W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.
Artykuł metodologiczny
Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Integralność bariery jelitowej jest cechą charakterystyczną zdrowia jelit. Podczas gdy integralność bariery jelitowej można ocenić za pomocą markerów pośrednich, takich jak pomiar markerów stanu zapalnego w osoczu i translokacja bakterii do śledziony i węzłów chłonnych, złoty standard bezpośrednio określa ilościowo zdolność wybranych cząsteczek do przechodzenia przez warstwę błony śluzowej jelit w kierunku krążenia ogólnoustrojowego. W tym artykule wykorzystano nieinwazyjną, opłacalną i nieobciążającą technikę do ilościowego określenia i śledzenia w czasie rzeczywistym przepuszczalności jelit u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego fluoresceiną izotiocyjanianem (dekstran FITC). Przed doustną suplementacją FITC-dextran myszy są na czczo. Następnie są one poddawane zgłębnikowaniu FITC-dekstranem rozcieńczonym w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Godzinę po zgłębniku myszy poddaje się znieczuleniu ogólnemu za pomocą izofluranu, a fluorescencję in vivo wizualizuje się w komorze obrazowania. Technika ta ma na celu ocenę fluorescencji resztkowej w jamie brzusznej i wychwytu wątrobowego, co sugeruje migrację wrotną sondy fluorescencyjnej. Próbki krwi i kału pobiera się 4 godziny po zgłębniku jamy ustnej, a myszy poświęca się. Próbki osocza i kału rozcieńczone w PBS są następnie platerowane i rejestrowana jest fluorescencja. Stężenie FITC-dekstranu jest następnie obliczane przy użyciu krzywej wzorcowej. W poprzednich badaniach obrazowanie in vivo wykazało, że fluorescencja szybko rozprzestrzenia się do wątroby u myszy ze słabszą barierą jelitową wywołaną dietą ubogą w błonnik, podczas gdy u myszy uzupełnionych błonnikiem w celu wzmocnienia bariery jelitowej sygnał fluorescencyjny jest zatrzymywany głównie w przewodzie pokarmowym. Ponadto w tym badaniu myszy kontrolne miały podwyższoną fluorescencję osocza i zmniejszoną fluorescencję kału, podczas gdy odwrotnie, myszy suplementowane inuliną miały wyższy poziom sygnałów fluorescencyjnych w jelitach i niski poziom w osoczu. Podsumowując, protokół ten zapewnia jakościowe i ilościowe pomiary przepuszczalności jelit jako markera zdrowia jelit.
Wprowadzenie
Bariera jelitowa odgrywa ważną rolę zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Wymaga to złożonej równowagi między umożliwieniem przenikania wymaganych składników odżywczych do krążenia ze światła jelita, a jednocześnie zapobieganiem przenikaniu cząsteczek prozapalnych, takich jak patogeny lub antygeny1. Zwiększona przepuszczalność może być spowodowana wieloma zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi, takimi jak choroby wątroby lub nieswoiste zapalenie jelit (IBD)2,3. Na przykład we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (WZJG), IBD, przewlekły stan zapalny prowadzi do rozpadu połączeń ścisłych, a następnie do przerwania bariery jelitowej i translokacji bakterii, potencjalnie utrwalając zapalenie błony śluzowej i ogólnoustrojowe4.
Integralność bariery jelitowej jest zatem ważnym wskaźnikiem zdrowia jelit. Obecne metody pomiaru przepuszczalności jelit mają jednak wiele ograniczeń. Na przykład metody mierzące markery stanu zapalnego osocza lub translokację bakteryjną do śledziony i węzłów chłonnych są pośrednie5,6. Inne metody mogą być inwazyjne i czasochłonne. W tym artykule opisano nieinwazyjny i opłacalny test, który bezpośrednio i ilościowo mierzy przepuszczalność jelit. Test ten wykorzystuje dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC) do śledzenia przepuszczalności jelit w czasie rzeczywistym poprzez pomiar fluorescencji in vivo. Ponadto pomiar poziomu dekstranu FITC-dekstranu w osoczu i kale określa ilościowo przepuszczalność jelit (Rysunek 1).
