Method Article

Test pustej przestrzeni w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/64621

⸱

February 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje nową metodę badania zachowania myszy podczas mikcji poprzez włączenie monitoringu wideo do konwencjonalnego testu pustego miejsca. Takie podejście dostarcza czasowych, przestrzennych i wolumetrycznych informacji na temat zdarzeń mikcji i szczegółów zachowania myszy podczas jasnych i ciemnych faz dnia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normalne zachowanie związane z oddawaniem moczu jest wynikiem skoordynowanej funkcji pęcherza, cewki moczowej i zwieraczy cewki moczowej pod właściwą kontrolą układu nerwowego. Aby zbadać dobrowolne zachowania związane z oddawaniem moczu w modelach mysich, naukowcy opracowali test pustki (VSA), metodę, która mierzy liczbę i obszar plam moczu osadzonych na bibule filtracyjnej wyściełającej podłogę klatki zwierzęcia. Chociaż technicznie prosty i niedrogi, test ten ma ograniczenia, gdy jest stosowany jako test punktu końcowego, w tym brak czasowej rozdzielczości zdarzeń mikcji i trudności w ilościowym określeniu nakładających się plam moczu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy monitorowany wideo VSA, który nazywamy VSA W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-VSA) i który pozwala nam określić częstotliwość mikcji, ocenić objętość mikcji i wzorce mikcji oraz dokonywać pomiarów w ciągu 6-godzinnych okien czasowych zarówno w ciemnej, jak i jasnej fazie dnia. Metoda opisana w tym raporcie może być zastosowana do szerokiej gamy badań na myszach, które badają fizjologiczne i neurobehawioralne aspekty dobrowolnego oddawania moczu w stanach zdrowotnych i chorobowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Magazynowanie moczu i oddawanie moczu są koordynowane przez centralny obwód (ośrodkowy układ nerwowy), który otrzymuje informacje o stanie napełnienia pęcherza przez nerwy miednicy i podbrzusza. Nabłonek dróg moczowych wyściełający drogi moczowe od miedniczki nerkowej do bliższej cewki moczowej tworzy ścisłą barierę dla produktów przemiany materii i patogenów obecnych w moczu. Jest to integralny składnik sieci czuciowej, która wyczuwa i komunikuje stan wypełnienia pęcherza moczowego do leżących poniżej tkanek i nerwów doprowadzających1,2. Przerwanie bariery urotelialnej lub zmiany w szlakach mechanotransdukcji urotelialnej mogą prowadzić do dysfunkcji oddawania moczu wraz z objawami ze strony dolnych dróg moczowych, takimi jak częstotliwość, parcie naglące, moczenie nocne i nietrzymanie moczu3,4,5,6,7. Podobnie starzenie się, cukrzyca, infekcje dolnych dróg moczowych, śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego i inne procesy chorobowe, które wpływają na pęcherz moczowy lub związane z nim obwody kontrolujące jego funkcję, są znane z powodowania dysfunkcji pęcherza moczowego8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Lepsze zrozumienie normalnych i nieprawidłowych zachowań związanych z oddawaniem moczu zależy od opracowania metod, które mogą niezawodnie rozróżniać różne wzorce oddawania moczu.

