Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64662

⸱

28 kwietnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Streszczenie

Tytanem pracy biologii rozwojowej jest mikroskop konfokalny, który pozwala badaczom określić trójwymiarową lokalizację oznaczonych molekuł w złożonych próbkach biologicznych. Podczas gdy tradycyjne mikroskopy konfokalne pozwalają na rozpoznanie dwóch sąsiadujących ze sobą punktów fluorescencyjnych oddalonych od siebie o kilkaset nanometrów, obserwacja najdrobniejszych szczegółów biologii subkomórkowej wymaga zdolności do rozdzielania sygnałów rzędu dziesiątek nanometrów. Opracowano wiele sprzętowych metod mikroskopii superrozdzielczej, aby umożliwić naukowcom ominięcie takich ograniczeń rozdzielczości, chociaż metody te wymagają specjalistycznych mikroskopów, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. Alternatywną metodą zwiększania zdolności rozdzielczej jest izotropowe powiększenie samej próbki w procesie znanym jako mikroskopia ekspansywna (ExM), który został po raz pierwszy opisany przez grupę Boydena w 2015 roku. ExM nie jest rodzajem mikroskopii per se, ale raczej metodą pęcznienia próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej cząsteczek składowych. Rozszerzoną próbkę można następnie obserwować w efektywnie zwiększonej rozdzielczości za pomocą tradycyjnego mikroskopu konfokalnego. W tym miejscu opisujemy protokół implementacji ExM w zarodkach Drosophila z całą górą, który służy do badania lokalizacji Par-3, miozyny II i mitochondriów w powierzchniowych komórkach nabłonka. Protokół ten zapewnia około czterokrotny wzrost wielkości próbki, co pozwala na wykrycie szczegółów subkomórkowych, które nie są widoczne za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Jako dowód zasady, przeciwciało anty-GFP jest używane do rozróżniania odrębnych pul miozyny-GFP między sąsiednimi korami komórkowymi, a znakowana fluorescencyjnie streptawidyna jest używana do wykrywania endogennych biotynylowanych cząsteczek w celu ujawnienia drobnych szczegółów architektury sieci mitochondrialnej. Protokół ten wykorzystuje powszechne przeciwciała i odczynniki do znakowania fluorescencyjnego i powinien być kompatybilny z wieloma istniejącymi protokołami immunofluorescencji.

Wprowadzenie

W biologii komórkowej i rozwojowej obserwacje są kluczowym dowodem, a zdolność do dokładnego określania wzorców lokalizacji białek jest fundamentalna dla wielu rodzajów eksperymentów. Konfokalna mikroskopia skaningowa jest standardowym narzędziem do obrazowania fluorescencyjnie znakowanych białek w trzech wymiarach wewnątrz nienaruszonych próbek. Konwencjonalne mikroskopy konfokalne nie są w stanie rozróżnić (rozdzielić) sąsiadujących sygnałów fluorescencyjnych oddzielonych od siebie o mniej niż połowę długości fali emitowanego przez nie światła1. Innymi słowy, dwa punktowe źródła światła muszą być oddalone od siebie o co najmniej 200-300 nm w kierunku lateralnym (500-700 nm w kierunku osiowym), aby można było rozdzielić je jako dwa odrębne sygnały. Bariera techniczna ta jest znana jako limit dyfrakcyjny i stanowi fundamentalną przeszkodę w badaniu złożonych struktur subkomórkowych (np. sieci aktomiozynowego cytoszkieletu lub sieci mitochondrialnych) o cechach przestrzennych poniżej limitu dyfrakcyjnego. Dlatego techniki zwiększające rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych budzą powszechne zainteresowanie społeczności biologicznej.

Aby obejść limit dyfrakcyjny, opracowano szereg różnych technologii mikroskopii super-rozdzielczej, które pozwalają na uzyskanie rozdzielczości rzędu kilkunastu nanometrów lub mniej1,2,3, odsłaniając świat złożoności biologicznej, który wcześniej był dostępny jedynie via mikroskopia elektronowa. Pomimo oczywistych zalet tych metod opartych na sprzęcie, mikroskopy super-rozdzielcze często wymagają specyficznego znakowania próbek i długiego czasu akwizycji, co ogranicza ich elastyczność, lub mogą być po prostu zbyt drogie dla niektórych laboratoriów. Alternatywą dla super-rozdzielczości opartej na mikroskopie jest mikroskopia ekspansyjna (ExM), która nie jest typem mikroskopii per se, lecz raczej metodą zwiększania objętości próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej składników molekularnych4. Izotropowo rozszerzone próbki można następnie obserwować przy efektywnie zwiększonej rozdzielczości, korzystając z tradycyjnego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. ExM została po raz pierwszy opisana przez grupę Boydena w 2015 roku5, a podstawowa technika została od tego czasu zaadaptowana do zastosowania w wielu różnych eksperymentach6,7,8. ExM została również zaadaptowana do zastosowania w całych embrionach, w szczególności u Drosophila9,10,11, C. elegans12 oraz zebrafish13, co czyni ją potężnym narzędziem dla biologów rozwojowych.

ExM opiera się na dwóch różnych rodzajach chemii hydrożeli: 1) pęczniejących hydrożelach polielektrolitowych, które znacznie zwiększają swoją objętość po namoczeniu w wodzie14, oraz 2) hydrożelach poliakrylamidowych, które charakteryzują się niezwykle małym odstępem między polimerami, co umożliwia izotropowe rozszerzanie próbki15. Choć opublikowano wiele protokołów ExM, zazwyczaj obejmują one następujące etapy: fiksację próbki, znakowanie, aktywację, żelowanie, trawienie i rozszerzanie4. Warunki fiksacji i strategie znakowania fluorescencyjnego różnią się oczywiście w zależności od potrzeb eksperymentu i systemu; w niektórych protokołach znakowanie odbywa się po rozszerzeniu. Cząsteczki docelowe w próbce muszą zostać przygotowane (aktywowane) do wiązania z hydrożelem, co można osiągnąć przy użyciu różnych metod chemicznych4. Podczas etapów żelowania próbka jest nasycana monomerami przyszłego hydrożelu (akrylanem sodu, akrylamidem i sieciującym bisakrylamidem), a następnie hydrożel jest tworzony w procesie polimeryzacji rodnikowej katalizowanej przez inicjator, taki jak nadsiarczan amonu (APS), oraz akcelerator, taki jak tetrametylendiamina (TEMED)4. Po żelowaniu próbka jest trawiona enzymatycznie, aby ujednolicić opór próbki przeciw pęcznieniu i zapewnić izotropowe rozszerzanie hydrożelu4. Na koniec strawiony hydrożel umieszcza się w wodzie, co powoduje jego rozszerzenie do około czterokrotności pierwotnego rozmiaru liniowego4.