Test przepuszczalności FITC-dekstranu był wcześniej używany w wielu różnych kontekstach, w tym w modelach zwierzęcych choroby Parkinsona7, sepsa8, udar niedokrwienny9, oraz oparzenie10. Ponadto test ten został ostatnio wykorzystany do zrozumienia, w jaki sposób mikrobiom jelitowy może być zaangażowany w różne procesy chorobowe i jak może być ukierunkowany lub manipulowany jako potencjalna terapia. Na przykład został wykorzystany do badania mikrobiomu i terapii opartych na mikrobiomie w aging11, IBDs12, rak jelita grubego13 i zaburzenie ze spektrum autyzmu11. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest związana z wieloma aspektami zdrowia i choroby, test ten jest szeroko stosowany. Jego względna prostota i niewielkie obciążenie czasowe sprawiają, że idealnie nadaje się do testowania warunków in vivo, co do których podejrzewa się, że zmieniają integralność bariery jelitowej. Jego wyniki ilościowe są przydatne do określenia skuteczności potencjalnego leczenia.
W tym badaniu, wpływ diety na funkcję bariery jelitowej został oceniony za pomocą testu FITC-dekstran. Porównano przepuszczalność jelit myszy otrzymujących dietę kontrolną i przepuszczalność jelitową myszy otrzymujących dietę uzupełnianą inuliną. Inulina jest korzystnym oligosacharydem, który, jak wykazano, poprawia funkcję bariery jelitowej12,13. Do pomiarów fluorescencji in vivo (tło) jako kontrolę ujemną wykorzystano jedną dodatkową nieleczoną mysz, która otrzymała PBS zamiast dekstranu FITC. Eksperyment ten pokazuje, że test FITC-dekstran jest cennym narzędziem do oceny przepuszczalności jelit.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council on Animal Care) po uzyskaniu zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami w CRCHUM. Ośmiotygodniowe samice myszy BALB/c, pozyskane z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów), zostały wykorzystane w niniejszym badaniu. Zwierzęta otrzymywały suplementację dietetyczną w postaci 10% inuliny (masowych). Grupa kontrolna otrzymywała analogiczną dietę pozbawioną dodatku inuliny. Myszy miały ad libitum dostęp do diety. Przegląd analizy przedstawiono w Rysunek 1.
Rycina 1Schemat testu z użyciem FITC-dekstranu. T−4- Na 4 h przed zgastrykowaniem ograniczono dostęp do pokarmu. T0- Podano FITC-dekstran poprzez podanie doustne przez zgłębnik. T1 - 1 h po podaniu doustnym, in vivo oceniono fluorescencję. T4– 4 h po podaniu doustnym (gavage) pobrano próbki kału i osocza, a następnie zmierzono fluorescencję. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
1. Podanie FITC-dekstranu
- Przed podaniem FITC-dekstranu poddać myszy 4-godzinnemu postowi, zapewniając im jednocześnie dostęp do wody ad libitum.
UWAGA: Post należy rozpocząć najlepiej na początku cyklu świetlnego (rano). Podczas postu myszy można przenieść do nowej klatki bez ściółki, aby ograniczyć koprofagię. - Przygotować 200 µL 80 mg·mL−1 4 kDa FITC-dekstranu (patrz Tabela materiałów) rozpuszczonego w sterylnym 1x roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS) (na jedną mysz). Próbki należy przygotować bezpośrednio przed podaniem i przechowywać je w ciemności.
