Obecny protokół opisuje podejście skleralne do implantacji urządzenia pod siatkówkowego, wykonalną technikę chirurgiczną do zastosowania w modelach zwierzęcych chorób siatkówki w badaniach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwój techniki chirurgicznej dla implantów podsiatkówkowych u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwyrodnienie siatkówki, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie. Zastosowano wiele podejść w celu opracowania terapii opartych na medycynie regeneracyjnej dla AMD, w tym terapii opartych na komórkach macierzystych. Gryzonie jako modele zwierząt na zwyrodnienie siatkówki są podstawą badań translacyjnych ze względu na szerokie spektrum odmian, które rozwijają choroby zwyrodnieniowe siatkówki na różnych etapach. Jednak naśladowanie ludzkiej terapii w postaci implantów podsiatkówkowych u gryzoni jest wyzwaniem, ze względu na różnice anatomiczne, takie jak wielkość soczewki i objętość szklistki. Ten protokół chirurgiczny ma na celu dostarczenie przewodniego sposóbu przeszczepu implantów do przestrzeni podsiatkówkowej u szczurów. Włączono przyjazną dla użytkownika, wyczerpującą deskrypcję kluczowych kroków. Ten protokół został opracowany jako opłacalna procedura chirurgiczna dla reprodukowalności w różnych badaniach przedklinicznych na szczurach. Przed przeprowadzeniem eksperymentu chirurgicznego wymagana jest odpowiednia miniaturyzacja implantu wielkości ludzkiej, co obejmuje dostosowanie wymiarów implantu. Dostarczenie implantu do przestrzeni podsiatkówkowej odbywa się za pomocą zewnętrznego podejścia zamiast procedury downękowej. Za pomocą małej ostryej igły wykonuje się nacięcie sklery w przednio-górnym kwadrancie skroniowym, po którym następuje paracenteza w celu zmniejszenia ciśnienia śródgałkowego, minimalizując w ten sposób opór podczas implantacji chirurgicznej. Następnie wykonuje się iniekcję roztworu soli równoważących (BSS) przez nacięcie w celu uzyskania ogniskowego oderwania siatkówki (RD). Ostatnim etapem jest włożenie i wizualizowanie implantu do przestrzeni podsiatkówkowej. Ocena pooperacyjna umiejscowienia implantu pod siatkówką obejmuje obrazowanie za pomocą spektralnej domeny tomografii koherencyjnej optycznej (SD-OCT). Powtórki obrazowania potwierdzają stabilność podsiatkówkową implantu, zanim oczy są pobrane i unieruchamiane na potrzeby analizy histologicznej.
Wprowadzenie
Degeneracja plamki żółtej związana z wiekiem (AMD) jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie. W 2020 roku szacowano, że AMD dotyczyło 196 milionów osób, a do 2040 roku liczba ta ma wzrosnąć do około 288 milionów1. W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka terapii w celu złagodzenie zmian wzroku związanych z późnymi etapami AMD, głównie w celu leczenia rozwoju i postępu nowotworzeniom naczyniówkowego obserwowanego w mokrej postaci AMD. Z kolei leczenie suchej postaci AMD, gdzie dysfunkcja i utrata komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) progresuje do atrofii RPE i siatkówki, szacuje się na 85% do 90% przypadków AMD, z częstością występowania na poziomie 0,44% na całym świecie1,2. AMD została opisana jako choroba wieloczynnikowa, w której czynniki takie jak wiek, genetyka i środowisko przyczyniają się do wystąpienia i progresji choroby; kilka terapii jest w trakcie rozwoju, aby zwrócić się do różnych szlaków patofizjologicznych związanych z tą chorobą3.
Terapia oparta na komórkach macierzystych została opracowana jako nowatorska opcja terapeutyczna w celu zastąpienia niewydolnego RPE w suchej postaci AMD4. Chociaż użycie pluripotencjalnych komórek macierzystych znajduje się jeszcze na wczesnym etapie badań klinicznych, bezpieczeństwo zostało wykazane w kilku badaniach klinicznych5,6,7. Do tej pory istnieją dwie główne drogi wdrożenia komórek macierzystych do przestrzeni pod siatkówkowej: w zawiesinie lub wstawiając łatkę monowarstwową wysiewianą na biokompatybilnym implancie8,9,10,11,12. Nowe strategie stosujące terapię opartą na komórkach macierzystych w badaniach przedklinicznych wymagają modeli zwierzęcych, w których terapeutyki oparte na komórkach macierzystych mogą być dostarczane do tego samego docelowego miejsca, jak to zamierzone u ludzi. Różnica w anatomii może wymagać niewielkich zmian w procedurach, sprzęcie chirurgicznym i podejściu w porównaniu z tymi stosowanymi z końcowym produktem przeznaczonym dla ludzi13,14. Modyfikacja technik chirurgicznych oka jest jedną z wymaganych zmian, która została szeroko opisana jako skuteczne podejście do zastosowania na różnych modelach zwierzęcych15,16,17.
