Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi pełnią ważne funkcje efektorowe w homeostazie i stanach zapalnych. Komórki te są obecne w każdej tkance w organizmie i mają ważną zdolność do zmiany swojego profilu w zależności od bodźców obecnych w mikrośrodowisku. Cytokiny mogą głęboko wpływać na fizjologię makrofagów, zwłaszcza IFN-γ i interleukiny 4, generując odpowiednio typy M1 i M2. Ze względu na wszechstronność tych komórek, produkcja populacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego może być podstawowym krokiem w wielu eksperymentalnych modelach biologii komórki. Celem tego protokołu jest pomoc naukowcom w izolacji i hodowli makrofagów pochodzących z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Progenitorzy szpiku kostnego od myszy C57BL / 6 wolnych od patogenów są przekształcani w makrofagi po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), który w tym protokole jest uzyskiwany z supernatantu mysiej linii fibroblastów L-929. Po inkubacji dojrzałe makrofagi są dostępne do stosowania od7 do 10dnia. Pojedyncze zwierzę może być źródłem około 2 x 107 makrofagów. Dlatego jest to idealny protokół do pozyskiwania dużych ilości pierwotnych makrofagów przy użyciu podstawowych metod hodowli komórkowych.
Wprowadzenie
Monocyty i makrofagi to jednojądrzaste fagocyty, które mogą pochodzić od komórek progenitorowych w szpiku kostnym. Ostatnie badania wykazały, że makrofagi również pochodzą z erytro-mieloidalnych komórek progenitorowych pochodzących z woreczka żółtkowego1. Niezależnie od ich pochodzenia, leukocyty te pełnią ważne funkcje efektorowe w homeostazie i zapaleniu2,3. Monocyty to komórki z krwi obwodowej, które mogą dalej różnicować się w makrofagi w tissue2,4, podczas gdy makrofagi to heterogeniczne komórki, które wykazują fenotypy i f....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół został przeprowadzony zgodnie z Krajową Radą Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach (Concea) i za zgodą Komitetu ds. Etyki i Wykorzystywania Zwierząt (CEUA). Myszy C57BL/6 zakupiono w Biotério Central z Federal University of Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brazylia. Środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak fartuchy laboratoryjne, rękawice i okulary ochronne, powinny być używane na wszystkich etapach opisanych w niniejszym protokole.
1. Przygotowanie supernatantu linii fibroblastów L-929 jako źródła M-CSF
- Rozmrozić komórki linii fibroblastów L-929 (American Type Culture Collection Certified Ce....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Makrofagi są dużymi, przylegającymi komórkami o szczególnych właściwościach fizjologicznych. W kulturze wykazują one różnorodność prezentacji morfologicznych ze względu na zdolność do przylegania do szkła i plastiku, a ich typowa, rozprzestrzeniona morfologia wiąże się z emisją wypustek cytoplazmatycznych (Rycina 1). Gdy progenitorzy szpiku kostnego zostaną poddani działaniu M-CSF z supernatantu komórek L-929 i rozpoczną transformację w dojrzałe makrofagi, stają się oni przylegający do płytk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wytwarzanie populacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego jest podstawowym krokiem w wielu eksperymentalnych modelach biologii komórki, zwłaszcza gdy ważne jest uzyskanie jednorodnej populacji komórek pierwotnych. Jak wspomniano, komórki progenitorowe mogą przekształcać się w makrofagi tylko w obecności M-CSF. Supernatanty komórkowe L-929 mogą być stosowane jako główne źródło M-CSF. Poza kosztami, nie ma problemu z użyciem samego rekombinowanego M-CSF 8,17.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), przez Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) i Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), oraz Brazylijskiej Narodowej Rady Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 20 cm³ | DESCARPACK | SI100S4G | Sterylna strzykawka |
| Igły 26-G | BD | 497AQDKT7 | Sterylne igły |
| Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml | SARSTEDT | 62547254 | Plastikowe probówki stożkowe odpowiednie do wirowania |
| 70% roztwór etanolu | EMFAL | 490 | Roztwór etanolu do esterylizacji |
| Rozwarstwienie anatomiczne kleszcze | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Przechowywać w sterylnej zlewce zawierającej 70% roztwór etanolu |
