Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Częściowa hepatektomia była szeroko stosowana do badania regeneracji wątroby u myszy, ale izolacja wysokiej wydajności żywotnych hepatocytów do dalszych zastosowań jednokomórkowych jest wyzwaniem. U myszy obserwuje się wyraźne nagromadzenie lipidów w regenerujących się hepatocytach w ciągu pierwszych 2 dni normalnej regeneracji wątroby. Ta tak zwana przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) jest tymczasowe, ale częściowo pokrywa się z główną fazą proliferacyjną. Oczyszczanie w gradiencie gęstości jest podstawą większości istniejących protokołów izolacji pierwotnych hepatocytów. Ponieważ oczyszczanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, oddziela populacje hepatocytów niestłuszczonych od stłuszczeniowych. Dlatego hepatocyty tłuszczowe często są tracone, dając niereprezentatywne frakcje hepatocytów.
Prezentowany protokół opisuje łatwą i niezawodną metodę izolacji in vivo regenerujących się hepatocytów, niezależnie od ich zawartości lipidów. Hepatocyty od samców myszy C57BL / 6 izoluje się 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Standardowa pompa perystaltyczna napędza podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości, stosując technikę perfuzji wstecznej z odpływem przez żyłę wrotną. Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazę w celu ich uwolnienia z kapsułki Glissona. Po umyciu i dokładnym odwirowaniu hepatocyty mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Podsumowując, w artykule opisano prostą i powtarzalną technikę izolacji reprezentatywnej populacji regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy. Metoda może również pomóc w badaniu stłuszczeniowej choroby wątroby.
Wprowadzenie
Wątroba może się zregenerować nawet po dużej utracie tkanki. Ta wyjątkowa zdolność regeneracyjna jest wyraźnie zilustrowana przez eksperymentalny model częściowej (70%) hepatektomii, po raz pierwszy opisany na szczurach przez Higginsa i Andersona w 1931 roku1. W tym modelu 70% wątroby jest chirurgicznie usuwane u zwierząt poprzez odcięcie większych płatów wątroby. Pozostałe płaty następnie rosną w wyniku kompensacyjnego przerostu, aby przywrócić pierwotną masę wątroby w ciągu około 1 tygodnia po operacji, aczkolwiek bez przywrócenia pierwotnej architektury wątroby2,3. Opracowano dodatkowe hepatektomie z różną ilością usuwanych tkanek, takie jak hepatektomia rozszerzona o 86%, w której resztki wątroby są zbyt małe, aby się zregenerować, co ostatecznie prowadzi do niewydolności wątroby po hepatektomii (PHLF), a następnie śmierci u 30%-50% zwierząt4,5,6. Modele te umożliwiają badanie prawidłowej i nieudanej regeneracji wątroby, w zależności od ilości wyciętej tkanki (Ryc. 1).
Chociaż mysie modele hepatektomii są z powodzeniem stosowane od wielu lat, dopiero niedawno bardziej zaawansowane metody analityczne pozwoliły na głębszy wgląd na poziomie pojedynczej komórki. Jednak w przypadku większości tych metod obecność pojedynczych hepatocytów jest podstawowym warunkiem wstępnym. Większość protokołów izolacji hepatocytów pierwotnych opiera się na dwuetapowej technice perfuzji kolagenazy i późniejszym oczyszczaniu w gradieniu gęstości w celu oddzielenia żywotnych hepatocytów od szczątków i komórek niemiąższowych, a także martwych7,8,9. Ta metoda została po raz pierwszy opisana przez Berry'ego i Frienda w 1969 roku10 i zaadaptowana przez Seglena i współpracowników w 1972 roku11,12. Ponieważ jednak wirowanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, hepatocyty obciążone lipidami są często tracone podczas standardowego oczyszczania. Chociaż taka utrata może być nieistotna dla wielu pytań badawczych, jest to kluczowy aspekt dla wczesnej regeneracji wątroby. W ciągu pierwszych 2 dni hepatocyty w regenerującej się wątrobie myszy gromadzą lipidy, zwiększając w ten sposób swój rozmiar i zmniejszając gęstość. Ta przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) służy do dostarczania paliwa regeneracyjnego i jest tymczasowe, ale częściowo nakłada się na główną fazę proliferacyjną i jest nierównomiernie rozmieszczone w zrazikach wątroby - jednostkach funkcjonalnych klasy wątroba13,14. Jednak po przedłużonej hepatektomii 86% TRAS również występuje, ale utrzymuje się, ponieważ regeneracja jest zatrzymana, a lipidy nie są utleniane14. W związku z tym gradientowe oczyszczanie hepatocytów po hepatektomii 70% lub 86% da niereprezentatywne frakcje, ponieważ większość hepatocytów obciążonych lipidami jest tracona z powodu ich niskiej gęstości15.
