Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Summary

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Abstract

Tytanem pracy biologii rozwojowej jest mikroskop konfokalny, który pozwala badaczom określić trójwymiarową lokalizację oznaczonych molekuł w złożonych próbkach biologicznych. Podczas gdy tradycyjne mikroskopy konfokalne pozwalają na rozpoznanie dwóch sąsiadujących ze sobą punktów fluorescencyjnych oddalonych od siebie o kilkaset nanometrów, obserwacja najdrobniejszych szczegółów biologii subkomórkowej wymaga zdolności do rozdzielania sygnałów rzędu dziesiątek nanometrów. Opracowano wiele sprzętowych metod mikroskopii superrozdzielczej, aby umożliwić naukowcom ominięcie takich ograniczeń rozdzielczości, chociaż metody te wymagają specjalistycznych mikroskopów, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. Alternatywną metodą zwiększania zdolności rozdzielczej jest izotropowe powiększenie samej próbki w procesie znanym jako mikroskopia ekspansywna (ExM), który został po raz pierwszy opisany przez grupę Boydena w 2015 roku. ExM nie jest rodzajem mikroskopii per se, ale raczej metodą pęcznienia próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej cząsteczek składowych. Rozszerzoną próbkę można następnie obserwować w efektywnie zwiększonej rozdzielczości za pomocą tradycyjnego mikroskopu konfokalnego. W tym miejscu opisujemy protokół implementacji ExM w zarodkach Drosophila z całą górą, który służy do badania lokalizacji Par-3, miozyny II i mitochondriów w powierzchniowych komórkach nabłonka. Protokół ten zapewnia około czterokrotny wzrost wielkości próbki, co pozwala na wykrycie szczegółów subkomórkowych, które nie są widoczne za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej. Jako dowód zasady, przeciwciało anty-GFP jest używane do rozróżniania odrębnych pul miozyny-GFP między sąsiednimi korami komórkowymi, a znakowana fluorescencyjnie streptawidyna jest używana do wykrywania endogennych biotynylowanych cząsteczek w celu ujawnienia drobnych szczegółów architektury sieci mitochondrialnej. Protokół ten wykorzystuje powszechne przeciwciała i odczynniki do znakowania fluorescencyjnego i powinien być kompatybilny z wieloma istniejącymi protokołami immunofluorescencji.

Introduction

W biologii komórkowej i rozwojowej, zobaczyć znaczy uwierzyć, a możliwość dokładnego określenia wzorców lokalizacji białek jest fundamentalna dla wielu typów eksperymentów. Laserowo-skaningowa mikroskopia konfokalna jest standardowym narzędziem do obrazowania białek znakowanych fluorescencyjnie w trzech wymiarach w nienaruszonych próbkach. Konwencjonalne mikroskopy konfokalne nie są w stanie rozróżnić (rozdzielić) sąsiednich sygnałów fluorescencyjnych, które są oddalone od siebie o mniej niż połowę długości fali emitowanego przez nie światła¹. Innymi słowy, dwa źródła punktowe muszą być oddalone od siebie o co najmniej 200-300 nm w kierunku bocznym (500-700 nm w kierunku osiowym), aby rozdzielić je jako dwa odrębne sygnały. Ta bariera techniczna jest znana jako granica dyfrakcji i stanowi podstawową przeszkodę w badaniach złożonych struktur subkomórkowych (np. sieci cytoszkieletu lub mitochondriów aktomiozyny) o cechach przestrzennych poniżej granicy dyfrakcji. W związku z tym techniki zwiększające zdolność rozdzielczą konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych cieszą się ogólnym zainteresowaniem społeczności biologicznej.

Aby ominąć limit dyfrakcji, opracowano szereg różnych technologii mikroskopii superrozdzielczej, które pozwalają na uzyskanie rozdzielczości rzędu kilkudziesięciu nanometrów lub mniej^1,2,3, odsłaniając świat biologicznej złożoności, który wcześniej był dostępny tylko przez mikroskopia elektronowa. Pomimo oczywistych zalet tych metod opartych na sprzęcie, mikroskopy superrozdzielcze często mają specyficzne wymagania dotyczące etykietowania próbek i długi czas pozyskiwania, co ogranicza ich elastyczność lub mogą być po prostu zbyt drogie dla niektórych laboratoriów. Alternatywą dla superrozdzielczości opartej na mikroskopie jest mikroskopia ekspansywna (ExM), która nie jest rodzajem mikroskopii per se, ale raczej metodą pęcznienia próbki przy zachowaniu względnej organizacji przestrzennej jej cząsteczek składowych⁴. Izotropowo rozszerzone próbki można następnie obserwować w efektywnie zwiększonej rozdzielczości za pomocą tradycyjnego fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. ExM został po raz pierwszy opisany przez grupę Boydena w 2015 roku⁵, a od tego czasu podstawowa technika została zaadaptowana do użytku w różnych eksperymentach^6,7,8. ExM został również przystosowany do stosowania w zarodkach pełnomocowanych, zwłaszcza u Drosophila^9,10,11, C. elegans¹² i zebrany¹³, co czyni go potężnym narzędziem dla biologów rozwojowych.

