Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Podsumowanie

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Streszczenie

Integralność bariery jelitowej jest cechą charakterystyczną zdrowia jelit. Podczas gdy integralność bariery jelitowej można ocenić za pomocą markerów pośrednich, takich jak pomiar markerów stanu zapalnego w osoczu i translokacja bakterii do śledziony i węzłów chłonnych, złoty standard bezpośrednio określa ilościowo zdolność wybranych cząsteczek do przechodzenia przez warstwę błony śluzowej jelit w kierunku krążenia ogólnoustrojowego. W tym artykule wykorzystano nieinwazyjną, opłacalną i nieobciążającą technikę do ilościowego określenia i śledzenia w czasie rzeczywistym przepuszczalności jelit u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego fluoresceiną izotiocyjanianem (dekstran FITC). Przed doustną suplementacją FITC-dextran myszy są na czczo. Następnie są one poddawane zgłębnikowaniu FITC-dekstranem rozcieńczonym w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Godzinę po zgłębniku myszy poddaje się znieczuleniu ogólnemu za pomocą izofluranu, a fluorescencję in vivo wizualizuje się w komorze obrazowania. Technika ta ma na celu ocenę fluorescencji resztkowej w jamie brzusznej i wychwytu wątrobowego, co sugeruje migrację wrotną sondy fluorescencyjnej. Próbki krwi i kału pobiera się 4 godziny po zgłębniku jamy ustnej, a myszy poświęca się. Próbki osocza i kału rozcieńczone w PBS są następnie platerowane i rejestrowana jest fluorescencja. Stężenie FITC-dekstranu jest następnie obliczane przy użyciu krzywej wzorcowej. W poprzednich badaniach obrazowanie in vivo wykazało, że fluorescencja szybko rozprzestrzenia się do wątroby u myszy ze słabszą barierą jelitową wywołaną dietą ubogą w błonnik, podczas gdy u myszy uzupełnionych błonnikiem w celu wzmocnienia bariery jelitowej sygnał fluorescencyjny jest zatrzymywany głównie w przewodzie pokarmowym. Ponadto w tym badaniu myszy kontrolne miały podwyższoną fluorescencję osocza i zmniejszoną fluorescencję kału, podczas gdy odwrotnie, myszy suplementowane inuliną miały wyższy poziom sygnałów fluorescencyjnych w jelitach i niski poziom w osoczu. Podsumowując, protokół ten zapewnia jakościowe i ilościowe pomiary przepuszczalności jelit jako markera zdrowia jelit.

Wprowadzenie

Bariera jelitowa odgrywa ważną rolę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Wymaga to złożonej równowagi między umożliwieniem przenikania wymaganych składników odżywczych do krążenia ze światła jelita, a jednocześnie zapobieganiem przenikaniu cząsteczek prozapalnych, takich jak patogeny lub antygeny¹. Zwiększona przepuszczalność może być spowodowana wieloma zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi, takimi jak choroby wątroby lub nieswoiste zapalenie jelit (IBD)^2,3. Na przykład we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (WZJG), IBD, przewlekły stan zapalny prowadzi do rozpadu połączeń ścisłych, a następnie do przerwania bariery jelitowej i translokacji bakterii, potencjalnie utrwalając zapalenie błony śluzowej i ogólnoustrojowe⁴.

Integralność bariery jelitowej jest zatem ważnym wskaźnikiem zdrowia jelit. Obecne metody pomiaru przepuszczalności jelit mają jednak wiele ograniczeń. Na przykład metody mierzące markery stanu zapalnego osocza lub translokację bakteryjną do śledziony i węzłów chłonnych są pośrednie^5,6. Inne metody mogą być inwazyjne i czasochłonne. W tym artykule opisano nieinwazyjny i opłacalny test, który bezpośrednio i ilościowo mierzy przepuszczalność jelit. Test ten wykorzystuje dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC) do śledzenia przepuszczalności jelit w czasie rzeczywistym poprzez pomiar fluorescencji in vivo. Ponadto pomiar poziomu dekstranu FITC-dekstranu w osoczu i kale określa ilościowo przepuszczalność jelit (Rysunek 1).

