Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hipertermia ultradźwiękowa o wysokiej intensywności sterowana rezonansem magnetycznym: wykonalna metoda leczenia w modelu mysiego mięsaka prążkowanokomórkowego

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64544

⸱

13 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children, 4Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 6Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary, 7Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 8Department of Medical Imaging, University of Toronto, 9Department of Pediatric Surgery, University of Toronto, 10Department of Surgery, University of Toronto

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do użycia kontrolowanej hipertermii, generowanej przez ultradźwięki o wysokiej intensywności sterowane rezonansem magnetycznym, do wywołania uwalniania leku z liposomów wrażliwych na temperaturę w modelu myszy mięsaka prążkowanokomórkowego.

Streszczenie

Ultradźwięki o wysokiej intensywności (MRgHIFU) sterowane rezonansem magnetycznym to sprawdzona metoda wytwarzania hipertermii miejscowej. Biorąc pod uwagę obrazowanie w czasie rzeczywistym i modulację energii akustycznej, modalność ta umożliwia precyzyjną kontrolę temperatury w określonym obszarze. Za pomocą tej nieinwazyjnej, niejonizującej technologii badanych jest wiele zastosowań termicznych, takich jak wytwarzanie hipertermii, w celu uwalniania leków z termowrażliwych nośników liposomalnych. Leki te mogą obejmować chemioterapię, taką jak doksorubicyna, dla której pożądane jest ukierunkowane uwalnianie ze względu na ograniczające dawkę ogólnoustrojowe działania niepożądane, a mianowicie kardiotoksyczność. Doksorubicyna jest podstawą leczenia różnych nowotworów złośliwych i jest powszechnie stosowana w nawrotowym lub nawracającym mięsaku prążkowanokomórkowym (RMS). RMS jest najczęstszym guzem pozaczaszkowym tkanek miękkich litych u dzieci i młodych dorosłych. Pomimo agresywnej, multimodalnej terapii, wskaźniki przeżycia RMS pozostały takie same przez ostatnie 30 lat. Aby zbadać rozwiązanie tej niezaspokojonej potrzeby, opracowano protokół eksperymentalny w celu oceny uwalniania termoczułej liposomalnej doksorubicyny (TLD) w immunokompetentnym, syngenicznym modelu myszy RMS wykorzystującym MRgHIFU jako źródło hipertermii do uwalniania leku.

Wprowadzenie

Mięsak prążkowanokomórkowy (RMS) to guz mięśni szkieletowych, który najczęściej występuje u dzieci i młodych dorosłych1. Choroba miejscowa jest często leczona za pomocą leczenia multimodalnego, w tym chemioterapii, promieniowania jonizującego i chirurgii. Stosowanie wielolekowych schematów chemioterapii jest bardziej rozpowszechnione u pacjentów pediatrycznych, z lepszymi wynikami w porównaniu z ich dorosłymi odpowiednikami2; Jednak pomimo trwających wysiłków badawczych, 5-letni wskaźnik przeżycia utrzymuje się na poziomie około 30% w najbardziej agresywnej postaci choroby3,4. Standardem leczenia w chemioterapii jest schemat wielolekowy, który obejmuje winkrystynę, cyklofosfamid i aktynomycynę D. W przypadku nawrotu lub nawrotu choroby stosuje się alternatywne chemioterapie, w tym standardową (wolną) doksorubicynę (FD) i ifosfamid1. Podczas gdy wszystkie te chemioterapie mają toksyczność ogólnoustrojową, kardiotoksyczność doksorubicyny narzuca ograniczenie dawki na całe życie5-7. Aby zwiększyć ilość leku dostarczanego do guza i zminimalizować toksyczność ogólnoustrojową, opracowano alternatywne preparaty, w tym kapsułkowanie liposomalne. Może to być doksorubicyna nieuczulona termoczuła, która została zatwierdzona do leczenia raka piersi i raka wątrobowokomórkowego, lub doksorubicyna termoczuła, dla której trwają badania kliniczne8,9,10,11,12,13. Alternatywne metody dostarczania liposomalnych leków kapsułkowanych, takie jak liposomy wielopęcherzykowe i liposomy ukierunkowane na ligandy, zostały ocenione i są obiecujące w leczeniu nowotworów9. W tym badaniu dodanie ciepła ma wieloczynnikowy wpływ, w tym uwalnianie leku14. Połączenie hipertermii (HT) generowanej za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności pod kontrolą rezonansu magnetycznego (MRgHIFU) i termoczułej liposomalnej doksorubicyny (TLD) jest nowatorskim multimodalnym podejściem terapeutycznym do stosowania tego toksycznego, ale skutecznego leku w leczeniu RMS, przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności ograniczającej dawkę i potencjalnym zwiększeniu odpowiedzi immunologicznej na nowotwór.