- Podać 200 µL zawiesiny FITC-dekstranu każdej myszy drogą zgłębnika przełykowego (via oral gavage), używając sterylnej, zakrzywionej igły do zgłębnika o rozmiarze 38 mm 22 G z końcówką w kształcie kulki lub gruszki (patrz Tabela materiałów). Uruchomić stoper po pierwszym podaniu i odczekać 5-10 min przed podaniem preparatu kolejnej myszy, aby umożliwić pomiary in vivo (krok 2), zachowując zawsze 1 h odstępu po podaniu. Pozostałą zawiesinę FITC-dekstranu zachować do przygotowania krzywej wzorcowej.
UWAGA: Bezpośrednio po podaniu preparatu można przywrócić dostęp do pokarmu, aby zapewnić formowanie się kału.
2. Pomiar fluorescencji in vivo
- Zanurzyć myszy w narkozie 1 h po zgłębnikowaniu, stosując 2,5% izofluranu lub alternatywny środek znieczulający. Potwierdzić prawidłowe znieczulenie zwierzęcia, uciskając palec u stopy lub ogon i upewniając się, że zwierzę nie reaguje.
- Usunąć sierść z okolic brzucha za pomocą golarki elektrycznej i obficie nałożyć okulistyczną maść nawilżającą na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie umieścić myszy pojedynczo w komorze obrazowania w pozycji grzbietowej.
UWAGA: Należy uwzględnić jedną mysz kontrolną, która otrzyma PBS lub sól fizjologiczną zamiast FITC-dekstranu, aby uwzględnić tło podczas obrazowania in vivo.
- Usunąć sierść z okolic brzucha za pomocą golarki elektrycznej i obficie nałożyć okulistyczną maść nawilżającą na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie umieścić myszy pojedynczo w komorze obrazowania w pozycji grzbietowej.
- Wykonać obrazowanie myszy przy użyciu komory obrazowania fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów). Pozyskać obrazy obszaru brzucha, ustawiając długość fali lasera na 470 nm i rozdzielczość na 2,0 mm.
- Uruchomić urządzenie i oprogramowanie, naciskając i przytrzymując przycisk start. Pozostawić system do rozgrzania.
UWAGA: System może wymagać 20 min lub więcej czasu na rozgrzanie, dlatego urządzenie należy uruchomić wcześniej, aby nie zakłócać obrazowania myszy 1 h po zgłębnikowaniu. - Kliknąć Device status i upewnić się, że wszystkie skonfigurowane urządzenia wyświetlają status „OK” przed kontynuowaniem.
- W razie potrzeby rozgrzać odpowiedni laser, klikając Laser control, a następnie przycisk Laser name wybranego lasera.
- Rozpocząć nowe badanie, klikając New study. Zapisać je w odpowiednim pliku pod wybraną nazwą.
- Kliknąć Study options, następnie wprowadzić Specimen ID oraz wybrać odpowiedni laser i eksperyment.
- Otworzyć komorę obrazowania i umieścić zwierzę w pozycji grzbietowej na płycie skanującej. Unieruchomić kończyny i ogon za pomocą taśmy oraz upewnić się, że nos i pysk ściśle przylegają do rurki znieczulającej, utrzymując stężenie 2,5% izofluranu.
- Dostosować wysokość płyty skanującej tak, aby obszar skanowania znajdował się nieco brzusznie od linii środkowej zwierzęcia. Wyregulować płytę, obracając pokrętło regulacyjne wewnątrz komory obrazowania. Zamknąć i zablokować drzwiczki komory obrazowania.
- Wyznaczyć obszar do zeskanowania za pomocą narzędzia Draw. Uwzględnić pełną szerokość brzucha od poziomu powyżej wątroby aż do odbytu. Kliknąć narzędzie Modify, aby dostosować obszar po jego wyznaczeniu.
- Ustawić rozdzielczość skanowania na 2,0 mm, a następnie kliknąć Next. Po zakończeniu automatycznego ustawiania mocy upewnić się, że parametry są poprawne i w razie potrzeby wprowadzić korekty. Kliknąć Start, aby rozpocząć skanowanie.
