Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Streszczenie

Osteocyty są uważane za komórki nieproliferacyjne, które są ostatecznie zróżnicowane od osteoblastów. Osteoblasty osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej kości (osteoid) wyrażają gen Pdpn w celu utworzenia dendrytów komórkowych i przekształcenia się w preosteocyty. Później preosteocyty wyrażają gen Dmp1, aby promować mineralizację macierzy, a tym samym przekształcać się w dojrzałe osteocyty. Proces ten nazywa się osteocytogenezą. IDG-SW3 to dobrze znana linia komórkowa do badań in vitro osteocytogenezy. Wiele wcześniejszych metod wykorzystywało kolagen I jako główny lub jedyny składnik matrycy hodowlanej. Jednak oprócz kolagenu I, osteoid zawiera również substancję naziemną, która jest ważnym składnikiem w promowaniu wzrostu, adhezji i migracji komórek. Ponadto substancja matrycy jest przezroczysta, co zwiększa przezroczystość żelu uformowanego w kolagen I, a tym samym pomaga w badaniu tworzenia dendrytów za pomocą technik obrazowania. W związku z tym artykuł ten szczegółowo opisuje protokół tworzenia żelu 3D przy użyciu macierzy zewnątrzkomórkowej wraz z kolagenem I w celu przeżycia IDG-SW3. W niniejszej pracy analizowano tworzenie dendrytów i ekspresję genów podczas osteocytogenezy. Po 7 dniach hodowli osteogennej pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym wyraźnie zaobserwowano rozległą sieć dendrytów. PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że poziomy mRNA Pdpn i Dmp1 stale rosły przez 3 tygodnie. W 4. tygodniu stereomikroskop ujawnił nieprzezroczysty żel wypełniony cząstkami mineralnymi, zgodny z testem fluorescencji rentgenowskiej (XRF). Wyniki te wskazują, że ta matryca hodowli skutecznie ułatwia przejście od osteoblastów do dojrzałych osteocytów.

Wprowadzenie

Osteocyty to kończnie zróżnicowane komórki pochodzące z osteoblastów^1,2. Gdy osteoblast zostanie zakopany przez osteoid, ulega osteocytogenezie i ulega ekspresji genu Pdpn, tworząc preosteocyty, genu Dmp1^{do mineralizacji osteoidu oraz genów} Sost i Fgf23, aby funkcjonować jako dojrzały osteocyt w tkance kostnej³. Tutaj wprowadzono system hodowli 3D w celu identyfikacji wydłużania dendrytów i ekspresji genów markerowych w procesie osteocytogenezy.

Komórki IDG-SW3 są nieśmiertelną pierwotną linią komórkową pochodzącą od transgenicznych myszy i mogą rozwijać lub replikować osteoblasty do późnego różnicowania osteocytów, gdy są hodowane w różnych podłożach⁴. W porównaniu z MLO-A5, MLO-Y4 i innymi liniami komórkowymi, profil ekspresji funkcjonalnych białek, zdolność do odkładania soli wapniowej i odpowiedzi na różne hormony w komórkach IDG-SW3 są bardziej prawdopodobne, że będą takie same jak w przypadku pierwotnych osteocytów w tkance kostnej⁴.

W porównaniu do systemów 2D, systemy hodowli 3D są bardziej zdolne do naśladowania środowiska wzrostu komórkowego in vivo, w tym gradientu składników odżywczych, niskiej sztywności mechanicznej i otaczającego zakresu mechanicznego (Tabela 1). Większość poprzednich metod hodowli komórek osteoblastycznych w systemie 3D wykorzystywała kolagen I jako unikalny składnik preparatów^4,5,6, ponieważ włókna kolagenu I służą jako miejsce odkładania się wapnia i fosforu. Jednak niezbędny składnik osteoidu, macierz zewnątrzkomórkowa, zawiera dużą grupę czynników komórkowych, które promują wzrost, adhezję i migrację komórek^7,8 i jest przezroczysty i wygodny do obserwacji obrazowej. W związku z tym protokół ten wykorzystuje Matrigel (zwany dalej macierzą błony podstawnej) jako drugorzędny składnik do badania osteocytogenezy.

Protokół

Ten protokół jest odpowiedni do hodowli komórek w czterech dołkach z 24-dołkowymi płytkami. W przypadku przygotowywania wielu próbek lub płytek należy odpowiednio zwiększyć ilości odczynników.