Doksorubicyna szybko uwalnia się z TLD w temperaturach >39 °C, znacznie powyżej średniej temperatury ludzkiego ciała wynoszącej 37 °C, ale nie na tyle wysoko, aby spowodować uszkodzenie tkanek lub ablację; zaczyna to następować przy 43 °C, ale następuje szybciej, gdy temperatury zbliżają się do 60 °C15. Do generowania HT in vivo stosowano różne metody, w tym lasery, mikrofale, ablację prądem o częstotliwości radiowej i skoncentrowane ultradźwięki, z których wiele to inwazyjne metody ogrzewania16. MRgHIFU to nieinwazyjna, niejonizująca metoda ogrzewania, która ułatwia precyzyjne ustawienie temperatury w tkance docelowej in situ. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) zapewnia obrazowanie w czasie rzeczywistym, w którym można użyć oprogramowania komputerowego do obliczenia pomiaru termometrycznego tkanki podczas leczenia; Następnie dane te mogą być wykorzystane do sterowania terapią ultradźwiękową w czasie rzeczywistym, aby osiągnąć i utrzymać żądaną nastawę temperatury17. MRgHIFU został przetestowany na różnych typach tkanek i może być stosowany w szerokim zakresie zabiegów termicznych, od łagodnego HT do ablacji, a także klinicznie do skutecznego leczenia bolesnych przerzutów do kości18. Ponadto wykazano, że HT powoduje cytotoksyczność guza, moduluje ekspresję białka i zmienia odpowiedź immunologiczną w mikrośrodowisku guza19,20,21,22. W jednym badaniu połączono łagodną HT z TLD, a następnie ablację MRgHIFU, w synergicznym modelu szczurzym R123, co spowodowało martwicę rdzenia guza i dostarczenie leku na obrzeża. Tradycyjnie radioterapia była stosowana jako terapia wspomagająca w celu uszkodzenia komórek nowotworowych i zmniejszenia miejscowego nawrotu choroby. Jednak jego użycie jest ograniczone przez dożywotnie dawkowanie i obrażenia poza celem1. Tak więc, HT jest wyjątkowy, ponieważ może powodować niektóre z tych samych efektów bez tych samych toksyczności lub ograniczeń.

Przedkliniczne modele zwierzęce dla RMS obejmują syngeniczne modele immunokompetentne i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) u gospodarzy z obniżoną odpornością. Podczas gdy modele z obniżoną odpornością pozwalają na wzrost ludzkich guzów, brakuje im odpowiedniego mikrośrodowiska guza i mają ograniczoną zdolność do badania odpowiedzi immunologicznej24. Mutacja aktywująca FGFR4 jest obiecującym markerem złego rokowania i potencjalnym celem terapeutycznym u dorosłych i dzieci RMS1,25. W syngenicznych modelach RMS opracowanych w laboratorium Gladdy, guzy są w stanie rosnąć w immunokompetentnym gospodarzu, który rozwija wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną na nowotwór26. Ponieważ HT wpływa na odpowiedź immunologiczną, obserwacja zmian w mysiej odpowiedzi immunologicznej jest cenną zaletą tego modelu nowotworu. Aby przetestować zarówno odpowiedź guza na TLD w porównaniu z FD, jak i zmianę odpowiedzi immunologicznej guza zarówno na chemioterapię, jak i HT, opracowano i zastosowano protokół leczenia syngenicznych mysich guzów RMS in vivo przy użyciu MRgHIFU i TLD, na czym koncentruje się to badanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z komitetami opieki nad zwierzętami z zatwierdzonymi protokołami użytkowania zwierząt pod nadzorem weterynarza w Centrum Fenogenomiki (TCP) i Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia (UHN) Centrum Zasobów Zwierzęcych (ARC) na zwierzętach. Wszystkie procedury, z wyjątkiem MRgHIFU, z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), aby zminimalizować narażenie zwierząt na powietrze zewnętrzne lub podatne infekcje.

1. Hodowla myszy

UWAGA: Łącznie 65 myszy (szczep B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) zostało włączonych do badania pilotażowego (samiec: n = 23; samica: n = 42). Zarówno samce, jak i samice myszy stosowano w wieku 7-9 tygodni. Ich młode zostały odsadzone od piersi i poddane genotypowaniu, a do eksperymentów wykorzystano myszy heterozygotyczne p53.

  1. Trzymaj dwie samice myszy z każdym samcem myszy, aby stworzyć klatki hodowlane. Policz wiek ich szczeniąt od urodzenia (narodziny = dzień 0).
  2. W 10 dniu zidentyfikuj szczenięta z wycięciem w uchu. Zbierz wycinki ogona do genotypowania przed wstrzyknięciem linii komórkowej.

