Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cukrzyca typu 1 charakteryzuje się autoimmunologicznym niszczeniem komórek beta trzustki produkujących insulinę. Obiecującym sposobem leczenia tej choroby jest przeszczepienie komórek beta pochodzących z komórek macierzystych. Modyfikacje genetyczne mogą być jednak konieczne w celu ochrony przeszczepionych komórek przed uporczywą autoimmunizacją. Mysie modele z cukrzycą są użytecznym narzędziem do wstępnej oceny strategii ochrony przeszczepionych komórek przed atakiem autoimmunologicznym. Opisano tutaj minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania przeszczepów komórkowych w adoptywnym modelu transferu cukrzycy u myszy. W tym protokole komórki z mysiej linii komórek beta trzustki NIT-1 eksprymujących transgen lucyferazy świetlika lucyferazy lucyferazy luc2 są przeszczepiane podskórnie do myszy z niedoborem odporności bez otyłości (NOD) z ciężkim złożonym niedoborem odporności (scid). Myszom tym jednocześnie wstrzykuje się dożylnie splenocyty od spontanicznie chorych na cukrzycę myszy NOD w celu przeniesienia autoimmunizacji. Przeszczepy są obrazowane w regularnych odstępach czasu za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego w celu monitorowania przeżycia komórek. Przeżywalność zmutowanych komórek jest porównywana z przeżywalnością komórek kontrolnych przeszczepionych tej samej myszy.
Wprowadzenie
Cukrzyca typu 1 (T1D) jest spowodowana autoimmunologicznym niszczeniem komórek beta trzustki produkujących insulinę. Utrata masy komórek beta powoduje niedobór insuliny i hiperglikemię. Pacjenci z cukrzycą typu 1 polegają na wielu codziennych zastrzykach insuliny egzogennej i doświadczają epizodów ciężkiej hiperglikemii i hipoglikemii przez całe życie. Powikłania związane z tymi epizodami obejmują retinopatię cukrzycową, upośledzoną czynność nerek i neuropatię1.
Zastrzyki z insuliny są lekiem, ale nie lekarstwem na cukrzycę typu 1. Zastąpienie utraconej masy komórek beta może jednak potencjalnie odwrócić chorobę, umożliwiając pacjentom wytwarzanie własnej insuliny. Jednak podaż wysepek dawców zwłok jest ograniczona2. Wysepki pochodzące z komórek macierzystych (wysepki SC) mogą zapewnić praktycznie nieograniczoną podaż komórek beta do przeszczepu. Kilka grup wykazało, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być różnicowane w celu wytworzenia funkcjonalnych komórek podobnych do beta3,4,5. Obiecujące dane z wczesnych badań klinicznych wskazują, że komórki te zachowują swoją funkcję po przeszczepie i mogą umożliwić pacjentom stanie się niezależnymi od insuliny6. Konieczna jest jednak przewlekła immunosupresja, co zwiększa ich podatność na raka i infekcje. Ponadto leki immunosupresyjne mogą być cytotoksyczne dla przeszczepów w dłuższej perspektywie7. Aby wyeliminować potrzebę immunosupresji, wysepki SC mogą być genetycznie modyfikowane w celu ochrony przed nawracającymi chorobami autoimmunologicznymi, a także alloimmunologią po przeszczepie.
