Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64718

⸱

10 lutego 2023

 , 
1Lester & Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

Streszczenie

Mysie gruczoły sutkowe składają się z drzew przewodowych, które są wyściełane komórkami nabłonkowymi i mają jeden otwór na końcu każdego sutka. Komórki nabłonkowe odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu gruczołu sutkowego i są źródłem większości nowotworów sutka. Wprowadzenie interesujących genów do komórek nabłonka sutka myszy jest kluczowym krokiem w ocenie funkcji genów w komórkach nabłonkowych i generowaniu mysich modeli guza sutka. Cel ten można osiągnąć poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie wektora wirusowego przenoszącego interesujące geny do mysiego drzewa przewodowego sutka. Wstrzyknięty wirus infekuje następnie komórki nabłonka sutka, wprowadzając interesujące geny. Wektor wirusowy może być lentiwirusowy, retrowirusowy, adenowirusowy lub wirusowy związany z adenowirusem (AAV). Badanie to pokazuje, w jaki sposób interesujący nas gen jest dostarczany do komórek nabłonka sutka poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie wektora wirusowego do sutka mysiego. Lentiwirus przenoszący GFP jest używany do wykazania stabilnej ekspresji dostarczonego genu, a retrowirus przenoszący Erbb2 (HER2 / Neu) jest używany do wykazania infekcjonowanych onkogenem atypowych zmian hiperplastycznych i guzów sutka.

Wprowadzenie

Komórki nabłonkowe gruczołów sutkowych odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu tych gruczołów i są główną komórką pochodzenia raka piersi. Badania nad biologią gruczołu sutkowego i nowotworzeniem często wymagają dostarczenia genów będących przedmiotem zainteresowania do tych komórek. Każdy gruczoł sutkowy myszy składa się z drzewa przewodowego wyściełanego komórkami nabłonkowymi z pojedynczym otworem na końcu brodawki. Taka struktura sprawia, że komórki nabłonka sutka są łatwo dostępne dla wektorów wirusowych, które mogą być dostarczane do światła drzewa przewodowego poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe1.

Technika iniekcji doprzewodowej sutka była pierwotnie stosowana dla znacznie większych zwierząt, takich jak kozy, króliki i szczury1. W przypadku znacznie mniejszych zwierząt, takich jak myszy, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe wymaga wielu delikatnych narzędzi i większej liczby ćwiczeń operatorów. Istnieją dwa podejścia do wstrzykiwania doprzewodowego u myszy. Jednym z nich jest wstrzyknięcie strzyka1. Innym jest bezpośrednie wstrzyknięcie do przewodu pierwotnego gruczołu sutkowego #3 lub #4 po ekspozycji chirurgicznej1. Ponieważ pierwsza z nich jest nieinwazyjna i szybsza, gdy operator jest dobrze przeszkolony, technika ta jest częściej stosowana i zostanie szczegółowo opisana w tym artykule.

W porównaniu do powszechnie stosowanych tradycyjnych transgenicznych modeli myszy, w których interesujący nas gen jest wprowadzany na etapie zapłodnienia jaj poprzez mikroiniekcję2,3,4, dostarczanie genów metodą wewnątrzprzewodowej iniekcji wirusa ma wiele zalet, w tym: (1) pozwala uniknąć czasochłonnego procesu tworzenia transgenicznej linii myszy dla każdego interesującego genu; (2) pozwala uniknąć potencjalnego upośledzenia normalnego rozwoju gruczołów mlecznych narzuconego przez gen będący przedmiotem zainteresowania; (3) wprowadza interesujący nas gen w dowolnym momencie po urodzeniu; (4) może z łatwością współwprowadzać więcej niż jeden gen będący przedmiotem zainteresowania; (5) lepiej naśladuje naturalny proces rakotwórczy, ponieważ zakażone, a tym samym przenoszące onkogeny komórki, są otoczone przez normalne komórki; oraz (6) w połączeniu z technologią TVA (wirus nowotworowy A, białko powierzchniowe komórek ptasich i receptor dla wektora RCAS retrowirusa)5, gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać wprowadzony do określonej populacji komórek w celu zbadania pochodzenia komórek nowotworowych i przeprowadzenia testów śledzenia linii komórkowych w gruczołach sutkowych6,7,8, 9.

Dowolne wektory pochodzące z retrowirusa10, lentivirus11,12, adenovirus13, oraz wirus związany z adenowirusem (AAV)14 mogą być używane do wewnątrzprzewodowego dostarczania materiałów genetycznych. Wektory retrowirusowe i lentiwirusowe trwale integrują się z genomem gospodarza; W ten sposób stabilnie wprowadzają interesujące geny do komórek nabłonka sutka. Podczas gdy lentiwirus może zintegrować się z genomem każdej napotkanej komórki15, efektywna integracja genomowa retrowirusa wymaga proliferacji komórek docelowych16. Wektory adenowirusowe i AAV nie integrują się z genomem zakażonych komórek, a zatem tylko przejściowo wyrażają gen będący przedmiotem zainteresowania17,18. Ta cecha może być zaletą, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania musi być wyrażany tylko przez krótki czas, taki jak Cre, w celu usunięcia genu supresorowego z floksem.