Mimo że wcześniejsze publikacje wspominały o technikach chirurgicznych do implantacji pod siatkówkowej u szczurów, nie ma kompleksowych opisów takich technik, aby pokonać trudności techniczne, z jakimi mogą się spotkać badacze. Dlatego istnieje potrzeba szczegółowego opisu technik chirurgicznych, dostarczenia najlepszych praktyk i wniosków, aby uniknąć, a jeśli to konieczne, rozwiązywania problemów podczas kluczowych etapów całej procedury. Celem niniejszego manuskryptu jest przedstawienie kompleksowych wytycznych dotyczących chirurgicznej implantacji implantatu do przestrzeni pod siatkówkowej u szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Kalifornii (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i Deklaracją Stowarzyszenia Badań nad Widocznością i Okulistyką (ARVO) w sprawie stosowania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku. W obecnym badaniu wykorzystano łącznie 12 samców szczura Royal College of Surgeon (RCS). Zwierzęta były hodowane w wybiegu i włączone do badania po osiągnięciu wieku 28 ± 1 dni postnatalnie. Przeprowadzono pełne badanie oka, aby zweryfikować brak nieprawidłowości oka. Subretinalne implanty, ultracienkie membrany wykonane z Parylene C i powlekane witronektyną, zostały zaprojektowane przez specjalną komercyjną organizację (patrz Tabela Materiałów). Membrany te replikują ludzkie membrany pod względem ich grubości i przepuszczalności (6,0 µm grubości siatka z 20 µm okrągłymi porami w ultracienkich obszarach). Miniaturyzacja długości i szerokości (1,0 mm x 0,4 mm) w porównaniu z ludzkimi membranami została osiągnięta, aby pomieścić subretinalne implanty wewnątrz oczu gryzoni18.
1. Opieka nad zwierzętami i przygotowanie chirurgiczne
- Ważenie zwierzęcia w celu obliczenia dawki znieczulenia i znieczulenie zgodnie z krokiem 1.2.
- Znieczulenie zwierzęcia przez wstrzyknięcie do jamy brzusznej mieszaniny ketaminy i ksylazyny (35-50 mg/kg i 5-10 mg/kg odpowiednio; patrz Tabela Materiałów). Wstrzyknij za pomocą strzykawki 1,0 ml i igły 30 G.
- Naładuj kolejną strzykawkę 1,0 ml połową ilości mieszaniny znieczulającej (ketamina i ksylazyna), aby utrzymać odpowiedni poziom znieczulenia podczas zabiegu.
- Potwierdź odpowiednie znieczulenie brakiem odruchu stępującego (mocne ściśnięcie palca).
- Aby odpowiednio uwidocznić jamę szklaniastki i siatkówkę, rozszerz źrenicę poprzez wkroplenie 1% tropikamidu i 2,5% kropli do oczu fenylefryny (patrz Tabela Materiałów) w leczonym oku.
- Zaaplikuj drugą dawkę kropli dylatacyjnych po 5 min.
- Naładuj sztuczne łzy lub żel smarujący do oka nieoperacyjnego co 5-10 minut, podczas gdy zwierzę jest znieczulone, aby nawilżyć rogówkę.
- Pokładź sterylną prześcieradło na podgrzewaczu (patrz Tabela Materiałów). Pokładź sterylną prześcieradło na stół chirurgiczny.
- Przygotuj sterylny obszar chirurgiczny, umieszczając na stole chirurgicznym następujące sterylne instrumenty: rękawice chirurgiczne, implant subretinalny i narzędzia chirurgiczne: kleszcze moskitierne (3), drobne nożyczki mikrochirurgiczne (1), uchwyt do igieł (1), drobne kleszcze z zębami (1), drobne kleszcze proste bez zębów (2), strzykawka mikrolitowa (1), igła stępiona 32 G (1), igła 27 G lub 30 G (2), szycie jedwabne 4-0 (3), waciki, zrównoważony roztwór soli (BSS) i szkiełko pokrywne (patrz Tabela Materiałów).
- Pod sterylnymi warunkami i używając sterylnych rękawic, napełnij strzykawkę mikrolitową roztworem BSS i przymocuj stępioną igłę 32 G.