Badania nad komórkami macierzystymi są bardzo wymagające pod względem kosztów i pracy. Mysie linie komórkowe i modele zwierzęce są użytecznymi narzędziami do wstępnej identyfikacji i eksperymentalnej walidacji strategii ochrony przeszczepionych komórek przed autoimmunizacją. U myszy NOD rozwija się spontaniczna cukrzyca autoimmunologiczna z wieloma podobieństwami do ludzkiej cukrzycy typu 1 < klasa = "xref">8, a linia komórkowa insulinoma NIT-1 dzieli tło genetyczne z tym szczepem myszy < sup class="xref">9. Cukrzyca może być adoptywnie przeniesiona na pokrewny szczep myszy NOD-scid z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie splenocytów cukrzycowych od myszy NOD w celu czasowej synchronizacji początku cukrzycy u replikowanych myszy eksperymentalnych10. Model ten może być wykorzystany do stosunkowo szybkiej i niedrogiej identyfikacji celów genetycznych w celu dalszej walidacji na wyspach SC. Ostatnio metoda ta została zastosowana do identyfikacji i walidacji RNLS, celu, który okazał się chronić pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe przed autoimmunizacją in vivo oraz wyspy trzustkowe pochodzące z iPSC przed stresem komórek beta in vitro11. Opisano tutaj prosty protokół przeszczepiania genetycznie modyfikowanych komórek NIT-1 i nieinwazyjnego monitorowania ich przeżycia w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Rycina 1: Schemat transplantacji i obrazowania przeszczepów w modelu adopcyjnego transferu cukrzycy u myszy. Komórki NIT-1 wykazujące ekspresję transgenu lucyferazy świetlika (luc2) są przeszczepiane podskórnie myszom NOD-scid. Jednocześnie myszy otrzymują iniekcję autoreaktywnych splenocytów wyizolowanych od spontanicznie cukrzycowej myszy NOD. Przeszczepy są obrazowane w regularnych odstępach czasu za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego. Rycina stworzona przy użyciu BioRender.com. Skróty: NOD = non-obese diabetic (nieotyłe cukrzycowe); scid = severe combined immunodeficient (ciężki złożony niedobór odporności). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami i badania zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) w Joslin Diabetes Center. Myszy NOD oraz NOD-scid można łatwo pozyskać z komercyjnych źródeł. Wszystkie myszy w niniejszym badaniu są utrzymywane w obiekcie monitorowanym przez zwierzęta sentinelowe. Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, zwierząt, instrumentów i oprogramowania wykorzystanych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Inżynieria i utrzymanie linii komórkowych NIT-1
- Hodować linie komórkowe NIT-1, które mają wspólne tło genetyczne z myszami NOD, oraz komórki 293FT w naczyniach traktowanych do hodowli tkankowych w pożywce DMEM zawierającej 4,5 g/L glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny, w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
- Hodować komórki 293FT do uzyskania 70%-80% konfluencji przed transfekcją.
- Na każdą płytkę 10 cm z komórkami 293FT połączyć 10 µg pLenti-luciferase-blast (patrz Supplemental File 1), który wykazuje ekspresję transgenu lucyferazy świetlika (luc2) pod kontrolą konstytutywnie aktywnego promotora EF1α, po 2 µg każdego z plazmidów pakujących pMD2.G, pMDLg/pRRE i pRSV-Rev, 4 µg plazmidu białka otoczki pCMV-VSV-G oraz 60 µg liniowej polietylenoiminy (PEI) w 1 mL bezzsurowiczej pożywki DMEM. Dostosować ilości w zależności od liczby komórek przeznaczonych do transfekcji.
- Pozostawić DNA, PEI i DMEM w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min, a następnie dodać je do komórek 293FT.
- Zebrać pożywkę zawierającą cząsteczki lentiwirusowe 48 h po transfekcji.
- Przeprowadzić transdukcję komórek NIT-1 przy konfluencji ~80%, stosując 1 mL pożywki zawierającej cząsteczki lentiwirusowe na 106 komórek przez 48-72 h.
- Wyselekcjonować komórki wykazujące ekspresję lucyferazy za pomocą 5 µg/mL blastycydyny przez 48 h.
- Dalej modyfikować genetycznie komórki wykazujące ekspresję lucyferazy, aby dopasować je do postawionego pytania badawczego. W celu porównania należy uwzględnić linię kontrolną komórek typu dzikiego lub kontrolę niecelującą, wykazującą ekspresję lucyferazy.
UWAGA: Przykłady modyfikacji genów docelowych obejmują knockout CRISPR, CRISPRa/i, knockdown shRNA oraz nadekspresję.
2. Przygotowanie komórek NIT-1 do przeszczepu
- Hodować komórki wykazujące ekspresję lucyferazy do momentu osiągnięcia konfluencji na poziomie 80%–90%.
