In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Komórki nabłonkowe gruczołów sutkowych odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu tych gruczołów i są główną komórką pochodzenia raka piersi. Badania nad biologią gruczołu sutkowego i nowotworzeniem często wymagają dostarczenia genów będących przedmiotem zainteresowania do tych komórek. Każdy gruczoł sutkowy myszy składa się z drzewa przewodowego wyściełanego komórkami nabłonkowymi z pojedynczym otworem na końcu brodawki. Taka struktura sprawia, że komórki nabłonka sutka są łatwo dostępne dla wektorów wirusowych, które mogą być dostarczane do światła drzewa przewodowego poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe¹.

Technika iniekcji doprzewodowej sutka była pierwotnie stosowana dla znacznie większych zwierząt, takich jak kozy, króliki i szczury¹. W przypadku znacznie mniejszych zwierząt, takich jak myszy, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe wymaga wielu delikatnych narzędzi i większej liczby ćwiczeń operatorów. Istnieją dwa podejścia do wstrzykiwania doprzewodowego u myszy. Jednym z nich jest wstrzyknięcie strzyka¹. Innym jest bezpośrednie wstrzyknięcie do przewodu pierwotnego gruczołu sutkowego #3 lub #4 po ekspozycji chirurgicznej¹. Ponieważ pierwsza z nich jest nieinwazyjna i szybsza, gdy operator jest dobrze przeszkolony, technika ta jest częściej stosowana i zostanie szczegółowo opisana w tym artykule.

W porównaniu do powszechnie stosowanych tradycyjnych transgenicznych modeli myszy, w których interesujący nas gen jest wprowadzany na etapie zapłodnienia jaj poprzez mikroiniekcję^2,3,4, dostarczanie genów metodą wewnątrzprzewodowej iniekcji wirusa ma wiele zalet, w tym: (1) pozwala uniknąć czasochłonnego procesu tworzenia transgenicznej linii myszy dla każdego interesującego genu; (2) pozwala uniknąć potencjalnego upośledzenia normalnego rozwoju gruczołów mlecznych narzuconego przez gen będący przedmiotem zainteresowania; (3) wprowadza interesujący nas gen w dowolnym momencie po urodzeniu; (4) może z łatwością współwprowadzać więcej niż jeden gen będący przedmiotem zainteresowania; (5) lepiej naśladuje naturalny proces rakotwórczy, ponieważ zakażone, a tym samym przenoszące onkogeny komórki, są otoczone przez normalne komórki; oraz (6) w połączeniu z technologią TVA (wirus nowotworowy A, białko powierzchniowe komórek ptasich i receptor dla wektora RCAS retrowirusa)⁵, gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać wprowadzony do określonej populacji komórek w celu zbadania pochodzenia komórek nowotworowych i przeprowadzenia testów śledzenia linii komórkowych w gruczołach sutkowych^{6,7,8, 9}.

Dowolne wektory pochodzące z retrowirusa¹⁰, lentivirus^11,12, adenovirus¹³, oraz wirus związany z adenowirusem (AAV)¹⁴ mogą być używane do wewnątrzprzewodowego dostarczania materiałów genetycznych. Wektory retrowirusowe i lentiwirusowe trwale integrują się z genomem gospodarza; W ten sposób stabilnie wprowadzają interesujące geny do komórek nabłonka sutka. Podczas gdy lentiwirus może zintegrować się z genomem każdej napotkanej komórki¹⁵, efektywna integracja genomowa retrowirusa wymaga proliferacji komórek docelowych¹⁶. Wektory adenowirusowe i AAV nie integrują się z genomem zakażonych komórek, a zatem tylko przejściowo wyrażają gen będący przedmiotem zainteresowania^17,18. Ta cecha może być zaletą, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania musi być wyrażany tylko przez krótki czas, taki jak Cre, w celu usunięcia genu supresorowego z floksem.