Tradycyjnie, dobrowolne oddawanie moczu przez myszy było badane za pomocą testu mimicznego miejsca (VSA), opracowanego przez Desjardinsa i współpracowników20, i szeroko przyjętego ze względu na jego prostotę, niski koszt i nieinwazyjne podejście8,21,22,23,24. Ten test jest zwykle wykonywany jako test końcowy, w którym mysz spędza określoną ilość czasu w klatce wyłożonej bibułą filtracyjną, która jest następnie analizowana poprzez zliczenie liczby i ocenę wielkości plamek moczu, gdy bibuła filtracyjna jest umieszczana w świetle ultrafioletowym (UV) (plamki moczu fluoryzują w tych warunkach)20. Pomimo tych wielu zalet, tradycyjny VSA ma pewne poważne ograniczenia. Ponieważ myszy często oddają mocz w tych samych miejscach, badacze muszą ograniczyć czas trwania testu do stosunkowo krótkiego okresu czasu (≤4 godziny)25. Nawet jeśli VSA jest wykonywany w krótszych okresach czasu, prawie niemożliwe jest usunięcie małych pustych plamek (SVS), które opadają na duże puste miejsca, lub odróżnienie SVS od przenoszenia moczu przylegającego do ogonów lub łap. Bardzo trudno jest również odróżnić, czy SVS są konsekwencją częstych, ale indywidualnych zdarzeń związanych z oddawaniem moczu (fenotyp, który często obserwuje się w odpowiedzi na zapalenie pęcherza moczowego4,26), czy też z powodu dryblingu po mikcji (fenotyp związany z niedrożnością ujścia pęcherza moczowego27). Co więcej, chęć wykonania testu w godzinach pracy, w połączeniu z trudnościami w dostępie do pomieszczeń mieszkalnych przy wyłączonym świetle, często ogranicza te testy do okresu świetlnego 24-godzinnego cyklu okołodobowego. W związku z tym te ograniczenia czasowe uniemożliwiają ocenę zachowania myszy w zakresie oddawania moczu podczas ich aktywnej fazy nocnej, zmniejszając zdolność do analizowania określonych genów lub zabiegów, które są regulowane przez rytmy okołodobowe.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, badacze opracowali alternatywne metody oceny zachowania związanego z oddawaniem moczu w czasie rzeczywistym26,28,29,30,31,32. Niektóre z tych podejść obejmują użycie drogiego sprzętu, takiego jak klatki metaboliczne26,28,29, lub użycie kamer termowizyjnych30; Jednak one również mają ograniczenia. Na przykład w klatkach metabolicznych mocz ma tendencję do przylegania do drutów dna siatkowego i do ścianek lejka, zmniejszając ilość moczu, który jest zbierany i mierzony. W związku z tym dokładne zbieranie danych o małych pustkach może być trudne. Co więcej, klatki metaboliczne nie dostarczają informacji o przestrzennym rozkładzie zdarzeń mikcji (tj. oddawanie moczu w rogach w porównaniu ze środkiem komory). Biorąc pod uwagę, że promieniowanie podczerwone o dużej długości fali używane przez kamery termograficzne nie przenika do ciał stałych, aktywność mikcji oceniana za pomocą termografii wideo musi być wykonywana w systemie otwartym, co może być trudne w przypadku aktywnych myszy, ponieważ mogą one skakać na kilka cali w powietrzu. Innym systemem jest zautomatyzowane podejście do usuwania plam na papierze (aVSOP), 33, które składa się ze zwiniętej bibuły filtracyjnej, która zwija się ze stałą prędkością poniżej podłogi z siatki drucianej klatki dla myszy. Takie podejście zapobiega uszkodzeniom papieru i nakładaniu się plam moczowych, które występują w klasycznym VSA, a jego wdrożenie pozwala badaczowi na przeprowadzanie eksperymentów przez kilka dni. Nie zapewnia jednak badaczowi dokładnego czasu zdarzeń związanych z mikcją, a także nie ma możliwości zbadania zachowania i tego, jak koreluje ono z wykrywaniem. Aby uzyskać te informacje, naukowcy włączyli monitoring wideo do testów mikcji, podejście, które umożliwia jednoczesną ocenę aktywności myszy i zdarzeń związanych z oddawaniem moczu31,32. Jedno z podejść polega na umieszczeniu diody elektroluminescencyjnej (LED) i kamery wideo z filtrem białkowym z zielonej fluorescencji pod eksperymentalną klatką w celu wizualizacji zdarzeń mikcji, a także diody LED na podczerwień i kamery wideo nad klatką w celu uchwycenia pozycji myszy32. Ta konfiguracja została wykorzystana do monitorowania zachowania pustki podczas wykonywania fotometrii światłowodowej; Jednak jasno oświetlone otoczenie tego systemu wymagało od badaczy potraktowania myszy środkiem moczopędnym w celu stymulacji mikcji. W innym eksperymentalnym projekcie kamery szerokokątne umieszczono powyżej i poniżej eksperymentalnej klatki, aby zobrazować odpowiednio aktywność motoryczną myszy i zdarzenia oddawania moczu. W tym przypadku plamy moczu osadzone na bibule filtracyjnej wyściełającej podłogę klatki zostały ujawnione poprzez oświetlenie bibuły filtracyjnej lampami UV umieszczonymi pod klatką31. Ta konfiguracja została wykorzystana w krótkich testach, trwających 4 minuty, podczas lekkiej fazy dnia, w celu zbadania neuronów pnia mózgu zaangażowanych w dobrowolne zachowanie związane z mikcją31. Nie podano przydatności tego systemu do stosowania w fazie ciemnej lub w okresach czasu >4 min.

W tym artykule opisana jest metoda, która rozszerza tradycyjne VSA, pozwalając na długoterminowe monitorowanie wideo zachowania myszy podczas mikowania. To ekonomiczne podejście dostarcza czasowych, przestrzennych i wolumetrycznych informacji o zdarzeniach opróżniania przez dłuższy czas w jasnych i ciemnych fazach dnia, wraz ze szczegółami związanymi z zachowaniem myszy3,4,34. Podane są szczegółowe informacje dotyczące budowy komór opróżniania, wdrożenia VSA W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-VSA) oraz analizy danych. RT-VSA jest cenny dla badaczy dążących do zrozumienia mechanizmów fizjologicznych kontrolujących funkcję układu moczowego, do opracowania farmakologicznych podejść do kontroli mikcji oraz do zdefiniowania molekularnych podstaw procesów chorobowych, które wpływają na dolne drogi moczowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urothelial Piezo1/2 myszy z podwójnym nokautem (Pz1/2-KO, genotyp: Piezo1fl/fl; Piezo2fl/fl; Upk2CRE+/-) i kontrolne (Pz1/2-C, genotyp: Piezo1fl/fl; Piezo2fl/fl; Upk2CRE-/-) zostały wygenerowane we własnym zakresie ze szczepów rodzicielskich uzyskanych z laboratoriów Jax (szczep Piezo1fl/fl # 029213; Szczep Piezo2fl/fl # 027720; Upk2CRE+/- szczep # 029281). W eksperymentach wykorzystano zarówno samice (1,5–3 miesiące i waga 17–20 g), jak i samce (2–4 miesiące i waga 23–29 g). Do eksperymentów z zapaleniem pęcherza moczowego wywołanego cyklofosfamidem użyto samic C57Bl/6J typu dzikiego (w wieku 3 miesięcy i o wadze ~20 g) (laboratoria Jacksona, szczep # 000664). Zwierzęta były trzymane w pomieszczeniach, a eksperymenty były przeprowadzane w Ośrodku Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Pittsburghu za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami Polityki Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych oraz Ustawy o dobrostanie zwierząt.