- Usunąć pożywkę wzrostową i wypłukać komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, 5 ml dla szalki 10 cm).
- Do każdej płytki dodać 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na 2 min.
- Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml pożywki wzrostowej.
- Użyć pipety, aby wypłukać komórki z płytki i przenieść je do probówki stożkowatej.
UWAGA: Komórki z wielu naczyń tej samej linii komórkowej mogą zostać połączone. - Należy policzyć komórki, stosując barwnik taki jak błękit trypanowy, ręcznie za pomocą komory countingowej (hemocytometru) lub automatycznie przy użyciu automatycznego licznika komórek.
- Wirować przy 250 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadsącz za pomocą pipety aspiracyjnej.
- Resuspenduj osad komórkowy w PBS do stężenia 5 × 107 komórek/ml (107 liczba komórek na linię komórkową na mysz zostanie przeszczepiona w objętości 200 µL).
- Przechowywać komórki w lodzie (do 3 h) aż do momentu transplantacji.
3. Transplantacja komórek NIT-1 do myszy NOD-scid
- Zanurzyć myszy biorców (myszy NOD-scid w wieku 8–10 tygodni, tej samej płci co myszy użyte do izolacji splenocytów) w narkozie poprzez inhalację izofluranem w komorze indukcyjnej. Do komory podawać 2,5% izofluranu przy przepływie 1,5 L/min i tempie ewakuacji 9 L/min.
- Posmarować oczy zwierzęcia maścią oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu.
- Za pomocą golarki elektrycznej z nakładką usunąć sierść z grzbietu (strony grzbietowej) myszy, aby odsłonić skórę. Ogolony obszar transplantacji powinien mieć wymiary około 1 x 2 cala. Wrócić ogolone myszy do komory indukcyjnej aż do momentu transplantacji.
- Przenosić myszy pojedynczo na czystą powierzchnię, stosując maskę nosową z izofluranem. Delikatnie skierować głowę myszy do maski. Aby utrzymać znieczulenie podczas transplantacji, stosować przepływ izofluranu na poziomie 0,25 L/min.
- Przetrzeć obszar transplantacji gazikiem nasączonym alkoholem izopropylowym, aby usunąć luźną sierść i zdezynfekować skórę.
- Przed pobraniem do strzykawki upewnić się, że komórki zostały całkowicie resusp endowate. Pobrać nadmiarową objętość (>300 µL) komórek do sterylnej strzykawki 1 mL z igłą 26 G. Usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie przenieść nadmiar komórek z powrotem do probówki, tak aby w strzykawce pozostało 300 µL zawiesiny komórkowej.
- Trzymając w niedominującej ręce zakrzywioną pęsetę, delikatnie unieść skórę po jednej stronie (lewej lub prawej) grzbietu myszy, aby ułatwić dostęp do przestrzeni podskórnej.
- Dominującą ręką ustawić strzykawkę równolegle do płaszczyzn czołowej i strzałkowej ciała myszy. Kierując igłę w stronę głowy myszy, wprowadzić ją w skórę w pobliżu tylnych kończyn i delikatnie poprowadzić do przestrzeni podskórnej. Upewnić się, że cała igła pozostaje pod skórą i nie przebija jej na wylot.
- Ustawić pęsetę tak, aby delikatnie trzymać skórę wokół nasady igły. Powoli podać niewielką ilość zawiesiny komórkowej (<50 µL) i potwierdzić powstanie niewielkiego wybrzuszenia pod skórą w miejscu wstrzyknięcia. Kontynuować wstrzykiwanie zawiesiny komórkowej, aż do momentu podania 200 µL do przestrzeni podskórnej.
- Trzymając pęsetę w miejscu i utrzymując igłę równolegle do ciała myszy, powoli wycofać igłę. Po usunięciu igły przytrzymać skórę zamkniętą pęsetą przez kilka sekund, aby zapobiec wyciekowaniu komórek z miejsca nakłucia.