Schemat przetwarzania embrionów; fiksacja, znakowanie, przyleganie do szkiełka nakrywki, obrazowanie; immunofluorescencja.
Rycina 1: Przegląd mikroskopii ekspansyjnej w embrionach Drosophila. ExM to wieloetapowy protokół, którego wykonanie zajmuje co najmniej 4 dni. Zbieranie embrionów, fiksacja i dewitellinizacja trwają 1 dzień lub więcej, w zależności od tego, czy łączone są embriony z wielu partii. Znakowanie immunofluorescencyjne trwa 1 lub 2 dni, w zależności od tego, czy embriony są inkubowane przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Aktywację embrionów, żelowanie, trawienie i ekspansję można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Żele można zamontować i obrazować natychmiast po ekspansji, choć ze względów praktycznych często korzystnie jest rozpocząć obrazowanie następnego dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzania ExM na całych zarodkach Drosophila we wczesnych i średnich stadiach rozwoju16 w celu wizualizacji subkomórkowych wzorców lokalizacji białek w superrozdzielczości (Rycina 1). Metoda ta wykorzystuje chemię estru N-hydroksysukcynimidy kwasu metakrylowego (MA-NHS) do aktywacji i kotwiczenia cząsteczek białek w hydrożelu17; stanowi ona modyfikację wcześniej opisanego protokołu ExM przeznaczonego dla tkanek i zarodków Drosophila w późniejszych stadiach rozwoju11. W tym protokole zastosowano studzienki z polidimetylosiloksanu (PDMS) do formowania hydrożeli oraz ułatwienia wymiany roztworów podczas aktywacji i żelowania. Alternatywna metoda niewymagająca tworzenia studzienek PDMS polega na zanurzaniu zarodków przytwierdzonych do szkiełek nakrywkowych w kroplach roztworu monomeru umieszczonych na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej22. Ponadto protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania nieprzepuszczalnej błony witelinowej otaczającej zarodki Drosophila, co jest warunkiem niezbędnym do przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Co istotne, ta metoda ręcznego oddzielania zarodków może być wykorzystana do selekcji wyłącznie prawidłowo rozwiniętych zarodków Drosophila przed znakowaniem próbek, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania powiększonych próbek o właściwym stadium rozwoju i orientacji, a tym samym znacznie usprawnia późniejszą analizę danych.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi University of Arkansas (UARK) dotyczącymi badań na bezkręgowcach, takich jak Drosophila melanogaster, i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego UARK (protokół nr 20001).

1. Unieruchomienie i dewitellinizacja embrionów Drosophila

UWAGA: Krok 1 opisuje procedurę (usuwanie ręczne) manualnego usuwania błony żółtkowej, przezroczystej nieprzepuszczalnej błony otaczającej embrion. Co istotne, usuwanie ręczne pozwala na wybór embrionów na odpowiednim etapie rozwoju na początku protokołu ExM, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania embrionów w użytecznej orientacji po zakończeniu protokołu ExM. Niniejszy protokół ExM jest jednak w pełni kompatybilny z masowym pobieraniem embrionów oraz standardowymi procedurami usuwania błony żółtkowej w oparciu o metanol; w takim przypadku można przejść bezpośrednio do kroku 2 (znakowanie immunofluorescencyjne).