- Po zakończeniu skanowania wyjąć zwierzę z komory obrazowania i umieścić je w inkubatorze w celu utrzymania temperatury ciała podczas wybudzania z narkozy.
- Kliknąć Continue study, aby zachować ustawienia, a następnie powtórzyć kroki 2.2.5–2.2.10, aż wszystkie myszy zostaną zeskanowane.
- Nacisnąć i przytrzymać przycisk zasilania przez 3 s, aby wyłączyć komorę obrazowania.
- Uruchomić urządzenie i oprogramowanie, naciskając i przytrzymując przycisk start. Pozostawić system do rozgrzania.
- Ocenić fluorescencję poprzez porównanie fluorescencji brzucha każdego zwierzęcia oraz myszy kontrolnej na obrazach o jednolitej skali, korzystając z oprogramowania powiązanego z użytym systemem obrazowania (patrz Tabela materiałów).
- Otworzyć pliki obrazów, odnajdując je pod wybraną nazwą pliku. Otworzyć jednocześnie wszystkie pliki posiadające zsynchronizowane ustawienia.
- Korzystając z paska narzędzi ustawień obrazu, użyć przycisków Sync image oraz Sync scale, aby zsynchronizować ustawienia obrazów, co umożliwi dokładne porównanie.
- Zapisać obrazy z dostosowanymi skalami.
3. Pomiar fluorescencji w próbkach kału i osocza
- Pobrać od każdej myszy odległość kałową do sterylnej probówki 4 godziny po zgłębnikowaniu. Probówki przechowywać w ciemności na lodzie.
- Zanurzyć myszy w anestezji poprzez dożylne wstrzyknięcie 240 mg/ml pentobarbitalu sodowego (rozcieńczenie 1:100; patrz Tabela materiałów). Podawać w dawce 0,03 ml/g masy ciała.
- Pobrać próbki krwi w ilości co najmniej 700 µL w probówce przeznaczonej do pobierania osocza, zawierającej heparynę lub EDTA w celu zapobiegania krzepnięciu (patrz Tabela materiałów) poprzez wprowadzenie szklanej kapilary do splotu zatokowego*14.
UWAGA: Alternatywne metody pobierania krwi obejmują punkcję serca lub pobranie z żyły ogonowej. Ponieważ jest to procedura terminalna, myszy muszą zostać poddane eutanazji. poprzez zwichnięcie stawów obrótczonych lub alternatywna humanitarna metoda. Należy postępować zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki ds. doświadczeń na zwierzętach w zakresie eutanazji.
- Pobrać próbki krwi w ilości co najmniej 700 µL w probówce przeznaczonej do pobierania osocza, zawierającej heparynę lub EDTA w celu zapobiegania krzepnięciu (patrz Tabela materiałów) poprzez wprowadzenie szklanej kapilary do splotu zatokowego*14.
- Wiruj próbki krwi przy 9390 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Przenieść osocze do nowej sterylnej probówki i przechowywać w ciemności na lodzie.
- Rozcieńczyć 50 mg próbek kału w 200 µL z 1x PBS i rozcieńczyć osocze w stosunku 1:2 za pomocą 1x PBS. Stosunek rozcieńczenia można zmodyfikować w zależności od intensywności sygnału fluorescencyjnego.
- Przygotuj krzywą standardową, wykorzystując rozcieńczenia seryjne dekstranu FITC w 1x PBS. Rozpocznij od najwyższego stężenia wynoszącego 20 mg·ml⁻¹−1 dekstran FITC, rozcieńczyć seryjnie 7–10 razy w stosunku 1:1.
UWAGA: W związku z tym stężenia muszą wynosić 20 mg·mL−1, 10 mg·ml⁻¹−1, 5 mg·ml⁻¹−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·mL−1, 0,3125 mg·ml⁻¹−1itp. - Płytka 100 µL próbki i standardy w nieprzezroczystej czarnej płytce 96-dołkowej. Należy uwzględnić próbę ślepą z PBS. Fluorescencję odczytano za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów) z absorpcją przy 530 nm i wzbudzeniem przy 485 nm.
