Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64534

⸱

11 października 2022

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy regeneruje się co 5-7 dni i jest kontrolowany przez populację komórek macierzystych nabłonka jelitowego (IESC) znajdującą się na dole regionu krypty. IESC obejmują aktywne komórki macierzyste, które samoodnawiają się i różnicują w różne typy komórek nabłonkowych, oraz spokojne komórki macierzyste, które służą jako rezerwowe komórki macierzyste w przypadku urazu. Regeneracja nabłonka jelitowego jest kontrolowana przez zdolności do samoodnawiania się i różnicowania tych aktywnych IESC. Ponadto równowaga populacji komórek macierzystych krypty i utrzymanie niszy komórek macierzystych są niezbędne do regeneracji jelit. Hodowla organoidów jest ważnym i atrakcyjnym podejściem do badania białek, cząsteczek sygnałowych i sygnałów środowiskowych, które regulują przeżycie i funkcje komórek macierzystych. Ten model jest tańszy, mniej czasochłonny i bardziej podatny na manipulację niż modele zwierzęce. Organoidy naśladują również mikrośrodowisko tkankowe, zapewniając znaczenie in vivo. Niniejszy protokół opisuje izolację krypt okrężnicy, osadzanie tych izolowanych komórek krypty w trójwymiarowym systemie matrycy żelowej i hodowlę komórek krypty w celu utworzenia organoidów okrężnicy zdolnych do samoorganizacji, proliferacji, samoodnawiania i różnicowania. Model ten pozwala manipulować środowiskiem - wybijając określone białka, takie jak klaudyna-7, aktywując/dezaktywując szlaki sygnałowe itp. - w celu zbadania, jak te efekty wpływają na funkcjonowanie komórek macierzystych okrężnicy. W szczególności zbadano rolę białka ścisłego połączenia klaudyny-7 w funkcji komórek macierzystych okrężnicy. Claudin-7 jest niezbędny do utrzymania homeostazy jelit oraz funkcji bariery i integralności. Nokaut klaudyny-7 u myszy wywołuje fenotyp podobny do choroby zapalnej jelit, wykazujący zapalenie jelit, przerost nabłonka, utratę masy ciała, owrzodzenia błony śluzowej, złuszczanie się komórek nabłonka i gruczolaki. Wcześniej informowano, że klaudyna-7 jest niezbędna do funkcjonowania komórek macierzystych nabłonka jelitowego w jelicie cienkim. W tym protokole ustanawia się system hodowli organoidów okrężnicy w celu zbadania roli klaudyny-7 w jelicie grubym.