Lentiwirus, adenowirus i AAV infekują wszelkie napotkane komórki myszy. Ale ponieważ nabłonek światła jest w dużej mierze izolowany od leżącej poniżej warstwy podstawnej, która jest dodatkowo oddzielona od zrębu błoną podstawną, wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe ogranicza infekcję głównie do komórek nabłonka światła, głównej komórki pochodzenia raka piersi. W tej warstwie nabłonka świetlnego istnieją również odrębne podtypy komórek, w tym komórki macierzyste, komórki progenitorowe i kilka grup komórek zróżnicowanych. Do infekowania określonych podzbiorów komórek w populacji komórek luminalnych można zastosować technologię TVA, za pomocą której wektory RCAS pochodzące z wirusa ptasiej białaczki^5,10 lub pseudotypowane wektory lentiwirusowe¹¹ selektywnie infekują komórki wyrażające TVA u myszy, które są nosicielami transgenu TVA pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki, takiego jak promotor, który jest aktywny tylko w komórkach macierzystych⁶ lub niektóre komórki progenitorowe^6,7 lub komórki pęcherzykowe ⁸ lub aktywne komórki szlaku Wnt⁹.

Ten protokół przedstawia technikę wprowadzania interesujących genów do komórek nabłonka sutka poprzez doprzewodową iniekcję wektora wirusowego. Następnie demonstruje się wykrywanie ekspresji wprowadzonych genów i wynikających z nich zmian hiperplastycznych i nowotworów.

Wszystkie procedury z użyciem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee protokołem dla zwierząt. W niniejszym badaniu wykorzystano 9-12-tygodniowe samice myszy FVB/N lub MMTV-tva. Myszy zostały pozyskane komercyjnie lub samodzielnie wykonane (patrz tabela materiałów). Wykorzystano wirusy Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu). Przygotowanie wirusa i określenie miana przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami^10,12.

1. Przygotowanie strzykawki

1. Przytnij metalowe igły piasty 33 G (patrz Tabela materiałów) na około 1 cm długości. Po autoklawowaniu należy przechowywać igły i strzykawkę o pojemności 50 μl w 70% alkoholu.
2. Wyjmij strzykawki i igły z alkoholu. Wypchnąć pozostały alkohol ze strzykawki i igły. Zdemontować strzykawkę w celu wysuszenia na powietrzu na autoklawowanej chłonnej podkładce stołowej.
3. Zmontować strzykawkę po wyschnięciu.

2. Przygotowanie wirusa

1. W razie potrzeby wyjąć jedną lub kilka probówek z wirusem z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić wirusa na lodzie.
   UWAGA: W zależności od liczby komórek, które mają zostać zainfekowane, wirus może wymagać rozcieńczenia do zamierzonych mian przy użyciu 1x PBS w tym czasie.
2. Dodać błękit bromofenolowy, zanurzając końcówkę pipety na głębokość 1 cm w proszku błękitu bromofenolowego (patrz tabela materiałów). Następnie wprowadzić dołączoną śladową ilość błękitu bromofenolowego do zawiesiny wirusa.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zapas wirusa wynosi zwykle 200 μl na probówkę, więc końcowe stężenie barwnika wynosi około 0,2% (0,2 μg/100 μL). Błękit bromofenolowy należy sterylizować promieniowaniem mikrofalowym przez 45 sekund przy dużej mocy 1250 W (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że cała procedura odbywa się w sterylnym środowisku.
3. Zmieszać błękit bromofenolowy z roztworem wirusa, pipetując 10 razy w górę i w dół.
4. Umieść wirusa na lodzie i przynieś wiaderko z lodem do wiwarium.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Znieczulić samicę myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny, patrz tabela materiałów). Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
   UWAGA: Mysz nie może reagować na szczypanie palców u nóg w dobrym znieczuleniu. Izofluran może być również stosowany do znieczulania myszy.
2. Połóż mysz w pozycji leżącej na ciepłej podkładce i przymocuj wszystkie cztery kończyny do ławki za pomocą taśmy klejącej.
3. Zidentyfikuj jeden sutek (lub więcej) do wstrzyknięcia (w niniejszym badaniu preferowany jest numer 4). Odsłoń go, przycinając otaczające włosy za pomocą nożyczek.
4. Nałóż 70% waciki nasączone alkoholem i jodoforem na obszar sutka w trzech rundach, aby oczyścić i odsłonić sutek.