2. Genotypowanie myszy

  1. Ekstrahować DNA z zebranych 2 mm wycinków ogona za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Oznaczyć stężenie i czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260-280 nm na spektrofotometrze (patrz tabela materiałów).
  3. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
    1. Stworzyć mieszankę wzorcową zawierającą dostępną w handlu mieszaninę PCR (zawierającą polimerazę Taq, dNTPS i MgCl2; patrz tabela materiałów), starter i dH2O w stosunku 12,5:0,25:10,75 (μL) dla wymaganej liczby próbek. Dodać 1 μl próbki DNA do każdej probówki PCR i dołączyć dH2O, próbkę zerową (homozygotyczną pod względem mutacji p53), próbkę heterozygotyczną (heterozygotyczną pod względem mutacji p53) i próbkę typu dzikiego (homozygotyczną pod względem normalnej mutacji p53) jako kontrolę PCR.
    2. Dodać 24 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki PCR zawierającej DNA. Pipetować roztwór w każdej probówce PCR w górę iw dół, aby rozprowadzić DNA w całej mieszance głównej.
    3. Umieścić probówki reakcyjne w termocyklerze i cyklować zgodnie z następującymi specyfikacjami: 95 °C przez 2 minuty, 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 15 s i 72 °C przez 1 minutę, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu gotowości do analizy na żelu.
  4. Analizować produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Przygotuj 2% żel (50 ml 1x TAE i 1 g agarozy), podgrzewając agarozę w TAE i mieszając aż do rozpuszczenia. Po schłodzeniu i nadal płynnym dodaj 2,5 μl barwnika żelowego DNA do agarozy i wymieszaj. Wlej żel do pudełka żelowego z grzebieniem. Umieść żel w aparacie elektroforetycznym (patrz Tabela Materiałów) i przykryj 1x TAE.
    2. Załaduj 10 μl 1 kB drabinki DNA na żel. Załadować 12,5 μl każdej próbki. Uruchom żel na 25 minut przy napięciu 135 V.
    3. Zobrazuj żel przy użyciu odpowiednich ustawień dla użytego barwnika żelu DNA na naobraziaczu żelowym (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Przygotowanie modelu guza (Rysunek 1)

  1. Hoduj linię komórek M25FV24C (pasaż 12-15) na tydzień przed datą wstrzyknięcia w kompletnej pożywce wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] z dodatkami: 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy) w kolbie o pojemności 75 ml, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Gdy komórki zlewają się w ~80%, odessać pożywkę i umyć komórki 1x 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    UWAGA: M25FV24C jest mysią linią komórkową zmodyfikowaną do nadekspresji zmutowanego FGFR4V550E, który obserwuje się u dzieci i dorosłych RMS1,26.
  2. Podnieś komórki, dodając 0,5 ml 0,25% roztworu trypsyny z boku płytki i inkubując naczynie przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Gdy komórki wydają się oderwane, dodaj 2,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej w temperaturze pokojowej, aby dezaktywować trypsynę. Użyj podwielokrotności próbki o objętości 10 μl, aby określić stężenie komórek żywotnych za pomocą hemocytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.
  3. Przygotuj odpowiednią objętość komórek zawieszonych w DPBS do wstrzyknięcia i umieść w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml: objętość do odwirowania = (liczba myszy × liczba komórek na mysz)/ (koncentracja komórek), gdzie liczba myszy = myszy do wstrzyknięcia + 10 dodatkowych myszy z powodu błędu, a liczba komórek na mysz = 104.
  4. Wirować przez 5 minut przy 153 x g. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości (10 μl na mysz × liczbę myszy) buforu do wstrzykiwań miologicznych (pożywka F10 + 0,5% FBS) i wstrzyknąć myszom w ciągu 1 godziny od przygotowania tej zawiesiny.

4. Wstrzyknięcie do komórek domięśniowych

UWAGA: M25FV24C komórki są wstrzykiwane do prawej tylnej kończyny myszy między 4 a 6 tygodniem życia. Wstrzyknięcie w ciągu 4 tygodni powoduje powstanie małej myszy z guzem, który może być trudniejszy do leczenia, ponieważ wokół jest mniej tkanki do dyspersji HT; Odczekanie do 6 tygodni daje większą mysz, co ułatwia leczenie guza.