Wprowadzenie

Hodowla organoidów jelitowych to trójwymiarowy (3D) system ex vivo, w którym komórki macierzyste są izolowane z krypt jelitowych tkanki pierwotnej i umieszczane w matrycy żelowej1,2. Te komórki macierzyste są zdolne do samoodnowy, samoorganizacji i funkcjonalności narządów2. Organoidy naśladują mikrośrodowisko tkanek i są bardziej podobne do modeli in vivo niż dwuwymiarowych (2D) modeli hodowli komórkowych in vitro, chociaż mniej podatne na manipulację niż komórki3,4. Model ten eliminuje przeszkody napotykane w modelach 2D, takie jak brak prawidłowych adhezji komórka-komórka, interakcje komórka-matryca i jednorodne populacje, a także zmniejsza ograniczenia modeli zwierzęcych, w tym wysokie koszty i długie okresy czasu5. Organoidy jelitowe - określane również jako kolonoidy dla tych wyhodowanych z komórek macierzystych pochodzących z krypty okrężnicy - są zasadniczo mini-narządami, które zawierają nabłonek zawierający wszystkie typy komórek, które byłyby obecne in vivo, a także światło. Model ten pozwala na manipulowanie systemem w celu badania wielu aspektów jelita, takich jak nisza komórek macierzystych, fizjologia jelit, patofizjologia i morfogeneza jelit3,5,6. Stanowi również doskonały model do odkrywania leków, badania zaburzeń jelitowych u ludzi, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i rak jelita grubego, opracowywania spersonalizowanych terapii dostosowanych do potrzeb pacjenta oraz badania regeneracji tkanek4,7,8,9. Ponadto system organoidów może być również używany do badania komunikacji komórkowej, metabolizmu leków, żywotności, proliferacji i odpowiedzi na bodźce7,8. Chociaż modele zwierzęce mogą być wykorzystywane do testowania potencjalnych terapii stanów patologicznych jelit, są one dość ograniczone, ponieważ badanie wielu leków jednocześnie stanowi wyzwanie. W in vivo występuje więcej zmiennych zakłócających, a związane z nimi koszty i czas są odpowiednio wysokie i długie. Z drugiej strony, system hodowli organoidów pozwala na badanie przesiewowe wielu środków terapeutycznych jednocześnie w krótszym czasie, a także pozwala na spersonalizowane leczenie poprzez zastosowanie hodowli organoidów pochodzących od pacjenta4,8. Zdolność organoidów okrężnicy do naśladowania organizacji tkanek, mikrośrodowiska i funkcjonalności sprawia, że są one również doskonałym modelem do badania regeneracji i naprawy tkanek9. Nasze laboratorium stworzyło system hodowli organoidów w jelicie cienkim w celu zbadania wpływu klaudyny-7 na funkcje komórek macierzystych jelita cienkiego10. W tym badaniu ustanowiono system hodowli organoidów w jelicie grubym w celu zbadania zdolności lub braku zdolności komórek macierzystych do samoodnawiania, różnicowania i proliferacji w modelu warunkowego nokautu klaudyny-7 (cKO).

Claudin-7 jest bardzo ważnym białkiem o ścisłym połączeniu (TJ), które ulega silnej ekspresji w jelicie i jest niezbędne do utrzymania funkcji i integralności TJ11. myszy cKO cierpią na fenotyp podobny do IBD, wykazując ciężkie stany zapalne, owrzodzenia, złuszczanie się komórek nabłonkowych, gruczolaki i podwyższony poziom cytokin11,12. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że klaudyny są niezbędne dla funkcji bariery nabłonkowej, pojawiają się nowe role klaudyny; Biorą udział w proliferacji, migracji, progresji raka i funkcjonowaniu komórek macierzystych10,12,13,14,15,16,17. Obecnie nie wiadomo, w jaki sposób klaudyna-7 wpływa na niszę komórek macierzystych i funkcję komórek macierzystych okrężnicy. Ponieważ jelito szybko się odnawia mniej więcej co 5-7 dni, utrzymanie niszy komórek macierzystych i prawidłowe funkcjonowanie aktywnych komórek macierzystych jest niezbędne18. W tym miejscu stworzono system do badania potencjalnego wpływu regulacyjnego klaudyny-7 na niszę komórek macierzystych okrężnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wschodniej Karoliny (ECU) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i ECU dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Indukowane, specyficzne dla jelit myszy z nokautem klaudyny-7 zostały wygenerowane przez skrzyżowanie transgenicznych myszy C57BL6 klaudyna-7-flox z myszami Villin-CreERT219. W badaniu wykorzystano samce i samice myszy w wieku 3 miesięcy.

1. Przygotowanie odczynnika/sprzętu

  1. Schłodzić następujące odczynniki/sprzęt przed rozpoczęciem związanych z nimi eksperymentów: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do przemywania tkanki jelita grubego podczas izolacji krypty; kołyska/rotator (umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C) do inkubacji z pożywką dysocjacyjną nabłonka.
    1. Usunąć matrycę żelową (patrz tabela materiałów) z temperatury -20 °C i rozmrozić na lodzie przed posiewem.
    2. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C przed odwirowaniem krypt do posiewu.
    3. Schłodzić 0,1% bufor cytrynianu sodu (patrz tabela materiałów) i przechowywać na lodzie przed wykryciem śmierci komórki in situ.
  2. Ogrzej następujące odczynniki przed rozpoczęciem związanych z nimi eksperymentów: 96-dołkową płytkę hodowlaną przez 24 godziny przed posiewem; Nośniki L-WRN (patrz Spis Materiałów) przed dodaniem do platerowanych krypt i przed każdą wymianą nośnika.
    1. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 94 °C przed barwieniem.