1. Przygotowanie mieszanki kolagenu I

UWAGA: Kolagen I i żel macierzy błony podstawnej szybko w temperaturze pokojowej. Dlatego z kolagenem należy obchodzić się na lodzie (od 2 °C do 8 °C). Wszystkie użyte końcówki i rurki muszą być wstępnie schłodzone, chyba że wskazano inaczej. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w kapturze ochronnym.

1. Umieść wszystkie odczynniki i probówki wirówkowe na lodzie.
2. Powoli odpipetować 0,48 ml kolagenu I (5 mg/ml) i 0,1 ml 10x minimalnej niezbędnej pożywki (MEM) (z czerwienią fenolową) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml trzymanej na lodzie. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
3. Zgodnie z paletą kolorów wskaźnika czerwieni fenolowej użyj odpowiedniej objętości 7,5% (w/v) NaHCO₃ (około 0,2 ml), aby dostosować wskaźnik czerwieni fenolowej do koloru pomarańczowego, co oznacza, że wartość pH mieści się w zakresie 7,0-7,4,
   UWAGA: W zależności od pH pożywki, objętość NaHCO₃ jest używana do doprowadzenia pH do około 7,0-7,4. Dodatkowo NaOH służy do neutralizacji pH.
4. Doprowadzić końcową objętość mieszaniny do 1 ml, dodając odpowiednią objętość ddH₂O. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby przygotować się do użycia.
   UWAGA: Ostateczna objętość ddH₂O będzie zależeć od ilości NaHCO₃ lub NaOH użytej w kroku 1.3.

2. Przygotowanie mieszaniny komórkowo-matrycowej

1. Powoli odpipetować 0,9 ml macierzy membrany podstawnej do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie.
2. Hodować komórki IDG-SW3 w kolbie T25 z 4 ml kompletnej pożywki (alfa-MEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) uzupełnionej 50 U/ml INF-γ w temperaturze 33 °C.
3. Gdy komórki IDG-SW3 osiągną 90% konfluencję, usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4 w całym protokole) pipetą. Trawić komórki 0,5 ml 0,25% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 30 s.
4. Inaktywuj trypsynę, dodając 3,5 ml kompletnej pożywki (alfa-MEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]). Przenieść zawiesinę komórek o objętości 4 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
5. Odwirowywać zawiesinę komórek w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml kompletnej pożywki na lodzie.
6. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj końcową gęstość komórek za pomocą kompletnej pożywki do 4 × 10⁵ komórek/ml. Dodać 0,1 ml przygotowanej zawiesiny komórkowej do 0,9 ml macierzy zewnątrzkomórkowej z kroku 2.1. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
   UWAGA: Jeśli potrzebna jest kontrola bezkomórkowa, dodaj 0,1 ml kompletnej pożywki do 0,9 ml macierzy zewnątrzkomórkowej jako kontrolę ujemną.

3. Powlekanie mieszaniny komórkowo-żelowej

1. Delikatnie dobrze wymieszaj obie mieszaniny z kroku 2.6 i kroku 1.4 do 2 ml, pipetując lód w górę i w dół. Odpipetować 0,5 ml końcowej mieszaniny do każdego dołka (cztery dołki na płytce 24-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania mieszaniny komórek i żelu.
2. Dodaj 0,5 ml pożywki osteogennej (kompletna pożywka zawierająca 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 4 mM β-glicerofosforanu, znanego również jako pożywka indukcyjna osteogenna)⁴ do mieszaniny komórkowo-żelowej w każdym dołku, aby rozpocząć różnicowanie osteogenne w temperaturze 37 °C. Rozważ to jako Dzień 0.
3. Co 2 dni zastępować połowę pożywki świeżą pożywką osteogenną utrzymywaną w temperaturze 37 °C. Kontynuować hodowlę przez 35 dni.