W tym zmodyfikowanym protokole izolacji, hepatocyty myszy C57BL/6 są izolowane 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Zwykle kaniulacja i perfuzja pozostałości w celu izolacji komórek odbywa się przez żyłę wrotną. Jednak opór wrotno-naczyniowy w małych pozostałościach po dużej resekcji jest wysoki16, a zatem perfuzja jest delikatna. Ponieważ żyła główna pozostaje nienaruszona przez hepatektomię, perfuzję można łatwo przeprowadzić w kierunku wstecznym poprzez kaniulację żyły głównej. Standardowa pompa perystaltyczna kieruje podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości wątroby, wykorzystując perfuzję wsteczną z odpływem przez żyłę wrotną (rysunek uzupełniający S1). Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazy i uwalniane z kapsułki Glissona. Po umyciu i starannym przetworzeniu żywotnych hepatocytów poprzez stopniową izolację przy użyciu metody wirowania z niską prędkością, hepatocyty można wykorzystać do dalszych analiz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z federalnymi regulacjami Szwajcarii dotyczącymi zwierząt i zostały zatwierdzone przez Biuro Weterynaryjne w Zurychu (n° 007/2017, 156/2019), co zapewniło humanitarne traktowanie. Samce myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni utrzymywano w 12-godzinnym cyklu dzień/noc z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Każda grupa eksperymentalna składała się z sześciu do ośmiu zwierząt. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i odczynników użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Częściowa hepatektomia u myszy
- W przypadku standardowej hepatektomii (70%), podwiązać i wyciąć lewy płat boczny, prawą część płata środkowego oraz lewą część płata środkowego (Rycina 1B). W przypadku rozszerzonej hepatektomii (86%)4, usunąć dodatkowo płaty ogonowe oraz prawy płat przedni (Rycina 1C).
- UWAGA: Standardowa hepatektomia jest procedurą stosowaną w badaniach nad regeneracją wątroby od wielu lat. Protokoły tej procedury są dostępne3,17, w tym protokół wspomagany wideo opracowany przez Mitchell i Willenbringa18. Dalsze szczegóły dotyczące technik hepatektomii zastosowanych w niniejszym opracowaniu znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.
Rysunek 1: Standardowa (70%) i rozszerzona (86%) hepatektomia u myszy. (A) Pięć płatów wątroby myszy i ich respective wkłady do całkowitej masy wątroby. (B) Schematyczna ilustracja 70%-hepatektomii u myszy. Ciemne płaty reprezentują przyszłą pozostałość wątroby. (C) Schematyczna ilustracja 86%-hepatektomii u myszy. Ciemne płaty reprezentują przyszłą pozostałość wątroby. (D) Precyzyjna objętość usuniętej tkanki po 70%- i 86%-hepatektomii. (E) Brzuch myszy bezpośrednio po 70%-hepatektomii; (F) brzuch myszy bezpośrednio (lewa strona) i 48 h (prawa strona) po 86%-hepatektomii. Zwróć uwagę na blady kolor stłuszczonej pozostałości (biała strzałka). n = 6-7/grupa. Skróty: sHx = standardowa hepatektomia; eHx = rozszerzona hepatektomia; LW = masa wątroby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych
- Przygotować bufory do perfuzji, trawienia i konserwacji (patrz Tabela 1).
- Dostosować pH wszystkich roztworów buforowych w temperaturze 37 °C, dodając w razie potrzeby wodorotlenek sodu (NaOH) lub kwas solny (HCl). Optymalne pH dla buforów wynosi 7.4.
- Umieścić bufor do konserwacji oraz pożywkę Williams' Medium E na lodzie.
- Przygotować bufor do cytometrii przepływowej i przechowywać go na lodzie.
Tabela 1: Roztwory i bufory używane do trawienia i oczyszczania hepatocytów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
3. Przygotowanie sprzętu do perfuzji
- Podgrzej kąpiel wodną do 42 °C następnie umieścić bufor perfuzyjny (50 ml) i bufor do trawienia (10–20 ml) w kąpieli wodnej. Nie dodawać jeszcze kolagenazy do buforu do trawienia.
- Przygotować pompę perystaltyczną i włożyć przewody. Kompletny układ perfuzyjny przedstawiono na Rycina 2.
