Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Podsumowanie

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Streszczenie

Częściowa hepatektomia była szeroko stosowana do badania regeneracji wątroby u myszy, ale izolacja wysokiej wydajności żywotnych hepatocytów do dalszych zastosowań jednokomórkowych jest wyzwaniem. U myszy obserwuje się wyraźne nagromadzenie lipidów w regenerujących się hepatocytach w ciągu pierwszych 2 dni normalnej regeneracji wątroby. Ta tak zwana przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) jest tymczasowe, ale częściowo pokrywa się z główną fazą proliferacyjną. Oczyszczanie w gradiencie gęstości jest podstawą większości istniejących protokołów izolacji pierwotnych hepatocytów. Ponieważ oczyszczanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, oddziela populacje hepatocytów niestłuszczonych od stłuszczeniowych. Dlatego hepatocyty tłuszczowe często są tracone, dając niereprezentatywne frakcje hepatocytów.

Prezentowany protokół opisuje łatwą i niezawodną metodę izolacji in vivo regenerujących się hepatocytów, niezależnie od ich zawartości lipidów. Hepatocyty od samców myszy C57BL / 6 izoluje się 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Standardowa pompa perystaltyczna napędza podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości, stosując technikę perfuzji wstecznej z odpływem przez żyłę wrotną. Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazę w celu ich uwolnienia z kapsułki Glissona. Po umyciu i dokładnym odwirowaniu hepatocyty mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Podsumowując, w artykule opisano prostą i powtarzalną technikę izolacji reprezentatywnej populacji regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy. Metoda może również pomóc w badaniu stłuszczeniowej choroby wątroby.

Wprowadzenie

Wątroba może się zregenerować nawet po dużej utracie tkanki. Ta wyjątkowa zdolność regeneracyjna jest wyraźnie zilustrowana przez eksperymentalny model częściowej (70%) hepatektomii, po raz pierwszy opisany na szczurach przez Higginsa i Andersona w 1931 roku¹. W tym modelu 70% wątroby jest chirurgicznie usuwane u zwierząt poprzez odcięcie większych płatów wątroby. Pozostałe płaty następnie rosną w wyniku kompensacyjnego przerostu, aby przywrócić pierwotną masę wątroby w ciągu około 1 tygodnia po operacji, aczkolwiek bez przywrócenia pierwotnej architektury wątroby^2,3. Opracowano dodatkowe hepatektomie z różną ilością usuwanych tkanek, takie jak hepatektomia rozszerzona o 86%, w której resztki wątroby są zbyt małe, aby się zregenerować, co ostatecznie prowadzi do niewydolności wątroby po hepatektomii (PHLF), a następnie śmierci u 30%-50% zwierząt^4,5,6. Modele te umożliwiają badanie prawidłowej i nieudanej regeneracji wątroby, w zależności od ilości wyciętej tkanki (Ryc. 1).

Chociaż mysie modele hepatektomii są z powodzeniem stosowane od wielu lat, dopiero niedawno bardziej zaawansowane metody analityczne pozwoliły na głębszy wgląd na poziomie pojedynczej komórki. Jednak w przypadku większości tych metod obecność pojedynczych hepatocytów jest podstawowym warunkiem wstępnym. Większość protokołów izolacji hepatocytów pierwotnych opiera się na dwuetapowej technice perfuzji kolagenazy i późniejszym oczyszczaniu w gradieniu gęstości w celu oddzielenia żywotnych hepatocytów od szczątków i komórek niemiąższowych, a także martwych^7,8,9. Ta metoda została po raz pierwszy opisana przez Berry'ego i Frienda w 1969 roku¹⁰ i zaadaptowana przez Seglena i współpracowników w 1972 roku^11,12. Ponieważ jednak wirowanie gradientowe zależy od gęstości i wielkości komórek, hepatocyty obciążone lipidami są często tracone podczas standardowego oczyszczania. Chociaż taka utrata może być nieistotna dla wielu pytań badawczych, jest to kluczowy aspekt dla wczesnej regeneracji wątroby. W ciągu pierwszych 2 dni hepatocyty w regenerującej się wątrobie myszy gromadzą lipidy, zwiększając w ten sposób swój rozmiar i zmniejszając gęstość. Ta przejściowa stłuszczenie związane z regeneracją (TRAS) służy do dostarczania paliwa regeneracyjnego i jest tymczasowe, ale częściowo nakłada się na główną fazę proliferacyjną i jest nierównomiernie rozmieszczone w zrazikach wątroby - jednostkach funkcjonalnych klasy wątroba13^,14. Jednak po przedłużonej hepatektomii 86% TRAS również występuje, ale utrzymuje się, ponieważ regeneracja jest zatrzymana, a lipidy nie są utleniane¹⁴. W związku z tym gradientowe oczyszczanie hepatocytów po hepatektomii 70% lub 86% da niereprezentatywne frakcje, ponieważ większość hepatocytów obciążonych lipidami jest tracona z powodu ich niskiej gęstości¹⁵.