  1. Przed aspiracją kilkakrotnie odwróć zawiesinę komórek, aby równomiernie rozprowadzić komórki w roztworze. Odessać 10 μl (104 komórek) za pomocą strzykawki mikrolitrowej (patrz tabela materiałów). Scruff myszy; Po unieruchomieniu dostęp do mięśni ud ogonowych można uzyskać, rozciągając tylną nogę. Ogol nogę za pomocą maszynki do strzyżenia i przetrzyj 70% etanolem.
  2. Wstrzyknąć zawiesinę komórek M25FV24C (10 μl, 104 komórki) do mięśni prawej kończyny tylnej uda myszy w wieku 4-6 tygodni za pomocą gazoszczelnej strzykawki mikrolitrowej z igłą G 26s.
    UWAGA: Igłę należy wprowadzić równolegle do kości udowej w kierunku kolana, uważając, aby nie uderzyć w nerw kulszowy. Włożyć tylko czubek igły (około 2 mm) ze względu na małą masę mięśniową kończyny tylnej.
  3. Podawać roztwór spokojnym ruchem. Wyjąć igłę i upewnić się, że nie dojdzie do krwawienia. Umieść mysz z powrotem w drugiej klatce.
  4. Oceniaj zwierzęta codziennie i monitoruj ich tylne kończyny pod kątem wzrostu guza poprzez badanie palpacyjne. Poddaj myszy eutanazji za pomocą dwutlenku węgla, jeśli napotkany zostanie którykolwiek z następujących wczesnych punktów końcowych: guz o średnicy przekraczającej 1,5 cm, owrzodzenie guza lub ogólnoustrojowe objawy choroby (piloerekcja, zgarbiona postawa, brak aktywności lub zmniejszone spożycie pokarmu lub wody).

5. Przesiewowe badanie rezonansem magnetycznym

  1. Znieczulić mysz do poziomu, do którego nie ma ruchu przy ściskaniu łapy, izofluranem pod następującymi parametrami: indukować w komorze z 4% przy 1,5 l/min, następnie przenieść do stożka nosowego na sankach skanera MRI i kontynuować utrzymywanie izofluranu na stożku nosowym z 1,5%-2% przy 0,75 l/min. Zamocuj monitor oddechu. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Wyobraź sobie znieczuloną mysz za pomocą skanera MRI (patrz Tabela materiałów). Na obrazie T2-zależnym (Ax_Screen akwizycji, Tabela 1) zwróć uwagę na wymiary w płaszczyźnie i liczbę osiowych wycinków, w których pojawia się guz. Zwróć uwagę na położenie guza w odniesieniu do kości udowej i bocznej powierzchni uda, do której wpadłaby fala ultradźwiękowa.
    UWAGA: Guz pojawia się jako hiperintensywna masa w mięśniu, która jest asymetryczna z przeciwnej strony. Dobry początkowy rozmiar guza dla wielu terapii to 2 mm x 2 mm x 2 mm zarówno dla badań ostrych, jak i badań przeżycia. Jeśli jest znacznie większy, będzie dobry tylko do ostrych badań, ponieważ guz osiągnie punkt końcowy wielkości przed zakończeniem trzech cotygodniowych zabiegów. Kryteria wykluczenia leczenia HIFU obejmują: owinięty wokół kości udowej, zbyt blisko kości udowej, zbyt tylny na myszy, przyśrodkowy do kości udowej, zbyt blisko odbytnicy.
  3. Wyjmij mysz ze skanera i uzyskaj masę bazową. Ogol mysz od połowy ciała aż do stóp pod narkozą za pomocą golarki elektrycznej.
    UWAGA: Idealnie, golenie odbywa się 1 dzień przed zabiegiem, ponieważ pozwala to myszy na wykonanie pielęgnacji, co pozwala kremowi do depilacji działać wydajniej
    4. .
  4. Odzyskaj mysz w BSC, używając poduszki grzewczej pod jednym końcem klatki. Przywróć mysz do klatki, gdy odzyska pozycję leżącą mostka.