- Podłączyć kaniulę dożylną 26 G do końcowej części przewodu za pomocą złącza Luer-Lock. Włożyć początkową część przewodu do rurki z wstępnie ogrzanym buforem perfuzyjnym w kąpieli wodnej. Przepłukać przewód 70% etanolem, a następnie 50 ml jałowego chlorku sodu (NaCl 0,9%). Odpowietrzyć przewód ciepłym buforem perfuzyjnym (prędkość pompy 3 ml/min).
- Uśpij mysz, stosując anestezję inhalacyjną izofluranem (800 ml/min O22, 3%–5% izofluranu do indukcji i 2% do podtrzymania znieczulenia podczas procedury). Izofluranem należy operować pod wyciągiem laboratoryjnym, zapewniając odpowiednią wentylację.
- Podaj buprenorfinę podskórnie 30 minut przed operacją w dawce 0,1 mg/kg masy ciała.
- Aby zapobiec hipotermii, umieść uspokojoną mysz na podkładce grzewczej, a pod górną część brzucha włóż zwiniętą chusteczkę z tkaniny, aby unieść wątrobę ponad pozostałe organy i ułatwić dostęp do żyły głównej dolnej.
UWAGA: Nie należy używać tkanek zbyt grubych, ponieważ może dojść do załamania naczyń, co wpłynęłoby na skuteczność perfuzji. - Nanieść maść do oczu, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
- Przed rozpoczęciem operacji należy upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, sprawdzając odruch cofania kończyny (poprzez uciśnięcie opuszek stopy w obu tylnych łapach). W przypadku wystąpienia reakcji należy podać dodatkową dawkę środka znieczulającego i powtórzyć test przed rozpoczęciem procedury.
- Oczyścić brzuch 70% etanolem.
- Ponownie otwórz nacięcie w linii pośrodkowej, przecinając szew i delikatnie rozsuwając brzegi rany. Jeśli od hepatektomii minęło więcej niż 24–48 h, usuń szew i przetnij skórę nożyczkami.
- Przymocuj szew z polipropylenu 5-0 do mostka, pociągnij go w kierunku kranialnym i utrwal w tej pozycji. Użyj rozieracza lub prostych klamer, aby utrzymać brzuch w pozycji otwartej. Jama brzuszna musi być wyeksponowana w maksymalnym stopniu, aby zoptymalizować dostęp i widoczność.
- Przesunąć jelita w prawo za pomocą patyczków kosmetycznych, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną. Do odsunięcia i utrzymania jelit należy użyć wilgotnej ściereczki.
- Umieść ciężki przedmiot o wysokości około 2 cm (np. pierścień obciążnikowy z powłoką silikonową do kolb miarowych) obok tylnych kończyn myszy (Rycina uzupełniająca S2A). Umieść dren z podłączoną kaniulą dożylną 26 G na obiekcie i ostrożnie ustaw igłę nad żyłą główną. Dostosuj długość drenu.
- Przenieść przygotowany roztwór zapasu kolagenazy do wstępnie ogrzanej probówki z buforem do trawienia. Dodać 250 µL roztworu zapasowego do 10 ml buforu trawiennego. Przygotuj od 10 do 20 ml buforu trawiennego na jedno zwierzę. W przypadku większych zwierząt lub perfuzji całych wątrób przygotuj do 30 ml buforu trawiennego.
UWAGA: Zaleca się dodanie roztworu zapasowego kolagenazy do ogrzanego buforu do trawienia około 30 minut przed rozpoczęciem procesu trawienia.
Rycina 2Przegląd układu perfuzyjnego. (A) Stół operacyjny z wyposażeniem niezbędnym do perfuzji. (B) Materiały niezbędne do przygotowania wątroby, a także do ekstrakcji i izolacji hepatocytów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Kanulacja i perfuzja
- Ustaw prędkość pompy na 3 mL/min i włącz pompę. Poczekaj, aż wstępnie ogrzany bufor perfuzyjny dotrze do igły. Odrzuć pierwsze 2-3 mL buforu perfuzyjnego.
- Wykonaj kaniulację żyły głównej dolnej.
- Podczas przepływu buforu przez igłę, wprowadź kaniulę dożylną 26 G pod małym kątem do żyły głównej poniżej nerki. Upewnij się, że ścięcie igły jest skierowane do góry.
- Użyj patyczka bawełnianego, aby delikatnie odciągnąć żyłę główną w kierunku ogona poniżej miejsca nakłucia, tak aby wytworzone napięcie ułatwiło wprowadzenie kaniuli do żyły. Obserwuj pojawienie się krwi w komorze zwrotnej cewnika w momencie wejścia igły do światła naczynia.