W tym zmodyfikowanym protokole izolacji, hepatocyty myszy C57BL/6 są izolowane 24-48 godzin po hepatektomii za pomocą klasycznego dwuetapowego podejścia perfuzji kolagenazy. Zwykle kaniulacja i perfuzja pozostałości w celu izolacji komórek odbywa się przez żyłę wrotną. Jednak opór wrotno-naczyniowy w małych pozostałościach po dużej resekcji jest wysoki¹⁶, a zatem perfuzja jest delikatna. Ponieważ żyła główna pozostaje nienaruszona przez hepatektomię, perfuzję można łatwo przeprowadzić w kierunku wstecznym poprzez kaniulację żyły głównej. Standardowa pompa perystaltyczna kieruje podgrzane roztwory przez cewnikowaną żyłę główną dolną do pozostałości wątroby, wykorzystując perfuzję wsteczną z odpływem przez żyłę wrotną (rysunek uzupełniający S1). Hepatocyty są dysocjowane przez kolagenazy i uwalniane z kapsułki Glissona. Po umyciu i starannym przetworzeniu żywotnych hepatocytów poprzez stopniową izolację przy użyciu metody wirowania z niską prędkością, hepatocyty można wykorzystać do dalszych analiz.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne ze Szwajcarskimi Federalnymi Przepisami Dotyczącymi Zwierząt i zatwierdzone przez Biuro Weterynaryjne w Zurychu (nr 007/2017, 156/2019), zapewniając opiekę nad ludźmi. Samce myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni utrzymywano w 12-godzinnym cyklu dzień/noc ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Każda grupa doświadczalna składała się z sześciu do ośmiu zwierząt. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, sprzętu i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Częściowa hepatektomia u myszy

1. W przypadku standardowej hepatektomii (70%) należy podwiązać i wyciąć lewy płat boczny, prawą część płata środkowego i lewą część płata środkowego (Figura 1B). W przypadku rozszerzonej hepatektomii (86%)⁴, usuń również płaty ogoniaste i prawy płat przedni (Rysunek 1C).
2. UWAGA: Standardowa hepatektomia to zabieg, który od wielu lat jest stosowany w badaniach nad regeneracją wątroby. Dostępne są protokoły dla tej procedury^3,17, w tym protokół wspomagany wideo Mitchella i Willenbringa¹⁸. Więcej szczegółów na temat technik stosowanych w przypadku hepatektomii można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.

Rysunek 1: Standardowa (70%) i rozszerzona (86%) hepatektomia u myszy. (A) Pięć płatów wątroby myszy i ich odpowiedni wkład w całkowitą masę wątroby. (B) Schematyczna ilustracja 70% hepatektomii u myszy. Ciemne płaty reprezentują przyszłą pozostałość wątroby. (C) Schematyczna ilustracja 86% hepatektomii u myszy. Ciemne płaty reprezentują przyszłą pozostałość wątroby. (D) Precyzyjna objętość wyciętej tkanki po hepatektomii 70% i 86%. (E) Brzuch myszy bezpośrednio po 70% hepatektomii; (F) brzuch myszy natychmiast (po lewej) i 48 godzin (po prawej) po 86% hepatektomii. Zwróć uwagę na blady kolor pozostałości steatotycznej (biała strzałka). n = 6-7/grupę. Skróty: sHx = hepatektomia standardowa; eHx = rozszerzona hepatektomia; LW = masa wątroby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych

1. Przygotować perfuzji, trawienia i konserwacji (patrz Tabela 1).
   1. Dostosować pH wszystkich roztworów buforowych do temperatury 37 °C, dodając wodorotlenek sodu (NaOH) lub chlorowodór (HCl) w zależności od potrzeb. Optymalne pH wynosi 7,4.
   2. Umieść bufor konserwujący i Medium E Williamsa na lodzie.
2. Przygotować bufor do cytometrii przepływowej i przechowywać go na lodzie.