Test przepuszczalności FITC-dekstranu był wcześniej używany w wielu różnych kontekstach, w tym w modelach zwierzęcych choroby Parkinsona⁷, sepsa⁸, udar niedokrwienny⁹, oraz oparzenie¹⁰. Ponadto test ten został ostatnio wykorzystany do zrozumienia, w jaki sposób mikrobiom jelitowy może być zaangażowany w różne procesy chorobowe i jak może być ukierunkowany lub manipulowany jako potencjalna terapia. Na przykład został wykorzystany do badania mikrobiomu i terapii opartych na mikrobiomie w aging¹¹, IBDs^{12, rak} jelita grubego¹³ i zaburzenie ze spektrum autyzmu¹¹. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest związana z wieloma aspektami zdrowia i choroby, test ten jest szeroko stosowany. Jego względna prostota i niewielkie obciążenie czasowe sprawiają, że idealnie nadaje się do testowania warunków in vivo, co do których podejrzewa się, że zmieniają integralność bariery jelitowej. Jego wyniki ilościowe są przydatne do określenia skuteczności potencjalnego leczenia.

W tym badaniu, wpływ diety na funkcję bariery jelitowej został oceniony za pomocą testu FITC-dekstran. Porównano przepuszczalność jelit myszy otrzymujących dietę kontrolną i przepuszczalność jelitową myszy otrzymujących dietę uzupełnianą inuliną. Inulina jest korzystnym oligosacharydem, który, jak wykazano, poprawia funkcję bariery jelitowej^12,13. Do pomiarów fluorescencji in vivo (tło) jako kontrolę ujemną wykorzystano jedną dodatkową nieleczoną mysz, która otrzymała PBS zamiast dekstranu FITC. Eksperyment ten pokazuje, że test FITC-dekstran jest cennym narzędziem do oceny przepuszczalności jelit.

Protokół

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami po zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CRCHUM. Do niniejszego badania wykorzystano ośmiotygodniowe samice myszy BALB/c, pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Zwierzęta otrzymywały suplementację diety 10% inuliną wt/wt przez 2 tygodnie. Grupa kontrolna otrzymywała podobną dietę bez suplementu inuliny. Myszy miały dostęp ad libitum do diety. Przegląd testu jest pokazany w Rysunek 1.

Rysunek 1: Schemat testu FITC-dekstran. T−4-4 h przed zgłębnikiem usunięto dostęp do pokarmu. T0-FITC-dekstran podawano przez zgłębnik doustny. T1 - 1 h po zgłębniku, oceniono fluorescencję in vivo. T4-4 h po zgłębniku pobrano próbki kału i osocza oraz zmierzono fluorescencję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Podawanie FITC-dekstranu

1. Przed podaniem FITC-dextran myszy należy pościć przez 4 godziny, utrzymując ad libitum dostęp do wody.
   UWAGA: Post najlepiej rozpocząć na początku cyklu świetlnego (rano). Myszy mogą zostać przeniesione do nowej klatki bez ściółki podczas postu, aby ograniczyć koprofagię.
2. Przygotować 200 μl 80 mg·^mL-1 4 kDa FITC-dekstranu (patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonego w sterylnym 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) (na mysz). Świeżo przygotowane próbki należy przygotować bezpośrednio przed podaniem i chronić je przed światłem.
3. Każdej myszy należy podać 200 μl zawiesiny FITC-dekstranu przez zgłębnik doustny za pomocą wysterylizowanej, zakrzywionej igły do zgłębnika o średnicy 38 mm i wadze 22 G z końcówką w kształcie kuli lub gruszki (patrz tabela materiałów). Uruchom stoper po pierwszym zgłębniku i odczekaj 5-10 minut przed zgłębnikowaniem następnej myszy, aby umożliwić pomiary in vivo (krok 2), zawsze zachowując 1 godzinę po zgłębniku. Zachowaj pozostałą zawiesinę FITC-dekstranu dla krzywej standardowej.
   UWAGA: Bezpośrednio po zgłębniku pokarm może zostać zastąpiony, aby zapewnić tworzenie się kału.