- Wsuń igłę o dodatkowe 2-3 mm, aby upewnić się, że końcówka plastikowego cewnika również weszła do żyły.
- Przesuń plastikowy cewnik nad igłą i wprowadź go do żyły głównej o kolejne 5 mm. Usuń igłę powoli i bardzo ostrożnie.
UWAGA: Nie zaleca się mocowania kaniuli za pomocą ligatury. Krok ten jest czasochłonny, ponieważ w tym celu naczynie musiałoby zostać najpierw wypreparowane. Jeśli kaniula jest luźno ustawiona i podparta innym przedmiotem, dalsza fiksacja nie jest konieczna (patrz konfiguracja perfuzji na Ryc. uzupełniającej S2). Aby ustabilizować miejsce kaniulacji i zapobiec cofaniu się płynu, w miejscu kaniulacji można dodać pojedynczą kroplę monomerycznego n-butyl-cyanoakrylanu.
- Gdy z kaniuli zaczną wyciekać krople krwi, wypełnij ją ciepłym buforem perfuzyjnym za pomocą strzykawki.
- Ponownie podłącz rurkę do kaniuli, zachowując prędkość pompy 3 mL/min. Pozwól, aby bufor perfuzyjny wpłynął do wątroby.
- Po 2-3 s obserwuj powstawanie białych plamek w wątrobie i/lub rozszerzenie/obrzęk żyły wrotnej, co wskazuje, że bufor perfuzyjny przepływa przez wątrobę i wnika do zrazików wątrobowych z żyły centralnej (Ryc. 3).
- Odczekaj 1-2 s po pojawieniu się białych plamek na powierzchni wątroby, aż żyła wrotna widocznie spuchnie. Przetnij żyłę wrotną nożyczkami tak dystalnie jak to możliwe od wnęki wątroby. Użyj mikroklipsa naczyniowego, aby oznaczyć (nie zamknąć) miejsce cięcia (Ryc. 3B).
UWAGA: Upraszcza to ocenę przepływu przez wątrobę podczas procesu perfuzji. Wątroba natychmiast oczyszcza się z krwi i w ciągu kilku sekund staje się żółto-biała (Ryc. 3C). Dodatnie nacięcie skóry po prawej stronie otworu brzusznego ułatwia odpływ krwi oraz roztworu perfuzyjnego (Ryc. 3B oraz Ryc. uzupełniająca S2B,C). - Zwiększ przepływ do 4-7 mL/min w zależności od masy zwierzęcia, wielkości wątroby i zakresu wcześniejszej hepatektomii.
- Zaciśnij żyłę wrotną pęsetą lub zaciskiem naczyniowym na 7-10 s. Upewnij się, że żadna ciecz nie przepływa.
UWAGA: Wątroba widocznie puchnie podczas zaciskania i rozluźnia się po zwolnieniu. Jest to kluczowe dla przepłukania całej wątroby i usunięcia z niej pozostałej krwi. - Wykonaj drugie zaciskanie po około 30 s i upewnij się, że wątroba puchnie i rozluźnia się. Kontynuuj płukanie zwierzęcia, aż bufor wypływający z żyły wrotnej będzie przejrzysty, ale przez co najmniej 3-4 min.
UWAGA: Prędkość pompy zależy od rurki oraz wielkości wątroby. Musi być ona oceniana indywidualnie. - Na tym etapie procedury euthanasia powinna nastąpić w wyniku eksangwinacji. Potwierdź zatrzymanie krążenia systemowego (brak bicia serca lub drgań serca). Aby upewnić się, że nastąpiła śmierć, na tym etapie procedury wykonuje się obustronną odmę opłucnową jako dodatkową fizyczną metodę uśmiercenia.
UWAGA: Nieznacznie zmniejsz prędkość pompy, jeśli krążenie systemowe ustało (brak bicia serca lub drgań serca).