Tabela 1: Roztwory i używane do trawienia i oczyszczania hepatocytów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Przygotowanie sprzętu do perfuzji

1. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 42 °C i umieścić bufor perfuzyjny (50 ml) oraz bufor wytrawiający (10-20 ml) w łaźni wodnej. Nie należy jeszcze dodawać kolagenazy do buforu do wytrawiania.
2. Przygotuj pompę perystaltyczną i włóż rurkę. Pełna konfiguracja perfuzji jest pokazana w Rysunek 2.
   1. Podłącz kaniulę dożylną 26 G do końcówki wylotowej rurki za pomocą złącza Luer lock. Włóż końcówkę wlotową rurki do wstępnie podgrzanej rurki buforowej perfuzyjnej w łaźni wodnej. Przepłucz rurkę 70% etanolem, a następnie 50 ml sterylnego chlorku sodu (NaCl 0,9%). Zalać rurkę ciepłym buforem perfuzyjnym (prędkość pompy 3 ml/min).
3. Uspokoić mysz za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem (800 ml/min_O2, 3%-5% izofluranu do indukcji i 2% do leczenia podtrzymującego podczas zabiegu). Izofluran należy obchodzić się pod kapturem laboratoryjnym i zapewnić odpowiednią wentylację.
4. Buprenorfinę podawać podskórnie 30 minut przed zabiegiem w dawce 0,1 mg/kg masy ciała.
5. Aby zapobiec hipotermii, umieść uspokojoną mysz na podkładce rozgrzewającej i umieść zwiniętą tkankę z tkaniny pod górną częścią brzucha, aby podnieść wątrobę ponad inne narządy i ułatwić dostęp do żyły głównej dolnej.
   UWAGA: Nie używaj zbyt grubej tkanki, ponieważ możliwe jest załamanie naczyń krwionośnych, co wpłynie na skuteczność perfuzji.
6. Dodaj maść do oczu, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
7. Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, testując odruch wycofania pedału (ucisk opuszki stopy na obu tylnych łapach). W przypadku wystąpienia odpowiedzi należy podać dodatkowe znieczulenie i powtórzyć test przed rozpoczęciem zabiegu.
8. Oczyść brzuch 70% etanolem.
   1. Ponownie otwórz nacięcie w linii środkowej, przecinając szew i delikatnie rozsuwając krawędzie rany. Jeśli hepatektomia jest starsza niż 24-48 godzin, usuń szew i przetnij skórę nożyczkami.
   2. Przymocuj szew polipropylenowy 5-0 do mostka, pociągnij go czaszkowo i zamocuj w tej pozycji. Użyj retraktora lub prostych klipsów, aby utrzymać brzuch otwarty. Jama brzuszna musi być odsłonięta tak bardzo, jak to możliwe, aby zoptymalizować dostęp i wizualizację.
9. Przesuń jelita w prawo za pomocą bawełnianych wacików, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną. Użyj mokrej szmatki, aby zatrzymać jelita.
10. Umieść ciężki przedmiot o wysokości około 2 cm (np. pokryty silikonem pierścień obciążnikowy do kolb miarowych) w pobliżu tylnych nóg myszy (rysunek uzupełniający S2A). Umieść rurkę z podłączoną kaniulą dożylną 26 G na przedmiocie i ostrożnie umieść igłę na żyle głównej. Dostosuj długość rurki.
11. Umieścić przygotowany roztwór podstawowy kolagenazy do wstępnie podgrzanej probówki buforowej do wytrawiania. Dodać 250 μl roztworu podstawowego do 10 ml buforu wytrawiającego. Przygotuj 10-20 ml buforu trawiennego na zwierzę. W przypadku większych zwierząt lub perfuzji całych wątrób przygotuj do 30 ml buforu trawiennego.
    UWAGA: Zaleca się dodanie roztworu podstawowego kolagenazy do podgrzanego buforu wytrawiającego na około 30 minut przed rozpoczęciem procesu trawienia.
    
    Figure 2: Przegląd ustawień perfuzji. (A) Stół chirurgiczny ze sprzętem potrzebnym do perfuzji. (B) Materiały potrzebne do przygotowania wątroby, a także ekstrakcji i izolacji hepatocytów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Kaniulacja i perfuzja