- W przypadku oceny modyfikacji genetycznej powtórzyć transplantację po przeciwnej stronie myszy, używając innej strzykawki, tak aby do każdej myszy wstrzyknąć zarówno komórki mutantów, jak i kontrolne (jedna linia komórkowa po lewej stronie, a druga po prawej). Jeśli transplantowana jest tylko jedna linia komórkowa, wstrzyknąć komórki tylko po jednej stronie.
- Po transplantacji przenieść każdą mysz do nowej klatki. Pozwolić każdej myszy w pełni dojść do siebie po narkozie przed dodaniem do klatki kolejnych zwierząt.
UWAGA: Myszy uznaje się za ozdrowiałe, gdy wznowią normalną aktywność i nie wykazują oznak letargu ani zaburzeń ruchu. - Codziennie oceniać stan zdrowia myszy przez cały czas trwania eksperymentu po transplantacji. Jeśli szczepy utworzą duże wybrzuszenie lub myszy staną się słabe i letargiczne, zmierzyć poziom glukozy we krwi i podawać 10% (w/w) roztwór sacharozy w wodzie ad libitum wszystkim myszom z hipoglikemią. Postępować zgodnie ze wszystkimi zaleceniami weterynaryjnymi i eutanizować wszystkie myszy z utrzymującym się złym stanem ogólnym zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W niniejszym badaniu myszy eutanizowano poprzez inhalację CO2, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych.
4. Izolacja i oczyszczanie autoreaktywnych splenocytów
- Zidentyfikuj 10-16-tygodniowe samce lub samice myszy NOD z niedawno wystąpioną (mniej niż 10 dni) cukrzycą, używając pasków do pomiaru glukozy w moczu (lub krwi). Myszy NOD uznaje się za cukrzycowe, gdy poziom glukozy w moczu/krwi wynosi ≥250 mg/dL przez co najmniej 2 kolejne dni.
UWAGA: Dla każdej myszy NOD-scid potrzeba 10 milionów splenocytów; jedna śledziona zazwyczaj dostarcza od 50 milionów do 150 milionów splenocytów. Splenocyty wyizolowano z myszy wolnych od patogenów, utrzymywanych w placówce z monitoringiem sentynelowym. - Uśmierć odpowiednią liczbę cukrzycowych myszy NOD.
UWAGA: W niniejszym badaniu myszy uśmiercono poprzez inhalację CO2, a następnie wykonano zwichnięcie szyi w celu potwierdzenia zgonu. - Umyjąc mysz na grzbiecie, wykonaj nożyczkami chirurgicznymi pionowe nacięcie skóry o długości około 2 cali. Otwórz prawą stronę myszy (z perspektywy badacza) i zlokalizuj jaskrawoczerwoną śledzionę. Delikatnie oddziel śledzionę od różowego trzustki i przenieś ją do sterylnej płytki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej 5 mL sterylnego PBS. Powtórz sekcję u tak wielu myszy, jak jest to konieczne.
UWAGA: Śledziony od wielu myszy można połączyć w jednej płytce. Kolejne kroki wykonuj przy użyciu sterylnych odczynników i sprzętu w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. - Rozgnieć śledzionę (lub śledziony) płaską częścią tłoka sterylnej strzykawki.
- Umieść sitko o oczkach 40 µm lub 70 µm w probówce stożkowej o pojemności 50 mL i przemyj sitko 5 mL PBS w celu jego przygotowania. Przenieś zawiesinę z śledzioną (lub śledzionami) na sitko i kontynuuj delikatne rozgniatanie przez sitko. Przepłucz płytkę 10 mL PBS i przenieś płuczkę na sitko. Kontynuuj rozgniatanie, aż z sitka zniknie czerwony kolor.
- Wyrzuć sitko i wirować probówkę przy 500 × g przez 5 min w RT. Usuń nadsącz za pomocą pipety aspiracyjnej.
- Resuspenduj osad komórkowy w 5 mL (dla maksymalnie trzech śledzion) buforu do lizy ACK podgrzanego do RT i lizuj erytrocyty przez 4 min. Zwiększ objętość o 1-2 mL na każdą dodatkową śledzionę, jeśli są one potrzebne.