2. Pomiar fluorescencji in vivo

1. Myszy należy znieczulić 1 godzinę po zgłębniku, używając 2,5% izofluranu lub alternatywnego środka znieczulającego. Upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, szczypiąc palec u nogi lub ogon i upewniając się, że zwierzę nie reaguje.
   1. Usuń sierść z okolicy brzucha za pomocą golarki elektrycznej i obficie nałóż maść nawilżającą okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść myszy pojedynczo w komorze obrazowania leżącej grzbietowo.
      UWAGA: Należy dołączyć jedną mysz kontrolną, która otrzymuje PBS lub sól fizjologiczną zamiast FITC-dekstranu, aby uwzględnić tło podczas obrazowania in vivo.
2. Zobrazuj myszy za pomocą komory do obrazowania fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów). Uzyskuj obrazy okolicy brzucha, ustawiając długość lasera na 470 nm i rozdzielczość na 2,0 mm.
   1. Uruchom maszynę i oprogramowanie, klikając i przytrzymując przycisk start. Poczekaj, aż system się rozgrzeje.
      UWAGA: System może potrzebować 20 minut lub więcej na rozgrzanie, dlatego maszynę należy uruchomić wcześnie, aby nie przeszkadzać w obrazowaniu myszy po 1 godzinie od zgłębnika.
   2. Kliknij Stan urządzenia i upewnij się, że wszystkie skonfigurowane urządzenia pokazują "OK" przed kontynuowaniem.
   3. W razie potrzeby rozgrzej odpowiedni laser, klikając Sterowanie laserem, a następnie klikając przycisk Nazwa lasera żądanego lasera.
   4. Rozpocznij nowe badanie, klikając przycisk Nowe badanie. Zapisz w odpowiednim pliku o żądanej nazwie.
   5. Kliknij Opcje badania, a następnie wprowadź identyfikator próbki i wybierz odpowiedni laser i eksperyment.
   6. Otwórz komorę obrazowania i umieść zwierzę grzbietowo na płytce skanującej. Zabezpiecz kończyny i ogon taśmą i upewnij się, że nos i usta ściśle przylegają do rurki anestezjologicznej, utrzymując 2,5% izofluranu.
   7. Dostosuj wysokość płytki skanującej tak, aby obszar skanowania był nieco brzuszny od linii środkowej zwierzęcia. Wyreguluj płytkę, obracając pokrętło regulacyjne wewnątrz komory obrazowania. Zamknij i zablokuj drzwiczki komory obrazowania.
   8. Zaznacz obszar do skanowania za pomocą narzędzia Rysowanie. Uwzględnij całą szerokość brzucha od tuż nad wątrobą do odbytnicy. Kliknij narzędzie Modyfikuj, aby dostosować obszar po narysowaniu.
   9. Ustaw rozdzielczość skanowania na 2,0 mm, a następnie kliknij Dalej. Po zakończeniu automatyzacji zasilania upewnij się, że ustawienia są prawidłowe i dokonaj wszelkich potrzebnych regulacji. Kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie.
   10. Po zakończeniu skanowania wyjmij zwierzę z komory obrazowania i umieść je w inkubatorze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
   11. Kliknij Kontynuuj badanie, aby zachować ustawienia, a następnie powtarzaj kroki 2.2.5-2.2.10, aż wszystkie myszy zostaną zeskanowane.
   12. Kliknij przycisk zasilania i przytrzymaj go przez 3 sekundy, aby wyłączyć komorę obrazowania.
3. Oceń fluorescencję, porównując fluorescencję jamy brzusznej każdego zwierzęcia i myszy kontrolnej na jednolicie skalowanych obrazach za pomocą oprogramowania powiązanego z używanym systemem obrazowania (patrz tabela materiałów).
   1. Otwórz pliki obrazów, znajdując je pod wybraną nazwą pliku. Otwórz wszystkie pliki, które mają zsynchronizowane ustawienia w tym samym czasie.
   2. Korzystając z paska narzędzi ustawień obrazu, użyj przycisków Synchronizuj obraz i Skala synchronizacji, aby zsynchronizować ustawienia obrazów, co pozwoli na dokładne porównanie.
   3. Zapisz obrazy z ich dostosowanymi skalami.