  1. Przygotować lub zakupić zestaw cienkich szklanych igieł. Dokładne wymiary końcówki igły nie są krytyczne, ale należy upewnić się, że igły są sztywne i wystarczająco ostre, aby przebić błony witelinowe utrwalonych zarodków. Igły można wykonać z szklanych kapilar (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm) za pomocą wyciągacza do mikropipet, analogicznie do przygotowywania igieł do mikroiniekcji zarodków18; alternatywnie można zakupić gotowe igły.
  2. Zebrać zarodki stosując standardowe techniki dla Drosophila19 poprzez umieszczenie >100 dorosłych osobników Drosophila w wentylowanym plastikowym kubku zamkniętym płytką z agarem i sokiem owocowym20. Należy zastosować określone okna czasowe zbioru, aby uzyskać zarodki na odpowiednim etapie rozwoju16. Na przykład, aby uzyskać zarodki na etapie gastrulacji (stadium 6) i konwergencji-elongacji (stadium 7), należy wymienić płytkę z sokiem owocowym, zbierać zarodki przez 2 h w temperaturze 25 °C, a następnie zdjąć płytkę i inkubować ją przez kolejne 2 h w 25 °C, aby otrzymać zarodki w wieku ~2-4 h.
  3. Aby usunąć z zarodków chorion przypominający skorupkę jajka, pokryć powierzchnię płytek z sokiem owocowym 50% wybielaczem (Tabela 1), uwolnić zarodki z powierzchni agaru, mieszając je małym pędzlem, a następnie odczekać 3 min do rozpuszczenia chorionu.
  4. Przenieść zdechorionizowane zarodki pędzlem do fiolki scyntylacyjnej o pojemności 30 mL zawierającej 4 mL heptanu (organiczna faza górna) i 4 mL buforu do utrwalania (wodna faza dolna; Tabela 1). Formaldehyd należy rozcieńczyć bezpośrednio przed dodaniem zarodków, używając świeżo przygotowanego lub niedawno otwartego roztworu zapasowego, i zmieszać z 10x PBS oraz wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Formaldehyd należy przygotować z proszku paraformaldehydu lub 16% formaldehydu klasy EM w ampułkach szklanych. Można stosować roztwory zapasowe stężonego formaldehydu (np. 37% formaldehyd), choć wyniki mogą być mniej powtarzalne.
  5. Zarodki zgromadzą się na granicy fazy organicznej i wodnej. Należy dodać tyle zarodków, aby utworzyły pojedynczą warstwę na tej granicy. Jeśli do fiolki dodano zbyt wiele zarodków, utrwalanie będzie mniej efektywne.
  6. Za pomocą mocnej taśmy unieruchomić fiolki scyntylacyjne poziomo na wytrząsarce stołowej i inkubować przez 20 min przy 220 rpm. Dla optymalnego utrwalania należy utrzymać intensywną emulsję między fazą organiczną a wodną przez cały czas trwania procesu.
  7. Podczas utrwalania przygotować dla każdej z próbek jeden z poniższych elementów:
    1. Wziąć plastikową podstawę szalki Petriego o średnicy 6 cm wypełnioną do połowy 3% agarem i wyciąć w agarze prostokąt o wymiarach ~5 cm x 3 cm za pomocą żyletki lub skalpela. Do tego celu można również użyć płytek z agarem i sokiem owocowym.
    2. Za pomocą małej szpachelki laboratoryjnej wyjąć blok agaru. Odwrócić podstawę szalki Petriego i postawić ją na blacie. Umieścić blok agaru na górze odwróconej szalki (Rysunek 2A).
    3. Wziąć pokrywkę szalki Petriego i upewnić się, że jest sucha. W rękawiczkach nakleić kawałek dwustronnej taśmy klejącej wewnątrz pokrywki (kawałek taśmy powinien być nieco większy niż blok agaru; Rysunek 2B).
  8. Zdjąć fiolki z wytrząsarki, postawić je pionowo na blacie i pozwolić na rozdzielenie fazy organicznej i wodnej. Prawidłowo utrwalone zarodki pozostaną na granicy obu faz.
  9. Przenieść utrwalone zarodki na blok agaru za pomocą szklanej pipety Pasteura z gruszką lateksową. Aby zapobiec przywieraniu zarodków do wnętrza pipety, należy starać się utrzymać je w wąskiej szyjce pipety i przenosić w kilku małych partiach, a nie wszystkie naraz. Po przeniesieniu wszystkich zarodków na blok agaru, usunąć większość pozostałego heptanu z okolic zarodków za pomocą pipety P200. Wykonać ten krok tak szybko, jak to możliwe (<3 min), aby uniknąć wysuszenia utrwalonych zarodków, co mogłoby negatywnie wpłynąć na ich morfologię.
  10. Z wysokości ~2 cm opuścić pokrywkę z dwustronną taśmą na blok agaru, aby zarodki przykleiły się do taśmy (Rysunek 2C). Ostrożnie zdjąć pokrywkę z bloku agaru, położyć ją odwróconą do góry dnem na blacie, a następnie dodać tyle PBS-Tween (Tabela 1), aby pokryć zarodki w pokrywce.
  11. Używając stereomikroskopu przy powiększeniu około 100x i oświetleniu pośrednim, zidentyfikować zarodki na odpowiednim etapie rozwoju, korzystając z markerów morfologicznych. Dla zarodków w stadium 6 należy szukać takich markerów jak widoczna bruzda głowowa i inwaginowany mezoderm; dla zarodków w stadium 7 markerem jest wydłużona listwa zarodkowa; dla zarodków w stadium 11 markerami są całkowicie wydłużona listwa zarodkowa oraz widoczna segmentacja wzdłuż osi od głowy do ogona16.
    1. Aby zebrać pożądane zarodki, najpierw nakłuć błonę witelinową (przezroczystą owalną błonę wokół zarodka) w pobliżu końca przedniego lub tylnego zarodka cienką szklaną igłą; błona nieco opadnie wraz ze spadkiem ciśnienia. Następnie, używając precyzyjnej pęsety lub metalowej sondy, delikatnie wypchnąć zarodek z drugiej strony przez otwór; błona witelinowa pozostanie przyklejona do dwustronnej taśmy. Zarodki niepożądane pozostawić na taśmie.
  12. Okresowo zbierać pływające zarodki pozbawione błony witelinowej za pomocą szklanej pipety Pasteura i przenosić je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  13. Na tym etapie wykonać jeden z poniższych kroków:
    1. Przejść bezpośrednio do etapów znakowania immunofluorescencyjnego. Zarodki pozbawione błony witelinowej mogą trafić bezpośrednio do roztworu blokującego (krok 2.2). Nie należy pozostawiać zarodków w PBS-Tween ani w roztworze blokującym (Tabela 1) dłużej niż przez 16 h przed przejściem do następnego kroku.
    2. Przenieść zarodki do metanolu w celu przechowywania. Usunąć jak najwięcej PBS-Tween, a następnie dodać 1 mL metanolu. Po osadzeniu się zarodków usunąć jak najwięcej metanolu i dodać 1 mL świeżego metanolu. Przechowywać zarodki w temperaturze −20 °C bezterminowo. Przechowywanie w metanolu pozwala również na łączenie zarodków z wielu różnych zbiorów.

2. znakowanie immunofluorescencyjne

UWAGA: Poza etapami inkubacji przeciwciał, dokładne ilości cieczy i czasy w tej sekcji nie są krytyczne. Aby przeprowadzić płukanie lub przemywanie, należy pozwolić zarodkom opaść na dno probówki, usunąć jak największą ilość cieczy, nie wciągając zarodków, a następnie dodać ~1 mL nowej cieczy; dla uzyskania optymalnej przejrzystości i kontroli należy użyć szklanej pipety Pasteura z lateksową gruszką. W przypadku etapu płukania zarodki nie są kołysane, lecz jedynie pozostawione do opadnięcia; w przypadku etapu przemywania zarodki są kołysane na nutatorze przez wskazany czas, a następnie pozostawione do opadnięcia.

