych podłoży cyrkularnych
- Przygotowanie zamkniętych okrągłych substratów z rekombinowanym TOP1 lub ekstraktem komórkowym.
- Lizować osad komórkowy składający się z 0,5 × 106 komórek w 500 μl buforu do lizy, aby osiągnąć gęstość komórek 1,000 komórek/μl. Inkubować przez 10 minut na lodzie.
- Przygotować okrągłą mieszaninę składającą się z 2 μL 5 μM substratu specyficznego dla TOP1 (sekwencja substratu jest następująca: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') i 2 μL rekombinowanego enzymu TOP1 lub 2 μL komórki ekstrahować (patrz krok 3.1.1) w 16 μl 1x buforu reakcyjnego TOP1.
UWAGA: Stężenie użytego rekombinowanego TOP1 zależy od wybranej metody odczytu (patrz Rysunek 2, Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Rysunek 4 i Rysunek 5). Zobacz sekwencję substratu specyficznego dla TOP1 w Rysunek 1C. - Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C (patrz Rysunek 1C,D).
- Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μl 1% SDS.
- Przygotowanie zamkniętych okrągłych substratów w obecności leków
- Przygotuj okrągłą mieszaninę składającą się z 2 μL 5 μM substratu specyficznego dla TOP1 i 1 μL 100% DMSO lub 1 μL 1,6 mM kamptotecyny (CPT) w 14 μL 1x buforu reakcyjnego TOP1. Dodać 2 μl rekombinowanego enzymu TOP1 o stężeniu 5 ng/μl.
UWAGA: Można stosować inne związki małocząsteczkowe lub leki. W takim przypadku należy dokonać miareczkowania związku. Jeśli związek jest rozpuszczony w rozpuszczalniku innym niż DMSO, należy go użyć jako kontroli zamiast DMSO. - Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
- Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μl 1% SDS.
- Przygotuj okrągłą mieszaninę składającą się z 2 μL 5 μM substratu specyficznego dla TOP1 i 1 μL 100% DMSO lub 1 μL 1,6 mM kamptotecyny (CPT) w 14 μL 1x buforu reakcyjnego TOP1. Dodać 2 μl rekombinowanego enzymu TOP1 o stężeniu 5 ng/μl.
UWAGA: Krok 3 można rozpocząć równolegle z krokiem 2, a okręgi mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc. Alternatywnie, kręgi DNA można przygotować w tym samym czasie, co krok 4 i natychmiast zużyć. Zobacz sekwencję substratu specyficznego dla TOP1 w Rysunek 1C. Podłoże składa się w kształt hantli z podwójnym obszarem łodygi zawierającym preferowane miejsce cięcia TOP1 i dwie jednożyłowe pętle. Otwarte podłoże hantli jest przekształcane w zamknięte okrągłe podłoże przez rozszczepienie i podwiązanie za pośrednictwem TOP1 i jest dalej określane jako koło. Ze względu na nadmiar primeru 5'-amino, nie będzie konkurencji między otwartymi i zamkniętymi podłożami specyficznymi dla TOP1.
4. Blokowanie twórcy studni
- Zanurzyć koperkę w tacce o wymiarach 5 cm x 5 cm wypełnionej buforem 1, który został wstępnie podgrzany do 50 °C. Za pomocą pipety wepchnij płyn do studzienek, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 50 °C.
- Usunąć bufor 1 i przemyć 2 x 1 min dH2O. Energicznie wstrząsnąć ręką.
- Dodać bufor 2, który został wstępnie podgrzany do temperatury 50 °C. Upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 50 °C.
- Umyć 2 x 1 min z dH2O. Energicznie wstrząsnąć ręką.
- Myć z 70% EtOH przez 1 min. Energicznie wstrząsnąć ręką.
- Pozwól wiertnikowi schnąć na powietrzu.
UWAGA: Do osuszenia studni użyj sprężonego powietrza. Alternatywnie możliwe jest przedmuchiwanie powietrzem za pomocą pipety Pasteura. Przed kontynuowaniem upewnij się, że studzienki są suche.