1. Montaż klatek do badania pustych przestrzeni w czasie rzeczywistym (RT-VSA)

  1. Platforma RT-VSA składa się ze stojaka UV, na którym znajdują się dwie żarówki UV i dwóch kamer szerokokątnych (kamery dolne), które służą do rejestrowania aktywności mikcji w fazie światła dnia. Ułóż dwie komory myszy tak, aby odpoczywały na stojaku. Przymocuj kamery szerokokątne (kamery górne) do pokrywy każdej komory myszy, używane do rejestrowania aktywności pustki w ciemnej fazie dnia (Rysunek 1A).
  2. Zbuduj ramę stojaka UV i komór myszy z profili aluminiowych z rowkiem T 1 w x 1 calu. Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z listą komponentów użytych do budowy dwóch komór myszy i stojaka UV oraz Rysunek 1B–D, aby zapoznać się z różnymi widokami zmontowanych komponentów i wymiarów.
  3. Zbuduj każdą komorę myszy z ośmioma profilami aluminiowymi z rowkiem T przyciętymi na 10 cali i czterema przyciętymi na 14,75 cala. Zacznij od zmontowania dolnej części komory myszy i użyj standardowych łączników końcowych (Tabela 1), aby zmontować profile z rowkiem T zgodnie z Rysunek 1. Zamontuj akryl przepuszczający promieniowanie UV o wymiarach 38,5 cm x 26,5 cm w wewnętrznym kanale profili, aby zbudować podłogę komór myszy.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat montażu profili z rowkiem T ze standardowymi łącznikami końcowymi można znaleźć na stronie internetowej firmy.
  4. Zbuduj ściany komory myszy z resztą profili. Zamontuj w profilach panele z poliwęglanu o wymiarach 38,5 cm x 21,5 cm i 26,5 cm x 21,5 cm i 26,5 cm x 21,5 cm, aby zmontować zewnętrzne ścianki komory myszy. Użyj paneli z poliwęglanu AR o wymiarach 37,5 cm x 23,9 cm i 24,4 cm x 23,9 cm, aby zbudować wnętrze komory myszy.
  5. Zabezpiecz panele poliwęglanowe AR za pomocą standardowego łącznika końcowego z bieżnikiem 1/4-20. Zobacz instrukcję montażu paneli w profilach na stronie internetowej w UWAGA do kroku 1.3. Użyj komercyjnej uszczelki silikonowej, aby uszczelnić połączenia między panelami wewnętrznymi.
  6. Użyj dwóch profili z rowkiem T o średnicy 12 cali i dwóch 14,75 cala, aby zmontować pokrywę klatki, jak pokazano w Rysunek 1B. Zamontuj panel z poliwęglanu AR o wymiarach 38,5 cm x 26,5 cm w wewnętrznym kanale profili, aby uzupełnić pokrywę.
  7. Zamontuj 12-calowy wspornik profilu kamery prostopadle do długich osi górnej części klatki i zabezpiecz dwoma lekkimi przejściami wewnątrz nawiasów narożnych (oznaczonych 3 w Rysunek 1B). Użyj prostej płaskiej płytki (oznaczonej 2) jako wspornika montażowego kamery internetowej i zamontuj ją, jak pokazano na Rysunek 1B. Przymocuj kamerę do wspornika za pomocą mocującej kamerę.
  8. Użyj standardowego prawego zawiasu podnoszonego serii 10, aby przymocować pokrywę do korpusu komory myszy (oznaczonej 1 w Rysunek 1B).
  9. Zbuduj stojak UV z czterema profilami z rowkiem T przyciętymi do 40 cali, czterema profilami z rowkiem T przyciętymi do 32 cali i czterema profilami z rowkiem T przyciętymi do 10 cali, zgodnie z Rysunek 1C,D. Zamontuj w profilach akrylową taflę lustra o wymiarach 82,5 cm x 26,5 cm, aby zbudować dno komory UV.
  10. Użyj arkusza lustra akrylowego o wymiarach 82,5 cm x 30,5 cm i 26,5 cm x 30,5 cm, aby zbudować ścianę stoiska UV.
  11. Przymocuj płaskie płytki T z pięcioma otworami z serii 10 (oznaczone 2 w Rysunek 1C), płaskie płytki L z pięcioma otworami z serii 10 (oznaczone 3 w Rysunek 1C) oraz płaskie płytki trójnikowe z pięcioma otworami serii 10 (oznaczone 1 w Rysunek 1C), aby zabezpieczyć stojak UV.
  12. Zamontuj dolne kamery w profilu z rowkiem T przyciętym do 32 cali i przymocuj do dolnej części stojaka za pomocą dwóch wsporników narożnych przejściowych lite, jak pokazano na Rysunek 1D. Użyj prostych płaskich płyt, aby przymocować kamery internetowe do profilu z rowkiem T.
  13. Zamontuj lampy UV po wewnętrznej stronie, z przodu i z tyłu i przymocuj do prostych płaskich płyt, jak pokazano na Rysunek 1D.
  14. Podłącz cztery kamery internetowe do portów USB komputera z zainstalowanym oprogramowaniem do nadzoru wideo.

2. Pomieszczenia dla zwierząt przed eksperymentami

  1. Myszy doświadczalne w domu, wyhodowane w tym celu lub uzyskane z zewnętrznego stanowiska, w grupach po cztery. Jeśli to możliwe, do tych eksperymentów użyj samic lub samców myszy w tym samym wieku. Jeśli zwierzęta są pozyskiwane ze źródła zewnętrznego, należy pozwolić im zaaklimatyzować się przez co najmniej 7 dni przed przeprowadzeniem jakichkolwiek procedur doświadczalnych.
  2. Przez cały czas przebywania w obiekcie dla zwierząt należy umieszczać zwierzęta w standardowych klatkach zawierających ściółkę i urozmaicenie (np. plastikowe igloo, koło, kawałek papieru do rozdrabniania) i utrzymywać je w 12-godzinnym cyklu dzień/noc, z dostępem do wody i suchej karmy dla myszy ad libitum.