4. Identyfikacja żywotności komórek i dendrytów komórkowych za pomocą mikroskopu konfokalnego

1. Barwienie komórek
   UWAGA: Ester acetoksymetylowy kalceiny (kalceina AM) jest barwnikiem przenikającym komórki, który można wykorzystać do określenia żywotności komórek. Ethidium homodimer-I (EthD-1) nie przenika przez błonę nienaruszonych/żywotnych komórek⁹. W ten sposób kalceina AM/EthD-1 może być używana do identyfikacji żywotności komórek i dendrytów komórkowych.
   1. W dniu 1 i 7 hodowli wyjąć z zamrażarki roztwór podstawowy kalceiny AM (4 mM w DMSO) i roztwór podstawowy EthD-1 (2 mM w DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Zmineralizowana matryca ma silny sygnał autofluorescencyjny, więc stadium preosteocytów bez ekspresji Dmp1 w ciągu 7 dni od hodowli⁴ jest bardziej odpowiednie do obserwacji barwienia komórek.
   2. Dodać 4 μl 2 mM roztworu podstawowego EthD-1 i 5 μl 4 mM roztworu podstawowego kalceiny AM do 2 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco i dobrze wymieszać. Daje to około 2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1 jako roztwory robocze.
   3. Odpipetować 0,5 ml roztworu roboczego do studzienek na płytce 24-dołkowej. Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia matrycy komórkowo-żelowej.
   4. Po inkubacji dodać około 0,5 ml świeżego D-PBS do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Przykryj naczynie, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wysuszeniu próbek.
   5. Za pomocą kleszczyków zakończonych łokciami ostrożnie przenieść wybarwioną matrycę komórkowo-żelową z kroku 4.1.3 do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z kroku 4.1.4. Unikaj uszkadzania lub ścinania matrycy komórkowo-żelowej.
   6. Zobacz oznakowane komórki pod laserowym konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Zestaw do skanowania mikroskopem
   1. Umieść szalkę 35 mm na scenie. Wybierz obszary matrycy żelu komórkowego, które mają być skanowane przez okular za pomocą obiektywu 10x. Obiektywy o większym powiększeniu nie są zalecane ze względu na rozmiar rozszerzonych dendrytów.
   2. Wybierz filtry optyczne. Kalceina może być postrzegana jako zielona ze standardowym filtrem pasmowoprzepustowym fluoresceiny, a EthD-1 może być postrzegana jako czerwona z filtrami jodku propidyny lub barwnika Texas Red. Wybierz "tryb linii" do skanowania i ustaw "otworek" na 2 μm.
   3. Wybierz głębię danych o 8-bitowej głębi danych i rozdzielczość obrazu 1 024 pikseli x 1 024 piksele.
   4. Obraz za pomocą sekwencyjnego skanowania liniowego z optymalnymi ustawieniami lasera i detektora (zachowaj minimalną energię lasera, aby uniknąć potencjalnego fotowybielania).
      UWAGA: Optymalne ustawienie detektora zależy od końcowych sygnałów fluorescencyjnych.
3. Zbieranie "z-stosu" obrazów
   1. Zgodnie z sygnałem kanału zielonego zdefiniuj górną i dolną pozycję matrycy komórka-żel, która ma być skanowana, skupiając się na próbce podczas ciągłego skanowania.
   2. Po określeniu górnej i dolnej części próbki wybierz żądaną ramkę skanowania. Rozpocznij skanowanie. Próbka zostanie zeskanowana od góry do dołu z wybranymi ustawieniami z kroku 4.2, generując galerię obrazów.
4. Identyfikacja żywotności komórek.
   1. Wybierz jeden plasterek z kroku 4.3. Zielony i czerwony kanał wskazują odpowiednio żywe i martwe komórki.
5. Identyfikacja dendrytów komórkowych.
   1. Wybierz pojedynczy kanał zielony, aby wygenerować rekonstrukcje 3D za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Informacje o głębi są wyświetlane jako seria tęczowych obrazów pseudokolorowych. Dendryty znajdujące się na dole żelu są wyświetlane na czerwono, podczas gdy te na górze są wyświetlane na niebiesko.

5. Identyfikacja wyglądu za pomocą stereomikroskopu

1. W dniu 1, 7, 21 i 35 hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyć żele na płytce za pomocą D-PBS. Dodaj 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehydu w D-PBS do studzienki, aby utrwalić matrycę komórkowo-żelową w płytce przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usuń paraformaldehyd ze studzienki i umyj matrycę komórkowo-żelową jeszcze dwa razy za pomocą D-PBS w płytce. Pozostaw 0,5 ml D-PBS w każdym dołku do obrazowania.
3. Umieść płytkę na stoliku i wybierz optymalną pozycję przez okular za pomocą obiektywu 0,5x. Zobrazuj widok całego pola matrycy komórkowo-żelowej w płytce indywidualnie, korzystając z "automatycznej ekspozycji" w jasnym polu.

6. Identyfikacja depozycji minerałów za pomocą testu XRF

1. W 35 dniu hodowli sprawdź, czy ciekły azot jest wystarczający. Uruchom system XRF. Otwórz pomieszczenie z próbkami i przenieś żele za pomocą kleszczyków zakończonych łokciami z płytki na środek stolika na próbki instrumentu. Zamknij pomieszczenie na próbki i odczekaj 30 minut, aby przyrząd ostygł przed użyciem.
2. Ustaw "Czas ekspozycji" na 35 ms, "Zakres widma" na 0-40 keV, a "Prąd elektryczny" na 770 μA w celu konfiguracji akwizycji.
3. Wybierz od trzech do pięciu miejsc skanowania do analizy, przesuwając stolik z próbką.
4. Wybierz elementy (Ca i P) do wykrycia. Rozpocznij wykrywanie i wyeksportuj wyniki.
   UWAGA: Ca i P są pierwiastkami najobficiej występującymi w hydroksyapatycie.