Lentiwirus, adenowirus i AAV infekują wszelkie napotkane komórki myszy. Ale ponieważ nabłonek światła jest w dużej mierze izolowany od leżącej poniżej warstwy podstawnej, która jest dodatkowo oddzielona od zrębu błoną podstawną, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe ogranicza infekcję głównie do komórek nabłonka światła, głównej komórki pochodzenia raka piersi. W tej warstwie nabłonka świetlnego istnieją również odrębne podtypy komórek, w tym komórki macierzyste, komórki progenitorowe i kilka grup komórek zróżnicowanych. Do infekowania określonych podzbiorów komórek w populacji komórek luminalnych można zastosować technologię TVA, za pomocą której wektory RCAS pochodzące z wirusa ptasiej białaczki5,10 lub pseudotypowane wektory lentiwirusowe11 selektywnie infekują komórki wyrażające TVA u myszy, które są nosicielami transgenu TVA pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki, takiego jak promotor, który jest aktywny tylko w komórkach macierzystych6 lub niektóre komórki progenitorowe6,7 lub komórki pęcherzykowe 8 lub aktywne komórki szlaku Wnt9.

Ten protokół przedstawia technikę wprowadzania interesujących genów do komórek nabłonka sutka poprzez doprzewodową iniekcję wektora wirusowego. Następnie demonstruje się wykrywanie ekspresji wprowadzonych genów i wynikających z nich zmian hiperplastycznych i nowotworów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z użyciem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee protokołem dla zwierząt. W niniejszym badaniu wykorzystano 9-12-tygodniowe samice myszy FVB/N lub MMTV-tva. Myszy zostały pozyskane komercyjnie lub samodzielnie wykonane (patrz tabela materiałów). Wykorzystano wirusy Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu). Przygotowanie wirusa i określenie miana przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami10,12.

1. Przygotowanie strzykawki

  1. Przytnij metalowe igły piasty 33 G (patrz Tabela materiałów) na około 1 cm długości. Po autoklawowaniu należy przechowywać igły i strzykawkę o pojemności 50 μl w 70% alkoholu.
  2. Wyjmij strzykawki i igły z alkoholu. Wypchnąć pozostały alkohol ze strzykawki i igły. Zdemontować strzykawkę w celu wysuszenia na powietrzu na autoklawowanej chłonnej podkładce stołowej.
  3. Zmontować strzykawkę po wyschnięciu.

2. Przygotowanie wirusa

  1. W razie potrzeby wyjąć jedną lub kilka probówek z wirusem z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić wirusa na lodzie.
    UWAGA: W zależności od liczby komórek, które mają zostać zainfekowane, wirus może wymagać rozcieńczenia do zamierzonych mian przy użyciu 1x PBS w tym czasie.
  2. Dodać błękit bromofenolowy, zanurzając końcówkę pipety na głębokość 1 cm w proszku błękitu bromofenolowego (patrz tabela materiałów). Następnie wprowadzić dołączoną śladową ilość błękitu bromofenolowego do zawiesiny wirusa.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zapas wirusa wynosi zwykle 200 μl na probówkę, więc końcowe stężenie barwnika wynosi około 0,2% (0,2 μg/100 μL). Błękit bromofenolowy należy sterylizować promieniowaniem mikrofalowym przez 45 sekund przy dużej mocy 1250 W (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że cała procedura odbywa się w sterylnym środowisku.
  3. Zmieszać błękit bromofenolowy z roztworem wirusa, pipetując 10 razy w górę i w dół.
  4. Umieść wirusa na lodzie i przynieś wiaderko z lodem do wiwarium.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulić samicę myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny, patrz tabela materiałów). Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Mysz nie może reagować na szczypanie palców u nóg w dobrym znieczuleniu. Izofluran może być również stosowany do znieczulania myszy.
  2. Połóż mysz w pozycji leżącej na ciepłej podkładce i przymocuj wszystkie cztery kończyny do ławki za pomocą taśmy klejącej.
  3. Zidentyfikuj jeden sutek (lub więcej) do wstrzyknięcia (w niniejszym badaniu preferowany jest numer 4). Odsłoń go, przycinając otaczające włosy za pomocą nożyczek.
  4. Nałóż 70% waciki nasączone alkoholem i jodoforem na obszar sutka w trzech rundach, aby oczyścić i odsłonić sutek.

4. Wewnętrzna iniekcja wirusa

UWAGA: Lampa powiększająca może być użyta do wizualizacji otworu sutkowego.