1. Ustaw prędkość pompy na 3 ml/min i włącz pompę. Pozwól, aby podgrzany bufor perfuzyjny dotarł do igły. Odrzucić pierwsze 2-3 ml buforu perfuzyjnego.
2. Wykonaj kaniulację żyły głównej dolnej.
   1. Podczas gdy bufor przepływa przez igłę, wprowadzić kaniulę dożylną 26 G pod płytkim kątem do żyły głównej poniżej nerki. Upewnij się, że skos igły jest skierowany do góry.
   2. Za pomocą bawełnianego wacika delikatnie pociągnij żyłę główną doogonowo poniżej miejsca nakłucia, tak aby zapewnione napięcie ułatwiło wprowadzenie kaniuli do żyły. Poszukaj krwi w komorze błyskowej cewnika, gdy igła wejdzie w światło.
   3. Przesuń igłę o dodatkowe 2-3 mm, aby upewnić się, że końcówka plastikowego cewnika również weszła do żyły.
   4. Wsuń plastikowy cewnik na igłę i do żyły głównej o kolejne 5 mm. Wyjmij igłę powoli i bardzo ostrożnie.
      UWAGA: Nie zaleca się mocowania kaniuli za pomocą ligatury. Ten etap jest czasochłonny, ponieważ w tym celu naczynie musi zostać najpierw wypreparowane. Jeśli kaniula jest luźno umieszczona i podparta przedmiotem, dalsze mocowanie nie jest konieczne (patrz konfiguracja perfuzji na rysunku uzupełniającym S2). Aby ustabilizować miejsce kaniulacji i zapobiec przepływowi wstecznemu, na miejsce kaniulacji można dodać pojedynczą kroplę monomerycznego cyjanoakrylanu n-butylu.
3. Gdy krew wypłynie z kaniuli, napełnij ją ciepłym buforem perfuzyjnym za pomocą strzykawki.
4. Ponownie podłącz probówkę do kaniuli, nadal działając z prędkością pompy 3 ml/min. Pozwól, aby bufor perfuzyjny dostał się do wątroby.
5. Po 2-3 s poszukaj białych plam tworzących się w wątrobie i/lub rozszerzenia/obrzęku żyły wrotnej, które wskazują, że bufor perfuzyjny przepływa przez wątrobę i wchodzi do zrazików wątroby z żyły centralnej (Ryc. 3).
6. Poczekaj, aż żyła wrotna widocznie puchnie w ciągu 1-2 sekund po pojawieniu się białych plam na powierzchni wątroby. Przeciąć żyłę wrotną nożyczkami jak najdystalniej od wnęki wątroby. Użyj klipsa do mikro naczynia, aby oznaczyć (nie zasłaniać) miejsce cięcia (Rysunek 3B).
   UWAGA: Upraszcza to ocenę przepływu przez wątrobę podczas procesu perfuzji. Wątroba natychmiast oczyszcza się z krwi i w ciągu kilku sekund zmienia kolor na żółto-biały (Ryc. 3C). Dodatkowe nacięcie przez skórę po prawej stronie otworu brzusznego ułatwia odpływ krwi, a także roztworu perfuzyjnego (Rysunek 3B i Rysunek uzupełniający S2B,C).
7. Zwiększ przepływ do 4-7 ml / min w zależności od masy ciała zwierzęcia, wielkości wątroby i zakresu wcześniejszej hepatektomii.
8. Zacisnąć żyłę wrotną pęsetą lub zaciskiem naczyniowym na 7-10 s. Upewnij się, że nie przepływa przez nią płyn.
   UWAGA: Wątroba widocznie puchnie podczas zaciskania i rozluźnia się po uwolnieniu. Ma to kluczowe znaczenie dla przepłukania całej wątroby i oczyszczenia jej z pozostałej krwi.
9. Wykonaj drugi zacisk po około 30 s i upewnij się, że wątroba puchnie i rozluźnia się. Kontynuuj płukanie zwierzęcia, aż bufor wypływający z żyły wrotnej będzie czysty, ale przynajmniej przez 3-4 minuty.
   UWAGA: Prędkość pompy zależy od rurki, a także od wielkości wątroby. Musi być oceniany indywidualnie.
10. Na tym etapie procedury eutanazja powinna była nastąpić wtórnie do wykrwawienia. Upewnij się, że krążenie ogólnoustrojowe zostało zatrzymane (brak bicia serca lub migotania serca). Aby zapewnić śmierć, na tym etapie procedury wykonuje się obustronną odmę opłucnową jako wtórną metodę fizyczną eutanazji.
    UWAGA: Nieznacznie zmniejsz prędkość pompy, jeśli krążenie ogólnoustrojowe zostało zatrzymane (brak bicia serca lub migotania serca).