Rysunek 3: Proces perfuzji od kaniulacji do trawienia. (A) Anatomia wątroby myszy z żyłą główną dolną (biała strzałka) i żyłą wrotną (żółta strzałka). (B) Kaniulacja żyły głównej dolnej. Kaniulę zabezpiecza się podwiązką (biała strzałka), a miejsce odpływu przez otwartą żyłę wrotną zostaje zaznaczone (niezakleszczone) mikroklamrą naczyniową. (C) Zwróć uwagę na występowanie struktur plamistych przed całkowitym wypłukaniem krwi z wątroby przez bufor perfuzyjny (biała strzałka). Wykonuje się nacięcie skóry (żółta strzałka) i umieszcza tampon z waty, aby zapewnić drenaż krwi i płynu perfuzyjnego. Można stosować przerywane zakleszczanie za pomocą klamry naczyniowej lub pęsety. (D) Wątroba powinna zostać oczyszczona z całej krwi (*). Po wprowadzeniu do wątroby buforu trawiennego zawierającego kolagenazę, organ przestanie się rozluźniać po zakleszczeniu, a płaty wątroby zwiększą swoją objętość. (E) Po pewnym czasie na powierzchni wątroby można zaobserwować pęcherzyki powietrza (*). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Trawienie
- Wstrzymaj pracę pompy perfuzyjnej i szybko przenieś rurkę doprowadzającą z buforu perfuzyjnego do uprzednio ogrzanego buforu do trawienia. Ponownie uruchom pompę.
- Przed Gdy bufor do trawienia dotrze do wątroby, należy ponownie zacisnąć żylną aortę wrotną na 3-4 s. Należy upewnić się, że po zwolnieniu zacisku wątroba rozluźnia się, a płyn perfuzyjny pozostaje przejrzysty.
UWAGA: Bufor do trawienia zawiera czerwoną czerwień fenolową i jest łatwo rozróżnialny od przejrzystego buforu perfuzyjnego, co umożliwia łatwe śledzenie jego położenia w probówce. - Gdy bufor trawienny dotrze do wątroby, ponownie zaklemprz żyłę wrotny za pomocą mikroklipsa naczyniowego.
UWAGA: Podczas zaciskania wątroba pęcznieje, lecz nie wraca do pierwotnego stanu po zwolnieniu zacisku. Jest to zjawisko prawidłowe. - Aby ułatwić proces trawienia, należy zamknąć żyłę główną górną za pomocą klamry naczyniowej bezpośrednio poniżej przepony, co umożliwi przepływ buforu trawiennego z żyły głównej dolnej do wątroby, a następnie odpływ przez otwartą żyłę wrotną.
UWAGA: Takie zaklemowanie zapewnia pominięcie krążenia systemowego i zapobiega niepożądanemu kontaktowi z pozostałościami składników krwi lub inhibitorami. Krok ten jest opcjonalny, ponieważ po operacji pozorowanej dostęp do żyły głównej górnej za powiększoną tkanką wątroby jest utrudniony, natomiast w przypadku myszy po hepatektomii dostęp ten jest znacznie łatwiejszy. - Trawić przez około 4 min przy szybkości przepływu 5 ml/min. W miarę postępu procesu trawienia należy szukać oznak pęcznienia wątroby oraz małych, przejrzystych obszarów na jej powierzchni. Ponadto należy zaobserwować, że wątroba nabiera tekstury mokrej tkaniny i wydaje się niemal nasiąknięta (Rycina 3E). Sprawdzić konsystencję, delikatnie dotykając powierzchni zwilżonym patyczkiem kosmetycznym.
- Kontynuuj perfuzję do momentu, aż zaobserwowana zostanie wyraźna różnica w teksturze powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba przybiera bardzo jasny kolor i pęcherzykowaty wygląd (Rysunek 3E), a torebka Glissona (tj. osłonka wątroby) oddziela się od miąższu. Proces trawienia należy przerwać niezwłocznie po uzyskaniu tych właściwości przez wątrobę, ponieważ nadmierna trawienie może uszkodzić hepatocyty. Przed dostaniem się powietrza do wątroby należy wyciągnąć igłę.
UWAGA: Zazwyczaj do uzyskania wystarczającego stopnia trawienia potrzeba 10–20 ml buforu do trawienia. Zależy to od wielkości zwierzęcia, zakresu hepatektomii, konfiguracji cewników oraz jakości roztworu kolagenazy. W razie potrzeby należy zwiększyć czas perfuzji, a nie prędkość perfuzji. Zbyt wysokie ciśnienie w układzie naczyniowym może spowodować pęknięcie wątroby, co może prowadzić do wycieku płynu do perfuzji/trawienia do przestrzeni zaotrzewnowej.
6. Przygotowanie wątroby
- Ostrożnie usuń wątrobę z jamy brzusznej. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ organ jest obecnie bardzo wiotki i kruchy.
- Chwyć pęsetą centralną tkankę łączną pomiędzy płatami i lekko unieś ją do góry, traktując ją jako punkt zakotwiczenia.