ExM opiera się na dwóch różnych chemiach hydrożelowych: 1) pęczniejące hydrożele polielektrolitowe, które znacznie zwiększają swój rozmiar po namoczeniu w wodzie¹⁴, oraz 2) hydrożele poliakrylamidowe, które mają bardzo małe odstępy między polimerami, aby umożliwić izotropowe rozszerzanie próbki¹⁵. Chociaż istnieje wiele opublikowanych protokołów ExM, zazwyczaj mają one następujące etapy: utrwalanie próbki, etykietowanie, aktywacja, żelowanie, trawienie i ekspansja⁴. Warunki fiksacji i strategie znakowania fluorescencyjnego będą się oczywiście różnić w zależności od potrzeb eksperymentu i systemu, a w niektórych protokołach znakowanie następuje po ekspansji. Cząsteczki docelowe w próbce muszą być przygotowane (aktywowane) do wiązania z hydrożelem, co można osiągnąć przy użyciu różnych substancji chemicznych⁴. Podczas etapów żelowania próbka jest nasycana monomerami przyszłego hydrożelu (akrylan sodu, akryloamid i bisakryloamid sieciujący), a hydrożel jest następnie formowany przez polimeryzację wolnorodnikową katalizowaną przez inicjator, taki jak nadsiarczan amonu (APS), i akcelerator, taki jak tetrametylenodiamina (TEMED)⁴. Po żelowaniu próbka jest trawiona enzymatycznie w celu ujednolicenia odporności próbki na pęcznienie i zapewnienia izotropowej ekspansji hydrożelu⁴. Na koniec strawiony hydrożel umieszcza się w wodzie, co powoduje, że rozszerza się on do około czterokrotności swojego pierwotnego rozmiaru liniowego⁴.

Rysunek 1: Przegląd mikroskopii ekspansji w zarodkach Drosophila. ExM to wieloetapowy protokół, którego ukończenie zajmuje co najmniej 4 dni. Pobranie, utrwalenie i dewitellinizacja zarodków trwają 1 dzień lub dłużej, w zależności od tego, czy zarodki z wielu kolekcji są łączone. Znakowanie immunofluorescencyjne trwa 1 dzień lub 2 dni, w zależności od tego, czy zarodki są inkubowane przez noc z przeciwciałami pierwotnymi. Aktywację, żelowanie, trawienie i ekspansję zarodka można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Żele mogą być montowane i obrazowane natychmiast po rozprężeniu, chociaż ze względów praktycznych często pożądane jest rozpoczęcie obrazowania następnego dnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić ExM na wczesnych i średnich zarodkach Drosophila w całym stadium wierzchowania¹⁶, aby zobrazować wzorce lokalizacji białek subkomórkowych w super rozdzielczości (Rysunek 1). Metoda ta wykorzystuje chemię estru N-hydroksysukcynimidylowego kwasu metyloakrylowego (MA-NHS) do aktywacji i zakotwiczenia cząsteczek białka w hydrożelu¹⁷ i jest modyfikacją wcześniej opublikowanego protokołu ExM do stosowania w późnych stadiach zarodków i tkanek Drosophila¹¹. Protokół ten wykorzystuje studzienki polidimetylosiloksanu (PDMS) do formowania hydrożeli i ułatwiania wymiany roztworu podczas aktywacji i żelowania. Alternatywna metoda, która nie wymaga tworzenia studzienek PDMS, polega na obniżeniu zarodków przyczepionych do szkiełek nakrywkowych do kropli roztworu monomeru umieszczonych na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej²². Ponadto protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania nieprzepuszczalnej błony witelinowej, która otacza zarodki Drosophila, co jest warunkiem wstępnym barwienia immunofluorescencyjnego. Co ważne, ta metoda ręcznego obierania zarodków może być stosowana do selekcji tylko odpowiednio sklasyfikowanych zarodków Drosophila przed etykietowaniem próbki, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo otrzymania rozszerzonych próbek o prawidłowym stadium i orientacji, a tym samym sprawia, że dalsze gromadzenie danych jest znacznie bardziej efektywne.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu Arkansas (UARK) dotyczącymi badań na zwierzętach bezkręgowych, takich jak Drosophila melanogaster, i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego UARK (protokół #20001).

1. Fiksacja i dewitynizacja zarodków Drosophila

UWAGA: Krok 1 opisuje procedurę (ręczne złuszczanie) ręcznego usuwania błony witelinowej, przezroczystej, nieprzepuszczalnej błony otaczającej zarodek. Co ważne, ręczne obieranie pozwala na selekcję prawidłowo zaawansowanych zarodków na początku protokołu ExM, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania zarodków w użytecznej orientacji na końcu protokołu ExM. Jednak ten protokół ExM jest całkowicie kompatybilny z masowym pobieraniem zarodków i standardowymi procedurami usuwania błony witelinowej na bazie metanolu, w którym to przypadku można przejść bezpośrednio do kroku 2 (znakowanie immunofluorescencyjne).