5. Hybrydyzacja kręgów do twórcy studni
- Dodaj 4 μl okręgów (wykonanych w kroku 3) do każdego odpowiedniego dołka.
- Umieścić komorze wilgotnościowej w komorze wilgotnościowej na 1 godzinę z dH2O w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Komorę wilgotnościową można wykonać, używając pudełka na końcówki do pipet wypełnionegodH2O. Alternatywnie hybrydyzację można przeprowadzić przez noc w temperaturze 25 °C w komorze wilgotnościowej.
6. Mycie
- Umyj studnię za pomocą buforu 3.
- Usuń bufor 3 i zastąp go buforem 4.
- Usunąć bufor 4 i przemyć 70% EtOH.
- Usuń EtOH i pozwól wiertnikowi wyschnąć.
UWAGA: Wszystkie etapy mycia są wykonywane przez 1 minutę w tacy o wymiarach 5 cm x 5 cm poprzez całkowite zanurzenie szkiełka. Zawsze upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza.
7. Wzmocnienie toczącego się koła
- Przygotuj mieszaninę RCA składającą się z 1x buforu reakcyjnego Phi29 uzupełnionego 0,2 μg / μL BSA, 1 jednostką polimerazy Phi29 i 0,25 mM dNTP i 0,0125 mM ATTO-488-dUTP do odczytu fluorescencji lub 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP i 0,01 mM Biotin-dCTP do odczytu kolorymetrycznego/chemiluminescencyjnego. Dodaj 4 μl do każdego dołka. Zobacz Rysunek 1E.
UWAGA: Przygotowanie mieszanki RCA musi odbywać się na lodzie. W przypadku włączania nukleotydów fluorescencyjnych do RCA, unikaj bezpośredniego światła z tego etapu, aby chronić fluorofory. - Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej. W przypadku stosowania nukleotydów fluorescencyjnych należy ustawić komorę wilgotnościową w ciemności. Zobacz Rysunek 1F,G.
8. Mycie
- W przypadku protokołów odczytu chemiluminescencji lub kolorymetrii umyj studzierkę jak w kroku 6, a następnie przejdź do kroku 11.
- W przypadku protokołu odczytu fluorescencji przed praniem usuń silikonową siatkę za pomocą pęsety, jak w poniższych krokach.
- Myć szkiełko przez 10 minut w buforze 3.
- Usuń bufor 3 i zastąp go buforem 4. Prać przez 5 min.
- Usuń bufor 4 i myj przez 1 minutę w 70% EtOH.
- Usuń EtOH i pozwól studni wyschnąć.
9. Wizualizacja fluorescencyjnych produktów z toczącego się koła za pomocą skanera fluorescencyjnego
- Zeskanuj szkiełko w skanerze fluorescencyjnym za pomocą filtrów odpowiadających zastosowanemu fluoroforowi. Użyj maksymalnego możliwego fotopowielacza, który nie daje nasycenia.
UWAGA: Skaner fluorescencyjny używany do akwizycji obrazu w tym protokole wyposażony jest w laser o długości fali 473 nm oraz filtr-wzbudzenie FAM o długości fali 490 nm, emisja 520 nm. - Zaimportuj obraz do ImageJ i zmień typ obrazu na 8-bitowy (Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Aby zmierzyć pasma osobno, ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi. Narysuj żądany obszar i zmierz intensywność (Analizuj | Środek). Następnie przenieś pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.
- Wykreśl dane w żądanym oprogramowaniu. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikacja wyodrębniona z ImageJ, są przedstawione na Rysunek 2.
10. Wizualizacja fluorescencyjnych produktów z toczącego się koła za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
- Za pomocą pisaka odpornego na EtOH narysuj położenie studzienek przed zdjęciem siatki silikonowej i umyj szkiełko jak w kroku 8.2. Po zakończeniu etapów mycia zamontuj szkiełko z 1 μl podłoża montażowego bez 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) i dodaj szklankę nakryciową. Aby umożliwić wizualizację w aparacie, przyklej szkiełko do szkiełka mikroskopowego o wymiarach 76 mm x 26 mm.
- Analizuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju i kamerę. Zrób 12-15 zdjęć każdej próbki/studzienki.
- Zaimportuj obrazy do ImageJ i ułóż je w stos (punkt menu Obraz | Stosy | Obraz do stosu). Zmień typ obrazu na 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy).
- Ustawianie progu (punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg).
- Ustaw próg w następujący sposób: ustaw dolny pasek i dostosuj górny pasek tak, aby tylko prawe sygnały były czerwone, a tło czarne. Upewnij się, że próg jest tak niski, jak to możliwe, zanim rzeczywiste sygnały zaczną zanikać.
- Przejrzyj poszczególne obrazy i upewnij się, że odpowiadają obrazom przed ustawieniem progu. Pamiętaj, że próg może się zmieniać w zależności od eksperymentu.
- Zliczanie sygnałów (Analizuj | Analizuj cząstki). Upewnij się, że pole podsumowania w ustawieniach ImageJ jest zaznaczone.
- Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego lub innego oprogramowania w celu dalszego przetwarzania danych. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikacja wyodrębniona z ImageJ, są przedstawione na Rysunek 3.
11. Sprzężenie przeciwciała antybiotyny sprzężonego z HRP z produktami znakowanego biotyną toczącego się koła
- Do każdej studzienki dodać 4 μl przeciwciała antybiotyny sprzężonego z HRP, rozcieńczonego w stosunku 1:300 w buforze 5, uzupełnionego 5% odtłuszczonym mlekiem beztłuszczowym i 5% BSA.
- Inkubować przez 50 minut w temperaturze 15-25 °C w komorze wilgotnościowej (patrz Rysunek 1H).
- Mycie 3 x 3 min z buforem 5.
- Wysuszyć maszynę do odwiertu.
12. Wizualizacja produktów z toczącego się koła znakowanego biotyną
- Wizualizacja z ECL
- Bezpośrednio przed użyciem zmieszać 40 μl ECL Luminolu i 40 μlH2O2Pierwsza. Dodaj 2 μl do każdego dołka.
- Wizualizacja slajdu za pomocą kamery CCD lub na kliszach rentgenowskich.
- Wizualizacja za pomocą TMB
- Po kroku 11.4 usuń silikonową siatkę. Następnie dodaj 400 μl TMB na wierzch całego szkiełka i umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Poczekaj ~5-10 min na rozwinięcie koloru. Po rozwinięciu koloru umyj szkiełko 70% EtOH.
- Wizualizuj rozwój kolorów gołym okiem. Zrób zdjęcie slajdu aparatem fotograficznym lub telefonem komórkowym.
- Zaimportuj obraz do ImageJ i zmień typ obrazu na 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Aby zmierzyć pasma osobno, ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi. Narysuj żądany obszar i zmierz intensywność (Analizuj | Środek). Następnie przenieś pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.
- Wykreśl dane w żądanym oprogramowaniu. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikację wyodrębnione z ImageJ, są przedstawione w Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6.
Wyniki
W niniejszej pracy przedstawiono protokół wykrywania aktywności TOP1 z wykorzystaniem testu REEAD16. Protokół ten został zastosowany do wykrywania aktywności rekombinowanej TOP1 przy użyciu czterech różnych metod odczytu: skanera fluorescencyjnego, mikroskopu fluorescencyjnego, chemiluminescencji oraz metody kolorymetrycznej. Protokół posłużył również do wykrycia aktywności TOP1 wyekstrahowanej z komórek Caco2, jako przykładu ekstraktu surowego, z wykorzystaniem odczytu chemiluminescencyjnego lub TMB. Ponadto protokół został wykorzystany jako narzędzie do przesiewania leków w celu wykrycia inhibicji aktywności rekombinowanej TOP1 przez CPT, jako przykład inhibitora specyficznego dla TOP1, przy zastosowaniu metody odczytu chemiluminescencyjnego.