6. Eksperyment: Przygotowanie zwierząt na dzień leczenia HIFU

  1. Aby przygotować system HIFU o małym otworze (patrz tabela materiałów), włącz generator i napełnij przetwornik wystarczającą ilością wody dejonizowanej, aż membrana rozszerzy się poniżej przetwornika, ale nie tak mocno, aby ścisnęła mysz. Odgazuj wodę w obwodzie przetwornika przez 30 minut, aby usunąć rozpuszczony tlen z medium.
  2. Przygotuj skojarzony system komputerowy.
    1. Włącz komputer sterujący i upewnij się, że jest podłączony przez Ethernet do generatora HIFU i przez USB do wyświetlacza sondy termicznej. Uruchom oprogramowanie i kliknij przycisk Home, aby ustawić przetwornik w położeniu domowym przed włożeniem myszy.
    2. Skalibruj światłowodowe sondy termiczne: Uzyskaj bazową temperaturę pokojową i zanotuj zmianę temperatury w pomieszczeniu MRI. Zwróć uwagę na wielkość dryftu temperatury dla każdej sondy ze względu na natężenie pola magnetycznego. Włóż sondę temperatury rurki dryfującej do szklanej rurki wypełnionej gadolinem w celu kalibracji temperatury podczas skanowania i zabezpiecz rurkę dryfującą taśmą.
      UWAGA: Podstawowa temperatura pokojowa (rurka dryfująca) jest dodawana ręcznie jako parametr termometryczny w graficznym interfejsie użytkownika w oprogramowaniu. Obszar zainteresowania (ROI) jest ustawiany w rurze dryfu na obrazie MR w celu wykrycia dryfu temperatury i automatycznie skoryguje obrazy termometryczne.
    3. Pobrać lek do wstrzyknięcia do strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić go w automatycznej pompie podawczej (patrz tabela materiałów). Zagruntować linię, która połączy się z cewnikiem do żył ogonowych myszy, aż lek całkowicie wypełni linię, naciskając przycisk ręcznego podawania na automatycznej pompie podającej.
    4. Użyj lampy grzewczej, aby ogrzać myszy w klatkach przez ~ 20 minut przed przeniesieniem do komory anestezjologicznej.
      UWAGA: Wstępne podgrzewanie sprzyja rozszerzeniu naczyń krwionośnych, które wystąpi, gdy tylko mysz zostanie znieczulona i pomoże w umieszczeniu cewnika.
  3. Znieczulij mysz izofluranem (indukcja: 4% przy 1,5 l/min; konserwacja: 1,5%-2% przy 0,75 l/min) i przenieś do stożka nosowego. Nałóż lubrykant rogówkowy na oczy, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym brakiem odruchu mrugania w znieczuleniu.
  4. Nałóż krem do depilacji na ogolony obszar, w tym na całą prawą tylną kończynę, i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi usuwania owłosienia.
    UWAGA: Umieść mysz pod lampą grzewczą podczas pobytu w BSC, aby pomóc w termoregulacji podczas usuwania włosów w znieczuleniu.
  5. Po zmyciu kremu do depilacji ciepłą wodą zważ mysz na wadze cyfrowej i zapisz dawkowanie leku.
  6. Przesuń mysz na stożek nosowy zgodny z rezonansem magnetycznym na sankach rezonansu magnetycznego. Umieść lampę grzewczą na myszy, aby utrzymać ją w cieple podczas przygotowań do rezonansu magnetycznego. Umieść mysz w bocznej pozycji odleżynowej stroną bez guza skierowaną w dół, a guz znajduje się powyżej w wydrukowanym w 3D uchwycie myszy na sankach (rysunek uzupełniający 1 i rysunek 2). Upewnij się, że guz jest prawidłowo umieszczony (tj. w środku cewki poziomo i pionowo, z wysokością tuż nad krawędziami uchwytu myszy, aby uwzględnić ucisk przez przetwornik ultradźwiękowy).
    UWAGA: W razie potrzeby wytnij skompresowany segment podkładki żelowej do ultradźwięków, aby umieścić go pod myszą, wyściełając spód uchwytu, o grubości umożliwiającej wyrównanie guza do górnej części uchwytu.
  7. Schowaj niezaangażowaną nogę z dala od nogi guza, pod myszą lub wyprostowaną z zgiętą nogą guza. Upewnij się, że stopy nie znajdują się w bliskim lub dalekim polu ścieżki guza i wiązki ultradźwiękowej. Ustaw lampę grzewczą w odległości 15 cm od ogona, aby się ogrzać w celu wprowadzenia cewnika do żyły ogonowej.
  8. Włóż sondę temperatury przełyku.
    1. Przeciągnij sondę przełykową przez stożek nosowy i pochyl szyję myszy. Przechyl nos myszy do góry, aby utworzyć linię od ust prosto do brzucha, wysuwając głowę. Wsuń sondę termiczną nad język na około 0,5 cm do przełyku myszy i załóż stożek nosowy wokół nosa myszy. Zabezpiecz sondę przełykową i stożek nosowy w górnej części sań.
      UWAGA: Natychmiast po założeniu należy obserwować objawy niewydolności oddechowej, ponieważ może ona zostać nieprawidłowo wprowadzona do tchawicy.
  9. Włóż sondę temperatury doodbytniczej.