  1. Jeśli zarodki nie były przechowywane w metanolu, przejdź do kroku 2.2. Jeśli zarodki były przechowywane w metanolu, przepłucz je dwukrotnie w PBS-Tween, a następnie myj przez 20 min dwukrotnie w PBS-Tween.
  2. Myj zarodki przez 30-60 min w 1 mL roztworu blokującego.
  3. Inkubuj zarodki z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze przeciwciał (Tabela 1) przez 2 h w temperaturze pokojowej lub najlepiej przez noc w 4 °C. Wykonaj ten krok w jak najmniejszej objętości (50-300 µL), aby oszczędzać przeciwciała pierwszorzędowe; mieszanie na nutatorze nie jest ściśle wymagane.
    1. Zwiększ ilość przeciwciał pierwszorzędowych stosowanych w typowym eksperymencie immunofluorescencyjnym o co najmniej 50% dla ExM. Stosuj następujące stężenia przeciwciał pierwszorzędowych: 1:200 dla przeciwciała królikowatego poliklonalnego anty-Par-321 oraz 1:100 dla przeciwciała króliczego poliklonalnego anty-GFP.
  4. Usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych (przechowuj w 4 °C, jeśli jest to wymagane), przepłucz dwukrotnie w PBS-Tween, a następnie myj przez 15 min cztery razy w PBS-Tween.
  5. Inkubuj zarodki z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w końcowej objętości 300 µL (rozcieńczonymi w roztworze przeciwciał) przez 1 h w temperaturze pokojowej na nutatorze. Na tym etapie można dodać znakowaną fluorescencyjnie streptawidynę. Od tego kroku w miarę możliwości chronij zarodki przed nadmierną i przedłużoną ekspozycją na światło, na przykład przykrywając probówki nieprzeźroczystą pokrywą pudełka lub przechowując próbki w szufladzie.
    1. Stosuj następujące stężenia: 1:500 dla przeciwciała koziego poliklonalnego anty-IgG króliczego sprzężonego z Alexa Fluor 488; 1:500 dla przeciwciała koziego poliklonalnego anty-IgG królikowatego sprzężonego z Alexa Fluor 568; oraz 1:1000 dla streptawidyny-Alexa Fluor 488.
  6. Usuń i zutylizuj roztwór przeciwciał drugorzędowych. Przepłucz zarodki dwukrotnie w PBS-Tween i myj przez 15 min cztery razy w PBS-Tween.
  7. Na tym etapie zarodki można przechowywać w 4 °C w ciemności, jednak należy przetwarzać próbki tak szybko, jak to możliwe (<24 h).

3. Przygotowanie studni z PDMS

UWAGA: Dołki z PDMS można przygotować z wyprzedzeniem do 2 tygodni.

  1. Ustaw inkubator lub płytkę grzejną na 55 °C, a wirówkę umożliwiającą wirowanie probówek stożkowych na 15 °C.
  2. Aby przygotować roztwór PDMS (Tabela 1), umieść probówkę stożkową o pojemności 50 mL w pojemniku pomocniczym na wadze i dodaj do niej 10 g bazy elastomeru silikonowego za pomocą strzykawki. Następnie dodaj 1 g utwardzacza elastomeru silikonowego i kilkukrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać składniki.
  3. Przygotuj probówkę przeciwwagę, dolewając odpowiednią ilość wody do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Wirowanie roztworu PDMS należy przeprowadzić przy 500 x g przez 3 min w temperaturze 15 °C, a następnie wlać go do szalki Petriego o średnicy 10 cm do głębokości ~1 mm. W razie potrzeby usuń pęcherzyki powietrza, delikatnie dmuchając na roztwór wężem powietrznym. Pozostaw roztwór PDMS do stwardnienia przez noc w temperaturze 55 °C.
  4. Po stwardnieniu płyty PDMS nacinaj skalpelem obszary kwadratowe nieco mniejsze niż szkiełko nakrywki o wymiarach 22 mm x 22 mm. Wewnątrz każdego kwadratu nacinaj i usuwaj kwadratowy otwór o szerokości ~8 mm.
  5. Przenieś każdy kwadratowy otwór z PDMS na szkiełko nakrywki o wymiarach 22 mm x 22 mm i mocno go przytwierdź (Rycina 2D). Przygotowanie sześciu lub więcej szkiełek nakrywek powinno zapewnić odpowiednią liczbę rozszerzonych embrionów do obrazowania.

4. Przytwierdzanie embrionów do szkiełek nakrywkowych

  1. Nanieś wystarczającą ilość 0,1% poli-L-lizyny, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywki wewnątrz każdej studni (~50 µL), a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 55 °C do wyschnięcia. Powtórz ten krok, aby zwiększyć przyczepność.
  2. Krótko wypłucz zarodki raz w 1x PBS, aby usunąć detergent Tween, a następnie przenieś >10 zarodków do każdej ze studni pokrytych poli-L-lizyną.
  3. Pozostaw zarodki do czasu ich osadzenia się na dnie studni. Usuń nadmiar cieczy znad przytwierdzonych zarodków za pomocą pipety Pasteura. Bezzwłocznie przejdź do następnego kroku.

5. Aktywacja i żelowanie

UWAGA: Aktywacja odnosi się do dodania MA-NHS do embrionów, co zmodyfikuje białka i przeciwciała w próbce, umożliwiając im związanie się z hydrożelem. Żelowanie odnosi się do wytworzenia hydrożelu wewnątrz i wokół embrionów w każdej studience. Podczas żelowania embriony są przenikane roztworem monomeru, a następnie traktowane roztworem żelującym w celu utworzenia hydrożelu.