1. Przygotuj lub kup pewną liczbę cienkich szklanych igieł. Rzeczywiste wymiary końcówki igły nie są krytyczne, ale upewnij się, że igły są wystarczająco sztywne i ostre, aby przebić błony witelinowe utrwalonych zarodków. Igły należy wykonać ze szklanych rurek kapilarnych (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet, tak jak przygotowuje się igły do mikroiniekcji zarodków¹⁸; Alternatywnie kup wstępnie wyciągnięte igły.
2. Zbierz zarodki przy użyciu standardowych technik Drosophila¹⁹, umieszczając >100 dorosłych Drosophila w wentylowanym plastikowym kubku zamkniętym talerzem z sokiem owocowym/agarem²⁰. Użyj czasowych okien pobrań, aby wzbogacić zarodki o odpowiednim stadium¹⁶. Na przykład, aby wzbogacić do etapu gastrulacji (etap 6) i etapu zbieżnego rozciągnięcia (etap 7), zmień talerz z sokiem owocowym, zbieraj zarodki przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, a następnie wyjmij płytkę i leżakuj przez kolejne 2 godziny w temperaturze 25 °C, aby uzyskać zarodki w wieku ~2-4 godzin.
3. Aby usunąć kosmówkę przypominającą skorupkę jajka z zarodków, przykryj powierzchnię talerzy z sokiem owocowym 50% wybielaczem (Tabela 1), uwolnij zarodki z powierzchni agaru, mieszając je małym pędzlem i odczekaj 3 minuty, aż kosmówka się rozpuści.
4. Przenieść zdekorionowane zarodki za pomocą pędzla do 30 ml fiolki scyntylacyjnej zawierającej 4 ml heptanu (organiczna faza górna) i 4 ml buforu utrwalającego (wodna faza dolna; Tabela 1). Świeżo rozcieńczyć formaldehyd ze świeżo przygotowanego lub niedawno otwartego bulionu i wymieszać z 10x PBS i wodą dejonizowaną bezpośrednio przed dodaniem zarodków.
   UWAGA: Przygotuj formaldehyd z mocy paraformaldehydu lub 16% formaldehydu klasy EM w szklanych ampułkach. Można stosować zapasy skoncentrowanego formaldehydu (np. 37% formaldehydu), chociaż wyniki mogą być mniej spójne.
5. Zarodki gromadzą się na styku faz organicznych i wodnych. Dodaj tyle zarodków, ile utworzy pojedynczą warstwę na granicy faz. Jeśli do fiolki doda się zbyt wiele zarodków, nie utrwalą się one tak dobrze.
6. Za pomocą mocnej taśmy unieruchom fiolki scyntylacyjne leżące po bokach na wytrząsarce stołowej i mieszaj je przez 20 minut z prędkością 220 obr./min. Aby uzyskać optymalne utrwalenie, utrzymuj energiczną emulsję między fazą organiczną a wodną podczas całego utrwalania.
7. W czasie utrwalania należy przygotować jedną z następujących próbek dla każdej z poniższych próbek.
   1. Weź plastikową podstawę szalki Petriego o średnicy 6 cm, wypełnioną do połowy 3% agarem i naciąć prostokąt o wymiarach ~5 cm x 3 cm w agarze za pomocą żyletki lub skalpela. Do tego celu można również użyć talerzy z sokiem owocowym/agarem.
   2. Za pomocą małej szpatułki laboratoryjnej usuń płytę agarową. Odwróć podstawę szalki Petriego i połóż ją na ławce. Umieść płytę agarową na wierzchu odwróconego naczynia (Rysunek 2A).
   3. Weź pokrywkę szalki Petriego i upewnij się, że jest sucha. Zakładając rękawiczki, umieść kawałek taśmy dwustronnej wewnątrz pokrywki (kawałek taśmy powinien być nieco większy niż płyta agarowa; Rysunek 2B).
8. Wyjąć fiolki z shakera, ustawić je pionowo na stole i odczekać, aż faza organiczna i wodna oddzielą się. Prawidłowo utrwalone zarodki pozostaną na granicy między dwiema fazami.
9. Przenieść utrwalone zarodki na płytę agarową za pomocą szklanej pipety Pasteura wyposażonej w bańkę lateksową. Aby zapobiec przyleganiu zarodków do wnętrza pipety, należy starać się utrzymywać zarodki w wąskiej szyjce pipety i przenosić zarodki w wielu małych partiach, a nie wszystkie naraz. Gdy wszystkie zarodki znajdą się na płycie agarowej, usuń większość pozostałości heptanu z okolic zarodków za pomocą pipetora P200. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe (<3 min), aby uniknąć wysuszenia utrwalonych zarodków, co może negatywnie wpłynąć na morfologię.
10. Z wysokości ~2 cm upuść pokrywkę z taśmą dwustronną na płytę agarową, aby przykleić zarodki do taśmy (Rysunek 2C). Delikatnie zdejmij pokrywkę z płyty agarowej, połóż ją do góry nogami na stole, a następnie dodaj tyle PBS-Tween (Tabela 1), aby przykryć zarodki w pokrywce.
11. Używając stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego przy powiększeniu około 100x z pośrednim oświetleniem, zidentyfikuj prawidłowo zaawansowane zarodki za pomocą markerów morfologicznych. W przypadku zarodków w stadium 6 użyj markerów, takich jak widoczna bruzda głowowa i wgłębiona mezoderma; W przypadku zarodków w stadium 7 użyj markerów, takich jak przedłużona opaska zarodkowa; W przypadku zarodków w stadium 11 użyj markerów, takich jak w pełni rozciągnięta wstęga zarodkowa i widoczna segmentacja wzdłuż osi od głowy do ogona¹⁶.
    1. Aby zebrać pożądane zarodki, najpierw nakłuj błonę witelinową (przezroczystą owalną błonę wokół zarodka) w pobliżu przedniego lub tylnego końca zarodka cienką szklaną igłą; błona nieco się opróżni wraz ze zwolnieniem ciśnienia. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków lub metalowej sondy delikatnie wepchnij zarodek na drugim końcu przez otwór; Membrana Vitelline pozostanie przyklejona do taśmy dwustronnej. Pozostaw niepożądane zarodki przyklejone do taśmy.
12. Okresowo zbieraj pływające zbowizowane zarodki za pomocą szklanej pipety Pasteura i przenoś je do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
13. W tym momencie wykonaj jedną z poniższych czynności.
    1. Przejdź bezpośrednio do etapów znakowania immunofluorescencyjnego. Zinterpretowane zarodki mogą trafić bezpośrednio do roztworu blokującego (krok 2.2). Nie należy dopuścić do tego, aby zarodki pozostawały w PBS-Tween lub roztworze blokującym (Tabela 1) dłużej niż 16 godzin przed przejściem do następnego etapu.
    2. Przenieś zarodki do metanolu w celu przechowywania. Usuń jak najwięcej PBS-Tween, a następnie dodaj 1 ml metanolu. Gdy zarodki się uspokoją, usuń jak najwięcej metanolu i dodaj 1 ml świeżego metanolu. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony. Przechowywanie metanolu pozwala również na łączenie zarodków z wielu kolekcji.