UWAGA: Próbki i wzorce można nanosić w dwóch lub trzech powtórzeniach, a następnie wyciągnąć średnią z ich wartości fluorescencji. - Wyznacz stężenie FITC-dekstranu w każdej próbce, porównując fluorescencję do znanych stężeń z krzywej standardowej. W przypadku próbek pomnóż stężenie przez czynnik rozcieńczenia (krok 3.5).
Wyniki
Analiza fluorescencji in vivo wykazała, że myszy, które otrzymały jedynie dietę kontrolną, wykazywały wyższe wchłanianie FITC-dekstranu przez wątrobę oraz wyższe poziomy fluorescencji resztkowej w jamie brzusznej w porównaniu do myszy, które otrzymały dietę uzupełnioną inuliną (Rycina 2A). Pewna fluorescencja była widoczna w kątnicy myszy otrzymujących dietę z inuliną, jednak wchłanianie przez wątrobę było znikome lub nieobecne, co wskazuje, że diety te chroniły przed zwiększoną przepuszczalnością jelitową.
Poziomy fluorescencji w próbkach osocza i kału służą do potwierdzenia i ilościowego określenia ich odpowiedników in vivo. Myszy otrzymujące dietę uzupełnioną o inulinę miały znacznie niższe poziomy FITC-dekstranu w osoczu w porównaniu z myszami otrzymującymi jedynie dietę kontrolną (Rysunek 2B). Wskazuje to na poprawę funkcji bariery jelitowej, ponieważ mniejsza ilość FITC-dekstranu przenikała przez barierę jelitową do krwiobiegu. Zgodnie z tym, myszy otrzymujące dietę z inuliną miały znacznie wyższe poziomy FITC-dekstranu w kałach niż myszy otrzymujące jedynie dietę kontrolną (Rysunek 2C). Potwierdza to zachowanie nienaruszonej funkcji bariery jelitowej, gdyż FITC-dekstran pozostał w okrężnicy aż do momentu wydalenia, co uznaje się za stan prawidłowy. Niższe poziomy FITC-dekstranu w kałach myszy kontrolnych wskazują, że przenikał on przez barierę jelitową do krwiobiegu, zamiast zostać prawidłowo wydalony. Wysokie poziomy FITC-dekstranu w osoczu potwierdzają ten wynik.
Rysunek 2: Suplementacja inuliną w diecie zmniejsza translokację FITC-dekstranu przez barierę jelitową. (A) Pozostała fluorescencja i wątrobowe wychwytywanie FITC-dekstranu. Czerwony = najwyższa intensywność; ciemnofioletowy = najniższa intensywność. Maksymalna fluorescencja 2,15 x 103, minimalna fluorescencja 0,378. (B) Stężenie FITC-dekstranu w osoczu. P = 0,010. (C) Stężenie FITC-dekstranu w kałach. P = 0,00003. N = 4 na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Każda kropka reprezentuje jedną mysz. Nieparzysty test t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Funkcja bariery jelitowej jest integralną częścią wielu różnych procesów chorobowych. W związku z tym ocena przepuszczalności jelit w sposób nieinwazyjny, opłacalny i wymierny jest niezbędna do dokładnego odwzorowania tych chorób w modelach zwierzęcych. Test FITC-dekstran daje możliwość takiej reprezentacji. Jednak protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać dokładnie, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Po pierwsze, niezbędne jest zapewnienie stosowania dekstranu FITC-dextran o odpowiedniej wielkości. Do badania przepuszczalności in vivo optymalna masa cząsteczkowa wynosi 4 kDa FITC-dekstran, a wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej przepuszczalność maleje15. W związku z tym stosowanie dekstranu FITC o innej masie cząsteczkowej może dostarczyć mylących lub niewiarygodnych wyników. Ponadto ważne jest, aby zanotować czas każdego zgłębnika i odpowiednio dostosować punkty czasowe dla zbierania danych in vivo oraz pobierania osocza i kału. Na przykład, jeśli dwie myszy są poddawane do siebie w odstępie 10 minut, odczyty fluorescencji in vivo oraz zbieranie kału i osocza również muszą nastąpić w odstępie 10 minut. Porównanie fluorescencji w tych samych punktach czasowych pozwala na dokładniejsze odwzorowanie różnic w przepuszczalności. Ponadto kolejność, w jakiej badane są zwierzęta z różnych grup, powinna być zmieniana, aby zapobiec efektowi grupowania spowodowanemu czasem. Zamiast badać najpierw wszystkie zwierzęta z grupy A, a następnie wszystkie zwierzęta z grupy B jako drugie (AAABBB), zaleca się, aby grupa została zamieniona po każdym zwierzęciu (ABABAB).