Rysunek 3: Proces perfuzji od kaniulacji do trawienia. (A) Anatomia wątroby myszy z żyłą główną dolną (biała strzałka) i żyłą wrotną (żółta strzałka). (B) Kaniulacja żyły głównej dolnej. Kaniula zabezpieczona jest podwiązaniem (biała strzałka), a miejsce odpływu przez otwartą żyłę wrotną jest oznaczone (nie zaciśnięte) zaciskiem mikronaczyniowym. (C) Zwróć uwagę na pojawienie się niejednolitych struktur, zanim bufor perfuzyjny oczyści wątrobę z całej pozostałej krwi (biała strzałka). Skóra jest nacinana (żółta strzałka) i umieszczany jest bawełniany wacik, aby zapewnić drenaż krwi i płynu perfuzyjnego. Zaciskanie przerywane można wykonać za pomocą zacisku naczyniowego lub pęsety. (D) Wątroba powinna zostać oczyszczona z całej krwi (*). Po tym, jak bufor trawienny zawierający kolagenazę dostanie się do wątroby, nie będzie się już rozluźniać po zaciśnięciu, a płaty wątroby zwiększą się. (E) Po pewnym czasie można zaobserwować bąbelkowy wygląd na powierzchni wątroby (*). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Trawienie

1. Wstrzymaj pompę perfuzyjną i szybko przenieś rurkę wlotową z buforu perfuzyjnego do wstępnie podgrzanego buforu do wytrawiania. Uruchom ponownie pompę.
2. Zanim bufor trawienny dotrze do wątroby, należy jeszcze raz zacisnąć żyłę wrotną na 3-4 s. Upewnij się, że wątroba rozluźnia się po zwolnieniu zacisku, a płyn perfuzyjny pozostaje czysty.
   UWAGA: Bufor wytrawiający zawiera czerwień fenolową i jest łatwy do odróżnienia od klarownego buforu perfuzyjnego. Pozwala to na łatwe śledzenie w tubie.
3. Gdy tylko bufor trawienny dotrze do wątroby, ponownie zaciśnij żyłę wrotną za pomocą zacisku do mikronaczyń.
   UWAGA: Podczas zaciskania wątroba puchnie, ale nie rozluźnia się po zwolnieniu zacisku. To normalne.
4. Aby ułatwić proces trawienia, zamknąć żyłę główną górną zaciskiem naczyniowym bezpośrednio pod przeponą, aby umożliwić przejście buforu trawiennego z żyły głównej dolnej do wątroby do odpływu przez otwartą żyłę wrotną.
   UWAGA: To zaciskanie zapewnia ominięcie krążenia ogólnoustrojowego i zapobiega niepotrzebnemu kontaktowi z resztkowymi składnikami/inhibitorami krwi. Ten krok jest opcjonalny, ponieważ trudno jest zbliżyć się do żyły głównej górnej za powiększoną tkanką wątroby po pozorowanej operacji, ale dostęp jest znacznie łatwiejszy u myszy poddanych hepatektomii.
5. Trawić przez około 4 minuty przy natężeniu przepływu 5 ml/min. W miarę postępu trawienia szukaj oznak początku puchnięcia wątroby i małych przezroczystych odcinków na powierzchni wątroby. Ponadto zauważ, że wątroba nabiera tekstury mokrego kawałka materiału i wydaje się prawie rozmoczona (Rysunek 3E). Zbadaj konsystencję, ostrożnie dotykając wilgotnym bawełnianym wacikiem.
6. Kontynuuj perfuzję, aż będzie można zauważyć wyraźną różnicę w teksturze powierzchni wątroby. Zauważ, że wątroba nabiera bardzo jasnego koloru i bąbelkowego wyglądu (Ryc. 3E), a torebka Glissona (tj. worek wątroby) oddziela się od miąższu. Przerwij proces trawienia, gdy tylko wątroba uzyska te właściwości, ponieważ nadmierne trawienie może uszkodzić hepatocyty. Wyjąć igłę, zanim powietrze dostanie się do wątroby.
   UWAGA: Zwykle potrzeba 10-20 ml buforu trawiennego, aby osiągnąć wystarczające trawienie. Zależy to od wielkości zwierzęcia, zakresu hepatektomii, konfiguracji rurki i jakości roztworu kolagenazy. W razie potrzeby wydłuż czas perfuzji, a nie prędkość perfuzji. Zbyt duże ciśnienie w układzie naczyniowym może spowodować pęknięcie wątroby, a płyn perfuzyjny/trawienny może zostać utracony do przestrzeni zaotrzewnowej.