3. Nagrania RT-VSA w jasnych i ciemnych fazach dnia

UWAGA: Poniższy protokół opisuje użycie RT-VSA do oceny zachowania myszy podczas jasnych i ciemnych faz dnia. Zwierzęta są przetrzymywane w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemnym z czasem Zeitgebera (ZT) = 0 o godzinie 07:00. Nagrania rozpoczynają się między 10:30 a 11:00 (ZT = 3,5–4,0) dla eksperymentów z fazą światła oraz między 18:00 a 18:30 (ZT = 11,0–11,5) dla eksperymentów z fazą ciemną. Gdy zwierzęta są badane w obu warunkach, eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w dwóch oddzielnych dniach, z co najmniej 5 kolejnymi dniami między testami jasnymi i ciemnymi. Eksperymenty nie powinny być przeprowadzane w dni, w których pomieszczenia dla zwierząt są sprzątane lub klatki są zmieniane, ponieważ może to powodować stres, który wpływa na zachowanie mikcji. Wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach minimalnego stresu dla myszy.

  1. Przetransportować zwierzęta doświadczalne z ich miejsca przetrzymywania do sali zabiegowej, w której znajdują się komory rejestracyjne RT-VSA.
  2. Przygotowanie komory nagraniowej RT-VSA
    1. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej (24.3 cm x 36.3 cm) na dnie każdej klatki nagrywającej RT-VSA. W zależności od pory dnia należy użyć cienkiej (eksperymenty z fazą jasną) lub grubej (eksperymenty z fazą ciemną) bibuły filtracyjnej.
      UWAGA: Gruba bibuła filtracyjna jest używana podczas aktywnej ciemnej fazy, ponieważ jest bardziej odporna na rozdrabnianie niż cienka bibuła filtracyjna. Górne kamery służą do wizualizacji plam moczu osadzonych na grubej bibule filtracyjnej podczas ciemnej fazy. Natomiast w fazie światła używane są dolne kamery, ponieważ światło otoczenia uniemożliwia górnym kamerom wykrycie plam moczu osadzonych na bibule filtracyjnej. W takim przypadku stosuje się cienką bibułę filtracyjną. Odkryliśmy, że dolne kamery są nieskuteczne w wykrywaniu małych zdarzeń mikcji osadzonych na grubej bibule filtracyjnej.
    2. Na bibule filtracyjnej umieść następujące elementy: plastikowe igloo (które zapewnia miejsce do spania), sterylną probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w celu wzbogacenia oraz plastikowe naczynie o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierające dwa lub trzy kawałki suchej karmy dla myszy i 14–16 g wody w postaci żelu (niezwilżającego żelu wodnego; Rysunek 2).
      UWAGA: Użycie mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml w celu wzbogacenia było specyficzne dla obudowy użytej w tym badaniu.
    3. Gdy komory nagraniowe będą gotowe, delikatnie umieść eksperymentalne myszy w środku, kładąc je miękko na bibule filtracyjnej. Należy upewnić się, że przenoszenie zwierząt z klatki w pomieszczeniach inwentarskich do klatek rejestrujących odbywa się przy minimalnym stresie.
    4. Gdy wszystkie zwierzęta doświadczalne znajdą się w swoich klatkach do nagrywania, z zamkniętymi pokrywami, przykryj górną część pokryw chłonną podkładką stołową, aby zminimalizować bezpośrednie odbicia światła otoczenia na powierzchni pokrywy z pleksiglasu.
    5. Włącz lampy UV w dolnej komorze.
      UWAGA: Zwierzęta nie mają bezpośredniego kontaktu ze światłem UV. Zalecana lampa UV jest szczegółowo opisana w sekcji materiały.
  3. Nagrania RT-VSA
    1. Aby nagrywać wideo z górnej i dolnej kamery, użyj oprogramowania do nagrywania wideo, które można skonfigurować do nagrywania z wielu kamer internetowych lub kamer sieciowych jednocześnie.
    2. Po otwarciu programu rozpocznij nagrywanie, naciskając Command i R w oknie programu. Wykonuj nagrania wideo z szybkością 1 klatki na sekundę.
    3. Natychmiast po rozpoczęciu nagrań należy wyjść z pomieszczenia, delikatnie zamykając drzwi. Upewnij się, że w pomieszczeniu panuje cisza przez cały czas trwania eksperymentu.
  4. Kończenie nagrań RT-VSA
    1. Powrót do sali zabiegowej po 7 godzinach (eksperymenty w fazie światła) lub następnego dnia rano (eksperymenty w fazie ciemnej).
    2. Zatrzymaj nagrywanie, naciskając Command i T. Wyłącz światła UV.
    3. Po zatrzymaniu nagrywania oprogramowanie automatycznie generuje plik filmowy (w formacie .m4v) dla każdej kamery i zapisuje go pod nazwą kamery w wybranym wcześniej folderze docelowym. Sprawdź, czy w każdym folderze aparatu eksperymenty są uporządkowane w folderach według daty.
    4. Sprawdź, czy w każdym folderze daty/eksperymentu znajduje się jeden plik .m4v oraz wszystkie pliki .jpeg odpowiadające każdej klatce filmu.
    5. UWAGA: Pliki .jpeg mogą być użyte do odzyskania eksperymentu w przypadku uszkodzenia plików filmowych.
    6. Utwórz folder na pulpicie z nazwą i datą eksperymentu, a następnie przenieś wszystkie .m4v pliki do tego folderu. W razie potrzeby usuń pliki .jpeg po zapisaniu plików filmowych i utworzeniu ich kopii zapasowej.
    7. UWAGA: W przypadku eksperymentów z fazą światła oprogramowanie wygeneruje jeden film na kamerę, natomiast w przypadku eksperymentów z fazą ciemną wygeneruje dwa filmy dla każdej kamery. Dzieje się tak, ponieważ nowy plik .m4v jest generowany po północy, gdy zmienia się data.
    8. Skopiuj folder zawierający filmy na dysk flash w celu analizy na komputerze zewnętrznym. Ten krok może potrwać kilka minut i może być wykonywany równolegle z krokami od 3.5.1 do 3.5.3.
  5. Czyszczenie klatek rejestrujących i przenoszenie myszy doświadczalnych z powrotem do ich pomieszczeń
    1. Usuń niebieską podkładkę zakrywającą pokrywy klatek. Przenieść zwierzęta z klatek rejestrujących do ich klatki w pomieszczeniach inwentarskich.
    2. Wyjąć akcesoria i artykuły spożywcze znajdujące się w komorach zapisowych (tj. plastikowe igloo, plastikowe tuby, naczynie z resztkami karmy i żelu wodnego oraz bibułę filtracyjną) i wyrzucić je do odpadów biologicznie niebezpiecznych.
    3. Wyczyść klatki za pomocą odkurzacza ręcznego, usuwając resztki jedzenia i kału znajdujące się na dnie klatki. Następnie spryskaj podłogę i wewnętrzne ściany klatki 70% etanolem i wyczyść wnętrze kawałkiem miękkiej szmatki. Pozostaw pokrywę klatek otwartą, aby mogły wyschnąć na powietrzu.
    4. Umieścić klatkę ze zwierzętami w pojemniku wtórnym i przetransportować zwierzęta z powrotem do ich miejsca przetrzymywania.