2. Znakowanie immunofluorescencyjne

UWAGA: Poza etapami inkubacji przeciwciał, dokładne ilości płynów i czasy nie są kluczowe w tej sekcji. Aby wykonać płukanie lub płukanie, pozwól zarodkom osiąść na dnie probówki, usuń jak najwięcej płynu bez zasysania zarodków, a następnie dodaj ~1 ml nowego płynu; użyj szklanej pipety Pasteura wyposażonej w lateksową żarówkę, aby uzyskać optymalną przejrzystość i kontrolę. Na etapie płukania zarodki nie są kołysane, po prostu pozwalają im się osiąść; Na etapie mycia zarodki są kołysane na nutatorze przez wskazany czas, a następnie pozostawiane do osiadania.

1. Jeśli zarodki nie były przechowywane w metanolu, należy przejść do kroku 2.2. Jeśli zarodki były przechowywane w metanolu, spłucz je dwukrotnie PBS-Tween, a następnie dwukrotnie przemyj przez 20 minut PBS-Tween.
2. Myj zarodki przez 30-60 minut w 1 ml roztworu blokującego.
3. Inkubować zarodki z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze przeciwciał (Tabela 1) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub najlepiej przez noc w temperaturze 4 °C. Wykonać ten etap w jak najmniejszej objętości (50-300 μl), aby zachować przeciwciała pierwszorzędowe; kołysanie na nutatorze nie jest bezwzględnie wymagane.
   1. Zwiększ ilość pierwszorzędowego przeciwciała stosowanego w typowym eksperymencie immunofluorescencyjnym o co najmniej 50% dla ExM. Stosować następujące stężenia przeciwciał pierwszorzędowych: 1:200 dla poliklonalnego przeciwciała anty-Par-3 świnki morskiej²¹ i 1:100 dla poliklonalnego królika anty-GFP.
4. Usunąć główny roztwór przeciwciała (w razie potrzeby zachować w temperaturze 4 °C), dwukrotnie spłukać PBS-Tween, a następnie przemyć przez 15 minut czterokrotnie PBS-Tween.
5. Inkubować zarodki z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w końcowej objętości 300 μl (rozcieńczonych w roztworze przeciwciał) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na nutatorze. Na tym etapie można dodać znakowaną fluorescencyjnie streptawidynę. Począwszy od tego etapu, w miarę możliwości należy chronić zarodki przed nadmiernym i długotrwałym nasłonecznieniem, na przykład przykrywając probówki nieprzezroczystą pokrywką pudełka lub przechowując próbki w szufladzie.
   1. Stosować następujące stężenia: 1:500 dla poliklonalnej poliklonalnej anty-króliczej IgG kóz połączonej z Alexa Fluor 488; 1:500 dla poliklonalnej poliklonalnej kozy anty-świnki morskiej połączonej z Alexa Fluor 568; i 1:1000 dla streptawidyny-Alexa Fluor 488.
6. Wyjąć i usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała. Opłucz zarodki dwukrotnie za pomocą PBS-Tween i myj przez 15 minut cztery razy za pomocą PBS-Tween.
7. Na tym etapie zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności, ale próbki są przetwarzane tak szybko, jak to możliwe (<24 godziny).

3. Przygotowanie studni PDMS

UWAGA: Studnie PDMS można wykonać do 2 tygodni wcześniej.

1. Ustaw inkubator lub płytę grzejną na 55 °C i ustaw wirówkę, która może obracać stożkowe probówki na 15 °C.
2. Aby przygotować roztwór PDMS (Tabela 1), umieść stożkową probówkę o pojemności 50 ml w wtórnym pojemniku na wadze i dodaj 10 g bazy z elastomeru silikonowego do probówki za pomocą strzykawki. Następnie dodaj 1 g utwardzacza z elastomeru silikonowego i kilkakrotnie odwróć probówkę do wymieszania.
3. Utwórz probówkę równoważącą, dodając odpowiednią ilość wody do drugiej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować roztwór PDMS o stężeniu 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 15 °C, a następnie wlać go na 10 cm szalkę Petriego na głębokość ~1 mm. W razie potrzeby usuń bąbelki, delikatnie w roztwór wężem powietrznym. Pozostawić roztwór PDMS do zestalenia się przez noc w temperaturze 55 °C.
4. Po zestaleniu się płyty PDMS za pomocą skalpela naciąć kwadratowe obszary, które są nieco mniejsze niż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm. Wewnątrz każdego kwadratu naciąć i usunąć kwadratową studzienkę o szerokości ~8 mm.
5. Przenieś każdy kwadrat PDMS dobrze na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm i mocno go przyklej (Rysunek 2D). Przygotowanie sześciu lub więcej szkiełek nakrywkowych powinno dać dużą liczbę rozszerzonych zarodków do zobrazowania.

4. Przyklejanie zarodków do szkiełek nakrywkowych

1. Nałóż tyle 0,1% poli-L-lizyny, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego wewnątrz każdej studzienki (~50 μL) i umieść je w inkubatorze o temperaturze 55 °C do wyschnięcia na powietrzu. Powtórz ten krok, aby zwiększyć przyczepność.
2. Krótko opłucz zarodki raz na 1x PBS, aby usunąć detergent Tween, a następnie przenieś >10 zarodków do każdego z dołków pokrytych poli-L-lizyną.
3. Pozwól zarodkom osiąść na dnie studzienek. Usunąć nadmiar płynu z przylegających zarodków za pomocą pipety Pasteura. Natychmiast przejdź do następnego kroku.

5. Aktywacja i żelowanie

UWAGA: Aktywacja odnosi się do dodania MA-NHS do zarodków, co zmodyfikuje białka próbki i przeciwciała, aby mogły związać się z hydrożelem. Żelowanie odnosi się do wytwarzania hydrożelu w zarodkach i wokół nich w każdym dołku. Podczas żelowania zarodki są przesiąkane roztworem monomeru, a następnie traktowane roztworem żelującym w celu utworzenia hydrożelu.