Wyniki uzyskane podczas analizy aktywności TOP1 przy użyciu odczytu fluorescencyjnego przedstawiono na Rysunku 2 oraz Rysunku 3. Reprezentatywny skan preparatu fluorescencyjnego oraz wynikowa kwantyfikacja przedstawione są na Rysunku 2. Jak wynika z kwantyfikacji, metoda ta posiada granicę detekcji wynoszącą 12,5 ng TOP1. Reprezentatywne obrazy i wynikowa kwantyfikacja uzyskane przy użyciu odczytu z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawione są na Rysunku 3. Przy zastosowaniu tej metody odczytu granica detekcji wynosi zaledwie 0,1 ng TOP1. Wyniki uzyskane podczas analizy aktywności TOP1 przy użyciu odczytu chemiluminescencyjnego przedstawiono na Rysunku 4, a wyniki z odczytu kolorymetrycznego na Rysunku 5. Granica detekcji dla tych metod odczytu wynosi 6 ng TOP1 lub odpowiada TOP1 wyekstrahowanej z 312 komórek Caco2. Rysunek 6 przedstawia pomiary aktywności TOP1 w obecności 80 µM CPT lub DMSO jako przykład zastosowania w przesiewaniu leków. Reprezentatywny obraz i wynikowa kwantyfikacja z trzech niezależnych eksperymentów wykazują, że CPT hamuje zależną od TOP1 cyrkularyzację substratu, zgodnie z oczekiwaniami24,25.
Rysunek 1: Schematyczny opis protokołu REEAD. (A,B) Przygotowanie funkcjonalizowanych szkiełek. Siatkowa podkładka silikonowa jest mocowana do funkcjonalizowanego szkiełka. Następnie do szkiełka przyłącza się starter 5'-aminowy, co umożliwia amplifikację substratu specyficznego dla TOP1. (C,D) Generowanie zamkniętych kolistych substratów. Substrat specyficzny dla TOP1 zwija się w kształt hantle z preferowanym miejscem cięcia TOP1 w dwuniciowej łodydze oraz sekwencją wiązania startera w jednej z dwóch jednoniciowych pętli. (C) TOP1 jest uwalniany podczas lizy komórek. Po cięciu i ligacji zapśredniczonej przez TOP1 substrat zostaje przekształcony w zamknięty krąg; (D) zastosowano oczyszczoną, rekombinowaną TOP1. (E) Amplifikacja metodą kroczącego kręgu. Zamknięte koliste substraty są hybrydyzowane z zakotwiczonym na powierzchni starterem i amplifikowane metodą RCA przy użyciu polimerazy Phi29. RCA może być przeprowadzona albo poprzez wbudowanie nukleotydów fluorescencyjnych, jak w F, albo nukleotydów biotinylowanych, jak w G. Fluorescencyjne produkty kroczącego kręgu są wizualizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera fluorescencyjnego. (H) Przyłączanie przeciwciała antybiotynowego sprzężonego z HRP. Biotynilowane produkty kroczącego kręgu są inkubowane z przeciwciałem antybiotynowym sprzężonym z HRP. Rozwój sygnału jest zapśredniczony przez enzym HRP, a sygnały są wizualizowane za pomocą ECL i wykrywane kamerą CCD lub za pomocą TMB, co pozwala na wizualizację kolorymetryczną. Skróty: REEAD = rolling circle enhanced enzyme activity detection; RCA = rolling circle amplification; TOP1 = topoizomeraza 1; HRP = peroksydaza chrzanowa; ECL = enhanced chemiluminescence; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Pomiary aktywności TOP1 przy użyciu skanera fluorescencyjnego. Lewy panel przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności 3-50 ng TOP1 z zastosowaniem protokołu odczytu skanerem fluorescencyjnym. Prawy panel przedstawia wynikową analizę ilościową. Test t z korektą Welcha, p = 0,0064, n = 4. Skrót: TOP1 = topoizomeraza 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3Pomiary aktywności TOP1 przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Panel lewy przedstawia reprezentatywne obrazy preparatu podczas analizy aktywności 0,1–12,5 ng TOP1 z wykorzystaniem protokołu odczytu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Należy zwrócić uwagę, że obrazy zostały przycięte w celu właściwego zaprezentowania kropek. Z tego powodu nie odpowiadają one liczbie sygnałów w analizie ilościowej przedstawionej w panelu prawym. t-test z poprawką Welcha, p = 0,0136, n = 3. Skrót: TOP1 = topoizomeraza 1. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Pomiary aktywności TOP1 z wykorzystaniem odczytu chemiluminescencyjnego. (A) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności 3-50 ng TOP1 przy użyciu protokołu odczytu chemiluminescencyjnego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p < 0,0001, n = 4. (B) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności TOP1 wyekstrahowanego z 156-40 000 komórek Caco2 przy użyciu protokołu odczytu chemiluminescencyjnego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0224, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Pomiary aktywności TOP1 z wykorzystaniem odczytu kolorymetrycznego. (A) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy 3-50 ng TOP1 z zastosowaniem protokołu odczytu kolorymetrycznego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0012, n = 4. (B) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności TOP1 wyekstrahowanego z 156-40 000 komórek Caco2 z zastosowaniem protokołu odczytu kolorymetrycznego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0117, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Pomiary aktywności TOP1 po zastosowaniu leków z wykorzystaniem protokołów odczytu chemiluminescencyjnego. Lewy panel przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy 10 ng TOP1 w obecności 5% DMSO lub 80 µM CPT przez 1 min. Prawy panel przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0017, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1; CPT = kamptotecyna; DMSO = dimetylosulfoksyd; Neg = kontrola negatywna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Topoizomerazy reprezentują klasę enzymów modyfikujących DNA, które cieszą się dużym zainteresowaniem badawczym i klinicznym, będąc celem związków małocząsteczkowych o potencjalnym działaniu w leczeniu przeciwnowotworowym lub w walce z chorobami zakaźnymi. Co więcej, aktywność ludzkiego TOP1 okazała się skutecznym biomarkerem rokowania i leczenia nowotworów 18,19,23. Chociaż to aktywność TOP1 wpływa na skuteczność inhibitora chemioterapeutyku26, często w warunkach klinicznych ocenia się ilość DNA-RNA lub ilość TOP1. Wynika to z braku szybkich, łatwych i bezpłatnych narzędzi na bazie żelu, które mogą zapewnić dokładne i precyzyjne określenie ilościowe aktywności topoizomerazy w każdym środowisku laboratoryjnym.
W tym miejscu opisano protokół testu REEAD pozwalający na pomiar aktywności TOP1 w sposób bezżelowy. W tym protokole oczyszczony TOP1 lub surowy ekstrakt z komórek jest inkubowany ze specjalnie zaprojektowanym substratem DNA w kształcie hantli, który po rozszczepieniu/podwiązaniu za pośrednictwem TOP1 jest przekształcany w zamkniętą, okrągłą cząsteczkę. Okręgi są następnie hybrydyzowane na szklanej powierzchni i wzmacniane przez RCA. Aby umożliwić łatwość użycia w przeprowadzaniu reakcji zachodzących na szkiełku, do szkła przymocowana jest silikonowa siatka, która tworzy indywidualne dołki, w których zachodzą reakcje. W ten sposób protokół wykorzystuje system wielodołkowy - silikonową siatkę - zwaną wellmaker.
Protokół został wykorzystany do wykrycia aktywności rekombinowanych TOP1 i TOP1 wyekstrahowanych z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2, podanych jako przykład. Ponadto, jako przykład wykorzystania REEAD jako narzędzia do badań przesiewowych leków, protokół został wykorzystany do wykrycia hamowania aktywności TOP1 przez dobrze znany inhibitor TOP1 CPT24,25. Test został połączony z różnymi metodami odczytu - mikroskopią fluorescencyjną, która daje wysoką czułość, oraz skanerem fluorescencyjnym, chemiluminescencyjnym lub kolorymetrycznym, które wymagają mniej specjalistycznego sprzętu i szkolenia. Bardzo czuły odczyt mikroskopu fluorescencyjnego ma ograniczenia związane z koniecznością dobrej jakości ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego, wykwalifikowanego personelu oraz czasochłonnego pozyskiwania i analizy obrazu.