6. Przygotowanie wątroby

1. Delikatnie usuń wątrobę z jamy brzusznej. Bądź bardzo ostrożny, ponieważ jest teraz bardzo cienki i delikatny.
2. Chwyć centralną tkankę łączną między płatami za pomocą kleszczy i lekko unieś ją do góry, używając jej jako punktu zaczepienia.
3. Przeciąć wszystkie połączenia wątroby z innymi narządami, usunąć woreczek żółciowy i umieścić wątrobę w lodowatym buforze konserwującym.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby ekstrakcja hepatocytów i dalsze przetwarzanie odbyły się natychmiast, aby utrzymać żywotność hepatocytów. Jednakże, w razie konieczności, wątroba może być przechowywana przez krótki czas w temperaturze 4 °C (np. do transportu). Opóźnienie to nie powinno przekraczać 30-40 minut.

7. Ekstrakcja hepatocytów

1. Przenieś wątrobę na 10-centymetrową szalkę Petriego i dodaj 10 ml lodowatego Medium E Williamsa.
2. Rozerwij kapsułkę Glissona pęsetą z cienką końcówką w kilku miejscach wzdłuż powierzchni wątroby. Chwyć centralną część (np. tkankę łączną przy wnęce wątroby) dwiema parami pęset i powoli je rozsuń, pozwalając kapsułki rozerwać się bez uszkadzania hepatocytów. Uwolnić komórki, delikatnie potrząsając kapsułką (Rysunek uzupełniający S3).
   UWAGA: Idealnie, wątroba łatwo rozrywa się i uwalnia komórki. Nie używaj siły. Skrobak do komórek może pomóc w całkowitym usunięciu wszystkich komórek i zwiększeniu wydajności komórek. Nie kroić wątroby na kawałki nożyczkami.
3. Przefiltrować 5 ml miazgi wątrobowej przez sitko o wielkości 100 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz filtr 10 ml świeżego, lodowatego podłoża. Przefiltruj pozostałe 5 ml miazgi przez sitko do komórek.
   UWAGA: Użyj pipety serologicznej o pojemności 25 ml, aby przenieść miazgę wątrobową ze zdysocjowanymi hepatocytami (Figura 4A). Mniejsze pipety z mniejszymi otworami zwiększają naprężenia ścinające i nieodwracalnie uszkadzają hepatocyty.
4. Dodać łącznie 30 ml zimnego podłoża, aby przepłukać szalkę Petriego, przefiltrować ją i dodać zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml, aż będzie pełna. Wszystkie wyizolowane komórki są teraz w zawieszeniu (Rysunek 4B).

Rysunek 4: Oczyszczanie przez delikatne odwirowanie. (A) Homogenat wątroby pozostały po etapie ekstrakcji. (B) Widok mikroskopowy (20-krotne powiększenie) homogenatu; Zwróć uwagę na oznaczone zanieczyszczenie gruzem. (C) Etapy oczyszczania, wirowania i (D) mikroskopowe widoki supernatantów, które mają zostać odrzucone. (E) Mikroskopowy widok oczyszczonej frakcji hepatocytów. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Izolacja hepatocytów

1. Wirować z prędkością 50 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C (najniższe możliwe przyspieszenie i najmniejsze hamowanie).
   UWAGA: Hepatocyty są gęstsze niż komórki wątroby niemiąższowe. Ze względu na niską siłę wirowania tylko hepatocyty są granulowane, podczas gdy inne komórki (np. komórki odpornościowe, erytrocyty i komórki sinusoidalne) pozostają w supernatancie.
2. Odessać większość supernatantu, pozostawiając 1 ml do ponownego zawieszenia komórek poprzez delikatne obracanie probówki.
3. Dodać 40 ml zimnego podłoża E Williamsa i ponownie wirować w temperaturze 50 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (niskie przyspieszenie, niskie hamowanie), aby dodatkowo usunąć martwe hepatocyty i resztki komórek oraz hepatocyty żywotne i tłuszczowe (Rysunek 4C).
4. Odrzucić większość supernatantu, pozostawiając 1 ml do ponownego zawieszenia komórek poprzez zawirowanie probówki.
5. Dodać 40 ml zimnego Williams' E medium i ponownie wirować przy 50 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (niskie przyspieszenie, słabe hamowanie).
6. Odessać większość supernatantu, pozostawiając 1 ml do ponownego zawieszenia komórek, delikatnie obracając probówkę.
   UWAGA: Nie zatrzymuj tego procesu, dopóki komórki nie zostaną naprawione lub przeanalizowane. Hepatocyty są bardzo delikatne i każde opóźnienie w procesie perfuzji, trawienia i oczyszczania może uszkodzić komórki.
7. Oznaczyć końcowe stężenie komórek po dodaniu błękitu trypanowego, używając ulepszonej przez Neubauera komory liczącej.
   UWAGA: Większość szczątków i komórek niemiąższowych została już usunięta, co spowodowało powstanie czystej osadki składającej się z około 10-15 × 10⁶ hepatocytów pozostałych po 70% hepatektomii.
8. W zależności od pożądanego stężenia dodaj więcej lodowatego podłoża. Zawiesinę komórek hepatocytów należy wykorzystać do dalszej analizy lub rozpocząć pierwotną hodowlę komórkową.
   UWAGA: Na tym etapie w zawiesinie pozostaje tylko kilka komórek immunologicznych i niemiąższowych (<5%). Jeśli wymagane jest dalsze oczyszczanie, przeprowadź negatywną selekcję komórek CD31⁺ i CD45⁺ metodą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub fluorescencyjnie (MACS/FACS). Do tej pory nie ma wiarygodnego i solidnego markera powierzchniowego dla komórek miąższowych wątroby.