  1. Aktywuj zarodki przez 1 h w temperaturze pokojowej, napełniając studzienki roztworem aktywacyjnym (1 mM MA-NHS świeżo rozcieńczony w 1x PBS; Tabela 1). Wymieniaj ten roztwór mniej więcej co 10 min w ciągu godziny.
  2. Przepłucz zarodki trzy razy w 1x PBS. Inkubuj zarodki w roztworze monomeru (Tabela 1) przez 45 min w temperaturze 4 °C.
  3. Podczas inkubacji zarodków w roztworze monomeru przygotuj roztwór żelujący (Tabela 1). Przygotowanie ~2 mL roztworu żelującego jest wystarczające, aby pokryć studzienki PDMS w całej 10 cm szalce Petriego. Pamiętaj, aby dodać APS na samym końcu, ponieważ zainicjuje on polimeryzację i rozpocznie proces żelowania.
    1. Rozcieńcz utleniacz katalityczny świeżo z proszku (np. 1% TEMPO w/v w wodzie). Połącz 1,960 µL roztworu monomeru z 30 µL 10% TEMED i 10 µL 1% TEMPO.
    2. Aby uniknąć jednoczesnej polimeryzacji całej partii roztworu żelującego, pracuj w małych partiach. Rozdziel roztwór żelujący (bez APS) na aliquoty po 125 µL w ośmiu probówkach paska PCR.
    3. Usuń roztwór monomeru z trzech studzienek PDMS za pomocą próżni, uważając, aby nie uszkodzić zarodków. Dodaj 5 µL APS do jednej z probówek PCR zawierających roztwór żelujący, aby zainicjować polimeryzację. Szybko rozdziel polimeryzujący się roztwór żelujący pomiędzy studzienki (~40 µL na studzienkę). Powtarzaj czynność do czasu pokrycia wszystkich studzienek i zarodków.
  4. Pozostaw próbki do żelowania na 1,5-2,5 h w temperaturze 37 °C. Od czasu do czasu poruszaj hydrożelami, aby monitorować polimeryzację. Stwardniałe hydrożele nie będą drgać. Grubsze hydrożele będą wymagały więcej czasu na zakończenie polimeryzacji i stwardnienie.

6. Trawienie i ekspansja

UWAGA: Grubsze i większe żele będą pęcznieć dłużej, a ich środek może potrzebować kilku godzin do całkowitego rozszerzenia; proces ten można przyspieszyć poprzez przycięcie krawędzi żelu. W miarę pęcznienia żele będą miały współczynnik załamania światła niemal identyczny jak woda, przez co staną się bardzo trudne do zauważenia.

  1. Po zakończeniu żelowania odklej studnie z PDMS od szkiełka podstawowego, starając się nie naruszyć hydrożeli. W razie potrzeby odetnij nadmiar materiału hydrożelowego.
  2. Przenieś hydrożele (nadal przymocowane do szkiełek podstawowych) pojedynczo do studni płytki sześciostudnijkowej (Rysunek 2E). Należy pamiętać, że hydrożele mogą nieznacznie zwiększyć swoją objętość podczas trawienia.
  3. Przykryj żele całkowicie buforem do trawienia (Tabela 1) na 1 h w temperaturze 37 °C. Zazwyczaj 30 mL buforu do trawienia wystarcza do pokrycia żeli w płytce 6-studnijkowej.
  4. Po trawieniu przenieś każdy hydrożel pojedynczo do szalki Petriego o średnicy 6 cm, zsuwając je ze szkiełka podstawowego. Może być konieczne użycie drugiego szkiełka do odseparowania żelu. Napełnij każdą szalkę Petriego wodą dejonizowaną, aby żel spęczniał. Wymień wodę trzy- lub czterokrotnie w ciągu 1-2 h, aż żele całkowicie spęcznieją (przewidywany jest około czterokrotny wzrost szerokości).

7. Montowanie i obrazowanie

UWAGA: Spęcznione hydrożele składają się prawie w całości z wody, co sprawia, że są niemal przezroczyste i niezwykle kruche. Do przemieszczania i podnoszenia żelów można używać długich szkiełek nakrywkowych. Montuj i obrazuj tylko jeden lub dwa żele naraz, ponieważ żele będą stopniowo oddawać wodę i zaczną przesuwać się po szkiełku nakrywkowym.

  1. Używając pipety Pasteura, usuń z czarodziejskiej szalki tak dużo nadmiaru wody, jak to możliwe, aby zminimalizować przemieszczanie się żeli podczas manipulacji.
  2. Przenieś każdy rozszerzony żel, z embrionami znajdującymi się na dolnej powierzchni, na duże szkiełko nakrywowe (np. 24 mm x 40 mm) w celu obrazowania.
  3. Zamocuj każde szkiełko nakrywowe z żelem nad obiektywem odwróconego konfokalnego mikroskopu skaningowego. Zlokalizuj odpowiednio przygotowane i zorientowane preparaty, korzystając z trybów mikroskopii epifluorescencyjnej lub w jasnym polu z obiektywami powietrznymi o małym powiększeniu (5x lub 10x) lub średnim powiększeniu (20x).
  4. Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, przełącz się na obiektyw immersyjny (olejowy lub wodny) o dużym powiększeniu (60x, 63x lub 100x). Powierzchnia embrionów musi znajdować się w zakresie ogniskowania obiektywu (<300 µm od szkiełka nakrywowego dla obiektywu 63x), aby możliwe było wykonanie obrazu.
  5. Zbierz dane z próbek, korzystając z trybu konfokalnego skanowania laserowego mikroskopu. Należy pamiętać o pozyskiwaniu nienasyconych obrazów z dobrym zakresem dynamicznym oraz zastosowaniu odpowiedniej liczby pikseli na obraz, aby uchwycić maksymalną możliwą ilość informacji o próbce23.