4. Generowanie krzywych kalibracyjnych

UWAGA: Krzywa kalibracyjna jest potrzebna do przekształcenia pustych przestrzeni w objętości moczu. W przypadku wykonywania eksperymentów w jasnej i ciemnej fazie dnia należy wygenerować dwie krzywe kalibracyjne, po jednej dla każdego rodzaju użytej bibuły filtracyjnej (bibuły filtracyjne cienkie i grube). Krzywe kalibracyjne są generowane w dwóch egzemplarzach. Każda powtórzona próba jest przeprowadzana na bibule filtracyjnej umieszczonej w komorze rejestracyjnej RT-VSA. Biorąc pod uwagę jego złożony skład i pobudliwość na promieniowanie UV, użyj moczu myszy do wykonania krzywych kalibracyjnych.

  1. Zbieranie moczu myszy
    1. Weź kawałek elastycznej przezroczystej folii (10 cm x 15 cm) i połóż go na ławce.
    2. Chwyć mysz za ogon i potrząśnij nią. Delikatnie masuj dolną część brzucha, aby wywołać oddawanie moczu. Zbierz mocz na powierzchni przezroczystego arkusza folii z tworzywa sztucznego.
    3. Delikatnie wypuść zwierzę do klatki. Za pomocą pipety przenieś mocz z powierzchni przezroczystej folii do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz procedurę z wieloma myszami, aż zbierze się ~ 10 ml moczu myszy, zgromadź mocz i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Do wygenerowania zduplikowanych krzywych kalibracyjnych dla fazy jasnej i ciemnej wymagane jest łącznie ~10 ml moczu myszy. Aby uniknąć stresu u myszy eksperymentalnych, nie należy używać myszy, które zostaną poddane eksperymentom RT-VSA do zbierania moczu.
  2. Zapisy krzywej kalibracyjnej
    1. Rozmrozić mocz zebrany w kroku 4.1 i wymieszać go, delikatnie wirując przez 10–15 sekund.
    2. Umieść kawałek cienkiej bibuły filtracyjnej (24.3 cm x 36.3 cm) w każdej z dwóch klatek nagrywających RT-VSA.
    3. Odmierzyć pipetą następujące objętości moczu (w μl) na każdej bibule filtracyjnej: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 i 750. Aby zapobiec nakładaniu się plamek w wyniku dyfuzji, należy je rozmieścić w wystarczającej odległości od siebie.
    4. Zamknij pokrywę klatek i przykryj je podkładkami.
    5. Rozpocznij nagrywanie, naciskając Command i R, stosując te same parametry oprogramowania, które są używane do nagrywania eksperymentów (krok 3.3.).
    6. Zarejestruj krzywą kalibracyjną na 1 godzinę, aby umożliwić maksymalną dyfuzję plamek moczu. Naciśnij Command i T, aby zatrzymać nagrywanie.
    7. Utwórz nowy folder na pulpicie, umieść w nim pliki .m4v, a następnie przenieś dane na dysk flash w celu późniejszej analizy.
    8. Wykonaj podobną procedurę, aby wygenerować zduplikowane krzywe za pomocą grubej bibuły filtracyjnej. W takim przypadku dodaj dodatkowe warstwy padów, aby zaciemnić wnętrze i symulować ciemne warunki fazowe.
  3. Analiza zapisów krzywej kalibracyjnej
    1. Otwórz .m4v pliki w oprogramowaniu odtwarzacza filmów, maksymalizując okno tak, aby wypełniło ekran. Aby przeanalizować krzywe kalibracyjne wykonane na grubej bibule filtracyjnej, należy użyć plików uzyskanych za pomocą górnych kamer (rysunek 3A). Aby przeanalizować krzywe kalibracyjne wykonane na cienkiej bibule filtracyjnej, należy użyć plików uzyskanych za pomocą dolnych kamer (Rysunek 3B).
    2. Odtwórz .m4v file, przesuwając suwak czasu do przodu i do tyłu, aby uzyskać przegląd pełnego filmu z krzywą kalibracyjną 1 godziny.
    3. Określ zakres czasu, w którym mniejsze plamki moczu (<25 μl) mają największą intensywność i rozprzestrzeniły się maksymalnie. Zrób zrzut ekranu w tym przedziale czasu. Nazwij plik zrzutu ekranu i zapisz go jako plik .png (Rysunek 3A, górny panel).
      UWAGA: Zrzuty ekranu są wykonywane przez naciśnięcie F6. Aby skonfigurować F6 do pobierania zrzutów ekranu, wybierz: Preferencje systemowe > Klawiatura > Skróty i wpisz F6 w polu znajdującym się po prawej stronie opcji Zapisz obraz ekranu jako plik.
    4. Zidentyfikuj zakres czasu, w którym średnie i duże plamki moczu (>50 μl) mają maksymalną powierzchnię i zrób zrzut ekranu. Możliwe, że niektóre z mniejszych plamek moczu nie będą widoczne do czasu, gdy większe plamki moczu wykażą maksymalną dyfuzję. Nazwij plik i zapisz zrzut ekranu jako plik .png (Rysunek 3A, dolny panel).
    5. Otwórz oprogramowanie ImageJ (NIH), a następnie przeciągnij i upuść ikonę pliku .png uzyskaną w kroku 4.3.3, aby otworzyć plik obrazu ( Rysunek 4A).
    6. Na pasku narzędzi wybierz ikonę Selekcje wielokątów i narysuj obramowanie bibuły filtracyjnej.
    7. Następnie wybierz Analizuj z paska menu, wybierz Ustaw pomiary z rozwiniętego menu, a następnie z okna, które się pojawi, wybierz Obszar. Kliknij przycisk OK. Pozwala to na uzyskanie wartości powierzchni po wykonaniu kroku 4.3.8.
    8. Następnie ponownie wybierz pozycję Analizuj z paska menu i wybierz pozycję Zmierz z rozwiniętych opcji. Pojawi się okno wyników zawierające obszar kolumny, który pokazuje wartości obszaru w pikselu2 (Rysunek 4B–D).
    9. Wybierz ikonę Zaznaczanie odręczne na pasku narzędzi i użyj jej, aby narysować linię wokół obwodu pojedynczego pustego miejsca. Zmierz obszar jak w kroku 4.3.8. Oprogramowanie aktualizuje tabelę wyników w miarę wykonywania nowych pomiarów. Nowy zestaw liczb pojawi się poniżej poprzednich. Zapisz liczbę, która pojawia się pod obszarem kolumny okna wyników dla każdego analizowanego punktu (Rysunek 4E–G).
    10. Powtórzyć kroki od 4.3.5 do 4.3.7 dla każdego z powtórzonych miejsc.
    11. Ustaw całkowitą powierzchnię bibuły filtracyjnej na 100% i oblicz procent powierzchni (% powierzchni) dla każdego miejsca moczu. Ta normalizacja poprawi błędy, które mogą wystąpić w wyniku różnic w powiększeniu lub ustawieniu kamer.
    12. Utwórz nową tabelę XY w programie do tworzenia wykresów i wstaw wartości objętości moczu (w μl) w kolumnie X oraz zduplikowane wartości obszaru % w kolumnie Y.
    13. Następnie wybierz Analiza > Analizuj > Analiza XY > Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej). W wyświetlonym oknie parametrów wybierz opcję Model wielomianowy > Wielomian drugiego rzędu (kwadratowy) >.
    14. Następnie na karcie metody kliknij, aby zaznaczyć następujące opcje: Regresja metodą najmniejszych kwadratów, Bez ważenia i Rozważ każdą replikowaną wartość y jako pojedynczy punkt.
    15. Na karcie Wiązanie wybierz opcję B0, Typ wiązania > Stała równa i wpisz 0 w kolumnie Wartość. Kliknij przycisk OK.