- Zatrzymaj reakcję, dodając 5 mL pożywki dla komórek NIT-1 (opisanej powyżej) na każde 5 mL buforu do lizy. Przepuść zawiesinę komórkową przez nowe sitko, aby usunąć grudki. Wyrzuć sitko i wirować przy 500 × g przez 5 min w RT.
- Resuspenduj osad komórkowy w 20 mL PBS i dokonaj zliczenia komórek. Wirować przy 500 × g przez 5 min w RT. Resuspenduj komórki w sterylnym PBS do stężenia 1 × 108 komórek/mL (objętość iniekcji to 0,1 mL/mysz) w probówce reakcyjnej z bezpiecznym zamknięciem o pojemności 1,5 mL.
- Przechowuj komórki na lodzie (nie dłużej niż przez 1 h) lub w RT i natychmiast przystąp do iniekcji do żyły ogonowej.
5. Dożylne wstrzyknięcie splenocytów od myszy z cukrzycą poprzez boczną żyłę ogonową
- Rozgrzej ciało dorosłych myszy biorców szczepu NOD-scid (np.., stosując lampę grzewczą przez ok. 5–10 min) w celu rozszerzenia naczyń krwionośnych (ułatwia to wizualizację oraz wstrzyknięcie substancji do żyły).
UWAGA: Aby uniknąć przegrzania myszy, nie należy przekraczać tego czasu. Należy stale monitorować stan zdrowotny zwierząt. Jeśli myszy wydają się wyczerpane lub nieruchome, należy natychmiast wyłączyć lampę grzewczą. - Podgrzej zawiesinę komórkową. Przygotuj sterylną strzykawkę (0,3–1,0 ml) ze sterylną igłą (27–30 G, 0,3 mm/0,5 cala lub mniejszą) lub użyj sterylnej strzykawki insulinowej 0,5 ml z igłą 0,3 mm (0,5 cala). Zawsze zachowaj sterylność igły i używaj sterylnej tacy, jeśli strzykawka musi zostać odłożona pomiędzy iniekcjami.
- Przed każdym wstrzyknięciem należy ponownie zawiesić roztwór splenocytów. Dla każdej myszy należy pobrać 100 µL podgrzaną i wymieszaną zawiesinę splenocytów do strzykawki. Należy upewnić się, że w strzykawce lub w zawiesinie nie znajdują się pęcherzyki powietrza.
UWAGA: Przed umieszczeniem myszy w urządzeniu stabilizującym należy przygotować cały sprzęt i materiały (gaziki nasączone alkoholem do dezynfekcji, strzykawkę z przygotowanymi do wstrzyknięcia splenocytami oraz nową klatkę do odseparowania myszy po iniekcji). - Umieść mysz w urządzeniu do unieruchamiania. Chwyć ogon niedominującą ręką i zlokalizuj jedną z dwóch bocznych żył ogonowych. W razie potrzeby delikatnie obróć ogon. Przetrzyj ogon chusteczką do dezynfekcji (70% alkohol izopropylowy), aby oczyścić skórę i zwiększyć widoczność żyły.
- Wprowadzić igłę pod kątem ostrym w centralną część ogona, posługując się ręką dominującą. Kierując ściętą stronę igły do góry, przesunąć ją o kilka milimetrów przez skórę.
UWAGA: Należy upewnić się, że igła jest równoległa do żyły i umieszczona tuż pod skórą. Należy przygotować się na gwałtowne ruchy myszy/ogona bezpośrednio po przebiciu skóry/ściany naczynia. Prawidłowe wprowadzenie igły powinno sprawiać wrażenie „gładkiego wsuwania się” do żyły. W przypadku konieczności ponownej próby, należy przesunąć się wyżej na ogonie, w stronę ciała. - Naciśnij delikatnie tłok strzykawki, aby wstrzyknąć zawiesinę splenocytów. Podczas wstrzykiwania nie należy przesuwać igły w głąb ani wycofywać jej. Prawidłowe wstrzyknięcie przebiega płynnie, bez odczuwania przeciwciśnienia, a o jego powodzeniu świadczy pojawienie się przezroczystego lub białego przepływu krwi bezpośrednio po zabiegu.