  1. Przeciąć dystalną końcówkę brodawki sutkowej za pomocą sterylnych nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji, aż pod lampą powiększającą będzie widoczny mały centralny otwór kanałowy (patrz tabela materiałów).
  2. Do strzykawki wsypać 10 μl mieszaniny wirusa/błękitu bromofenolowego.
    UWAGA: W tej demonstracji używane są Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu).
  3. Ostrożnie włóż igłę do otworu sutka za pomocą lampy powiększającej. Orientacja igły jest nieznacznie regulowana od przyśrodkowej do bocznej, aby wyrównać się z głównym kanałem.
  4. Wstrzyknąć całe 10 μl wirusa do drzewa kanałowego.
    UWAGA: Kanaliki pod skórą powinny zmienić kolor na niebieski, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie. Wszelki opór lub pojawienie się miejscowej zmiany koloru wskazuje na niepowodzenie iniekcji.
  5. Umieść mysz na podgrzewaczu do slajdów ustawionym na 45 °C, aż mysz całkowicie się wybudzi (~30-60 min).

5. Wykrywanie zainfekowanych komórek za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego

  1. Trzy do pięciu dni po wstrzyknięciu wirusa przenoszącego GFP lub inne geny fluorescencyjne należy poddać mysz eutanazji poprzez nadmierne dawkowanie 4 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny).
  2. Otwórz klatkę piersiową. Przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej oraz wzdłuż kończyn górnych i dolnych za pomocą nożyczek. Podnieś skórę i odsłoń gruczoły sutkowe.
  3. Usunąć wstrzyknięty gruczoł sutkowy ze skóry za pomocą kleszczy i nożyczek. Należy również usunąć niewstrzyknięty gruczoł jako kontrolę.
  4. Umieść gruczoły sutkowe na szklanych szkiełkach i rozprowadź gruczoły do ich pierwotnego kształtu.
  5. Obserwuj i obrazuj gruczoły pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne dane, aby zademonstrować pomyślne wstrzyknięcie dokanałowe, skuteczną infekcję wirusową oraz wpływ dostarczonych genów na tumorigenezę gruczołów mlekowych. Ilość wstrzykiwanego wirusa musi być dostosowana do celu każdego eksperymentu. Aby zilustrować, jak szeroki obszar drzewa przewodowego gruczołu mlekowego można zainfekować, należy użyć dużej ilości wirusa niosącego geny umożliwiające obrazowanie, takie jak GFP. Z drugiej strony, aby naśladować naturalną spontaniczną tumorige...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono technikę iniekcji doprzewodowej wirusa w celu wprowadzenia genów do komórek nabłonka sutka myszy w celu modelowania sporadycznego raka piersi. Zwykle wstrzykuje się myszom w wieku co najmniej 5 tygodni lub starszym, aby proces onkogenny rozpoczął się po rozwinięciu gruczołu sutkowego. Poza tym otwór sutkowy u myszy w wieku poniżej 5 tygodni jest często zbyt mały do wstrzyknięcia. Z drugiej strony, sutki bardzo starych myszy są czasami zdegenerowane, a przecięcie może nie ujawnić otworu przewodowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Obaj autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Gary'emu Chamnessowi za jego pomocne komentarze na temat tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Departament Obrony (DOD), CDMRP BC191649 (YL) i BC191646 (YL), a także National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Autorzy chcieliby podziękować Breast Center Pathology Core Facility wspieranemu przez SPORE P50CA186784 oraz Cytometry and Cell Sorting Core wspieranemu przez CPRIT-RP180672, NIH CA125123 i RR024574 z pomocą Joela M. Sederstroma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-HACovanceMMS-101PRozcieńczenie: 1 : 1000
Sztuczne łzyCovetrusNDC 11695-0832-1
Błękit bromofenolowySigmaB5525promieniowanie mikrofalowe przez 45 sekund przy wysokiej mocy 1250 W kuchenka mikrofalowa
FACSCantoIIBD BiosciencesV96100899
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaMZ16 FA
FUCGW lenti-virusWłasnoręcznie wykonanaN/AZobacz odniesienie # 12
FVB/NThe Jackson LaboratoryJAX:001800
Igła HamiltonaHamilton91033autoklawizowana
strzykawka Hamilton201000autoklawizowana
lampa powiększająca LEDIntertek3165273
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacjiRobozRS-5621autoklawizowany
MMTV-tvaWłasnej produkcjiZobacz referencje # 10
RCAS-Neu (HA)Samodzielnie wykonanyNie dotyczyZobacz odniesienie # 10
Gryzonie Comboanesthetic IIIApteka weterynaryjnaRecepta weterynaryjna37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny

Bibliografia

  1. Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720(2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115(2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996(2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Iniekcja wektora wirusowegotransfer genów lentiwirusowychtransfer genów retrowirusowychmodel guza piersimikroskopia fluorescencyjnacytometria przepływowazawiesina pojedynczych komórek
In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.