Z tych powodów prezentowany jest odczyt skanera fluorescencyjnego, który pozwala na szybszą akwizycję i analizę, nawet jeśli kosztem czułości. W przypadku braku skanera fluorescencyjnego można rozważyć dwie doskonałe alternatywy, metody odczytu chemiluminescencji i kolorymetryczne. Obie metody są szybkie i proste, nie wymagają drogiego sprzętu ani specjalistycznego szkolenia. We wszystkich formatach odczytu REEAD ma wiele zalet w porównaniu z najnowocześniejszymi testami, które są bardziej czasochłonne, oparte na żelu (z wymaganiami dotyczącymi środków interkalacyjnych) i mniej bezpośrednio ilościowe. W przedstawionym protokole jest jednak kilka krytycznych kroków. Podczas przeprowadzania badań przesiewowych leków należy zoptymalizować punkty czasowe, stężenie leku i stosunek ilości TOP1 do substratu DNA w porównaniu z opisanymi ustawieniami zoptymalizowanymi dla CPT. Lek można badać, wykonując preinkubację z substratem DNA lub preinkubację z enzymem TOP1. Może to dostarczyć cennych informacji na temat zdolności cząsteczki do hamowania TOP1 i zapewnić wgląd w mechanizm działania leku.
Co więcej, jeśli występują niskie sygnały lub ich brak, najprawdopodobniej jest to spowodowane nieefektywną lizą surowej próbki lub degradacją TOP1 w ekstrakcie z powodu niewłaściwego stosowania inhibitorów proteazy. Ponadto może to być również spowodowane nieodpowiednim przechowywaniem ważnych składników testu, takich jak rekombinowany TOP1, polimeraza phi29, nukleotydy, substrat i starter. Wreszcie, należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania oligonukleotydów, ponieważ ma to ogromny wpływ na wydajność testu. W przypadku stosowania ekstraktu surowego należy zoptymalizować wydajność ekstrakcji określonej próbki biologicznej, a ilość i aktywność TOP1 może różnić się od podanego tutaj przykładu. Z tego powodu każdy surowy ekstrakt, który ma być poddany badaniu, będzie wymagał miareczkowania w celu określenia granicy wykrywalności testu i zakresu czułości przy użyciu tej konkretnej próbki. Protokół został zoptymalizowany pod kątem wykrywania ludzkiego TOP1. Aktywność innych eukariotycznych TOP1 można zmierzyć, ale stężenie NaCl i czas inkubacji mogą wymagać optymalizacji zgodnie z metodą oczyszczania enzymu i optymalną aktywnością enzymu. Więcej okrągłych substratów będzie wynikać z długotrwałej inkubacji, podczas gdy mniej okrągłych substratów będzie wynikać ze skróconej inkubacji.
Oprócz przedstawionych zastosowań, REEAD pozwala na pomiar aktywności TOP1 w surowych ekstraktach z małych biopsji od pacjentów z rakiem18, przewidywanie cytotoksycznego działania przeciwnowotworowego CPT w liniach komórek nowotworowych 20,21,22, a nawet wykrywanie aktywności enzymu w pojedynczych komórkach20,21. Co więcej, prezentowane ustawienie REEAD z wykorzystaniem odwiertu umożliwia wielodołkowe badania przesiewowe leków w bibliotekach związków syntetycznych lub naturalnych. Oprócz tego opracowano zmodyfikowaną wersję testu REEAD, zwaną REEAD C/L. Taka konfiguracja umożliwia oddzielne badania etapów rozszczepienia i podwiązania reakcji TOP127. Dzięki REEAD C/L możliwe jest określenie mechanizmu działania inhibitorów małocząsteczkowych i scharakteryzowanie ich jako inhibitorów katalitycznych TOP1 o potencjalnym działaniu przeciwpasożytniczym28 lub jako trucizny TOP1 do stosowania w leczeniu przeciwnowotworowym 24,25. Wreszcie, dzięki specyficznemu przeprojektowaniu substratów DNA w celu dopasowania do różnych wymagań (dotyczących wiązania DNA lub ligacji rozszczepienia) innych enzymów TOP1, REEAD był również stosowany do wykrywania chorób zakaźnych (takich jak w przypadku Plasmodium falciparum, powodującego malarię29) lub Leishmania donovani i wirusa małpiej ospy (dane nie pokazane). Lub może być używany do identyfikacji związków małocząsteczkowych o działaniu przeciwpatogennym. Przedstawiony protokół zapewnia naukowcom z dziedziny TOP1 łatwą metodę wykrywania aktywności enzymów przy niewielkiej lub żadnej optymalizacji i z możliwością dostosowania do jeszcze szerszych zastosowań w przyszłości.