Test ten można zmodyfikować tak, aby obejmował tylko ocenę próbek osocza i kału w przypadku braku dostępu do maszyny do obrazowania. Chociaż bezpośrednie obrazowanie fluorescencyjne in vivo pozwala na wizualizację poboru wątroby i resztkowej fluorescencji jamy brzusznej, ocena fluorescencji w próbkach osocza i kału nadal zapewnia ilościowy pomiar przepuszczalności jelit. Ponadto, jak wykazano w opisanym eksperymencie, poziomy fluorescencji w osoczu i kale dobrze korelują z obrazowaniem in vivo . Dodatkowo test ten można zmodyfikować tak, aby obejmował tylko obrazowanie in vivo . Dzięki temu zwierzęta mogą być utrzymywane przy życiu, aby kontynuować testowanie innych parametrów lub monitorować, jak zmienia się przepuszczalność jelit w czasie. Możliwość modyfikacji tego testu sprawia zatem, że jest on dostępny, ale nadal ilościowy. Wreszcie, dawka 200 μl 80 mg·mL-1 FITC-dekstranu podawana każdej myszy była stosowana wcześniej i wykazano, że jest skuteczna u myszy z niewielkimi różnicami w masie ciała16. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie myszy użyte w sekcji wyników reprezentatywnych ważyły około 20 g, co pozwala na zastosowanie tej samej dawki dla każdej myszy. Aby jednak uwzględnić różnice w masie ciała, FITC-dekstran może być podawany w dawce 0,6-0,8 mg/g masy ciała, na przykład17. Co istotne, niezależnie od zastosowanej dawki, ważne jest, aby ograniczyć ilość podawaną każdej myszy do mniej niż 10 ml·kg−1 , aby zapobiec powikłaniom lub dyskomfortowi18.
Chociaż test FITC-dekstran stanowi skuteczną metodę oceny funkcji bariery jelitowej, nadal ma pewne ograniczenia. Jednym z ograniczeń tego modelu jest to, że wymaga on poszczenia myszy przez kilka godzin, co oznacza, że porównywanie tych wyników z tymi od myszy, które nie były na czczo, jest niewiarygodne. Ponadto post może wpływać na wyniki w niektórych modelach, które wymagają ścisłych harmonogramów karmienia, na przykład podczas pomiaru poziomu glukozy we krwi w modelach zwierzęcych dla cukrzycy.