- Przetnij wszystkie połączenia wątroby z innymi organami, usuń pęcherzyk żółciowy i umieść wątrobę w lodowatym buforze konserwującym.
UWAGA: W idealnych warunkach ekstrakcja hepatocytów i dalsza obróbka powinny odbywać się natychmiast, aby zachować żywotność hepatocytów. Jeśli jednak jest to konieczne, wątrobę można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C (np. na potrzeby transportu). Opóźnienie to nie powinno przekraczać 30-40 min.
7. Ekstrakcja hepatocytów
- Przenieś wątrobę do szalki Petriego o średnicy 10 cm i dodaj 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej podłoża Williams' Medium E.
- Przerwij torebkę Glissona w kilku miejscach na powierzchni wątroby, używając pęsety z cienkimi końcówkami. Chwyć centralną część (np. tkankę łączną w wnęce wątroby) dwiema pęsetami i powoli rozsuń je, pozwalając na rozerwanie torebki bez uszkodzenia hepatocytów. Uwolnij komórki, delikatnie potrząsając torebką (Rycina uzupełniająca S3).
UWAGA: W idealnych warunkach wątroba łatwo ulega rozpadowi i uwalnia komórki. Nie należy stosować siły. Użycie skrobaka do komórek może pomóc w całkowitym usunięciu wszystkich komórek i zwiększeniu ich wydajności. Nie należy ciąć wątroby nożyczkami na kawałki. - Przefiltrować 5 ml pulpy wątrobowej przez 100 µm sitko do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 50 mL. Przemyć filtr 10 mL świeżego, schłodzonego w lodzie medium. Przefiltrować pozostałe 5 mL miazgi przez sitko.
UWAGA: Należy użyć pipety serologicznej o pojemności 25 ml do przeniesienia miazgi wątroby z dysocjowanymi hepatocytami (Rycina 4A). Mniejsze pipety z mniejszymi otworami zwiększają naprężenie ścinające i nieodwracalnie uszkadzają hepatocyty. - Dodaj łącznie 30 ml zimnego medium, aby wypłukać szalkę Petriego, przefiltruj je, a następnie przelej zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml, aż zostanie ona wypełniona. Wszystkie wyizolowane komórki znajdują się obecnie w zawiesinie (Rysunek 4B).
Rycina 4: Oczyszczanie za pomocą łagodnego wirowania. (A) Homogenat wątrobowy pozostały po etapie ekstrakcji. (B) Widok mikroskopowy (powiększenie 20x) homogenatu; zauważalne jest znaczne zanieczyszczenie debrisami. (C) Etapy wirowania oczyszczającego oraz (D) widoki mikroskopowe nadfiltrów przeznaczonych do usunięcia. (E) Widok mikroskopowy oczyszczonej frakcji hepatocytów. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
8. Izolacja hepatocytów
- Wiruj z prędkością 50 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C (przy najniższym możliwym przyspieszeniu i hamowaniu).
UWAGA: Hepatocyty są gęstsze niż nieparenchymalne komórki wątroby. Dzięki niskiej sile odśrodkowej w osadzie gromadzą się tylko hepatocyty, natomiast pozostałe komórki (np. komórki odpornościowe, erytrocyty i komórki sinusoidalne) pozostają w supernatancie. - Odsuń większość supernatantu, pozostawiając 1 mL w celu resuspensji komórek poprzez delikatne potrząsanie probówką.
- Dodaj 40 mL schłodzonego medium Williams' E i ponownie wiruj z prędkością 50 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C (niskie przyspieszenie, niskie hamowanie), aby dodatkowo usunąć martwe hepatocyty oraz szczątki komórkowe i otrzymać osad z żywych i tłustych hepatocytów (Rycina 4C).
- Wylej większość supernatantu, pozostawiając 1 mL w celu resuspensji komórek poprzez potrząsanie probówką.
- Dodaj 40 mL schłodzonego medium Williams' E i ponownie wiruj z prędkością 50 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C (niskie przyspieszenie, niskie hamowanie).
- Odsuń większość supernatantu, pozostawiając 1 mL w celu resuspensji komórek poprzez delikatne potrząsanie probówką.
UWAGA: Nie przerywaj tego procesu, dopóki komórki nie zostaną utrwalone lub przeanalizowane. Hepatocyty są bardzo delikatne i jakiekolwiek opóźnienie w procesie perfuzji, trawienia i oczyszczania może doprowadzić do uszkodzenia komórek. - Wyznacz końcową koncentrację komórek po dodaniu błękitu trypanu, używając ulepszonej komory licznikowej Neubauera.