3. Pomiar fluorescencji w próbkach kału i osocza

1. Zbierz granulkę kału od każdej myszy w sterylnej probówce 4 godziny po zgłębniku. Trzymaj rurki w ciemności na lodzie.
2. Znieczulić myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 240 mg/ml pentobarbitalu sodu (rozcieńczenie, 1:100; patrz tabela materiałów). Podawać w dawce 0,03 ml/g masy ciała.
   1. Pobrać próbki krwi o objętości co najmniej 700 μl do probówki przeznaczonej do pobierania osocza, zawierającej heparynę lub EDTA, aby zapobiec krzepnięciu (patrz Tabela Materiałów), wkładając szklaną rurkę kapilarną do splotu zaoczodołowego¹⁴.
      UWAGA: Alternatywne metody pobierania krwi obejmują nakłucie serca lub pobranie z żyły ogonowej. Ponieważ jest to procedura terminalna, myszy muszą zostać poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub alternatywną metodę humanitarną. Postępuj zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt dotyczącymi eutanazji.
3. Odwirować próbki krwi o masie 9,390 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś osocze do nowej sterylnej probówki i trzymaj je w ciemności na lodzie.
4. Rozcieńczyć 50 mg próbek kału w 200 μl 1x PBS i rozcieńczyć osocze 1:2 1x PBS. Współczynnik rozcieńczenia można modyfikować w zależności od intensywności sygnału fluorescencji.
5. Wygeneruj krzywą wzorcową, używając seryjnych rozcieńczeń FITC-dekstranu w 1x PBS. Zaczynając od najwyższego stężenia 20 mg·mL⁻¹ dekstranu FITC, rozcieńczyć w stosunku 1:1 szeregowo 7-10 razy.
   UWAGA: Stężenia muszą zatem wynosić 20 mg·mL⁻¹, 10 mg·mL⁻¹, 5 mg·mL⁻¹, 2,5 mg·mL⁻¹, 1.25 mg·mL⁻¹, 0.625 mg·mL⁻¹, 0.3125 mg·mL⁻¹ itd.
6. Umieścić 100 μl próbek i wzorców na nieprzezroczystej czarnej płytce 96-dołkowej. Dołącz puste miejsce PBS. Odczytać fluorescencję na czytniku płytek fluorescencyjnych (patrz tabela materiałów) z absorpcją przy 530 nm i wzbudzeniem przy 485 nm.
   UWAGA: Próbki i wzorce można posiać podwójnie lub trzykrotnie, a następnie uśrednić ich wartości fluorescencji.
7. Oznaczyć stężenie dekstranu FITC-w próbce, porównując fluorescencję ze znanymi stężeniami krzywej wzorcowej. W próbkach należy pomnożyć stężenie przez współczynnik rozcieńczenia (etap 3.5).

Wyniki

Analiza fluorescencji in vivo wykazała, że myszy, które otrzymywały tylko dietę kontrolną, miały wyższe spożycie FITC-dekstranu w wątrobie i wyższy poziom fluorescencji resztkowej w jamie brzusznej w porównaniu do myszy, które otrzymały dietę uzupełnioną inuliną (Rysunek 2A). Pewna fluorescencja była widoczna w jelicie ślepym myszy, które otrzymywały dietę inulinową, ale spożycie wątroby było niewielkie lub żaden, co wskazuje, że diety te chroniły przed zwiększoną przepuszczalnością jelit.

Poziomy fluorescencji w próbkach osocza i kału wzmacniają i kwantyfikują swoje odpowiedniki in vivo. Myszy, które otrzymywały dietę uzupełnioną inuliną, miały znacznie niższy poziom dekstranu FITC w osoczu w porównaniu z myszami, które otrzymywały tylko dietę kontrolną (Figura 2B). Wskazuje to, że poprawiła się funkcja bariery jelitowej, ponieważ mniej FITC-dekstranu mogło przeniknąć przez barierę jelitową do krążenia. Zgodnie z tym, myszy, które otrzymywały dietę inulinową, miały znacznie wyższy poziom dekstranu FITC w kale niż myszy, które otrzymywały tylko dietę kontrolną (Rysunek 2C). Potwierdza to, że miały one nienaruszoną funkcję bariery jelitowej, ponieważ dekstran FITC pozostał w okrężnicy aż do wydalenia, co jest uważane za normalne. Niższe poziomy dekstranu FITC-dekstranu w kale myszy kontrolnych wskazują, że przenikał on przez barierę jelitową do krążenia, a nie był odpowiednio wydalany. Wysoki poziom dekstranu FITC-dekstranu w osoczu potwierdza to odkrycie.