7. Identyfikacja funkcjonalnej ekspresji genów

1. W dniu 1, 7, 21, 28 i 35 dnia hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć matrycę komórkowo-żelową lodowatym D-PBS na płytce.
2. Przenieść żele za pomocą kleszczyków zakończonych łokciem z płytki do probówki o pojemności 2,0 ml (w zależności od czasu hodowli, matryca komórka-żel będzie się stopniowo kurczyć do około 0,1 ml w dniu 35). Upewnij się, że jeden żel jest umieszczony w jednej tubce. Do każdej probówki dodać 1 ml chloroformu fenolowego i dwie sterylne kulki do ubijania ze stali nierdzewnej (4 mm, jako matrycę do lizy). Umieścić probówki symetrycznie w wstępnie schłodzonym otworze na próbkę w mechanicznym homogenizatorze ubijającym.
3. Ustaw dudnienie na częstotliwość 55 Hz i amplitudę 1 cm na każdą 1 minutę mechanicznego dudnienia z 10-sekundową przerwą, w sumie z sześcioma cyklami. Rozpocznij ubijanie koralików.
4. Wyekstrahować całkowite RNA z matrycy komórka-żel przy użyciu metody fenol-chloroform-izoamylachohol. Odwrotna transkrypcja 2 μg całkowitego RNA do cDNA za pomocą losowych starterów heksamerowych.
5. Zaprojektuj startery ukierunkowane na β-aktynę, Pdpn, Dmp1, Sost i Fgf23 do PCR w czasie rzeczywistym (Tabela 2). β-aktyna jest genem porządkowym używanym do normalizacji. Geny Pdpn¹⁰ i Dmp1¹¹ ulegają ekspresji głównie w preosteocytach i zmineralizowanych osteocytach, podczas gdy Sost¹² i Fgf23¹³ ulegają ekspresji głównie w dojrzałych osteocytach.
6. Umieścić probówkę na termocyklerze z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 °C i przeprowadzić amplifikację PCR przy użyciu następujących ustawień cyklicznych PCR: 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s przez 35 cykli z początkowym etapem denaturacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut i końcowym krokiem przedłużania w temperaturze 60 °C przez 30 s. Analizować zmiany krotności za pomocą metody ΔΔCt.

Wyniki

Po barwieniu żywych i martwych komórek, komórki zwizualizowano za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego. Wszystkie komórki były pozytywne pod kątem calcein AM (kolor zielony), a w polu widzenia niemal nie występowały komórki pozytywne pod kątem EthD-1 (kolor czerwony), co wskazuje, że system żelowy wykonany tą metodą jest wysoce odpowiedni dla osteocytogenezy (Rycina 1A, lewa strona). Aby lepiej określić rozkład przestrzenny komórek, wybrano obraz w pseudokolorach, aby wyświetlić dendryt...

Dyskusja

Krytycznym punktem tego protokołu jest to, że kroki 1 i 2 muszą być wykonywane na lodzie, aby zapobiec spontanicznej krzepnięciu. W tej metodzie końcowe stężenie kolagenu I wynosiło 1,2 mg/ml. W związku z tym należy obliczyć optymalną objętość ddH₂O, aby dopasować ją do różnych kolagenów różnych producentów.

In vivo osteocytogeneza polega na polarnym przemieszczaniu się osteoblastów od powierzchni do wnętrza kości beleczkowej¹⁴. Protokół ten uwalnia ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy	Hyklon	SH30042,01
probówki 15 ml	Corning, NY, USA	430791
7,5% (w/v) Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Kolagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Scientific	10099141
	Biotechnologia, Szanghaj, Chiny	SKSI
laserowa konfokalna mikroskopia fluorescencyjna	Carl  Zeiss, Oberkochen, Niemcy	LSM 800
Zestaw do obrazowania żywych/martwych komórek	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel Matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), bez glutaminy	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Hydronowy	SH30256.
Mikroskop stereoskopowy	Carl  Zeiss, Oberkochen, Niemcy	Zeiss Axio ZOOM. V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific 15596026
fluorescencja rentgenowska	EDAX, USA	EAGLE III
β-glicerofosforan	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422

homogenizator BiHeng FS