UWAGA: Większość szczątków i komórek nieparenchymalnych została już usunięta, co skutkuje czystym osadem zawierającym około 10-15 × 106 hepatocytów pozostałych po hepatektomii 70%. - W zależności od pożądanej koncentracji dodaj więcej lodowatego medium. Wykorzystaj zawiesinę hepatocytów do dalszych analiz lub rozpocznij pierwotną hodowlę komórkową.
UWAGA: Na tym etapie w zawiesinie pozostaje jedynie niewielka liczba komórek odpornościowych i nieparenchymalnych (<5%). Jeśli wymagane jest dalsze oczyszczanie, przeprowadź selekcję negatywną komórek CD31+ i CD45+ za pomocą magnetycznego lub fluorescencyjnego sortowania komórek (MACS/FACS). Do chwili obecnej nie istnieje niezawodny i stabilny marker powierzchniowy dla komórek parenchymalnych wątroby.
9. Przygotowanie wyizolowanych hepatocytów do cytometrii przepływowej
- Odwiruj hepatocyty przy 100 × g przez 5 min.
- Odrzuć supernatant i dodaj odpowiednią ilość buforu do cytometrii przepływowej, zależnie od stężenia zawiesiny komórkowej.
- Przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki do cytometrii przepływowej. Odwiruj przez 5 min przy 100 × g i odrzuć supernatant.
- Dodaj do komórek 100-200 µL rozcieńczonego barwnika żywotności Alexa Fluor 488 Zombie green (stężenie 1:400) i delikatnie potrząśnij. Ostrożnie resuspenderuj hepatocyty poprzez ręczne wstrząsanie lub używając miksera Vortex z niską prędkością (maksymalnie 2-3) przez 2 s.
UWAGA: Do resuspenderowania komórek nie używaj wąskich końcówek do pipet. Są one bardzo kruche, a przykładane naprężenia ścinające powodują uszkodzenia i zmniejszają żywotność komórek. Jeśli pipetowanie jest nieuniknione, użyj pipety 1 000 µL po odcięciu najwęższej części końcówki w celu zwiększenia jej średnicy i pipetuj komórki bardzo powoli. - Umieść probówki na lodzie lub przechowuj je w temperaturze pokojowej, w zależności od planowanego barwienia. Inkubuj komórki przez 20-30 min w ciemności.
- Dodaj 2 mL buforu do cytometrii przepływowej i przemyj komórki 3x. Po każdym etapie płukania odwiruj komórki przy 100 × g przez 5 min.
- Dodaj 2 mL buforu do fiksacji (1:1 4% PFA i PBS). Ostrożnie resuspenderuj hepatocyty poprzez ręczne wstrząsanie lub używając miksera Vortex z niską prędkością (maksymalnie 2-3) przez 2 s.
- Fiksuj komórki przez 30 min.
- Odwiruj przy 100 × g przez kolejne 5 min, odrzuć supernatant i dodaj bufor do cytometrii przepływowej.
UWAGA: Komórki mogą być przechowywane w buforze do cytometrii przepływowej przed analizą do 72 h po izolacji.
10. Analiza hepatocytów za pomocą cytometrii przepływowej
- Przeanalizować hepatocyty za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją.
UWAGA: Należy uwzględnić stosunkowo duży rozmiar hepatocytów i dostosować napięcia. Zacząć od niskiego napięcia i nie przekraczać 350 V dla rozproszenia przedniego (FSC) oraz 220 V dla rozproszenia bocznego (SSC).- Dostosować napięcia dla FSC i SSC do szacowanego dużego rozmiaru komórek. Zidentyfikować populację hepatocytów i zarejestrować wszystkie zdarzenia, wykorzystując parametry SSC-A i FSC-A (Rysunek 5A).
- Zauważyć, że debris oraz komórki nieparenchymalne są wyświetlane w lewym dolnym rogu wykresu gęstości FSC względem SSC i zostają wykluczone (Rysunek 5A).
- Ponieważ dublety komórek mogą wpływać na analizę, należy sporządzić wykres gęstości wysokości rozproszenia bocznego (SSC-H) względem powierzchni rozproszenia bocznego (SSC-A) w celu wykluczenia dubletów, jak pokazano na Rysunku 5B.
- Wybrać końcową populację hepatocytów poprzez bramkowanie komórek CD31- (marker śródbłonka) i CD45- (marker immunologiczny) (Rysunek 5C).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poziom TRAS osiąga szczyt w 16 h po hepatektomii i stopniowo zanika w czasie od 32 do 48 h po standardowej hepatektomii, natomiast utrzymuje się powyżej 48 h po hepatektomii rozszerzonej. Makroskopowo TRAS jest łatwo widoczny jako blady kolor pozostałości wątroby (Rysunek 1F) i można go zaobserwować u myszy po hepatektomii między 16 a 48 h po zabiegu.