1. Aktywować zarodki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wypełniając studzienki roztworem aktywacyjnym (1 mM MA-NHS świeżo rozcieńczony w 1x PBS; Tabela 1). Roztwór należy zmieniać mniej więcej co 10 minut w ciągu 1 godziny.
2. Opłucz zarodki trzykrotnie 1x PBS. Inkubować zarodki w roztworze monomeru (tabela 1) przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
3. Podczas gdy zarodki znajdują się w roztworze monomeru, należy przygotować roztwór do żelowania (Tabela 1). Przygotowanie ~2 ml roztworu żelującego wystarcza do pokrycia studzienek PDMS z całej 10 cm szalki Petriego. Pamiętaj, aby dodać APS na końcu, ponieważ zainicjuje on polimeryzację i rozpocznie żelowanie.
   1. Rozcieńczyć utleniacz katalityczny świeżo z proszku (np. 1% TEMPO w/v w wodzie). Połączyć 1 960 μl roztworu monomeru z 30 μl 10% TEMED i 10 μl 1% TEMPO.
   2. Aby uniknąć polimeryzacji całej partii roztworu żelującego na raz, pracuj w małych partiach. Podzielić roztwór żelujący (bez APS) na 125 μl podwielokrotności między ośmioma probówkami paska PCR.
   3. Usuń roztwór monomeru z trzech studzienek PDMS za pomocą próżni, uważając, aby nie zakłócić pracy zarodków. Dodaj 5 μl APS do jednej z probówek PCR zawierających roztwór żelujący, aby zainicjować polimeryzację. Szybko rozprowadź polimeryzujący roztwór żelujący między studzienkami (~40 μl na studzienkę). Powtarzaj to, aż wszystkie studzienki i zarodki zostaną pokryte.
4. Pozostawić próbki do żelowania przez 1,5-2,5 godziny w temperaturze 37 °C. Hydrożele należy mieszać co jakiś czas w celu monitorowania polimeryzacji. Zestalone hydrożele nie będą się poruszać. Grubsze hydrożele będą potrzebowały więcej czasu, aby zakończyć polimeryzację i zestalenie.

6. Trawienie i ekspansja

UWAGA: Grubsze i większe żele potrzebują więcej czasu, aby się rozszerzyć, a środek żelu może potrzebować kilku godzin, aby całkowicie się rozprężyć; można to przyspieszyć, przycinając krawędzie żelu. W miarę rozszerzania się żeli ich współczynnik załamania światła stanie się prawie identyczny z indeksem wody i staną się bardzo trudne do zauważenia.

1. Po zakończeniu żelowania oderwij studzienki PDMS od szkiełka nakrywkowego, starając się nie naruszyć hydrożeli. W razie potrzeby odetnij nadmiar materiału hydrożelowego.
2. Przenieś hydrożele (nadal przyczepione do szkiełek nakrywkowych) pojedynczo do studzienek sześciodołkowej płytki (Rysunek 2E). Należy pamiętać, że hydrożele mogą nieznacznie rozszerzać się podczas trawienia.
3. Całkowicie przykryć żele buforem wytrawiającym (tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Ogólnie rzecz biorąc, 30 ml buforu wytrawiającego wystarcza do pokrycia żeli w 6-dołkowej płytce.
4. Po strawieniu przenieś każdy hydrożel pojedynczo na 6-centymetrową szalkę Petriego, zsuwając je z szkiełka nakrywkowego. Może być konieczne użycie drugiego szkiełka nakrywkowego w celu usunięcia żelu. Napełnij każdą szalkę Petriego wodą dejonizowaną, aby rozszerzyć żel. Zmieniaj wodę trzy do czterech razy w ciągu 1-2 godzin, aż żele całkowicie się rozprężą (spodziewaj się około czterokrotnego zwiększenia szerokości).

7. Montaż i obrazowanie

UWAGA: Hydrożele ekspandowane składają się prawie wyłącznie z wody, co czyni je prawie przezroczystymi i niezwykle delikatnymi. Żelami można manipulować za pomocą długich szkiełek nakrywkowych, aby je przesuwać i podnieść. Zamontuj i zobrazuj tylko jeden lub dwa żele na raz, ponieważ żele będą stopniowo uwalniać wodę i zaczną ślizgać się po szkiełku nakrywkowym.

1. Za pomocą pipety Pasteura usuń jak najwięcej wody z szalki Petriego, aby zminimalizować przesuwanie się żeli podczas obchodzenia się z nią.
2. Manewruj każdym ekspandowanym żelem, z zarodkami na dolnej powierzchni, na dużym szkiełku nakrywkowym (np. 24 mm x 40 mm) w celu obrazowania.
3. Zamontuj każde szkiełko nakrywkowe z żelem na obiektywie odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Zlokalizuj odpowiednio ustawione i zorientowane preparaty za pomocą trybów mikroskopii epifluorescencyjnej lub mikroskopii jasnego pola w mikroskopie z obiektywami powietrznymi o małym powiększeniu (5x lub 10x) lub średnim powiększeniu (20x).
4. Aby robić zdjęcia w wysokiej rozdzielczości, przełącz się na obiektyw zanurzony w oleju lub wodzie o dużym powiększeniu (60x, 63x lub 100x). Powierzchnia zarodków musi znajdować się w zakresie ogniskowania obiektywu (<300 μm od szkiełka nakrywkowego w przypadku obiektywu 63x), aby można było wykonać obraz.
5. Zbierz dane z próbek za pomocą laserowo-skaningowego trybu konfokalnego w mikroskopie. Upewnij się, że zbierasz nienasycone obrazy o dobrym zakresie dynamiki i użyj odpowiedniej liczby pikseli na obraz, aby przechwycić maksymalną możliwą informację o sample²³.