2. Izolacja krypty mysiej okrężnicy

  1. Przygotuj niezbędne nośniki, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Objętości pożywki są tutaj obliczane dla tkanki okrężnicy dwóch myszy.
    1. Przygotuj pożywkę do dysocjacji nabłonka: 30 ml 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM dichlorowodorku Y-27632 (patrz tabela materiałów). Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
    2. Przygotować pożywkę do dysocjacji krypt: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM dichlorowodorku Y-27632. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
    3. Suplement pożywki L-WRN: 50 ml pożywki L-WRN + 47,5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą + 500 μL L-glutaminy + 500 μl penniciliny/streptomycyny + 1 000 μl suplementu B-27 (50x) + 500 μl suplementu N2 (100x) + 50 μL roztworu buforowego HEPES (1 M) (patrz tabela materiałów).
    4. Przefiltrować kompletne (uzupełnione) pożywki L-WRN i podwielokrotność do przechowywania w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
      UWAGA: Rozmrożone podłoże jest stabilne w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Wykonaj izolację krypty.
    1. W przypadku znieczulenia ogólnego dodaj 1 ml izofluranu do bawełny i umieść go w plastikowej kasecie w komorze anestezjologicznej o pojemności 0,09 stopy sześciennej (patrz Tabela materiałów). Umieść mysz w komorze anestezjologicznej, aż oddech ustanie (około 3-5 minut), a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy20.
    2. Wykonaj około 2 nacięcia wzdłuż linii środkowej myszy, przypinając tylną skórę, aby odsłonić brzuch. Odizoluj okrężnicę, przecinając ją tuż pod jelitem ślepym od strony bliższej i powyżej odbytnicy od strony dystalnej21.
    3. Za pomocą kleszczy usuń tkankę tłuszczową przyczepioną do jelita grubego. Delikatnie wypchnij kał za pomocą płaskiego końca kleszczy i rozetnij tkankę wzdłużnie.
    4. Umyj chusteczkę 10-15 razy zimnym 1x PBS za pomocą kleszczy, aby "zawirować" chusteczkę w PBS między praniami.
    5. Za pomocą czystych, ostrych nożyczek pokrój tkankę na małe kawałki o wielkości około 3-5 mm.
    6. Powtórz ten proces dla drugiej myszy i połącz fragmenty tkanki w probówce o pojemności 50 ml zawierającej zimny środek dysocjacyjny nabłonka (krok 2.1.1).
    7. Inkubować fragmenty tkanki jelita grubego w pożywce do dysocjacji nabłonka przez 90 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
    8. Pozwól, aby fragmenty tkanki opadły na dno probówki, a następnie ostrożnie wyrzuć pożywkę dysocjacyjną nabłonka, nie naruszając tkanki. Powtórz ten proces, myjąc chusteczkę 10-15 razy zimnym 1x PBS. Wyrzuć jak najwięcej PBS podczas końcowego prania.
    9. Dodać pożywkę do dysocjacji krypt (krok 2.1.2) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej fragmenty tkanki jelita grubego i wstrząsać ręcznie przez 5-10 minut.
      UWAGA: Nośnik musi stać się mętny od oddzielonych krypt.
    10. Pod kapturem do hodowli komórkowej przefiltrować tkankę i pożywkę za pomocą nylonowego sitka komórkowego o wielkości 70 μm (patrz tabela materiałów) do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
    11. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu zawierającego kryptę.
      UWAGA: W zależności od sprzętu można przenieść odcedzoną pożywkę do probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania.
    12. Zawiesić granulat w ~ 3-4 ml zimnego 1x PBS.
    13. Odpipetować 10 μl wyizolowanych krypt w linii na szkiełku mikroskopowym. Pod mikroskopem policz liczbę pełnych, długich krypt, aby oszacować stężenie krypt na 10 μl.
    14. Oblicz odpowiednią objętość krypt do odwirowania, aby umieścić 10 krypt/μl w 96-dołkowej płytce.