Przewidywana końcowa wydajność wynosi 10-15 × 106 hepatocyty po hepatektomii 70% i 4-9 × 106...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opublikowany protokół zapewnia niezawodną i prostą metodę izolowania wysokiej wydajności normalnych i stłuszczeniowych mysich hepatocytów do analiz pojedynczych komórek lub analizy masowej komórek po sortowaniu FACS. Wyraźną przewagą nad oczyszczaniem w gradiencie gęstości jest to, że zawartość lipidów w komórkach zasadniczo nie ma wpływu na efektywną wydajność hepatocytów. W ten sposób frakcja hepatocytów stłuszczeniowych zostanie zachowana i uwzględniona w dalszych analizach. Ma to kluczowe znaczenie nie tylko dla bada...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Swiss National Fond (grant projektu 310030_189262).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amino-reaktywny barwnik |
| Attane Isoflurane ad us. weterynarz 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | UWAGA: wymaga wentylacji |
| Roztwór EDTA | Sigma-Aldrich | E8008-100ML-Etanol | |
| Sigma-Aldrich | V001229 | Rozcieńczyć wodą do 70% | |
| Płodowa surowica bydlęca (FCS) | Gibco | A5256701-Hanks | |
| (HBSS), Ca2+, Mg2+, czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | Do trawienia/konserwacji |
| Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), bez Ca2+, bez Mg2+, bez czerwieni fenolowej | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | Do roztworu buforu perfuzyjnego |
| HEPES, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Histoacryl | |
| (butylo-2-cyjanoakryl) | B. Braun | 1050052 | Do stabilizacji miejsca kaniulacji |
| Hoechst 33258 Roztwór barwnika barwiącego | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Liofilizowane kolagenazy I/II |
| NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Maść weterynaryjna | Dechra | 17033-211-38-Sól | |
| fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Gibco | A1286301-Sudan | |
| IV – Barwienie lipidów | Sigma-Aldrich | V001423-Temgesic | |
| (chlorowodorek buprenorfiny), roztwór do wstrzykiwań 0,3 mg/ml | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narkotyki. Przechowywać w bezpiecznym miejscu. |
| Błękit trypanowy, 0,4%, sterylnie filtrowany | Sigma-Aldrich | T8154 | Do liczenia komórek |
| Williamsa Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materiały | |||
| 25 mL pipeta serologiczna, Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| mL Probówki Falcon | TPP | - | |
| -BD Neoflon, Cewnik Pro IV 26 G | BD Skrobak | 391349-Cell | |
| szerokość obrotowego ostrza 25 mm | TPP | 99004-Falcon | |
| Sitko do komórek 100 i mikro; m Nylon | BD Falcon | 352360-Fenestrated | |
| sterylna serweta chirurgiczna | - | z tkaniny wielokrotnego użytku | |
| Dysza napełniająca do rurki o rozmiarze 16 # (ID 3,1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE # 16 | Aby wejść do probówek |
| Rurki do cytometrii przepływowej, 5 ml | BD Falcon | 352008-męski | |
| Luer do Barb, ID rurki 3,2 mm | Rurka | LM41 | do strzykawki szalki |
| Petriego, 96 x 21 mm | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | Aby schować mostek |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | Do szwu skórnego |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Rurka do podwiązki pęcherzyka żółciowego |
| 16 #, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, średnica zewnętrzna 6,4 mm | Drifton | SC0374T | Rurka perfuzyjna |
| Sprzęt | |||
| BD LSRFortessa Analizator komórek Cytometr przepływowy | BD | - | |
| Golarka dla gryzoni Isis | Aesculap | GT421-Stacja | |
| Isofluran | Provet | - | |
| Wirówka wolnoobrotowa – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Ulepszona komora licząca Neubauera | Marienfeld | - | |
| -Koncentrator tlenu – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 l/min |
| Pipetboy – Pipetor Turbo-Fix | TPP | 94700-Shenchen | |
| pompa perfuzyjna – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-Mikroskop | |
| chirurgiczny – SZX9 | Olympus | - | |
| Mata ocieplająca Thermo | Lux | - | |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | |
| - Kąpiel wodna – Precision GP 02 | Thermo | scientific-Dostosuj | do 42 ° Z |
Bibliografia
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