Metoda wytwarzania urządzeń z cienkich warstw; schemat z etapami montażu i zastosowanymi materiałami.
Rysunek 2: Ręczna dewitelinizacja i praca z hydrożelami. (A) Wycinanie fragmentu agaru z płytki z agarem i sokiem owocowym. (B) Przyklejanie dwustronnej taśmy do wnętrza pokrywki szalki Petriego o średnicy 6 cm. (C) Mocowanie zarodków do pokrywki z taśmą. (D) Płytka PDMS z kwadratową studzienką przyklejona do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 22 mm. (E) Szkiełko nakrywkowe ze studzienką PDMS wewnątrz płytki 6-dołkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Aby scharakteryzować ogólną skuteczność ExM w całych embrionach Drosophila, zmierzono długość embrionów wzdłuż osi głowa-ogon w niepowiększonych embrionach kontrolnych oraz w embrionach powiększonych (Rysunek 3A-C). Niepowiększone embriony kontrolne poddano tym samym warunkom fiksacji i etapom znakowania immunofluorescencyjnego co embriony powiększone, z wyjątkiem tego, że przed obrazowaniem zamontowano je w zestalonym medium montażowym. Pojedyncze niepowiększone embriony zajmowały około połowy pola widzenia przy użyciu obiektywu 10x (Rysunek 3A). W przeciwieństwie do nich, powiększone embriony zajmowały około dwóch pełnych pól widzenia przy użyciu tego samego obiektywu 10x (Rysunek 3B). Aby ocenić, jak stopień powiększenia różnił się zarówno w obrębie jednego eksperymentu, jak i między eksperymentami, ten sam protokół ExM wykonano w trzech oddzielnych próbach, a długość embrionów mierzono w trzech różnych żelach w ramach każdego pojedynczego eksperymentu. Średnia długość z głową do ogona niepowiększonych embrionów kontrolnych wynosiła 398.8 µm (odchylenie standardowe [SD] = 22.93 µm; n = 74; Rysunek 3C). Dla eksperymentu 1, eksperymentu 2 i eksperymentu 3 średnie długości embrionów wynosiły odpowiednio 1,596 µm (SD = 159.9 µm; n = 57), 1,868 µm (SD = 150.5 µm; n = 51) oraz 1,954 µm (SD = 120.3 µm; n = 44), co odpowiada odpowiednio 4.0-krotnemu, 4.7-krotnemu i 4.9-krotnemu czynnikowi powiększenia (Rysunek 3C). Zmienność wewnątrzeksperymentalna między żelami była znacznie mniej zauważalna niż zmienność międzyeksperymentalna, która wynosiła około 20% (Rysunek 3C). Aby ocenić wpływ ExM na morfologię komórek i embrionów, użyto przeciwciała przeciwko komponentowi połączeń przylegających Par-3 (Bazooka)21 do znakowania apikalnych błon komórkowych, a następnie obrazowano rozwijające się segmenty gębowe embrionów Drosophila w stadium 11 — stadium o złożonej strukturze segmentowej (Rysunek 3D-F). W próbce kontrolnej komórki w segmencie szczękowym miały średnią szerokość 4.76 µm (SD = 1.053 µm, n = 25; Rysunek 3D,F). W próbkach powiększonych obrazowanych przy użyciu tego samego obiektywu 40x i czynnika powiększenia (1x), komórki w segmencie szczękowym miały średnią szerokość 19.10 µm (SD = 3.966 µm, n = 18; Rysunek 3E,F), co stanowi 4.0-krotne powiększenie. Zatem, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami11, udało nam się powiększyć całe embriony Drosophila około czterokrotnie w wymiarach liniowych przy użyciu ExM bez rozdarcia próbek czy wyraźnych zniekształceń morfologii komórkowej lub tkankowej.

Rozwój zarodka: mikroskopia, pomiary; schematy, mikrografie (10x, 40x) i wykres analizy.
Rycina 3: Czterokrotna ekspansja zarodków Drosophila. (A) Nieeksponowane i (B) eksponowane zarodki Drosophila obrazowane za pomocą obiektywu 10x (0,3 NA) przy powiększeniu 1x. Poszczególne pola widzenia (FOV) zaznaczono liniami przerywanymi. Zarodki wykazywały ekspresję wersji łańcucha lekkiego miozyny z tagiem GFP i zostały zabarwione przeciwciałem anty-GFP. (C) Ilościowe oznaczenie długości zarodka (wzdłuż osi głowa-ogon) w trzech hydrożelach na eksperyment oraz z trzech oddzielnych eksperymentów ExM w porównaniu z nieeksponowanymi kontrolami. (D,E) Segmenty szczękowe z (D) nieeksponowanych i (E) eksponowanych zarodków Drosophila w stadium 11, obrazowane za pomocą obiektywu 40x (1,3 NA) przy powiększeniu 1x. Kontury komórek (złącza przylegające) wykryto za pomocą przeciwciała anty-Par-3/Bazooka (kolor biały). (F) Ilościowe oznaczenie szerokości komórek (długa oś) z równoważnych grup komórek z (D) i (E). Wykresy pudełkowe w (C) i (F) przedstawiają zakresy 25., 50. i 75. percentyla; wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne; symbole „+” oznaczają średnią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Aby wykazać, że ExM może być wykorzystywany do rozdzielania szczegółów subkomórkowych poniżej typowego limitu dyfrakcyjnego, obrazowano cytoszkielet akto-miozynowy w kontrolnych embrionach nierozszerzonych oraz w embrionach rozszerzonych poddawanych konwergentnemu wydłużaniu (stadium 7). Zdarzenia przebudowy tkanek podczas gastrulacji i konwergentnego wydłużania są w dużej mierze kontrolowane przez zmiany w lokalizacji białka motorycznego miozyny II24. Jednak w gęsto upakowanym nabłonku kolumnowym wczesnej ektodermy Drosophila trudno jest zaobserwować wiele drobnych szczegółów wzorca lokalizacji miozyny II, nawet przy obrazowaniu z powiększeniem 158x (obiektyw 63x z 2,5-krotnym zoomem optycznym) — co stanowi typową maksymalną rozdzielczość mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem. Na przykład, ponieważ miozyna II jest białkiem kortykalnym (znajdującym się bezpośrednio pod błoną plazmatyczną), pulle miozyny II25 zlokalizowane po obu stronach kontaktów międzykomórkowych nie były rozdzielone w embrionach w stadium 7 i jawiły się jako pojedyncza linia w miejscu styku sąsiadujących komórek (Rysunek 4A). W przeciwieństwie do tego, w rozszerzonych embrionach w stadium 7 można było zaobserwować równoległe linie miozyny II w złączach międzykomórkowych, reprezentujące pulle białek kortykalnych w sąsiednich komórkach (Rysunek 4B). Odległość między równoległymi liniami miozyny II w próbkach rozszerzonych wynosiła 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); po podzieleniu przez cztery daje to przewidywaną odległość ~220 nm między liniami miozyny w sąsiednich komórkach w embrionach nierozszerzonych, co rzeczywiście znajduje się tuż poniżej limitu dyfrakcyjnego dla sygnału wykrywanego za pomocą Alexa 488 (szczytowa emisja ~520 nm/2 = 260 nm).