Rysunek 2: Suplementacja diety inuliną zmniejsza translokację dekstranu FITC przez barierę jelitową. (A) Fluorescencja resztkowa i wychwyt wątrobowy dekstranu FITC. Czerwony = najwyższa intensywność; Ciemny fiolet = najniższa intensywność. Maksymalna fluorescencja 2,15 x 10³, minimalna fluorescencja 0,378. (B) Stężenie w osoczu dekstranu FITC. P = 0,010. (C) Stężenie dekstranu fitc w kale. P = 0,00003. N = 4 na grupę. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Każda kropka reprezentuje jedną mysz. Niesparowany test t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Funkcja bariery jelitowej jest integralną częścią wielu różnych procesów chorobowych. W związku z tym ocena przepuszczalności jelit w sposób nieinwazyjny, opłacalny i wymierny jest niezbędna do dokładnego odwzorowania tych chorób w modelach zwierzęcych. Test FITC-dekstran daje możliwość takiej reprezentacji. Jednak protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać dokładnie, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Po pierwsze, niezbędne jest zapewnienie stosowania dekstranu FITC-dextran o odpowiedniej wielkości. Do badania przepuszczalności in vivo optymalna masa cząsteczkowa wynosi 4 kDa FITC-dekstran, a wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej przepuszczalność maleje¹⁵. W związku z tym stosowanie dekstranu FITC o innej masie cząsteczkowej może dostarczyć mylących lub niewiarygodnych wyników. Ponadto ważne jest, aby zanotować czas każdego zgłębnika i odpowiednio dostosować punkty czasowe dla zbierania danych in vivo oraz pobierania osocza i kału. Na przykład, jeśli dwie myszy są poddawane do siebie w odstępie 10 minut, odczyty fluorescencji in vivo oraz zbieranie kału i osocza również muszą nastąpić w odstępie 10 minut. Porównanie fluorescencji w tych samych punktach czasowych pozwala na dokładniejsze odwzorowanie różnic w przepuszczalności. Ponadto kolejność, w jakiej badane są zwierzęta z różnych grup, powinna być zmieniana, aby zapobiec efektowi grupowania spowodowanemu czasem. Zamiast badać najpierw wszystkie zwierzęta z grupy A, a następnie wszystkie zwierzęta z grupy B jako drugie (AAABBB), zaleca się, aby grupa została zamieniona po każdym zwierzęciu (ABABAB).

Test ten można zmodyfikować tak, aby obejmował tylko ocenę próbek osocza i kału w przypadku braku dostępu do maszyny do obrazowania. Chociaż bezpośrednie obrazowanie fluorescencyjne in vivo pozwala na wizualizację poboru wątroby i resztkowej fluorescencji jamy brzusznej, ocena fluorescencji w próbkach osocza i kału nadal zapewnia ilościowy pomiar przepuszczalności jelit. Ponadto, jak wykazano w opisanym eksperymencie, poziomy fluorescencji w osoczu i kale dobrze korelują z obrazowaniem in vivo . Dodatkowo test ten można zmodyfikować tak, aby obejmował tylko obrazowanie in vivo . Dzięki temu zwierzęta mogą być utrzymywane przy życiu, aby kontynuować testowanie innych parametrów lub monitorować, jak zmienia się przepuszczalność jelit w czasie. Możliwość modyfikacji tego testu sprawia zatem, że jest on dostępny, ale nadal ilościowy. Wreszcie, dawka 200 μl 80 mg·^mL-1 FITC-dekstranu podawana każdej myszy była stosowana wcześniej i wykazano, że jest skuteczna u myszy z niewielkimi różnicami w masie ciała¹⁶. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie myszy użyte w sekcji wyników reprezentatywnych ważyły około 20 g, co pozwala na zastosowanie tej samej dawki dla każdej myszy. Aby jednak uwzględnić różnice w masie ciała, FITC-dekstran może być podawany w dawce 0,6-0,8 mg/g masy ciała, na przykład¹⁷. Co istotne, niezależnie od zastosowanej dawki, ważne jest, aby ograniczyć ilość podawaną każdej myszy do mniej niż 10 ml·^kg−1 , aby zapobiec powikłaniom lub dyskomfortowi¹⁸.

Chociaż test FITC-dekstran stanowi skuteczną metodę oceny funkcji bariery jelitowej, nadal ma pewne ograniczenia. Jednym z ograniczeń tego modelu jest to, że wymaga on poszczenia myszy przez kilka godzin, co oznacza, że porównywanie tych wyników z tymi od myszy, które nie były na czczo, jest niewiarygodne. Ponadto post może wpływać na wyniki w niektórych modelach, które wymagają ścisłych harmonogramów karmienia, na przykład podczas pomiaru poziomu glukozy we krwi w modelach zwierzęcych dla cukrzycy.