Rysunek 2: Ręczna dewitynizacja i praca z hydrożelami. (A) Wycinanie płyty agarowej z talerza z agarem/sokiem owocowym. (B) Umieszczenie taśmy dwustronnej wewnątrz pokrywy szalki Petriego o średnicy 6 cm. (C) Przyklejanie zarodków do zaklejonej taśmą pokrywy. (D) Płyta PDMS z kwadratową studnią przylegającą do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 22 mm. (E) Szkiełko nakrywkowe z dołkiem PDMS wewnątrz płytki 6-dołkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Aby scharakteryzować ogólną skuteczność ExM w pełnogórskich zarodkach Drosophila, długość zarodka wzdłuż osi głowa do ogona została zmierzona w nierozszerzonych zarodkach kontrolnych w porównaniu z rozszerzonymi zarodkami (Rysunek 3A-C). Nieekspandowane zarodki kontrolne poddano tym samym warunkom fiksacji i etapom znakowania immunofluorescencyjnego, co ekspandowane zarodki, z wyjątkiem tego, że przed obrazowaniem zostały zamontowane przy użyciu zestalonej pożywki montażowej. Poszczególne nierozciągnięte zarodki zajmowały około połowy pola widzenia przy użyciu obiektywu 10x (Ryc. 3A). W przeciwieństwie do tego, rozszerzone zarodki obejmowały w przybliżeniu dwa pełne pola widzenia przy użyciu tego samego 10-krotnego obiektywu (Ryc. 3B). Aby ocenić, jak stopień ekspansji różnił się zarówno w obrębie eksperymentów, jak i między nimi, ten sam protokół ExM przeprowadzono przy trzech oddzielnych okazjach, a długość zarodka mierzono w trzech różnych żelach w każdym indywidualnym eksperymencie. Średnia długość od głowy do ogona nierozszerzonych zarodków kontrolnych wynosiła 398,8 μm (odchylenie standardowe [SD] = 22,93 μm; n = 74; Rysunek 3C). Dla eksperymentu 1, eksperymentu 2 i eksperymentu 3 średnia długość zarodka wynosiła odpowiednio 1,596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1,868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) i 1,954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), reprezentując współczynniki ekspansji odpowiednio 4,0-krotnie, 4,7-krotnie i 4,9-krotnie (Rysunek 3C). Wewnątrzeksperymentalna zmienność między żelami była znacznie mniej zauważalna niż zmienność międzyeksperymentalna, która wynosiła około 20% (Rysunek 3C). Aby ocenić wpływ ExM na morfologię komórek i zarodków, do oznakowania wierzchołkowych błon komórkowych użyto przeciwciała przeciwko składnikowi połączenia adherens Par-3 (Bazooka)²¹ i zobrazowaliśmy rozwijające się segmenty gęb zarodków Drosophila w stadium 11 - stadium o złożonej strukturze segmentowej (Rysunek 3D-F). W próbie kontrolnej komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Rysunek 3D,F). W rozszerzonych próbkach zobrazowanych przy użyciu tego samego 40-krotnego obiektywu i współczynnika powiększenia (1x), komórki w segmencie szczęki miały średnią szerokość 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Rysunek 3E,F), reprezentujący 4,0-krotne rozszerzenie. Dlatego, zgodnie z poprzednimi raportami¹¹, byliśmy w stanie rozszerzyć zarodki Drosophila w całości około czterokrotnie w wymiarach liniowych przy użyciu ExM bez rozrywania próbki lub oczywistych zniekształceń w morfologii komórek lub tkanek.

Rysunek 3: Czterokrotna ekspansja zarodków Drosophila. (A) Nierozwinięte i (B) rozszerzone zarodki Drosophila zobrazowane za pomocą 10-krotnego obiektywu (0,3 NA) przy 1-krotnym powiększeniu. Poszczególne pola widzenia (FOV) są oznaczone liniami przerywanymi. Zarodki wykazywały ekspresję oznaczonej GFP wersji łańcucha lekkiego miozyny i zostały wybarwione przeciwciałem anty-GFP. (C) Kwantyfikacja długości zarodka (wzdłuż osi głowa do ogona) w trzech hydrożelach na doświadczenie i z trzech oddzielnych doświadczeń ExM w porównaniu z nieekspandowanymi kontrolami. (D,E) Segmenty szczęki z (D) nierozszerzonych i (E) rozszerzonych zarodków Drosophila w stadium 11 zobrazowane za pomocą obiektywu 40x (1,3 NA) przy 1-krotnym powiększeniu. Kontury komórek (połączenia adherens) wykryto za pomocą przeciwciała anty Par-3 / Bazooka (białego). (F) Kwantyfikacja szerokości komórki (oś długa) z równoważnych grup komórek z (D) i (E). Wykresy pudełkowe w (C) i (F) pokazują zakresy 25., 50. i 75. percentyla; wąsy wskazują wartości minimalne i maksymalne; Symbole "+" wskazują średnią. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby pokazać, że ExM może być używany do rozdzielania szczegółów subkomórkowych poniżej typowego limitu dyfrakcji, cytoszkielet aktomiozyny został zobrazowany w nierozszerzonej kontroli przeciwko rozszerzonym zarodkom przechodzącym zbieżne wydłużenie (etap 7). Zdarzenia przebudowy tkanek gastrulacji i zbieżnego rozciągania są w dużej mierze kontrolowane przez zmiany w lokalizacji białka motorycznego miozyny II²⁴. Jednak w gęsto upakowanym nabłonku walcowatym wczesnej ektodermy Drosophila trudno jest zaobserwować wiele drobnych szczegółów wzorca lokalizacji miozyny II, nawet gdy jest obrazowany przy 158-krotnym powiększeniu (63-krotny obiektyw z 2,5-krotnym zoomem optycznym) – typowa maksymalna zdolność rozdzielcza dla laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego. Na przykład, ponieważ miozyna II jest białkiem korowym (znajdującym się bezpośrednio pod błoną plazmatyczną), pule miozyny II ²⁵ znajdujące się po obu stronach kontaktów komórka-komórka nie były rozdzielalne w zarodkach stadium 7 i wyglądały jak pojedyncza linia, w której spotykały się sąsiednie komórki (Rysunek 4A). Natomiast w rozszerzonych zarodkach w stadium 7 można było zaobserwować równoległe linie miozyny II na połączeniach komórka-komórka, reprezentujące pule białek korowych w sąsiednich komórkach (Figura 4B). Odległość między równoległymi liniami miozyny II w próbkach ekspandowanych wynosiła 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); po podzieleniu przez cztery, daje to przewidywaną odległość ~220 nm między liniami miozyny w sąsiednich komórkach w nierozszerzonych zarodkach, która jest rzeczywiście tuż poniżej granicy dyfrakcji dla sygnału wykrytego za pomocą Alexa 488 (szczytowa emisja ~520 nm/2 = 260 nm).