Dodatkowo zbadaliśmy, czy ExM może zostać wykorzystane do obrazowania architektury sieci mitochondrialnej w gęsto upakowanych komórkach gastrulujących embrionów Drosophila (stadium 6). Funkcja mitochondriów jest ściśle powiązana ze strukturą sieci (tj. organellami połączonymi w przeciwieństwie do pofragmentowanych), jednak szczegóły organizacji sieci mitochondrialnej są trudne do wizualizacji przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej w typach komórek, które nie są płaskie i/lub cienkie. Mitochondria są naturalnie bogate w cząsteczki biotynilowane, w związku z czym można je znakować we wczesnym embrionie Drosophila za pomocą streptawidyny znakowanej fluorescencyjnie26. W niepowiększonych embrionach w stadium 6 znakowanych streptawidyną-Alexa 488 sygnał pojawiał się w postaci punktów cytoplazmatycznych, które często nakładały się na siebie i były trudne do rozdzielenia (Rycina 4C). W przeciwieństwie do nich, w powiększonych embrionach w stadium 6 widocznych było znacznie więcej drobnych szczegółów sieci mitochondrialnej, a punkty były łatwiejsze do rozdzielenia (Rycina 4D)26, 27. Wyniki te wskazują, że ExM może być stosowane do badania organizacji sieci mitochondrialnej w typach komórek, które tradycyjnie nie nadają się do analizy mitochondriów.

Lokalizacja miozyny II i Par-3 w komórkach; obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 158x.
Rysunek 4: Szczegóły cytoszkieletu akto-miozynowego i mitochondriów ujawnione za pomocą mikroskopii ekspansyjnej. (A,B) Lokalizacja miozyny II w komórkach neuroektodermy (pasma zarodkowego) obrazowana obiektywem 63x (1.4 NA) przy powiększeniu 2,5x w stadium 7 w zarodkach (A) nieekspandowanych i (B) ekspandowanych. Miozynę II wykryto w zarodkach wykazujących ekspresję transgenicznej wersji łańcucha lekkiego regulacyjnego miozyny II z tagiem GFP (sqh-GFP), przy użyciu przeciwciała anty-GFP (czerwony). W zarodku ekspandowanym można rozróżnić wyraźne pule korowej miozyny zlokalizowane w sąsiadujących komórkach (białe strzałki). (C,D) Sieci mitochondrialne w komórkach neuroektodermy obrazowane obiektywem 63× (1.4 NA) przy powiększeniu 2,5x w stadium 6 w zarodkach nieekspandowanych (C) i ekspandowanych (D). Mitochondria wykryto za pomocą streptawidyny-Alexa 488 (zielony), a obrysy komórek za pomocą przeciwciała anty-Par-3/Bazooka (magenta). Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przepisy na roztwory. Skład roztworów wykorzystanych w tym protokole w kolejności ich występowania. Wszystkie roztwory zapasowe są w formie ciekłej, chyba że zaznaczono inaczej. Odczynniki chemiczne resuspenderowano lub rozcieńczano w autoklawowanej wodzie filtrowanej, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Ręczna dewitynizacja
Większość protokołów utrwalania zarodków Drosophila polega na usunięciu błony witeliny poprzez potrząsanie utrwalonymi zarodkami w emulsji metanolu i heptanu, co powoduje pękanie błon w wyniku pęknięcia osmotycznego26. Podczas gdy dewitellinizacja na bazie metanolu (popping metanolu) jest skuteczna i odpowiednia do wielu zastosowań, ręczna dewitellinizacja (peeling ręczny) ma kilka istotnych zalet. Po pierwsze, ręczne obieranie pozwala na wybór precyzyjnie zainscenizowanych zarodków do dewitelinizacji i zebrania, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania rozszerzonych zarodków w użytecznej orientacji pod koniec eksperymentu. To wzbogacenie ma kluczowe znaczenie przy badaniu specyficznych aspektów szybkich procesów rozwojowych (np. inwagacji mezodermy lub zbieżnego rozciągania), dla których odpowiednio zaawansowane zarodki mogą stanowić zaledwie kilka procent wszystkich zarodków. nawet w ściśle określonym czasie oknie odbioru. Oczywiście, w przypadku wielu zastosowań, bardziej tradycyjne masowe pobieranie zarodków metanolem z okienka pobierania w określonym czasie będzie wystarczające, a ręczne obieranie może nie być warte dodatkowego wysiłku. Po drugie, na wiązanie niektórych pierwszorzędowych przeciwciał i barwników negatywnie wpływa wcześniejsza ekspozycja próbki na metanol. Z tego powodu ręczne obieranie może spowodować znaczny wzrost jakości sygnału immunofluorescencji w porównaniu z próbkami z metanolem, co czyni go przydatną ogólną techniką dla biologów rozwojowych Drosophila .

Mikroskopia konfokalna o wysokiej rozdzielczości w rozszerzonych zarodkach Drosophila
Podczas gdy wykonywanie mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości na próbkach ekspandowanych jest koncepcyjnie takie samo jak w przypadku próbek nieekspandowanych, ExM wprowadza pewne przeszkody techniczne. Warto zauważyć, że orientacja zarodka, która jest losowa, staje się jeszcze ważniejsza wraz ze wzrostem wielkości próbki, ponieważ obiektywy o dużym powiększeniu i wysokim NA są w stanie skupić światło tylko z obszarów próbki, które znajdują się bardzo blisko szkiełka nakrywkowego27. Dlatego zwykle możliwe jest skupienie się tylko na komórkach na powierzchni zarodka lub w jego pobliżu, które znalazły się w sąsiedztwie szkiełka nakrywkowego w momencie tworzenia żelu. Najlepszym sposobem, aby upewnić się, że na końcu znajdują się próbki o prawidłowej orientacji, jest rozpoczęcie protokołu ExM od ściśle zaplanowanej kolekcji utrwalonych zarodków (np. za pomocą ręcznego obierania) i wysiewu wielu zarodków w każdym dołku (>10). Aby uwidocznić komórki głęboko we wnętrzu zarodka, może być konieczne użycie bardziej specjalistycznych zestawów obrazowania, takich jak mikroskopia świetlna28. Ponadto stwierdzamy, że jakość obrazu można poprawić, otwierając otwór konfokalny do rozmiaru większego niż jedna przewiewna jednostka. Oczywiście zwiększenie rozmiaru otworka będzie się wiązało ze zmniejszeniem maksymalnej rozdzielczości, ale w praktyce nawet niewielkie zwiększenie rozmiaru otworka może znacznie zwiększyć intensywność sygnału (dane nie pokazane). Przyszłe badania powinny systematycznie koncentrować się na wielkości otworków i efektywnej rozdzielczości w próbkach ExM.