5. Analiza nagrań eksperymentalnych myszy

  1. Otwórz plik filmowy zebrany w fazie światła (dolna kamera) lub ciemnej fazie (górna kamera) w celu analizy.
  2. Oceń jakość pliku filmowego, przesuwając przewijak czasu do przodu i do tyłu, potwierdzając, że bibuła filtracyjna pozostaje nienaruszona (bez rozdzierania lub żucia) w 6-godzinnym oknie czasowym, które ma być analizowane. Jeśli papier jest podarty, nie wykonuj dalszej analizy, ponieważ mysz mogła oddać mocz na odsłonięty plastik, którego nie można określić ilościowo (Rysunek 5).
  3. Aby przeanalizować eksperymenty zebrane w jasnej lub ciemnej fazie, użyj polecenia przewijania do przodu lub suwaka paska czasu, aby przejść do żądanego okna czasu. Aktywność mikcji w fazie światła jest rejestrowana między godziną 11:00 a 17:00 (ZT = 4,0–10,0) oraz w fazie ciemnej między północą a godziną 06:00 (ZT = 17,0–23,0).
  4. Odtwórz film w trybie szybkiego przewijania do przodu, klikając ikonę >> (lub ręcznie przewijając film), szukając dowodów na to, że mysz jest puszona. Najłatwiejszym sposobem stwierdzenia, że tak się dzieje, jest poszukanie nagłego pojawienia się jasnych plam moczu na bibule filtracyjnej. Innym wskaźnikiem jest szukanie zmian w zachowaniu, w tym ruchu do rogów klatki i krótkiego okresu bezczynności, gdy mysz oddaje moc.
    UWAGA: W miarę jak ktoś staje się lepszy w wykrywaniu pustych przestrzeni, może zwiększyć prędkość przewijania lub przewijania do przodu. Jednak u myszy z bakteryjnym i chemicznie wywołanym zapaleniem pęcherza moczowego, które mają bardzo dużą liczbę małych pustek4,34, można przegapić zdarzenia związane z mikcją, jeśli porusza się zbyt szybko przez film.
  5. Zarejestruj czas, w którym występuje każde puste miejsce. Zgodnie z konwencją, czas pustki jest rejestrowany przy pierwszym znaku wykrycia moczu (Rysunek 6A,B).
  6. Aby dokonać pomiarów pustki, najpierw użyj paska przewijania, aby przesunąć się do przodu (lub do tyłu) w czasie, szukając momentu, w którym nastąpiła maksymalna dyfuzja plamki moczu. W tym momencie zatrzymaj film i zrób zrzut ekranu zgodnie z opisem w kroku 4.3.3. Umieść strzałkę myszy komputerowej w analizowanym miejscu, tak aby interesujące Cię miejsce było zaznaczone na zrzucie ekranu (Rysunek 6C,D).
  7. Nazwij plik zrzutu ekranu, używając liczb korelacyjnych, aby uwzględnić kolejność pojawiania się w filmie.
  8. Kontynuuj analizowanie pliku, powtarzając kroki 5.5 i 5.7 dla każdego pustego miejsca w filmie. Po przeanalizowaniu wszystkich pustych przestrzeni zmierz całkowitą powierzchnię bibuły filtracyjnej, wykonując zrzut ekranu i wykonując czynności opisane w 4.3.6.
  9. Obliczyć % powierzchni każdej z plamek moczu zgodnie z opisem w kroku 4.3.9. Przekształć wartości % powierzchni na objętość moczu (μl) dla każdego pustego miejsca, korzystając z krzywych kalibracyjnych wygenerowanych w kroku 4 i funkcji interpolacji w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.
    1. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów otwórz tabelę XY zawierającą dane krzywej kalibracyjnej i wstaw wartości obszaru % w kolumnie Y poniżej ostatniej wartości krzywej kalibracyjnej (Rysunek 7A).