Pomimo tych ograniczeń test FITC-dekstran pozostaje skuteczną metodą analizy przepuszczalności jelit, ponieważ jest ilościowy, wszechstronny, opłacalny i mniej inwazyjny niż wiele klasycznych metod. Na przykład powszechnymi sondami stosowanymi do pomiaru przepuszczalności jelit są małe sondy sacharydowe lub Cr-EDTA, które mają pewne zalety19. Jednak niektóre sondy sacharydowe mają przepuszczalność specyficzną tylko dla regionu. Ponieważ są one hydrolizowane w dystalnej części jelita cienkiego, nie dają wglądu w przepuszczalność okrężnicy19. Z drugiej strony, Cr-EDTA może dostarczyć informacji o przepuszczalności okrężnicy, ale wymaga pomiarów przez 24 godziny, co sprawia, że obciążenie czasowe tej metody jest znacznie wyższe niż w przypadku testu FITC-dekstran20. Co więcej, żadna z tych metod nie zapewnia bezpośredniego obrazowania in vivo tego testu. W związku z tym test FITC-dekstran stanowi stosunkowo prostą, bezpośrednią i skuteczną opcję w porównaniu z alternatywnymi metodami pomiaru przepuszczalności jelit.
Wreszcie, w procesach chorobowych, takich jak IBD4, choroba Alzheimera21 i choroba wątroby2, przepuszczalność jelit jest ważnym parametrem, który można zmierzyć za pomocą testu FITC-dekstran w celu ulepszenia badań. Na przykład przy opracowywaniu nowych metod leczenia, takich jak immunoterapie IBD, test ten można wykorzystać do zbadania skuteczności środka terapeutycznego w utrzymaniu integralności bariery jelitowej. Biorąc pod uwagę, że upośledzona funkcja bariery jelitowej może być zaangażowana w utrwalanie przewlekłego stanu zapalnego w WZJG, ważne jest zbadanie, jak dobrze terapia chroni przed zwiększoną przepuszczalnością4. To tylko jeden z przykładów, ale test FITC-dekstran jest dostępnym i wymiernym sposobem pomiaru przepuszczalności jelit w wielu różnych obszarach i aspektach badań.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie posiadają żadnych ujawnień.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant RGPIN-2018-06442 dla MMS). Dziękujemy zwierzętom w CRCHUM i dr Junzheng Peng z Platformy Fenotypowania Sercowo-Naczyniowego.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dieta 50 ppm Fe (10% inuliny) | Envigo Teklad | TD.190651 | Reprezentatywne wyniki |
| Dieta 50 ppm Fe (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Reprezentatywne wyniki |
| BALB/c Myszy 49-55 dni, samica | Charles River | 028BALB/C | Reprezentatywne wyniki |
| BD 1 mL Strzykawka tuberkulinowa z końcówką | ślizgową Becton, Dickinson and Company | 309659 | głębnika |
| BD Microtainer - z LH (heparyną litową) Becton | , Dickinson and Company | 365965 | Do pobierania osocza |
| Wirówka 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Zakrzywiona igła do zgłębnika (kaniula zgłębnika) 7,7,0 38 mm x 22 g | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | Już niedostępny - Potencjalna alternatywa jest dostępna w Instech Labs (FTP-22-38) |
| Eutanyl (pentobarbital sodowy) 240 mg/ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | rozcieńczenie 1/100; Podawany we wstrzyknięciu dootrzewnowym w stężeniu 0,03 ml/g masy ciała |
| FITC-dekstran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparynizowane rurki kapilarne | Kimble Chase Nauki przyrodnicze i badania | 2501 | Do pobierania krwi za oczodołem |
| Mikropłytka, PS, 96-dołkowa, płaskodenna (studzienka kominowa),, Flutrac, Med. Wiązanie | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | Do usuwania włosów |
| Optix MX2 i Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Maszyna do obrazowania fluorescencyjnego i oprogramowanie |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) | Żubel Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Maść weterynaryjna | Dechra | 12920060 | Maść okulistyczna zapobiegająca uszkodzeniom oczu podczas znieczulenia |
| Iskra Czytnik płytek | Tecan | 30086376 |
Bibliografia
- König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
- Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
- Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
- Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
- Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
- Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
- Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease. PLoS One. 14 (10), 0223238(2019).
- Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
- Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
- Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996(2015).
- Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
- Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
- Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
- JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
- Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B. Alterations in intestinal permeability. Gut. 55 (10), 1512-1520 (2006).
- von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973(2019).
- Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).
Przedruki i uprawnienia