4. Wewnętrzna iniekcja wirusa

UWAGA: Lampa powiększająca może być użyta do wizualizacji otworu sutkowego.

1. Przeciąć dystalną końcówkę brodawki sutkowej za pomocą sterylnych nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji, aż pod lampą powiększającą będzie widoczny mały centralny otwór kanałowy (patrz tabela materiałów).
2. Do strzykawki wsypać 10 μl mieszaniny wirusa/błękitu bromofenolowego.
   UWAGA: W tej demonstracji używane są Lenti-EGFP (FUCGW) i RCAS-Erbb2 (Neu).
3. Ostrożnie włóż igłę do otworu sutka za pomocą lampy powiększającej. Orientacja igły jest nieznacznie regulowana od przyśrodkowej do bocznej, aby wyrównać się z głównym kanałem.
4. Wstrzyknąć całe 10 μl wirusa do drzewa kanałowego.
   UWAGA: Kanaliki pod skórą powinny zmienić kolor na niebieski, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie. Wszelki opór lub pojawienie się miejscowej zmiany koloru wskazuje na niepowodzenie iniekcji.
5. Umieść mysz na podgrzewaczu do slajdów ustawionym na 45 °C, aż mysz całkowicie się wybudzi (~30-60 min).

5. Wykrywanie zainfekowanych komórek za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego

1. Trzy do pięciu dni po wstrzyknięciu wirusa przenoszącego GFP lub inne geny fluorescencyjne należy poddać mysz eutanazji poprzez nadmierne dawkowanie 4 μl/g środka znieczulającego (37,6 mg/ml ketaminy, 1,92 mg/ml ksylazyny i 0,38 mg/ml acepromazyny).
2. Otwórz klatkę piersiową. Przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej oraz wzdłuż kończyn górnych i dolnych za pomocą nożyczek. Podnieś skórę i odsłoń gruczoły sutkowe.
3. Usunąć wstrzyknięty gruczoł sutkowy ze skóry za pomocą kleszczy i nożyczek. Należy również usunąć niewstrzyknięty gruczoł jako kontrolę.
4. Umieść gruczoły sutkowe na szklanych szkiełkach i rozprowadź gruczoły do ich pierwotnego kształtu.
5. Obserwuj i obrazuj gruczoły pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.

Reprezentatywne dane są tutaj przedstawione, aby wykazać udaną iniekcję doprzewodową, udaną infekcję wirusową i wpływ dostarczonych genów na nowotworzenie sutka. Ilość wstrzykiwanego wirusa musi być dostosowana do celu każdego eksperymentu. Aby zilustrować, jak daleko może być zainfekowane drzewo przewodu sutkowego, należy użyć dużej ilości genów przenoszących wirusa, które można zobrazować, takich jak GFP. Z drugiej strony, aby naśladować naturalną spontaniczną nowopowstanie, należy użyć niewielkiej ilości wirusa przenoszącego onkogen, tak aby tylko kilka komórek zostało zainfekowanych i ewoluowało w zmiany przedrakowe, a ostatecznie w raka inwazyjnego, w polu skądinąd całkowicie normalnego gruczołu sutkowego.