Pomimo tych ograniczeń test FITC-dekstran pozostaje skuteczną metodą analizy przepuszczalności jelit, ponieważ jest ilościowy, wszechstronny, opłacalny i mniej inwazyjny niż wiele klasycznych metod. Na przykład powszechnymi sondami stosowanymi do pomiaru przepuszczalności jelit są małe sondy sacharydowe lub Cr-EDTA, które mają pewne zalety¹⁹. Jednak niektóre sondy sacharydowe mają przepuszczalność specyficzną tylko dla regionu. Ponieważ są one hydrolizowane w dystalnej części jelita cienkiego, nie dają wglądu w przepuszczalność okrężnicy¹⁹. Z drugiej strony, Cr-EDTA może dostarczyć informacji o przepuszczalności okrężnicy, ale wymaga pomiarów przez 24 godziny, co sprawia, że obciążenie czasowe tej metody jest znacznie wyższe niż w przypadku testu FITC-dekstran²⁰. Co więcej, żadna z tych metod nie zapewnia bezpośredniego obrazowania in vivo tego testu. W związku z tym test FITC-dekstran stanowi stosunkowo prostą, bezpośrednią i skuteczną opcję w porównaniu z alternatywnymi metodami pomiaru przepuszczalności jelit.

Wreszcie, w procesach chorobowych, takich jak IBD⁴, choroba Alzheimera²¹ i choroba wątroby², przepuszczalność jelit jest ważnym parametrem, który można zmierzyć za pomocą testu FITC-dekstran w celu ulepszenia badań. Na przykład przy opracowywaniu nowych metod leczenia, takich jak immunoterapie IBD, test ten można wykorzystać do zbadania skuteczności środka terapeutycznego w utrzymaniu integralności bariery jelitowej. Biorąc pod uwagę, że upośledzona funkcja bariery jelitowej może być zaangażowana w utrwalanie przewlekłego stanu zapalnego w WZJG, ważne jest zbadanie, jak dobrze terapia chroni przed zwiększoną przepuszczalnością⁴. To tylko jeden z przykładów, ale test FITC-dekstran jest dostępnym i wymiernym sposobem pomiaru przepuszczalności jelit w wielu różnych obszarach i aspektach badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dieta 50 ppm Fe (10% inuliny)	Envigo Teklad	TD.190651	Reprezentatywne wyniki
Dieta 50 ppm Fe (FeSO4)	Envigo Teklad	TD.190723	Reprezentatywne wyniki
BALB/c Myszy 49-55 dni, samica	Charles River	028BALB/C	Reprezentatywne wyniki
BD 1 mL Strzykawka tuberkulinowa z końcówką	ślizgową Becton, Dickinson and Company	309659	głębnika
BD Microtainer - z LH (heparyną litową) Becton	, Dickinson and Company	365965	Do pobierania osocza
Wirówka 5420	Eppendorf	S420KN605698
Zakrzywiona igła do zgłębnika (kaniula zgłębnika) 7,7,0 38 mm x 22 g	Harvard Apparatus Canada	34-024	Już niedostępny - Potencjalna alternatywa jest dostępna w Instech Labs (FTP-22-38)
Eutanyl (pentobarbital sodowy) 240 mg/ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	141704	rozcieńczenie 1/100; Podawany we wstrzyknięciu dootrzewnowym w stężeniu 0,03 ml/g masy ciała
FITC-dekstran 4	TdB Labs	20550
Heparynizowane rurki kapilarne	Kimble Chase Nauki przyrodnicze i badania	2501	Do pobierania krwi za oczodołem
Mikropłytka, PS, 96-dołkowa, płaskodenna (studzienka kominowa),, Flutrac, Med. Wiązanie	Greiner Bio-one	655076
MiniARCO Clipper Kit	Kent Scientific	CL8787-KIT	Do usuwania włosów
Optix MX2 i Optix Optiview	Advanced Research Technologies	2.02.00.6	Maszyna do obrazowania fluorescencyjnego i oprogramowanie
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS)	Żubel Inc	311-010-LL
Puralube Maść weterynaryjna	Dechra	12920060	Maść okulistyczna zapobiegająca uszkodzeniom oczu podczas znieczulenia
Iskra Czytnik płytek	Tecan	30086376