- Włóż wacik do igły 27 G lub 30 G, aby stworzyć uchwyt do bardziej wrażliwej manipulacji igłą.
- Aby utrzymać sterylne warunki przez cały zabieg, zmień sterylne rękawice, jeśli manipuluje się narzędziami lub obszarami niesterylnymi, takimi jak mikroskopik chirurgiczny.
2. Podejście skleralne do implantacji subretinalnej: technika chirurgiczna
- Odezwę chirurgiczną w następujący sposób.
- Gdy zwierzę jest znieczulone, a źrenica jest rozszerzona (krok 1.5), umieść zwierzę brzuchem w dół, głową w kierunku badacza.
UWAGA: Trzymaj szczura na podgrzewaczu przykrytym sterylną prześcieradłem przez cały czas operacji i aż do pełnego odrobienia się zwierzęcia. - Zaaplikuj 5% kropli povidonu (patrz Tabela Materiałów) na oko i wyczyść powierzchnię oka i powieki wacikami.
- Umieść i wyreguluj mikroskop chirurgiczny (patrz Tabela Materiałów) nad operowanym okiem.
UWAGA: Zaleca się stosowanie mikroskopu okulistycznego w trakcie całego zabiegu chirurgicznego, aby uzyskać ostrzejsze i większe uwidocznienie struktur okulistycznych. - Zapewnij odpowiednie uwidocznienie obszaru chirurgicznego, podnosząc górną powiekę i wysuwając gałkę oczną za pomocą szycia jedwabnego 4-0.
- Podnieś górną powiekę za pomocą szycia jedwabnego 4-0. Umieść szycie po przedniej stronie powieki na wysokości gruczołów Meiboma. Zabezpiecz szycie traktacyjne, zaciskając kleszcze moskitierne do powierzchni chirurgicznej.
UWAGA: Jeśli szycie jest umieszczone wyżej niż poziom gruczołów Meiboma, zamiast uniesienia powieki nas
- Podnieś górną powiekę za pomocą szycia jedwabnego 4-0. Umieść szycie po przedniej stronie powieki na wysokości gruczołów Meiboma. Zabezpiecz szycie traktacyjne, zaciskając kleszcze moskitierne do powierzchni chirurgicznej.
- Gdy zwierzę jest znieczulone, a źrenica jest rozszerzona (krok 1.5), umieść zwierzę brzuchem w dół, głową w kierunku badacza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Implantacja implantatu pod siatkówkowego u szczurów RCS (N = 12) wykazała wykonalność i powtarzalność techniki chirurgicznej w podawaniu pod siatkówkę u szczurów. W niniejszym badaniu prawe oko było okiem leczonym (N = 12) za pomocą implantatu. W klinice ocenie przeprowadzonej na zakończenie zabiegu za pomocą mikroskopu chirurgicznego, dziewięć z dwunastu leczonych oczu wykazało pod siatkówkową lokalizację implantatu (75,00%), dwa oczy (16,67%) zostały zidentyfikowane jako śródsiatkówkowe umieszczenie implantatu, a w jed...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż procedura ta została wcześniej opisana z niewielkimi odmianami, celem niniejszego artykułu jest dostarczenie kompleksowego opisu procedury chirurgicznej implantacji podsiatkówkowych u szczurów, która ma być przestrzegana podczas nauki techniki oraz w celu przeciwdziałania wyzwaniom chirurgicznym i potencjalnym komplikacjom, z jakimi mogą się spotkać badacze. Przedstawiony tu protokół chirurgiczny obejmuje użycie ultracienkiej membrany parylenowej, która była szeroko stosowana w naszym laboratorium przez kilka lat...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
M.S.H., D.R.H. i J.L. są współzałożycielami i konsultantami firmy Regenerative Patch Technologies (RPT). Pozostali autorzy potwierdzają, że nie mają żadnych powiązań ani zaangażowania w żadnej organizacji lub podmiocie mającym jakiekolwiek interesy finansowe lub niefinansowe w przedmiocie lub materiałach omówionych w niniejszym rękopisie.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte przez CIRM DT3 (MSH) i Research to Prevent Blindness (USC Roski Eye Institute). Chcielibyśmy podziękować Fernando Gallardo i dr Ying Liu za ich wsparcie techniczne.
