Artykuł metodologiczny

Nowe perspektywy metodologiczne w badaniach biologii komarów

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64602

⸱

11 sierpnia 2022

 , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

W tym artykule

Streszczenie

OMAWIANE ARTYKUŁY:

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, OS Techniki mikroiniekcji zarodków dla skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), E61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny. Dziennik eksperymentów wizualnych. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, TB, James, A. A. Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae . Dziennik eksperymentów wizualnych. (173), e62591(2021b).

Chen, T. Y. i wsp. Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (170), E62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, ND, Becnel, JJ, Short, SM Rozmnażanie pasożyta mikrosporydiów Edhazardia aedis w komarach Aedes aegypti . Dziennik eksperymentów wizualizowanych. (162), e61574 (2020).

Jensen, B. M. i wsp. Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (179), E63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, TM, Duvall, L. B. Karmienie i ilościowe określanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti . Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, JPV Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (174), e61849 (2021).

Liu, X. i wsp. Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (163), E61341 (2020).

Meuti, ME, Harrell, R. Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR / Cas9. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (163), E61651 (2020).

Tripathi, AK, Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Hodowla gametocytów Plasmodium falciparum i zakażenie komarami poprzez sztuczne karmienie błony. Dziennik eksperymentów wizualnych. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL). Dziennik eksperymentów wizualnych. (171), e61232 (2021).

Wang, X. i wsp. Heterologiczna ekspresja i analiza funkcjonalna receptorów zapachowych Aedes aegypti do ludzkich zapachów w oocytach Xenopus . Dziennik eksperymentów wizualnych. (172), e61813 (2021).

Artykuł redakcyjny

Patogeny przenoszone przez komary są odpowiedzialne za miliony infekcji u ludzi każdego roku. Aby zwalczać choroby wywoływane przez te patogeny, takie jak malaria i denga 1,2,3, naukowcy pogłębiają wiedzę na temat biologii komarów i opracowują nowe narzędzia do zwalczania komarów 4,5,6. Zbiór ten ułatwia nowe badania w tych dziedzinach dzięki postępom metodologicznym obejmującym biologię komarów, kontrolę komarów, infekcje patogenami i transgenezę komarów.

Jensen i wsp.7 opisują test aktywności owadobójczej u komarów i muszek owocowych, obejmujący bezpośrednie miejscowe stosowanie insektycydów i procedurę dawkowania i określania dawki w oparciu o masę owadów. W artykule omówiono przygotowanie miejsca pracy i roztworów chemicznych, stosowanie insektycydów oraz określanie przeżywalności owadów po ekspozycji. Metodologia stosowania miejscowego ułatwia stałą ekspozycję na określone dawki insektycydów, zmniejszając zmienność międzygatunkową i między testami, co będzie bardzo interesujące dla osób zajmujących się zwalczaniem szkodników lub badaniem odporności na insektycydy w populacjach komarów.

Chen i wsp.8 podkreślają prosty, wykonalny, wysokowydajny protokół ekstrakcji DNA próbek komarów do sekwencjonowania całego genomu, wykorzystujący magnetyczne kulki wiążące DNA. Protokół obejmuje homogenizację próbki i cały proces ekstrakcji. Takie podejście sprzyja wysokowydajnej, a jednocześnie wysoce powtarzalnej metodzie ekstrakcji DNA, która jest odpowiednia dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. Zainteresuje osoby pracujące nad aplikacjami genomiki komarów, zwłaszcza preparatami DNA komarów polnych.