Wariacje na temat podstawowego ExM
Opisany tutaj protokół jest stosunkowo prostym przykładem ExM, który powinien działać w wielu zastosowaniach i być łatwy do wdrożenia w większości laboratoriów biologii rozwojowej. Istnieje jednak wiele odmian podstawowej koncepcji ExM 4,5,7, które można wykorzystać do zwiększenia intensywności sygnału, osiągnięcia jeszcze dalszych stopni ekspansji i wykrywania cząsteczek kwasów nukleinowych, a także białek. W tym protokole zarodki są inkubowane z przeciwciałami przed żelowaniem i ekspansją. Alternatywnie, próbki można poddać działaniu przeciwciał po ich rozprężeniu 6,30, co może zwiększyć intensywność sygnału ze względu na zwiększoną dostępność epitopów i zmniejszoną utratę związanych przeciwciał podczas etapów ekspansji. Ponadto specyficzne cząsteczki sieciujące mogą być używane do przyłączania cząsteczek RNA do hydrożelu, aby umożliwić wykrycie RNA w ekspandowanych żelach przy użyciu metody hybrydyzacji reakcji łańcuchowej30. Wreszcie, próbki mogą być poddawane wielu rundom ekspansji, jak w iteracyjnej mikroskopii ekspansji (iExM)31, pan-ExM32 i ujawniającej ekspansję (ExR)31, aby osiągnąć jeszcze wyższe stopnie zwiększonej rozdzielczości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Jennifer Zallen za dostarczenie świnki morskiej przeciwciała pierwotnego anty-Par-3. Prace te były wspierane przez hojne fundusze (1R15GM143729-01 i 1P20GM139768-01 5743) z National Institute of General Medical Science (NIGMS), jednego z członków National Institutes of Health (NIH), a także Arkansas Biosciences Institute (ABI), który zapewnił częściowe fundusze na zakup naszego mikroskopu konfokalnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
akryloamidMilipore Sigma1490-100ML
nadsiarczan amonuVWRBDH9214-500G
przeciwciało poliklonalne królika anty-GFPTorrey Pines BioLabsTP-401
przeciwciało poliklonalne IgG kozy przeciwko śwince morskiej, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11075
przeciwciało poliklonalne przeciw królikowi IgG kozie, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
bisakryloamidResearch Products InternationalA11275
albumina surowicy bydlęcej (30% roztwór)Millipore SigmaA7284
probówki stożkowe, 50 mlfisherscientific 21008-940
szkło nakrywkowe, kwadratowe 22 mmVWR48366-227
szkło nakrywkowe, prostokątne 40 mm x 24 mmVWR48393-230
szklane kapilary do ciągnięcia igiełPrecision InstrumentsTW100F-4
szklane igły do mikroiniekcji (wstępnie naciągnięte)World Precision InstrumentsTIP10LT
guanidyna HClVWR101970-606
heptanVWREM-HX0078-1
lateksowe żarówki do pipetVWR82024-554
metanolVWRBDH1135-4LP
kwas melaksylowy N-hydroksysukcynimidyl esterVWR730300-1G
, 1,5 mlVWR20170-038
Płytka wielodołkowa, 6-dołkowaGenesee25-100
paraformaldehyd (16%, klasa EM, bez metanolu)Mikroskopia elektronowa 509804487(Fisher)
Pigazat Pasteura (2 ml, krótka końcówka)Zestaw VWR14673-010
PDMS (zestaw Sylgard 184, baza i utwardzacz)VWR102092-312
Płytki PetriegoGenesee32-107
fizjologiczna buforowana fosforanami (10 x roztwór)VWR97063-660
Roztwór poli-L-lizyny (0,1% roztwór)VWRP8920-1ooML
Proteinaza KThermo Fisher ScientificE00491
(30 ml)VWR66022-128
Akrylan soduVWR101181-226
Azydek sodu ( proszek)Millipore Sigma71289wytwarza 1% w/v zapasu roboczego; ostra TRUCIZNA w tym stężeniu!
Streptawidyna, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificS32354
TAE (50x)Taśma VWR97063-692
(dwustronna, szerokość 1 cala)Szkocka  3M665 Szkocka dwustronna 1inch/1296 inches Pudełkowa
TEMEDThermo Fisher ScientificPI17919
TEMPOVWREM8.14681.0005utleniacz katalityczny
Tween-20VWR97063-872wyjątkowo lepki po oczyszczeniu; zrobić 10% zapas roboczy z wodą
Zeiss LSM 900Zeiss Laserowymikroskop skaningowy używany bez AiryScan
World sól Fiolki scyntylacyjne

Bibliografia

  1. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  3. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  5. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  6. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Chang, J. -B. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  9. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  10. Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347(2017).
  11. Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
  12. Yu, C. -C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249(2020).
  13. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  14. Tanaka, T., et al. Phase transitions in ionic gels. Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).
  15. Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
  16. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
  17. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  18. Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
  19. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protocols. 2007, (2007).
  20. Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  21. de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
  22. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  23. Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
  24. Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
  25. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
  26. Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502(2017).
  27. Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
  28. Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1, 73(2021).
  29. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  30. Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
  31. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).
  32. Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnapreparaty całych organizmówpowiększanie próbekznakowanie fluorescencyjnecytoszkielet aktynomiozynowysieć mitochondrialnalokalizacja białek
Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.