Sponsor nie miał wpływu na projekt ani przebieg tego badania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 cc syringe | VWR | BD309659 | |
| 27 G needle 1/2'' | VWR | BD305109 | |
| 30 G needle 1/2'' | VWR | BD305106 | |
| 32 G Blunt needle - Small hub RN | Hamilton | 7803-04 | |
| 4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5 | Ethicon | 1984G | |
| 6'' sterile cotton tips | VWR | 10805-154 | |
| Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution | Alcon | 8007-1 | |
| BSS irrigating solution 15 mL | Accutome | Ax17362 | |
| Buprenorphine ER | ZooPharm | N/A | |
| Castroviejo Caliper | Storz | E2405 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12 mm | Storz | E1796 | |
| Clayman-Vannas scissors straight | Storz | E3383S | |
| Cover glass, square | WVR | 48366-227 | |
| EPS Polystyrene block | Silverlake LLC | CFB8x12x2 | |
| Gonak 15 mL | Accutome | Ax10968 | Luksfer |
| Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic | Storz | E6772 | |
| Hamilton syringe 700 series 100 µL | Hamilton | 7638-01 | |
| HEYEX Software | Heidelberg | N/A | oprogramowanie do zarządzania obrazami |
| Kelman-McPherson tying forceps angled | Storz | E1815 AKUS | |
| Ketamine (100 mg/mL) | MWI | 501072 | |
| Needle holder 9mm curved fine locking | Storz | 3-302 | |
| Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g | Accutome | Ax0720 | |
| Ophthalmic surgical microscope | Zeiss | SN: 233922 | |
| Phenylephrine 2.5% 15 mL | Accutome | Ax0310 | |
| Spectralis SD-OCT | Heidelberg | SPEC-CAM-011210s3600 | |
| Sterile Drape | VWR | 100229-300 | |
| Sterile surgical gloves | VWR | 89233-804 | |
| T-Pump heating system | Gaymar | TP650 | |
| Tropicamide 1% 15 mL | Accutome | Ax0330 | |
| Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin | Mini Pumps LLC, CA | specifically designed for this study | used as subretinal implants |
| Xylazine (100 mg/mL) | MWI | 510650 |
Bibliografia
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Schultz, N. M., Bhardwaj, S., Barclay, C., Gaspar, L., Schwartz, J. Global burden of dry age-related macular degeneration: a targeted literature review. Clinical Therapeutics. 43 (10), 1792-1818 (2021).
- Deng, Y., et al. Age-related macular degeneration: Epidemiology, genetics, pathophysiology, diagnosis, and targeted therapy. Genes & Diseases. 9 (1), 62-79 (2021).
- Nazari, H., et al. Stem cell-based therapies for age-related macular degeneration: The promises and the challenges. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 1-39 (2015).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Kashani, A. H., et al. Survival of an HLA-mismatched, bioengineered RPE implant in dry age-related macular degeneration. Stem Cell Reports. 17 (3), 448-458 (2022).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (6), 598-635 (2017).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Antognazza, M. R., et al. Characterization of a polymer-based, fully organic prosthesis for implantation into the subretinal space of the rat. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2271-2282 (2016).
- Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).
- Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatán minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- Yu, W., et al. Biocompatibility of subretinal parylene-based Ti/Pt microelectrode array in rabbit for further artificial vision studies. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 2 (1), 33-36 (2009).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of perforated subretinal prostheses with retinal tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5(2015).
- Lu, B., et al. Semipermeable parylene membrane as an artificial Bruch's membrane. 2011 16th International Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference. IEEE. , 950-953 (2011).
- Hu, Y., et al. Subretinal implantation of gelatin films with stem cells derived RPE in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 1763(2013).
- Aramant, R. B., Seiler, M. J. Retinal transplantation-advantages of intact fetal sheets. Progress in Retinal and Eye Research. 21 (1), 57-73 (2002).
- Peng, Q., et al. Structure and function of embryonic rat retinal sheet transplants. Current Eye Research. 32 (9), 781-789 (2007).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Ho, E., et al. Characteristics of prosthetic vision in rats with subretinal flat and pillar electrode arrays. Journal of Neural Engineering. 16 (6), 066027(2019).
- Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate Royal College of Surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958(2021).
- Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
- Matsuo, T., Hosoya, O., Tsutsui, K. M., Uchida, T. Behavior tests and immunohistochemical retinal response analyses in RCS rats with subretinal implantation of Okayama-University-type retinal prosthesis. Journal of Artificial Organs. 16 (3), 343-351 (2013).
- Seiler, M. J., et al. A new immunodeficient pigmented retinal degenerate rat strain to study transplantation of human cells without immunosuppression. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (7), 1079-1092 (2014).
- Stanzel, B. V. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. The British Journal of Ophthalmology. 51 (2), 124-129 (1976).
- Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Experimental Eye Research. 42 (4), 331-337 (1986).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