3. Poszycie krypty

  1. Odwirować odpowiednią objętość wyizolowanych krypt w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, nie naruszając przy tym granulowanych krypt.
  3. Dodać 100 μl matrycy żelowej (wystarczającej na dziewięć studzienek) do granulowanych krypt i ostrożnie pipetować, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać szczegółowy opis sposobu mieszania matrycy żelowej i krypt. Zazwyczaj 100 μl wystarcza na dziewięć dołków.
  4. Pozostawić matrycę żelową do częściowego zestalenia się (~1-2 min).
  5. Płytka 10 μl matrycy żelowej zmieszana z kryptami w każdym dołku wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki hodowlanej w celu utworzenia kształtu kopuły.
    UWAGA: Umieść kopułę na środku studni. Uważaj, aby matryca żelowa nie rozprzestrzeniła się na boki studzienki. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać szczegółowy opis krzepnięcia i powlekania.
  6. Pozostawić matrycę żelową do całkowitego związania przez 10-20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  7. Przygotować końcowy roztwór roboczy pożywki L-WRN.
    1. Dodać 100 μl pennicyliny/streptomycyny do 10 ml podwielokrotności pożywki L-WRN (patrz krok 2.1.3) (stabilnej przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C).
    2. Dodaj suplementy do 900 μl pożywki L-WRN z pennycyną/streptomycyną: 0,9 μl z 1 mg/ml EGF + 0,9 μl 10 mM dichlorowodorku Y-27632.
      UWAGA: Tomy są oparte na dziewięciu odwiertach. Dichlorowodorek Y-27632 dodaje się dopiero w dniu 0 (w czasie posiewu).
  8. Dodać 100 μl pożywki do każdego dołka. Uważaj, aby nie zakłócić pracy kopuły.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.

4. Tworzenie nokautu claudin-7 w kulturze

  1. Pozwól kryptom normalnie rosnąć w kulturze przez 24 godziny po poszyciu.
  2. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 2,7 μl 4-hydroksytamoksyfenu (4OH-tamoksyfenu) o stężeniu 1 mmol/l do 900 μl pożywki L-WRN (stężenie końcowe 3 μmol/l) + 0,9 μl 1 mg/ml EGF.
    UWAGA: Roztwór podstawowy 4OH-Tamoksyfenu przygotowuje się przez zmieszanie sproszkowanego 4OH-Tamoksyfenu (patrz Tabela Materiałów) z 1x PBS do stężenia 1 mmol/L.
  3. Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego.
  4. Dodać 100 μl pożywki zawierającej 4OH-tamoksyfen do każdej studzienki i oznaczyć je jako claudin-7 cKO/4OH-TAM.
    UWAGA: DMSO należy dodać do studzienek kontrolnych. Świeże pożywki zawierające 4OH-tamoksyfen należy dodawać co 2 dni.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C do następnej zmiany pożywki (~2-3 dni).

5. Utrzymanie organoidów okrężnicy

UWAGA: Media muszą być wymieniane co 2-3 dni. Kultura do 12 dni.

  1. Przygotować świeży końcowy roztwór roboczy pożywki L-WRN: 900 μl pożywki L-WRN + 0,9 μl 1 mg/ml EGF.
  2. Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego. Dodaj świeże podłoże do studzienek.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zakłócić pracy kopuły.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C do następnej zmiany podłoża.
    UWAGA: Kultury mogą być utrzymywane i pasażowane przez czas pożądany w eksperymencie. Kultury do niniejszego badania były zazwyczaj utrzymywane przez 9-12 dni, ale można chcieć kontynuować dalej, przez 15 lub 20 dni.