Oświadczenia
Autorzy: C.T. i K.M. są pracownikami VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. i M.S. są akcjonariuszami i/lub posiadaczami opcji na akcje. C.T., B.R.K. i M.S. oświadczają, że są wymienieni jako wynalazcy patentu EP2022/057172 złożonego w imieniu VPCIR biosciences ApS. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować technikowi laboratoryjnemu Noriko Y. Hansen, Wydziałowi Biologii Molekularnej i Genetyki, Uniwersytet w Aarhus, za pomoc techniczną w związku z oczyszczaniem enzymów Phi29 i TOP1.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Kamera do analizy | |||
| Kamera | Do analizy obrazu chemiluninowego | ||
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus | Wyposażony w 60-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem i filtr GFP ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Skaner fluorescencyjny | Typhoon | FLA 9500 | Wyposażony w laser 473 i filtr FAM |
| Komora wilgotnościowa z dH2O | |||
| Komora hybrydyzacyjna z nasyconym oprogramowaniem NaCl | |||
| ImageJ | Fidżi | Pobierz pod adresem: | |
| https://imagej.net/software/fiji/downloadsMaterials | |||
| Hodowla komórkowa | |||
| Pożywka do wzrostu komórek odpowiednia dla wybranej linii | |||
| Trypsyna | Sigma | #T4174 | |
| Kolby do hodowli tkankowych | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Funkcjonalizowane szkiełka | |||
| 5'-aminowy anty-TOP1 primer | Sigma | 5'-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3' | |
| Aktywowane slajdy Codelink HD | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Siatka krzemowa | Grace-biolabs | Wykonany na zamówienie | |
| klej Pertex | Histolabs | #00801 | |
| Szkiełko mikroskopowe 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Można użyć innego szkiełka mikroskopowego o tym samym wymiarze |
| Koła DNA i amplifikacja toczącego się koła | |||
| TOP1 specyficzny substrat | Sigma | 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT AAG TTT TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3' | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| polimeraza Phi29 | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Rekombinowany TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Wykrywanie toczącego się koła produkty | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Szklana | |||
| mieszanina ECL | Cytiva | #RPN2236 | |
| Sprzężone przeciwciało antybiotynowe HRP | Merck | #A4541 | |
| Pożywka montażowa (vectachield) | Laboratoria wektorowe | #H-1000 | |
| Lista | |||
| 1x Bufor | 1 mM EDTA, 8,12 mM Na2HPO4· 2H2O, 1.88 mM NaH2PO4· Bufor wydruku H2O | ||
| 6x | 300 mM Na3PO4, pH 8,5 | ||
| 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 | |||
| 10x Phi29 Bufor | 330 mM octan trisu pH 7,5, 100 mM octan Mg, 660 mM octan K, 1% Tween20, 200 mM | ||
| Bufor | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM etanoloamina. Uwaga: przechowywany w temperaturze 50 stopni Celsjusza. | ||
| Bufor 2 | 4x SSC, 0,1% SDS. Uwaga: przechowywany w temperaturze 50 stopni Celsjusza. | ||
| Bufor 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% SDS | ||
| Bufor 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 | ||
| Bufor 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 | ||
| Chemikalia do | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Etanoloamina | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-octan | Sigma | #T1258 | |
| Mg-octan | Sigma | #M0631 | |
| K-octan | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Odtłuszczone mleko w proszku | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
Bibliografia
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240(2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398(2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
Przedruki i uprawnienia