9. Przygotowanie izolowanych hepatocytów do cytometrii przepływowej

1. Odwirować hepatocyty w stężeniu 100 × g przez 5 minut.
2. Odrzucić supernatant i dodać żądaną ilość buforu cytometrii przepływowej, w zależności od stężenia zawiesiny komórek.
3. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki do cytometrii przepływowej. Wirować przez 5 minut przy stężeniu 100 × g i odrzucić supernatant.
4. Dodać 100-200 μl rozcieńczonego zielonego barwnika żywotności Alexa Fluor 488 Zombie (stężenie 1:400) do komórek i delikatnie nimi wstrząsnąć. Ostrożnie ponownie zawiesić hepatocyty przez ręczne potrząsanie lub za pomocą mieszalnika wirowego na niskich obrotach (maksymalnie 2-3) przez 2 s.
   UWAGA: Nie używaj małych końcówek pipet do ponownego zawieszenia komórek. Są one bardzo delikatne, a przyłożone naprężenie ścinające powoduje uszkodzenia i zmniejsza żywotność komórek. Jeśli nie można uniknąć pipetowania, po odcięciu najmniejszej części od końcówki należy użyć pipety o pojemności 1 000 μl, aby zwiększyć średnicę i bardzo powoli pipetować komórki.
5. Umieść probówki na lodzie lub przechowuj je w temperaturze pokojowej, w zależności od pożądanego zabarwienia. Inkubuj komórki przez 20-30 minut w ciemności.
6. Dodać 2 ml buforu do cytometrii przepływowej i przepłukać komórki 3 razy. Odwirować komórki po każdym etapie płukania w ilości 100 × g przez 5 minut.
7. Dodać 2 ml buforu utrwalającego (1:1, 4% PFA i PBS). Ostrożnie ponownie zawiesić hepatocyty przez ręczne potrząsanie lub za pomocą mieszalnika wirowego na niskich obrotach (maksymalnie 2-3) przez 2 sekundy.
8. Napraw komórki na 30 minut.
9. Odwirować przy stężeniu 100 × g przez kolejne 5 minut, odrzucić supernatant i dodać bufor cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Komórki mogą być przechowywane w buforze cytometrii przepływowej przed analizą do 72 godzin po izolacji.

10. Analiza hepatocytów za pomocą cytometrii przepływowej

1. Analizuj hepatocyty za pomocą aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek.
   UWAGA: Weź pod uwagę stosunkowo duży rozmiar hepatocytów i dostosuj napięcia. Zacznij od niskiego napięcia i nie przekraczaj 350 V dla rozproszenia do przodu (FSC) i 220 V dla rozproszenia bocznego (SSC).
   1. Dostosuj napięcia dla FSC i SSC do szacowanego dużego rozmiaru ogniw. Zidentyfikuj populację hepatocytów i zarejestruj wszystkie zdarzenia za pomocą SSC-A i FSC-A (Rysunek 5A).
   2. Zauważ, że szczątki i komórki niemiąższowe są wyświetlane w lewym dolnym rogu wykresu gęstości FSC w porównaniu z SSC i są wykluczone (Rysunek 5A).
   3. Ponieważ komórki dubletowe mogą wpływać na analizę, skonstruuj wykres gęstości wysokości rozrzutu bocznego (SSC-H) w stosunku do obszaru rozrzutu bocznego (SSC-A), aby wykluczyć dublety, jak pokazano na Rysunek 5B.
   4. Wybierz końcową populację hepatocytów przez bramkowanie komórek CD31^- (marker śródbłonka) i CD45^- (marker immunologiczny) (Figura 5C).