Ponadto, sprawdziliśmy również, czy ExM może być użyty do rozwiązania architektury sieci mitochondrialnej w gęsto upakowanych komórkach gastrulatujących zarodków Drosophila (etap 6). Funkcja mitochondriów jest ściśle związana ze strukturą sieci (tj. połączone i rozdrobnione organelle), ale szczegóły organizacji sieci mitochondrialnej są trudne do wizualizacji przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej w typach komórek, które nie są płaskie i / lub cienkie. Mitochondria są naturalnie bogate w biotynylowane cząsteczki, a zatem mitochondria mogą być znakowane we wczesnym zarodku Drosophila za pomocą fluorescencyjnie znakowanej streptawidyny²⁶. W nierozszerzonych zarodkach w stadium 6 znakowanych streptawidyną-Alexa 488 sygnał pojawił się jako cytoplazmatyczne punkciki, które często nakładały się na siebie i były trudne do rozdzielenia (Ryc. 4C). Dla porównania, w rozszerzonych zarodkach w stadium 6 widocznych było znacznie więcej drobnych szczegółów sieci mitochondrialnej, a puncta były łatwiejsze do rozpoznania ( Rysunek 4D) ^{26, 27}. Wyniki te wskazują, że ExM może być stosowany do badania organizacji sieci mitochondrialnej w typach komórek, które tradycyjnie nie nadają się do analizy mitochondrialnej.

Rysunek 4: Szczegóły cytoszkieletu i mitochondriów aktomiozyny ujawnione przez mikroskopię ekspansywną. (A,B) Lokalizacja miozyny II w komórkach neuroektodermy (pasmo zarodkowe) zobrazowana obiektywem 63x (1,4 NA) przy 2,5-krotnym powiększeniu w etapie 7 (A) nierozszerzonym i (B)) Rozszerzone zarodki. Miozynę II wykryto w zarodkach wykazujących ekspresję transgenicznej wersji łańcucha lekkiego regulatorowego miozyny II znakowanej GFP (sqh-GFP), którą wykryto za pomocą przeciwciała anty-GFP (kolor czerwony). Wyraźne pule miozyny korowej zlokalizowane w sąsiednich komórkach mogą być rozwiązane w rozszerzonym zarodku (białe strzałki). (C,D) Sieci mitochondrialne w komórkach neuroektodermy zobrazowane obiektywem 63× (1,4 NA) przy 2,5-krotnym powiększeniu w stadium 6 nierozszerzonych (C) i rozszerzonych (D) zarodków. Mitochondria wykryto za pomocą streptawidyny-Alexa 488 (zielony), a kontury komórek wykryto za pomocą przeciwciała anty-Par-3 / Bazooka (magenta). Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przepisy na rozwiązania. Skład roztworów stosowanych w tym protokole w kolejności pojawiania się. Wszystkie akcje są płynne, chyba że zaznaczono inaczej. Chemikalia zostały ponownie zawieszone lub rozcieńczone w autoklawowanej przefiltrowanej wodzie, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Ręczna dewitynizacja
Większość protokołów utrwalania zarodków Drosophila polega na usunięciu błony witeliny poprzez potrząsanie utrwalonymi zarodkami w emulsji metanolu i heptanu, co powoduje pękanie błon w wyniku pęknięcia osmotycznego²⁶. Podczas gdy dewitellinizacja na bazie metanolu (popping metanolu) jest skuteczna i odpowiednia do wielu zastosowań, ręczna dewitellinizacja (peeling ręczny) ma kilka istotnych zalet. Po pierwsze, ręczne obieranie pozwala na wybór precyzyjnie zainscenizowanych zarodków do dewitelinizacji i zebrania, co znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania rozszerzonych zarodków w użytecznej orientacji pod koniec eksperymentu. To wzbogacenie ma kluczowe znaczenie przy badaniu specyficznych aspektów szybkich procesów rozwojowych (np. inwagacji mezodermy lub zbieżnego rozciągania), dla których odpowiednio zaawansowane zarodki mogą stanowić zaledwie kilka procent wszystkich zarodków. nawet w ściśle określonym czasie oknie odbioru. Oczywiście, w przypadku wielu zastosowań, bardziej tradycyjne masowe pobieranie zarodków metanolem z okienka pobierania w określonym czasie będzie wystarczające, a ręczne obieranie może nie być warte dodatkowego wysiłku. Po drugie, na wiązanie niektórych pierwszorzędowych przeciwciał i barwników negatywnie wpływa wcześniejsza ekspozycja próbki na metanol. Z tego powodu ręczne obieranie może spowodować znaczny wzrost jakości sygnału immunofluorescencji w porównaniu z próbkami z metanolem, co czyni go przydatną ogólną techniką dla biologów rozwojowych Drosophila .