Sukces iniekcji wewnątrzprzewodowej można natychmiast potwierdzić poprzez odsłonięcie gruczołu sutkowego i obserwację niebieskiego drzewa kanałowego (Rysunek 1). Dwa do pięciu dni po wstrzyknięciu wirusa Lenti-EGFP (FUCGW) (~106 j.m.)12, zakażenie komórek nabłonka sutka można ocenić za pomocą całego preparatu mount, a następnie obserwacji pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (Ryc. 2). Alternatywnie, do analizy cytometrii przepływowej białek fluorescencyjnych lub markerów powierzchniowych komórek wytwarzanych przez wirusa6,7,19, zakażone gruczoły i niezakażone gruczoły (jako kontrole ujemne) mogą być zebrane i przetworzone na zawiesinę jednokomórkową, aby można było oszacować szybkość infekcji wirusowej (Rysunek 3). Inną metodą testowania/ilościowego określania infekcji wirusowej jest naprawienie zakażonych i niezakażonych gruczołów kontrolnych za pomocą 4% paraformaldehydu (lub formaliny), przetworzenie ich na bloki zatopione w parafinie i wybarwienie powstałych skrawków pod kątem produktów genów wytwarzanych przez wirusa i znaczników epitopów, takich jak HA i FLAG20,21.

Czy komórki zakażone wirusem rozszerzą się i utworzą zmiany przedrakowe, a następnie nowotwory, zależy od siły dostarczonego onkogenu (onkogenów) i ilości wstrzykniętego wirusa. W przypadku silnego onkogenu, takiego jak PyMT i aktywowany RAS, wczesne zmiany tworzą się w ciągu kilku dni, a guzy pojawiają się w ciągu kilku tygodni10 (Bu i wsp., niepublikowane obserwacje). Aktywowany ERBB2 prowadzi do zmian przedrakowych w ciągu kilku tygodni i guzów w ciągu kilku miesięcy10,22,23 (Rysunek 4), podczas gdy aktywowany PIK3CA prowadzi do guzów o medianie opóźnienia około 5 miesięcy24. Z drugiej strony, Wnt1 powoduje nowotwory raczej powoli: tylko u około 20% zakażonych myszy rozwinęły się guzy po 20 miesiącach21.

Rysunek 1: Pomyślnie wstrzyknięte drzewo sutkowe. Obraz został wykonany natychmiast po doprzewodowym wstrzyknięciu gruczołu sutkowego numer 4 9-tygodniowej samicy myszy FVB/N. Strzałka wskazuje położenie sutka z numerem 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wykrywanie zainfekowanych komórek za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej. (A) Jako kontrolna używana jest gruczoł przeciwległy, któremu nie wstrzyknięto iniekcji. (B) Obraz wykonany pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym pokazuje zainfekowane drzewo przewodu sutkowego. Gruczoł sutkowy numer 3 10-tygodniowej myszy FVB/N został wewnętrznie wstrzyknięty przewodowo wirusem Lenti-EGFP (FUCGW) (~106 IUs). Wstrzyknięty gruczoł sutkowy pobrano 5 dni po wstrzyknięciu. Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja zakażonych komórek za pomocą analizy cytometrii przepływowej dla EGFP wytwarzanego przez lentiwirusa. Kanał fikoerytryny (PE) został wykorzystany do ujawnienia sygnału autofluorescencyjnego. Jako kontrolę ujemną zastosowano przeciwległe gruczoły sutkowe bez iniekcji. Wstrzyknięte gruczoły sutkowe od 12-tygodniowej samicy myszy FVB/N pobrano 2,5 dnia po doprzewodowym wstrzyknięciu Lenti-EGFP (~106 IU / gruczoł) i przetworzono na zawiesinę jednokomórkową. Zawiesinę pojedynczej komórki przeanalizowano następnie za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia komórek GFP-dodatnich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Immunohistochemiczne potwierdzenie ekspresji wirusa produktu onkogenu we wczesnej zmianie chorobowej i guzie. (A) Wczesny gruczoł sutkowy zawierający zmianę #4 pobrano 14 dni po doprzewodowym wstrzyknięciu 106 IU RCAS-Neu (HA) myszom MMTV-tva. Do wykrycia znacznika HA zastosowano barwienie immunohistochemiczne. (B) Guz pobrano 1 rok po doprzewodowym wstrzyknięciu 104 IU RCAS-Neu (HA) do gruczołu #4 myszy MMTV-tva. Wiek myszy w momencie wstrzyknięcia: 12 tygodni. Podziałka skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obaj autorzy deklarują brak konfliktu interesów.