Kilka artykułów w kolekcji dotyczy postępów metodologicznych związanych z badaniami nad biologią komarów. Jové i wsp.9 opisują wysokoprzepustowe, oparte na fluorescencji oznaczanie ilościowe objętości posiłków dla komarów karmionych sztuczną dietą. Obejmuje przygotowanie posiłku, dodanie barwnika fluoresceinowego, dostarczenie posiłku w tanim systemie podajnika, a następnie ilościowe określenie objętości posiłku w próbkach karmionych komarów. Opisana metodologia pozwala na skuteczną ocenę żerowania komarów, co ma znaczenie dla testów żywieniowych obejmujących sztuczne diety, krew, cukier lub nektar. Będzie to cenne dla osób badających zachowania żywieniowe owadów. Tsujimoto i Adelman10 opisują nowatorską technikę oznaczania płodności i płodności komarów przy użyciu wypełnionych agarozą 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych. Protokół szczegółowo opisuje przygotowanie płytki, karmienie komarów, składanie jaj, obrazowanie płytki i pozyskiwanie danych. Zmniejsza czas, przestrzeń i pracę w porównaniu z konwencjonalną metodologią i zainteresuje badaczy oceniających przystosowanie komarów lub molekularne podstawy rozmnażania komarów. Lajevardi i wsp.11 wykorzystują test Ramsaya do badania transportu jonów i wydzielania płynów w tkankach wydalniczych komarów. Protokół dostosowuje test Ramsaya do użycia z niewielką ilością tkanki owada, a także omawia przygotowanie i kalibrację elektrod, przygotowanie tkanek komara do testu oraz rejestrowanie odczytów z kanalików malpighiego i tkanek trawiennych. Protokół ten zainteresuje osoby pracujące z układami trawiennymi lub wydalniczymi oraz neuropeptydową/endokrynologiczną regulacją tkanek owadów. Wang i wsp.12 opisują heterologiczną ekspresję receptorów zapachowych Ae. aegypti w oocytach Xenopus , aby ocenić ich reakcję na ludzkie zapachy. Obejmuje klonowanie genów receptora zapachowego, syntezę cRNA, sekcję i izolację oocytów Xenopus , heterologiczną ekspresję genów, a następnie zapis pojedynczej sensyllum w celu oceny aktywności receptora. Protokół ten zapewnia unikalny system oceny genetycznych i funkcjonalnych podstaw węchu komarów, z potencjalnymi zastosowaniami związanymi z badaniami nad zachowaniem komarów.

Cztery artykuły w tym zbiorze omawiają genetycznie modyfikowane komary i proces transgenezy. Carballar-Lejarazú i wsp.13 opisują szczegółowe procedury wytwarzania transgenicznych komarów Anopheles gambiae poprzez mikroiniekcję embrionalną, podczas gdy Bui i wsp.14 demonstrują mikroiniekcję zarodków Culex quinquefasciatus w celu edycji genomu opartej na CRISPR/Cas9. Pierwszy z nich jest kluczowym wektorem ludzkich pasożytów malarii, podczas gdy drugi jest kluczowym wektorem arbowirusów, w tym wirusa Zachodniego Nilu, i jest niedostatecznie zbadany w kontekście transgenezy. Protokoły te obejmują wyciąganie i ładowanie igieł, przygotowanie i wyrównanie komórek jajowych, a następnie wstrzyknięcie, a także odzyskiwanie zarodków i badania przesiewowe pod kątem fenotypów transgenowych. Protokół An. gambiae szczegółowo opisuje procedury składania jaj i pobierania jaj oraz wizualnie przedstawia udane zastrzyki. Konsola Cx. Protokół Quinquefasciatus określa szczegółowe parametry ciągnięcia igły i końcówki zwiększające szybkość mutagenezy. Artykuł Meuti i Harrella15 zawiera dogłębne skupienie się na transgenezie u Culex pipiens, w szczególności na procesie wstrzykiwania. Film pokazuje cały proces wtrysku bardzo szczegółowo; Opisano w nim zasypywanie i zakładanie igły, ustawianie komórek jajowych i wstrzykiwacza, a także szczegółowe informacje na temat skutecznego wstrzykiwania. Zapewnia rygorystyczne instrukcje techniczne i rozwiązywanie problemów związanych z procesem wstrzykiwania oraz oferuje wskazówki, jak zmaksymalizować szybkość wylęgu jaj i sprawność larw. Te trzy artykuły zainteresują tych, którzy chcą opracować nowe strategie kontroli wektorów, a także tych, którzy badają genetykę Anopheles i Culex oraz interakcje gospodarz-patogen. Carballar-Lejarazú i wsp.16 opisują proces prowadzenia prób w małych klatkach w celu oceny, czy systemy napędu genowego mogą rozprzestrzeniać określone geny do naiwnych populacji komarów w różnych warunkach. W protokole przeanalizowano mechanikę zalewowych prób uwalniania bez napędu oraz prób z napędem genowym z nakładającymi się lub nienakładającymi się generacjami komarów. Dostarcza precyzyjnych informacji na temat proporcji addycji typu dzikiego i transgenicznego, procesów przesiewowych i dostosowywania parametrów eksperymentalnych do testów sprawności lub do modelowania rozprzestrzeniania się alleli napędu genowego. Protokół ten przyniesie korzyści naukowcom zajmującym się kontrolą wektorów, którzy opracowują nowatorskie systemy napędu genowego i badają ich skuteczność.