Mikroskopia konfokalna o wysokiej rozdzielczości w rozszerzonych zarodkach Drosophila
Podczas gdy wykonywanie mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości na próbkach ekspandowanych jest koncepcyjnie takie samo jak w przypadku próbek nieekspandowanych, ExM wprowadza pewne przeszkody techniczne. Warto zauważyć, że orientacja zarodka, która jest losowa, staje się jeszcze ważniejsza wraz ze wzrostem wielkości próbki, ponieważ obiektywy o dużym powiększeniu i wysokim NA są w stanie skupić światło tylko z obszarów próbki, które znajdują się bardzo blisko szkiełka nakrywkowego²⁷. Dlatego zwykle możliwe jest skupienie się tylko na komórkach na powierzchni zarodka lub w jego pobliżu, które znalazły się w sąsiedztwie szkiełka nakrywkowego w momencie tworzenia żelu. Najlepszym sposobem, aby upewnić się, że na końcu znajdują się próbki o prawidłowej orientacji, jest rozpoczęcie protokołu ExM od ściśle zaplanowanej kolekcji utrwalonych zarodków (np. za pomocą ręcznego obierania) i wysiewu wielu zarodków w każdym dołku (>10). Aby uwidocznić komórki głęboko we wnętrzu zarodka, może być konieczne użycie bardziej specjalistycznych zestawów obrazowania, takich jak mikroskopia świetlna²⁸. Ponadto stwierdzamy, że jakość obrazu można poprawić, otwierając otwór konfokalny do rozmiaru większego niż jedna przewiewna jednostka. Oczywiście zwiększenie rozmiaru otworka będzie się wiązało ze zmniejszeniem maksymalnej rozdzielczości, ale w praktyce nawet niewielkie zwiększenie rozmiaru otworka może znacznie zwiększyć intensywność sygnału (dane nie pokazane). Przyszłe badania powinny systematycznie koncentrować się na wielkości otworków i efektywnej rozdzielczości w próbkach ExM.

Wariacje na temat podstawowego ExM
Opisany tutaj protokół jest stosunkowo prostym przykładem ExM, który powinien działać w wielu zastosowaniach i być łatwy do wdrożenia w większości laboratoriów biologii rozwojowej. Istnieje jednak wiele odmian podstawowej koncepcji ExM ^4,5,7, które można wykorzystać do zwiększenia intensywności sygnału, osiągnięcia jeszcze dalszych stopni ekspansji i wykrywania cząsteczek kwasów nukleinowych, a także białek. W tym protokole zarodki są inkubowane z przeciwciałami przed żelowaniem i ekspansją. Alternatywnie, próbki można poddać działaniu przeciwciał po ich rozprężeniu ^6,30, co może zwiększyć intensywność sygnału ze względu na zwiększoną dostępność epitopów i zmniejszoną utratę związanych przeciwciał podczas etapów ekspansji. Ponadto specyficzne cząsteczki sieciujące mogą być używane do przyłączania cząsteczek RNA do hydrożelu, aby umożliwić wykrycie RNA w ekspandowanych żelach przy użyciu metody hybrydyzacji reakcji łańcuchowej³⁰. Wreszcie, próbki mogą być poddawane wielu rundom ekspansji, jak w iteracyjnej mikroskopii ekspansji (iExM)³¹, pan-ExM³² i ujawniającej ekspansję (ExR)³¹, aby osiągnąć jeszcze wyższe stopnie zwiększonej rozdzielczości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
akryloamid	Milipore Sigma	1490-100ML
nadsiarczan amonu	VWR	BDH9214-500G
przeciwciało poliklonalne królika anty-GFP	Torrey Pines BioLabs	TP-401
przeciwciało poliklonalne IgG kozy przeciwko śwince morskiej, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11075
przeciwciało poliklonalne przeciw królikowi IgG kozie, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
bisakryloamid	Research Products International	A11275
albumina surowicy bydlęcej (30% roztwór)	Millipore Sigma	A7284
probówki stożkowe, 50 ml	fisherscientific	21008-940
szkło nakrywkowe, kwadratowe 22 mm	VWR	48366-227
szkło nakrywkowe, prostokątne 40 mm x 24 mm	VWR	48393-230
szklane kapilary do ciągnięcia igieł	Precision Instruments	TW100F-4
szklane igły do mikroiniekcji (wstępnie naciągnięte)	World Precision Instruments	TIP10LT
guanidyna HCl	VWR	101970-606
heptan	VWR	EM-HX0078-1
lateksowe żarówki do pipet	VWR	82024-554
metanol	VWR	BDH1135-4LP
kwas melaksylowy N-hydroksysukcynimidyl ester	VWR	730300-1G
, 1,5 ml	VWR	20170-038
Płytka wielodołkowa, 6-dołkowa	Genesee	25-100
paraformaldehyd (16%, klasa EM, bez metanolu)	Mikroskopia elektronowa 509804487	(Fisher)
Pigazat Pasteura (2 ml, krótka końcówka)	Zestaw VWR	14673-010
PDMS (zestaw Sylgard 184, baza i utwardzacz)	VWR	102092-312
Płytki Petriego	Genesee	32-107
fizjologiczna buforowana fosforanami (10 x roztwór)	VWR	97063-660
Roztwór poli-L-lizyny (0,1% roztwór)	VWR	P8920-1ooML
Proteinaza K	Thermo Fisher Scientific	E00491
(30 ml)	VWR	66022-128
Akrylan sodu	VWR	101181-226
Azydek sodu ( proszek)	Millipore Sigma	71289	wytwarza 1% w/v zapasu roboczego; ostra TRUCIZNA w tym stężeniu!
Streptawidyna, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	S32354
TAE (50x)	Taśma VWR	97063-692
(dwustronna, szerokość 1 cala)	Szkocka  3M	665 Szkocka dwustronna 1inch/1296 inches Pudełkowa
TEMED	Thermo Fisher Scientific	PI17919
TEMPO	VWR	EM8.14681.0005	utleniacz katalityczny
Tween-20	VWR	97063-872	wyjątkowo lepki po oczyszczeniu; zrobić 10% zapas roboczy z wodą
Zeiss LSM 900	Zeiss Laserowy		mikroskop skaningowy używany bez AiryScan