6. Zbieranie i osadzanie organoidów okrężnicy

  1. Usuń stare media ze studzienek za pomocą odsysania próżniowego.
  2. Utrwalić organoidy za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: PFA jest materiałem toksycznym. Zachowaj ostrożność podczas korzystania z tego odczynnika.
  3. Usunąć 4% PFA ze studzienek poprzez odsysanie próżniowe i dodawać 30% sacharozy przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Oznacz plastikową formę i napełnij ją do 90% związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów).
  5. Usuń 30% sacharozy ze studzienek poprzez odsysanie próżniowe. Dodaj 10 μl 1x PBS do każdej studzienki.
  6. Końcówką pipety delikatnie podrapaj dno studzienki, aby oddzielić kopułę zawierającą organoidy.
  7. Za pomocą pipety usunąć PBS zawierający zdysocjowane organoidy i załadować ciecz do formy zawierającej OCT.
    UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków do związku OCT.
  8. Kontynuuj ten proces, aż wszystkie organoidy zostaną usunięte ze wszystkich studzienek.
  9. W kolbie Dewara ze stali nierdzewnej dodać granulki suchego lodu i 2-metylobutan (tyle, aby pokryć granulki suchego lodu) (patrz Tabela materiałów).
  10. Stabilnie trzymaj blok OCT zawierający organoidy powyżej 2-metylobutanu do błyskawicznego zamrożenia.
  11. Przechowywać blok OCT zawierający organoidy w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do sekcji (może być przechowywany przez okres do 1 roku).

7. Immunofluorescencja

  1. Blok OCT zawierający organoidy należy podzielić na części o grubości 5 μm za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów) w temperaturze -20 °C.
  2. Dla każdej sekcji sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że został uchwycony organoid. Po zakończeniu cięcia szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do barwienia (można je przechowywać do 6 miesięcy).
  3. Podgrzewać szkiełka w 10 mM buforze cytrynianu sodu przez 10 minut w temperaturze 94 °C.
    UWAGA: Bufor wytwarza się przez rozpuszczenie cytrynianu sodu w wodzie dejonizowanej. Dostosuj pH do 6 za pomocą kwasu solnego.
  4. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia na blacie przez 20 minut. Płucz wodą destylowaną przez 5 minut.
  5. Zmontuj szkiełka w stojaku do barwienia (patrz tabela materiałów) z 0,2% Triton X-100 i inkubuj z 100 mM glicyną przez 15 minut.
  6. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciw mysim królikom klaudyną-722 (rozcieńczony w 1% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać trzy razy 1x PBS przez 10 minut każdy.
  8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym anty-królika Cy323 (rozcieńczony w 1% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 10 minut każdy.
  9. Zamontuj szkiełka za pomocą odpowiedniego medium montażowego (patrz Tabela materiałów) za pomocą DAPI i dodaj szkiełko nakrywkowe.