    UWAGA: Sondy temperatury doodbytniczej i przełykowej powinny znajdować się w odległości nie większej niż 3 °C od siebie.
  10. Umieść monitor oddechu z połączeniowym w kierunku głowy myszy, aby nie przeszkadzał w umieszczeniu przetwornika ultradźwiękowego. Zabezpiecz taśmą.
  11. Wprowadzić cewnik do żył ogonowych z igłą motylkową o sile 27 g do bocznej żyły ogonowej podłączonej do mikrorurki z 20 μl martwej przestrzeni i mocno przykleić taśmą. Po zaklejeniu taśmą upewnij się, że cewnik nadal dobrze się spłukuje.
  12. Użyj dwóch osób, aby przenieść przygotowaną mysz, sanki myszy, linię anestezjologiczną, przewód oddechowy, cewnik do żył ogonowych i przewody sondy termicznej do skanera MRI i umieścić w uchwycie sanek MRI.
  13. Poproś operatora oprogramowania HIFU (patrz Tabela materiałów) o przesunięcie menisku przetwornika bezpośrednio nad guzem poprzez oględziny w celu wstępnego wyrównania27. Nałóż lubrykant do oczu lub odgazowany żel ultradźwiękowy na bezwłosą skórę nad guzem i połącz przetwornik HIFU z obszarem guza.
  14. Podłączyć przewód doprowadzający lek z pompy automatycznej do cewnika do żyły ogonowej. Oblicz ilość martwej przestrzeni w linii żyły ogonowej i linii łączącej. Wsuń sanki myszy HIFU na szynach MRI do środka MRI.
  15. Ustaw ilość wlewu leku na pompie, w zależności od rodzaju i stężenia leku oraz masy ciała zwierzęcia, a następnie dodaj ilość martwej przestrzeni. Ustawić pompę na szybkość infuzji 200 μl/min.
    UWAGA: W tym badaniu FD i TLD stosowano w stężeniu 2 mg/ml i dawce 5 mg/kg masy ciała.
  16. Zapisz podstawowe temperatury sondy termicznej.
  17. Umieść urządzenie do ogrzewania konwekcyjnego powietrza (patrz tabela materiałów) na najcieplejsze ustawienie. Skieruj rurkę wydmuchującą powietrze w kierunku myszy w środku otworu MRI i zabezpiecz taśmą. Urządzenie grzewcze zostanie później ustawione na najniższe ustawienie (32 °C), aby zapobiec przegrzaniu myszy podczas sonikacji.
  18. Pobieranie pomiarowych obrazów MR (Ax_Loc, Sag_Loc; Tabela 1) w celu określenia lokalizacji guza do celowania w sonikację, w tym głębokości. Dostosuj odpowiednio pozycję przetwornika za pomocą oprogramowania HIFU, wstawiając żądaną odległość ruchu zmierzoną na obrazie, a następnie klikając kierunek strzałki, aby się poruszać (Rysunek 3A). Zwróć również uwagę na położenie rury dryfującej. Powtórz w razie potrzeby.
  19. Określić położenie ogniska przetwornika w płaszczyźnie czołowej, wykonując krótką sonifikację "próbną" o amplitudzie 5 s x 50 mV podczas akwizycji termometrycznej Test_Shot (Tabela 1).
  20. Dopasuj obrazy z badania MR do widoku koronalnego punktu ogniskowego w oprogramowaniu HIFU. Przejrzyj obrazy pod kątem lokalizacji guza, w stosunku do struktury kostnej i odbytnicy, a następnie zmień położenie przetwornika, jeśli uzna to za konieczne.
  21. Powtórz sonizację strzału testowego podczas dziewięciokrotnego obrazowania termicznego (Tabela 1), aby potwierdzić, czy objętość guza jest równomierna i dokładna przy minimalnym ogrzewaniu poza celem. Dostosuj położenie plasterka, położenie przetwornika i głębokość sterowania, a następnie potwierdź wydajność grzewczą, powtarzając "strzały próbne", jeśli uzna to za konieczne.
  22. Korzystając z oprogramowania do monitorowania leczenia HIFU, zdefiniuj ROI dla monitorowania termometrii w końcowym profilu grzewczym, mierząc odległość do przemieszczenia, a następnie zmieniając współrzędne siatki w programie. Ustaw ROI wokół rury dryfu w celu korekcji dryftu. Wprowadź temperaturę bazową na podstawie temperatury sondy doodbytniczej do pomiarów termometrycznych. System HIFU służy do inicjowania sonikacji leczenia HIFU oraz do monitorowania termometrycznego.
  23. Otwórz specyfikację 20-minutowego zabiegu hipertermii w oprogramowaniu i rozpocznij sonikację po zebraniu referencyjnych obrazów MR i rozpoczęciu termometrii.
  24. Wykonaj 20-minutowy zabieg (Rysunek 3B) podczas obrazowania termicznego (Tabela 1) za pomocą wbudowanego oprogramowania regulatora proporcjonalnej pochodnej całkującej (PID). Wstrzyknąć wybrany lek po 1,5 minuty, po tym jak temperatura w ROI ogrzeje się do żądanej temperatury (40 °C).
  25. Monitoruj temperaturę rdzenia przez cały czas trwania zabiegu. Jeśli temperatura w odbycie gwałtownie wzrasta podczas leczenia, może być konieczna zmiana pozycji myszy, aby uniknąć ocieplenia odbytu w ciągu 10 lub 20 minut trwania leczenia. Należy przerwać leczenie, jeśli temperatura w odbycie wzrośnie do >40 °C.