    2. Kliknij kartę Tabela wyników, a następnie na karcie modelu kliknij, aby wybrać opcję Interpoluj nieznane z krzywej standardowej i naciśnij OK. Obok karty tabeli wyników pojawi się zakładka o nazwie interpolowane wartości średnie X. Ta zakładka zawiera tabelę z interpolowanymi wartościami, które odpowiadają objętości moczu w μl dla każdego pustego miejsca. (Rysunek 7A,B).
  10. Powtórz kroki od 5.1 do 5.9, aby przeanalizować wszystkie myszy eksperymentalne.
  11. Utwórz plik skoroszytu, który zawiera dane uzyskane w krokach od 5.5 do 5.10, używając jednego arkusza kalkulacyjnego na mysz (Rysunek 7C). Utwórz jeden plik dla eksperymentów z fazą jasną, a drugi dla eksperymentów z ciemną fazą. Te dane podstawowe zawierają wszystkie surowe dane i niezbędne obliczenia, które są wykorzystywane w dalszych analizach.

6. Analiza wzorca oddawania moczu u myszy doświadczalnych

  1. Wygeneruj pierwotne i wtórne profile pustych przestrzeni (Rysunek 8A,B i Rysunek 9).
    UWAGA: Zgodnie z badaniami rozkładu częstości23, puste miejsca, które mają ≥20 μL, zazwyczaj stanowią >95% całkowitej objętości pustek i są uważane za pierwotne puste miejsca (PVS)8,23,35. Puste plamy o objętości ≤20 μl są uważane za wtórne lub małe puste plamy (SVS). Wykazano, że dyskryminacja między PVS i SVS jest użytecznym podejściem do charakteryzowania fenotypów mikcji. Podwyższona liczba SVS wskazuje na dysfunkcję mikcji35.
    1. Z pliku głównego zawierającego dane dotyczące miejsca mikcji (faza jasna lub faza ciemna) należy sklasyfikować plamki na podstawie ich objętości jako PVS, gdy ich objętość wynosi ≥20 μl, lub SVS, gdy ich objętość wynosi <20 μl.
    2. Policz liczbę i oblicz średnią objętość unieważnioną oraz całkowitą objętość dla PVS. Policz liczbę i oblicz całkowitą objętość dla SVS.
    3. Wygeneruj wykres, który porównuje kontrolę z leczonymi myszami dla każdego z obliczonych parametrów: liczba PVS, objętość opróżniona PVS, całkowita objętość PVS, liczba SVS, całkowita objętość SVS.
  2. Opcjonalnie: Wygeneruj skumulowany wykres pustej objętości (funkcja klatki schodowej), aby pokazać zachowanie pustki w czasie (Rysunek 10 i Rysunek 11).
    1. Otwórz plik główny skoroszytu i przekonwertuj czas puszenia, który jest wyrażony w godzinach, minutach i sekundach, na formę dziesiętną. Oblicz łączną objętość moczu (w μl) dla każdego punktu czasowego.
    2. Wygeneruj tabelę XY w oprogramowaniu do tworzenia wykresów z czasem w postaci dziesiętnej w kolumnie X i skumulowanymi objętościami moczu w kolumnie Y. Skopiuj dane dotyczące czasu i objętości moczu do tabeli. Dodaj punkty danych (0; 0) i (6; wartość maksymalna). Punkty te są niezbędne do uzupełnienia poziomych linii wykresu na początku doświadczenia (czas: 0 h), gdy objętość mikcji wynosi zero (0; 0), oraz na końcu doświadczenia (czas: 6 godzin), gdy łączna wartość wydalonego moczu jest równa wartości uzyskanej dla ostatniego mikcji (6; wartość maksymalna).
    3. Kliknij dwukrotnie wykres; powinno pojawić się okno formatowania wykresu. Wybierz kartę Wygląd, kliknij, aby usunąć zaznaczenie przycisku Pokaż symbole, a następnie kliknij, aby wybrać opcję Pokaż linię łączącą/krzywą. Kliknij opcję Styl i wybierz Przetrwanie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie mikcji myszy z nokautem urotelialnym Piezo1/2