Wyniki

TRAS osiąga szczyt po 16 godzinach od hepatektomii i stopniowo zanika 32-48 godzin po standardowej hepatektomii, ale utrzymuje się dłużej niż 48 godzin po przedłużonej hepatektomii. Makroskopowo TRAS jest łatwo widoczny jako blada cera pozostałości wątroby (Ryc. 1F) i można go zaobserwować u myszy poddanych hepatektomii między 16 godzinami a 48 godzinami po operacji.

Szacowana ostateczna wydajność to 10-15 × 10⁶ hepatocytów po 70%-hepatektomii i 4-9 × 10<...

Dyskusja

Opublikowany protokół zapewnia niezawodną i prostą metodę izolowania wysokiej wydajności normalnych i stłuszczeniowych mysich hepatocytów do analiz pojedynczych komórek lub analizy masowej komórek po sortowaniu FACS. Wyraźną przewagą nad oczyszczaniem w gradiencie gęstości jest to, że zawartość lipidów w komórkach zasadniczo nie ma wpływu na efektywną wydajność hepatocytów. W ten sposób frakcja hepatocytów stłuszczeniowych zostanie zachowana i uwzględniona w dalszych analizach. Ma to kluczowe znaczenie nie tylko dla bada...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	Amino-reaktywny barwnik
Attane Isoflurane ad us. weterynarz 99.9%	Provet AG	QN01AB06	UWAGA: wymaga wentylacji
Roztwór EDTA	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-Etanol
	Sigma-Aldrich	V001229	Rozcieńczyć wodą do 70%
Płodowa surowica bydlęca (FCS)	Gibco		A5256701-Hanks
(HBSS), Ca2+, Mg2+, czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	Do trawienia/konserwacji
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), bez Ca2+, bez Mg2+, bez czerwieni fenolowej	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	Do roztworu buforu perfuzyjnego
HEPES, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Histoacryl
(butylo-2-cyjanoakryl)	B. Braun	1050052	Do stabilizacji miejsca kaniulacji
Hoechst 33258 Roztwór barwnika barwiącego	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	Liofilizowane kolagenazy I/II
NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Maść weterynaryjna	Dechra	17033-211-38-Sól
fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Gibco		A1286301-Sudan
IV – Barwienie lipidów	Sigma-Aldrich		V001423-Temgesic
(chlorowodorek buprenorfiny), roztwór do wstrzykiwań 0,3 mg/ml	Indivior Europe Ltd.	345928	Narkotyki. Przechowywać w bezpiecznym miejscu.
Błękit trypanowy, 0,4%, sterylnie filtrowany	Sigma-Aldrich	T8154	Do liczenia komórek
Williamsa Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materiały
25 mL pipeta serologiczna, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
mL Probówki Falcon	TPP	-
-BD Neoflon, Cewnik Pro IV 26 G	BD Skrobak		391349-Cell
szerokość obrotowego ostrza 25 mm	TPP	99004-Falcon
Sitko do komórek 100 i mikro; m Nylon	BD Falcon	352360-Fenestrated
sterylna serweta chirurgiczna	-		z tkaniny wielokrotnego użytku
Dysza napełniająca do rurki o rozmiarze 16 # (ID 3,1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE # 16	Aby wejść do probówek
Rurki do cytometrii przepływowej, 5 ml	BD Falcon	352008-męski
Luer do Barb, ID rurki 3,2 mm	Rurka	LM41	do strzykawki szalki
Petriego, 96 x 21 mm	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	Aby schować mostek
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	Do szwu skórnego
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Rurka do podwiązki pęcherzyka żółciowego
16 #, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, średnica zewnętrzna 6,4 mm	Drifton	SC0374T	Rurka perfuzyjna
Sprzęt
BD LSRFortessa Analizator komórek Cytometr przepływowy	BD	-
Golarka dla gryzoni Isis	Aesculap	GT421-Stacja
Isofluran	Provet	-
Wirówka wolnoobrotowa – Scanspeed 416	Labogene	-	-
Ulepszona komora licząca Neubauera	Marienfeld	-
-Koncentrator tlenu – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 l/min
Pipetboy – Pipetor Turbo-Fix	TPP	94700-Shenchen
pompa perfuzyjna – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x-Mikroskop
chirurgiczny – SZX9	Olympus	-
Mata ocieplająca Thermo	Lux	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092
- Kąpiel wodna – Precision GP 02	Thermo	scientific-Dostosuj	do 42 ° Z