7. Eksperyment: Obrazowanie na modelu mysim i procedura sonikacji w badaniach ostrych

  1. Po zakończeniu leczenia należy wyjąć mysz z otworu rezonansu magnetycznego, zapewniając hemostazę w miejscu wprowadzenia cewnika do żyły ogonowej. Przenieś mysz do BSC i umieść na stożku nosowym w celu kontynuowania znieczulenia.
  2. Połóż mysz na plecach na niebieskiej podkładce chłonnej z unieruchomionymi kończynami i odsłoniętym sercem.
  3. Poddaj myszy eutanazji poprzez wykrwawienie przez nakłucie serca, a następnie usunięcie serca. Natychmiast pobrać krew i odwirować w celu oddzielenia osocza przy stężeniach 10,621 x g przez 10 minut.
  4. Przeprowadzić sekcję zwłok i przechowywać narządy zgodnie z wymaganiami do analizy. Zamrozić narządy w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy lub długotrwale w zbiorniku z ciekłym azotem.
  5. Mechanicznie homogenizować tkankę nowotworową, dodając dziewięciokrotny nadmiar (w/w) dejonizowanej wody i rozbijając tkankę za pomocą homogenizatora bijącego kulki. Ekstrahuj doksorubicynę z 600 μl homogenizowanej tkanki, dodając kolejno 75 μl 300 mg/ml azotanu srebra, 75 μl 10 mM kwasu siarkowego i 2,5 ml izopropanolu 1:1:chloroformu. Wirować przez 20 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.
  6. Aby przygotować próbki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), należy odwirować roztwór z kroku 7.5 przy 4 500 x g, usunąć warstwę rozpuszczalnika organicznego i wysuszyć izopropanol:chloroform pod strumieniem azotu gazowego. Zawiesić w 100 μl 2:1 MeOH:H2O. Zmierzyć stężenie doksorubicyny za pomocą HPLC-MS/MS28.

8. Eksperyment: Obrazowanie modelu mysiego i procedura sonikacji w badaniach nad przeżyciem

UWAGA: Dla badań nad przeżywalnością, postępuj zgodnie z procedurą przygotowania zwierząt w dniu leczenia HIFU (krok od 6.1 do 6.25).

  1. Po zakończeniu zabiegu umieść mysz pod lampą grzewczą, aby mogła dojść do siebie, i monitoruj jej oddech i ruch, aż odzyska pozycję leżącą mostka. Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.
    UWAGA: Upewnij się, że połowa klatki znajduje się w jednej linii z lampą grzewczą, ponieważ na regulację termiczną zwierząt ma wpływ znieczulenie i leczenie HT.
  2. Codziennie monitoruj myszy pod kątem zachowania, wzorców żywieniowych i częstości oddechów pod kątem wszelkich oznak niepokoju.
  3. Wykonuj zabiegi raz w tygodniu, wykonując kroki od 6.1 do 6.25 przez 3 kolejne tygodnie.
  4. Dwa razy w tygodniu wykonuj obrazowanie MRI myszy w celu pomiaru guza. Przez kilka tygodni podczas leczenia należy wykonywać jedno badanie MRI i jedno USG co tydzień. Po zakończeniu leczenia należy wykonywać badania ultrasonograficzne co dwa tygodnie.
  5. Poddać mysz eutanazji 60 dni po zakończeniu serii leczenia lub po osiągnięciu humanitarnego punktu końcowego (wielkość guza >1,5cm3 lub zachorowalność na nowotwór), a następnie sekcja zwłok z usunięciem guza i narządu do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując protokół hipertermii generowanej za pomocą MRgHIFU, możliwe było konsekwentne podgrzewanie guzów w kończynie tylnej do pożądanej temperatury zadanej przez cały czas trwania zabiegu (Rycina 4 przedstawia reprezentatywną próbę, 10 lub 20 min, n = 65). Aby uznać terapię za skuteczną, wartość ROI musiała zostać utrzymana powyżej 39 °C przez cały czas trwania leczenia, z <6 °C zmienność w trakcie leczenia oraz brak nagrzewania tkanek poza obszarem docelowym. Dodatkowo temperatura rdze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowany w niniejszym dokumencie protokół został wykorzystany do celowania w guzy kończyn tylnych za pomocą MRgHIFU do łagodnego leczenia HT i uwalniania kapsułkowanych leków z liposomów in vivo. Podczas badania pilotażowego w tym protokole napotkano kilka krytycznych etapów, a optymalizacja tych krytycznych kroków przyczyniła się do poprawy skuteczności leczenia w porównaniu z badaniem pilotażowym. Pierwszym z nich jest całkowite usunięcie włosów z obszaru, który ma być poddany sonikacji. Wszelkie uwięzienie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych ani konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować naszym źródłom finansowania tego projektu oraz zaangażowanemu personelowi, w tym: C17 Research Grant, Canada Graduate Scholarship, Ontario Student Opportunity Trust Fund oraz James J. Hammond Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówkiEppendorf Eppendorf22363204
1kb plus drabinka DNAFroggabioDM015-R500
2x HS-Red Taq (mieszanka PCR)Żubel801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpecBrukerT18493170/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Niemcy
C1000 TermocyklerBiorad1851148
Maszynki do strzyżeniaWhal Peanut8655
Skompresowany żel ultradźwiękowyAquaflexHF54-004
Konwekcyjne urządzenie grzewcze3M Bair Hugger70200791401
Krem depilacyjnyNair61700222611Shopper's Drug Mart
DMEMŻubr219-065-LK
Zestaw do ekstrakcji DNeasyQiagen 69504
DPBSŻubr311-420-CL
System do wstrzykiwania lekówAparat HarvardaPY2 70-2131PHD 22/2200 Kompatybilny z MRI Pompa strzykawkowa
Smar do oczuOptixcare50-218-8442
F10 MediaŻubr318-050-CL
FBSŻubr081-105
FroggaroseFroggaBioA87
Żel Obrazowanie molekularneBioRadGelDocXR
GlutamaxŻubr609-065-EL
Lampa grzewczaMorganville ScientificHL0100 Podobne do tego produktu
Wewnątrznaczyniowe rurki polietylenowe (0,015 "ID x 0,043" OD, 20G)Napar SAIPE-20-100
IsofluraneSigma792632
M25FV24C Linia komórkowaGladdy LabN/A
Mikrolitrowa strzykawkaHamilton01-01-7648
Żel do obrazowania molekularnego Doc XRBiorad170-8170
Uchwyt na myszUżytym materiałem do druku 3D był ABS-M30i i został wydrukowany na maszynie FDM Fortus 380mc Nie dotyczyWymiary: długość = 43 mm, promień zewnętrzny = 15 mm, szerokość wewnętrzna (miejsce, w którym siedziałaby mysz) = 20,7 mm.
MyRun MachineCosmo Bio Co LtdCBJ-IMR-001-EX
Spektrofotometr Nanodrop 8000Thermo ScientificND-8000-GL
p53 starteryEurofinsN/ANiestandardowe startery
Probówki PCRDiamedSSI3131-06
Penicylina/StreptomycynaŻubr450-200-EL
Oprogramowanie Proteus Pichardo labN/A
System monitorowania oddechuSAIIModel 1030Kompatybilny z MR system monitorowania i bramkowania dla małych zwierząt
Urządzenie HIFU o małym otworze, LabFUSImage Guided TherapyN/ALabFUS, Terapia sterowana obrazem, Pessac, Francja Liczba elementów 8
częstotliwość 2,5 MHz
średnica  25 mm
promień krzywizny 20 mm
Rozmiar plamki ogniskowej 0,6 mm x 0,6 mm x 2,0 mm