8. Wykrywanie śmierci komórki

  1. Utrwalić organoidy wewnątrz studzienek za pomocą 4% paraformaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać 1x PBS przez 5 min.
  2. Inkubować płytkę hodowlaną na lodzie z 0,1% Triton X-100 w zimnym 0,1% buforze cytrynianu sodu przez 2 minuty. Płukać dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut każdy.
  3. Przygotuj TUNEL reaction24,25 za pomocą TMR Red, zestawu do wykrywania śmierci komórki in situ(patrz Tabela Materiałów). Dodać 50 μl odczynników reakcyjnych TUNEL do każdego dołka.
  4. Inkubować w wilgotnej atmosferze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności.
    UWAGA: Wszystkie pozostałe kroki należy wykonać w ciemności.
  5. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Inkubować z 1:2,500 Hoechst (rozcieńczonym w 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty.
  6. Spłucz trzy razy 1x PBS przez 5 minut każdy. Użyj filtra TRITC do wizualizacji obrazów pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zbadania regulacyjnego wpływu klaudyny-7 na komórki macierzyste jelita grubego, krypty okrężnicy zostały wyizolowane z tkanki okrężnicy, jak opisano powyżej i pokazano w Rysunek 1A. Po wyizolowaniu krypt z tkanki pierwotnej, zostały one posiane w matrycy 3D na 96-dołkowej płytce, aby rosły przez 11 dni (Ryc. 1). Normalne, zdrowe krypty zamykają światło i stają się sferoidami do 2 dnia, a ostatecznie zaczynają pączkować i tworzyć różne typy komórek nabłonkowych około 5 dnia (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hodowla organoidów jest doskonałym modelem do badania funkcji komórek macierzystych, fizjologii jelit, odkrywania leków, chorób jelit człowieka oraz regeneracji i naprawy tkanek 7,8,9,10,11,26. Chociaż ma wiele zalet, może być trudny do ustalenia. Należy zachować ostrożność na wszystkich etapach całego protokołu, ale przede w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez NIH DK103166.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Eksykator próżniowy o pojemności 0,09 stopy sześciennej Stany Zjednoczone Plastic Corp78564komora anestezjologiczna
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9261
1,5 ml mikroprobówki wirówkoweThermoFisher69715
15 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-959-53A
1x Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanemGibco14190-144
2-metylobutanSigma277258
4% paraformaldehydThermoFisherJ61899.
4-hydroksytamoksyfen (4OH-TAM)Sigma579002
50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-432-22
70 µ m nylonowe sitko komórkoweCorning352350
96-dołkowa płytka hodowlanaGreiner Bio-One655180
B-27 Suplement (50x)Gibco12587-010
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1605-100
Claudin-7 przeciwciało przeciw mysiemu królikowiLaboratoria immunobiologiczne 18875
Szkło nakrywkowe (24 x 50-1,5)Fisher Scientific12544E
Cryomoldsvwr25608-916
Cultrex RCF BME, Typ 2R& D Systems3533-005-02matryca żelowa
Cy3 przeciwciało anty-króliczeJackson Immunoresearch111-165-003
Kolba DewaraThomas Scientific1173F61
DMEM Wysoka glukoza z L-glutaminąATCC30-2002
EVOS FLoid System obrazowaniaThermoFisher4477136
Fluoro-Gel II z DAPIElectron Nauki mikroskopowe17985-50
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
GlicynaJT Baker4059-02
HEPES (1 M) Roztwór buforowyGibco15630-080
HoechstThermoFisher62249
Zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, TMR RedRoche12156792910
IsofluranePivetal07-893-8440
L-WRN MediaHarvard Medical School Pozyskiwanie i hodowla organoidów żołądkowo-jelitowychRdzeń N/A
Zestaw chirurgiczny myszyKent Scientific CorporationINSMOUSEKIT
Murine EGFPeproTech315-09-500UG
N2 Suplement (100x)Gibco17502-048
Optymalna temperatura skrawania (OCT) mieszanka Agar ScientificAGR1180
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Sequenza Rackvwr10129-584
Cytrynian soduFisher ScientificS-279
SacharozaSigmaS9378
Triton X-100SigmaX100
Filtr próżniowy (0,22 &mikro; m; octan celulozy)Corning430769
Y-27632 dichlorowodorekTocris Bioscience1254
AK

Bibliografia

  1. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  3. Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
  4. Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257(2021).
  5. Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334(2020).
  6. Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
  7. Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
  8. Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
  9. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  10. Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
  11. Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
  12. Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978(2013).
  13. Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
  14. Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
  15. Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120(2015).
  16. Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
  17. Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
  18. Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383(2013).
  19. Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
  20. Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
  21. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611(2013).
  22. Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
  23. Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038(2013).
  24. Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
  25. Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188(2017).
  26. Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla organoid w jelita grubegokom rki macierzyste jelitizolacja krypt jelita grubegoknockout Claudyny 7nisza kom rek macierzystychregeneracja nab onkabarwienie immunofluorescencyjneosadzanie w matrycy elowejtest apoptozy

Powiązane artykuły