| C57Bl/6 mysz typu dzikiego | Zakupiona od Bioté rio Central na Uniwersytecie Federalnym Minas Gerais | Nie dotyczy | Myszy muszą być wolne od specyficznych patogenów, w wieku od 6 do 10 tygodni. Myszy muszą zostać zakwaterowane co najmniej tydzień wcześniej, aby mogły dojść do siebie po stresie związanym z transportem |
| Kolba do hodowli komórkowych T175 | GREINER | C7481-50EA | Kolba T-175, z szyjką skośną, powierzchnia 75 cm2, z nasadką filtrającą, wolna od DNaz, bez RNaz |
| Kolba do hodowli komórkowych T75 | GREINER | C7231-120EA | Kolba T-75, z pochyloną szyjką, powierzchnia 75 cm2, z nasadką filtrującą, bez DNaz, |
| Chusteczki dezynfekujące bez RNaz czy chusteczki dla niemowląt? | CLOROX | Nie dotyczy | Pomaga w czyszczeniu kości |
| Woda destylowana | GIBCO | 15230 | Sterylna woda destylowana |
| DMEM/F12-10 | Nie dotyczy | Nie dotyczy Nie dotyczy | 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 ml penicyliny/streptomycyny (P/S) do DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant komórek L-929 | Nie dotyczy | dotyczy | Dodać 20% supernatantu z hodowli komórek L929 na DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium zawiera 2,5 mM L-glutaminy, 15 mM HEPES, 0,5 mM pirogronianu sodu i 1200 mg/L wodorowęglanu sodu. Zawiesić proszek w 1 litrze wody destylowanej i dodać 3,7 g wodorowęglanu sodu. Dostosować pH do 7,2 i przefiltrować za pomocą 0,22 &mikro;M. Przechowywanie w temperaturze 2 - 8 & stopni; C zamrażarka |
| Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, Stany Zjednoczone (FBS) | GIBCO | 10082147 | Wzbogacenie hemocytometru DMEM-F12 |
| SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Służy do liczenia makrofagów w mikroskopii | |
| Komórki L-929 | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 to linia komórek fibroblastów myszy stosowanych jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) |
| Zaćmienie Nikon TI | NIKON | Nie dotyczy | Nikon TI Eclipse to mikroskop fluorescencyjny i z kontrastem fazowym |
| Nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórek | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Nieenzimatyczny roztwór do dysocjacji komórek usuwa makrofagi z płytki, nie uszkadzając ich |
| Niepoddane działaniu metody Okrągłe szalki hodowlane bez obróbki 100 & razy; 20– | mm CORNING CLS430591 | Nie stosować szalek Petriego poddanych działaniu kultur tkankowych ani żadnej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych | |
| P3199 Penicylina G Sól potasowa | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antybiotyki |
| Roztwór | Stosować 0,26 grama penicyliny i 0,40 grama streptomycyny. Wymieszać z 40 ml sterylnego PBS. Wewnątrz poziomej komory z przepływem laminarnym użyj 0,22 &mikro; M przefiltrować i przechowywać porcje 1,0 ml w probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml w zamrażarce (-20° C) | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami wolna od wapnia i magnezu (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterylny |
| siarczan streptomycyny S7975, 650-850U / mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | |
| Antybiotyki Pipety serologiczne 10 ml lub 25 ml | SARSTEDT | 861254001 | Pipety serologiczne stosuje się objętości większe niż 1 ml |
| wodorowęglanu sodu | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | Poprawka pH dla oprogramowania DMEM-F12 |
| Nis Elements Viewer | NIKON | Nie dotyczy | NIS-Elements Viewer to bezpłatny, samodzielny program do przeglądania plików graficznych i zestawów danych |
| Sterylny PBS i 2% roztwór P/S | LABORCRIN | 590338 | Dodać 1 ml P/S do 40 ml sterylnego PBS |
| Nożyczki do prostych tęczówek | PBS KATENA | Nie dotyczy | Przechowywać w sterylnej zlewce zawierającej 70% roztwór etanolu |
| Supernatant komórek L-929 | Nie dotyczy | Nie dotyczy | L-929 to linia mysich komórek fibroblastów wykorzystywanych jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Supernatant L-929 uzyskano z protokołu |
| Ostrze skalpela chirurgicznego nr 24 Stal nierdzewna | SWANN-MORTON | 311 | Służy do odsłaniania nasady kości |
| Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | GIBCO | 15250061 | Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%, jest rutynowo stosowany jako barwienie komórek do oceny żywotności komórek za pomocą testu wykluczenia barwnika |
| Roztwór trypsyny/EDTA 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Służy do dysocjacji komórek z butelki hodowlanej |
| Woda do wstrzykiwań (WFI) do hodowli komórkowych | GIBCO | A12873 | Sterylna i wolna od endotoksyn woda |
Bibliografia
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