Silnik: osie 2

Generator:
Liczba kanałów 8
Maksymalna moc elektryczna / kanał Wel 4
Maksymalna moc elektryczna Wel 32
Szerokość pasma 0,5 - 5 MHz
Sterowanie na kanał: Freq., Faza i. amplituda
Pomiary na kanał: Vrms, Irms, cos(theta)
Cykl pracy przy 100% mocy % 100% przez 1 min.

Przetwornik:
Liczba elementów 8
częstotliwość  2,5 MHz
średnica 25 mm
promień krzywizny 20 mm
Rozmiar plamki ogniskowej  0,6 mm x 0,6 mm x 2,0 mm
SYBR SafeThermoFisher ScientificS33102
TAEBisent811-540-FL
Cewnik do żył ogonowych (27G 0,5")Terumo Medical Corp15253
Wytrzymałe monitorowanieL201-08
Trypan niebieskiThermoFisher Scientific15250061
TrypsynaŻubr325-052-EL
Żel do ultradźwiękówAquasonicPLI 01-08

Bibliografia

  1. Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
  2. Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
  3. Dasgupta, R. Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology. , Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019).
  4. Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
  5. Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
  6. Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
  7. Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
  8. Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
  9. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12(2017).
  10. Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
  11. Kim, A. A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019).
  12. PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021).
  13. Suelmann, B. B. M. Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018).
  14. De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107(2021).
  15. Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
  16. Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
  17. Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
  18. Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
  19. Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65(2016).
  20. Dewhirst, M. W., Lee, C. -T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
  21. Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
  22. Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
  23. Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
  24. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
  25. De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564(2021).
  26. McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
  27. Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
  28. Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
  29. Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816(2021).
  30. Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 2/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

to:

Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto

Tagi

Lokalna hipertermiatermoczułe liposomy z doksorubicynąmysi model rabdomyosarkomycelowana hipertermia guzówmonitorowanie uwalniania lekutermometria MRIleczenie HIFUanaliza farmakokinetyczna
Hipertermia ultradźwiękowa o wysokiej intensywności sterowana rezonansem magnetycznym: wykonalna metoda leczenia w modelu mysiego mięsaka prążkowanokomórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.