Ostatnie trzy artykuły w kolekcji omawiają hodowlę patogenów i ekspozycję. Liu i wsp.17 demonstrują protokół ponownego wprowadzania bakterii do dorosłych komarów po leczeniu antybiotykami, aby pomóc zrozumieć biologiczne role odgrywane przez mikrobiotę. Obejmuje hodowlę i izolację bakterii, antybiotykoterapię i testy żywienia bakteryjnego. Protokół zapewnia dobrą syntezę złożonej, wieloaspektowej procedury. Przyda się osobom zainteresowanym badaniem mikrobioty komarów lub rozwojem dorosłych komarów gnotobiotycznych. Grigsby i wsp.18 zwracają uwagę na protokół integracji hodowli pasożyta Edhazardia aedis microsporidian ze standardową hodowlą Aedes aegypti . Szczegółowo opisuje izolację, identyfikację i liczenie zakaźnych zarodników przed ponownym zakażeniem komarów i utrzymaniem zakażonych jaj komarów. Zawiera porady dotyczące rozwiązywania problemów związanych z wykrywaniem zarodników i koordynowaniem wylęgu komarów z przygotowaniem zarodników. Protokół ten zainteresuje tych, którzy chcą hodować pasożyty mikrosporydów do celów eksperymentalnych, a także tych, którzy badają wpływ infekcji pasożytniczej na odporność komarów lub zdolność wektorową. Tripathi i wsp.19 szczegółowo opisują protokół hodowli gametocytów Plasmodium falciparum , przeprowadzania infekcji komarów Anopheles za pośrednictwem systemu podajnika membranowo-szklanego oraz liczenia oocyst i sporozoitów. Jest to niezbędny protokół dla hodowli P. falciparum , który może być trudny do osiągnięcia. Protokół będzie bardzo cenny dla osób badających zakażenie Plasmodium i przenoszenie wirusa u komarów, dla tych, którzy chcą opracować strategie przeciwmalaryczne, w tym narzędzia do blokowania transmisji, oraz dla tych, którzy badają kompetencje populacji An. gambiae w zakresie wektorów , w tym linie transgeniczne i strategie napędu genowego.

Zbiór artykułów porusza wiele tematów badawczych, które są ważne dla przyszłości zwalczania komarów i patogenów przenoszonych przez komary. Zrozumienie odporności komarów na pestycydy ma kluczowe znaczenie, ponieważ odzwierciedla sukces obecnych programów kontroli; Co więcej, wykrycie oporu może być sygnałem, że konieczne są zmiany w strategiach sterowania. Technologie inżynierii genetycznej, w tym transgeneza komarów, edycja genomu i napęd genowy, prawdopodobnie odegrają kluczową rolę w zwalczaniu komarów w nadchodzącej dekadzie i później ze względu na ich wysoką podatność i zdolność adaptacji. Poszerzona wiedza na temat biologii komarów, w szczególności w zakresie genomiki populacyjnej, interakcji gospodarz-patogen, zachowania komarów oraz molekularnych podstaw kluczowych cech biologicznych, dostarczy cennych informacji, które można wykorzystać do opracowania nowych narzędzi kontroli. Na przykład identyfikacja genów zaangażowanych w węch może pomóc naukowcom w opracowaniu nowych repelentów, podczas gdy identyfikacja genów zaangażowanych w interakcje gospodarz-patogen może ostatecznie doprowadzić do rozwoju transgenicznych komarów przenoszących efektory przeciwpatogenne. Zbiór ten dotyka wszystkich tych tematów, a w rękach biologów wektorowych z całego świata opisane tutaj metody pomogą ułatwić nowy i unikalny wgląd w wiele aspektów biologii komarów. Kluczowym wyzwaniem na przyszłość będzie wykorzystanie wiedzy uzyskanej w tych obszarach tematycznych do opracowania nowych strategii kontroli lub uzupełnienia lub optymalizacji obecnych strategii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Publikacja ta została wsparta przez Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), projekt Hatch 1026692 do EPC.

Bibliografia

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  2. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., Das, J. K. Global burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of Poverty. 3, 21(2014).
  3. Caminade, C., McIntyre, K. M., Jones, A. E. Impact of recent and future climate change on vector-borne diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1436 (1), 157-173 (2019).
  4. Caragata, E. P., et al. Prospects and pitfalls: Next-Generation tools to control mosquito-transmitted disease. Annual Review of Microbiology. 74, 455-475 (2020).
  5. Jones, R. T., Ant, T. H., Cameron, M. M., Logan, J. G. Novel control strategies for mosquito-borne diseases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 376 (1818), 20190802(2021).
  6. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (1), 0007831(2020).
  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Culex QuinquefasciatusAnopheles GambiaeGenetically-engineered MosquitoesMicroinjection TechniquesDNA Extraction ProtocolInsecticide Toxicity BioassayAedes AegyptiNeuropeptides RegulationCRISPR/Cas9Plasmodium FalciparumArtificial Membrane Feeding
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.