Podczas fazy przechowywania cyklu mikcji, przypuszcza się, że nabłonek dróg moczowych wyczuwa napięcie wywierane przez mocz zgromadzony w pęcherzu moczowym i przekształca ten bodziec mechaniczny w reakcje komórkowe, takie jak uwalnianie surowiczego ATP1,3. Wcześniej wykazaliśmy, że mechanicznie aktywowane kanały PIEZO1 i PIEZO2 są wyrażane w mysim uroth...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie monitoringu wizyjnego jest opłacalną modyfikacją, która ma kilka zalet w porównaniu z klasycznym VSA. W klasycznym VSA, który jest zwykle używany jako test punktu końcowego, trudno jest odróżnić nakładające się na siebie puste miejsca. Nie jest to błahy problem, ponieważ myszy mają tendencję do wielokrotnego oddawania moczu w tym samym obszarze, gdy test jest przedłużony o kilka godzin, zwykle w rogach klatki. Tak więc pierwszą zaletą RT-VSA jest to, że badacz może łatwo zidentyfikować poszczególne miejsca, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez R01DK119183 grantu NIH (dla GA i MDC), nagrodę za projekt pilotażowy za pośrednictwem P30DK079307 (dla MGD), nagrodę American Urology Association Career Development i grant Fundacji Winters (dla NM) oraz przez Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores z Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,00" X 1,00 cala Profil z rowkiem teowym - cztery otwarte rowki teowe –   cięte do 10 cali80/201010Ilość: 20
1.00" X 1,00 cala Profil z rowkiem teowym - cztery otwarte rowki teowe –   cięte do 12 cali80/201010Ilość: 6
1.00" X 1,00 cala Profil z rowkiem teowym - cztery otwarte rowki teowe –   cięte do 40 cali80/201010Ilość: 4
1.00" X 1,00 cala Profil z rowkiem teowym - cztery otwarte rowki teowe – cięte do 14,75 cala80/201010Ilość: 12
1,00" X 1,00 cala Profil z rowkiem teowym - cztery otwarte rowki teowe – Przyciąć do 32 cali80/201010Ilość: 5
1/4-20 Podwójnie wsuwana ekonomiczna nakrętka teowa80/203280Ilość: 16
1/4-20 Potrójnie wsuwana ekonomiczna nakrętka teowa80/203287Ilość: 18
10 i 25 Seria 2 Otwór - 18mm Kątownik narożny z rowkiem wewnętrznym z podwójnym wspornikiem80/2014061Ilość: 6
10 Otwór serii 3 - prosta płaska płyta80/204118Ilość: 8
10 Seria 5 Otwór - Płaska płyta "L"80/204081Ilość: 8
10 Seria 5 Otwór - Płaska płyta "T"80/204080Ilość: 8
10 Seria 5 Otwór - Trójnik Płaski80/204140Ilość: 2
Standardowy zawias podnoszony serii 10 - prawy80/202064Ilość: 2
10 do 15 Seria 2 otwory - Lite Transition Inside Corner Bracket80/204509Ilość: 6
24-calowych lamp UVADJ Products LLCT8-F20BLB24Ilość: 2
Żarówka 20 W & ndash; 24" Długość fali: 365nm
Akrylowy arkusz lustraProfesional PlasticsIlość: 1
82,5 cm x 26,5 cm
Akrylowy arkusz lustraProfesional PlasticsIlość: 2
26,5 cm X 30,5 cm
Akrylowy arkusz lustraProfesional PlasticsIlość: 2
82,5 cm x 30,5 cm
Poliwęglan AR (odporność na promieniowanie UV)80/2065-2641Ilość: 2
4,5 mm gruby, przezroczysty, 38,5 cm x 26,5 cm
Poliwęglan AR (odporny na promieniowanie UV)80/2065-2641Ilość: 4
4,5 mm gruby, przezroczysty, 38,5 cm x 21,5 cm
Poliwęglan AR (odporny na promieniowanie UV)80/2065-2641Ilość: 4
4,5 mm gruby, przezroczysty, 26,5 cm x 21,5 cm
Poliwęglan AR (odporny na promieniowanie UV)80/2065-2641Ilość: 4
Grubość 4,5 mm, przezroczysty 37,5 cm x 23,9 cm
Poliwęglan AR (odporność na promieniowanie UV)80/2065-2641Ilość: 4
Grubość 4,5 mm, przezroczysty, 24,4 cm x 23,9 cm
Bibuła chromatograficzna (cienki papier)  Bibuła Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos (gruby papier)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad SoftwareWersja 9.4.0oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk
ImageJ FIDŻINIH
ParafilmMerckfolia przezroczysta
Oprogramowanie Quick Time Player 10.5 Odtwarzacz multimedialnyApple
Szpiegbezpieczeństwa Oprogramowaniesystem oprogramowania do nadzoru wideo
Standardowe zapięcie końcowe, 1/4-2080/203381Ilość: 80
Akryl przepuszczający promieniowanie UVSpartechPolycast Solacryl SUVTIlość: 2
38,5 cm x 26,5 cm 
Żel wodny: HydroGelClearH2O   70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Kamerka internetowaLogitechC930eIlość: 4
Ben

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314(2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79(2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939(1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73(2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Void Spot AssayReal Time VSAVoiding BehaviorMouse ModelsUrine Spot AnalysisVoluntary MicturitionVideo MonitoringBladder FunctionUrethral SphincterCyclophosphamide Treatment

Related Articles