- Ostrożnie wyjmij igłę z żyły, a następnie lekko przyciśnij ogon chusteczką dezynfekcyjną do momentu ustąpienia krwawienia. Zwolnij mysz z urządzenia stabilizującego i delikatnie przenieś ją do świeżo przygotowanej klatki.
UWAGA: Wstrzyknij splenocyty dwóm lub trzem myszom kontrolnym, które nie otrzymały przeszczepu komórek NIT-1, aby potwierdzić zdolność autoreaktywnych splenocytów do indukowania cukrzycy, co zajmuje około 2–4 tygodni po wstrzyknięciu.
6. Bioluminescencyjne obrazowanie in vivo przeszczepów NIT-1
UWAGA: Obrazuj przeszczepy jeden lub dwa razy w tygodniu. W dniu transplantacji odczekaj co najmniej 2 h po zabiegu, aby umożliwić stabilizację przeszczepów i zapewnić trwałą ekspresję lucyferazy. Jeśli czas jest czynnikiem ograniczającym, pierwszy pomiar można przeprowadzić w Dniu 1. Zalecany wstępny harmonogram obrazowania to Dzień 0 lub Dzień 1 po wstrzyknięciu, Dzień 5, Dzień 10, Dzień 14, Dzień 18 oraz Dzień 25. Należy jednak dostosować harmonogram w zależności od postępu autoimmunizacji, ocenianego na podstawie zaniku sygnału bioluminescencyjnego.
- Przygotuj roztwór D-lucyferyny o stężeniu 15 mg/mL w buforze PBS Dulbecco. Mieszaj w temperaturze pokojowej (RT) do rozpuszczenia, a następnie przefiltruj sterylnie (0,22 µm). Przechowuj w aliquotach 1 mL w temperaturze −20 °C i rozmrażaj w razie potrzeby.
UWAGA: Alikwoty można zamrażać ponownie. - Co najmniej 5 min przed obrazowaniem wstrzyknij myszom doprzewnownowośrodkowo, używając strzykawki 1 mL i igły 26 G, roztwór D-lucyferyny w dawce 150 mg/kg.
UWAGA: Dla każdej myszy używaj nowej strzykawki i igły. - Zanieś myszy do narkozy poprzez inhalację izofluranem zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Zalecane warunki to 2,5% izofluranu przy przepływie 1,5 L/min do komory usypiającej i szybkości ewakuacji 9 L/min.
- Smaruj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu.
- Uruchom oprogramowanie powiązane z urządzeniem do obrazowania. Utwórz nowego użytkownika i/lub zaloguj się. Na panelu sterowania w prawym dolnym rogu wybierz Initialize (Rysunek 2A). Aby automatycznie zapisywać dane obrazowania, utwórz odpowiednie foldery na komputerze, a następnie wybierz Acquisition | Auto-save to… (Rysunek 2A). Po zakończeniu inicjalizacji urządzenia ustaw czas ekspozycji na 1 min.
UWAGA: Pełne parametry obrazowania przedstawiono na Rysunku 2B. - Przenoś myszy pojedynczo z komory usypiającej do urządzenia do obrazowania. Umieść mysz na brzuchu z rozstawionymi kończynami i delikatnie wprowadź głowę do stożka nosowego. Przepływ izofluranu na poziomie 0,25 L/min podawany przez stożek nosowy jest odpowiedni do utrzymania narkozy podczas obrazowania. Delikatnie spłaszcz mysz, naciskając obiema dłońmi środek jej grzbietu, a następnie rozsuwając dłonie na zewnątrz.
- Wybierz Acquire (Rysunek 2B). Zapisz wszelkie istotne szczegóły eksperymentu w wyskakującym oknie (Rysunek 2C).
UWAGA: Reprezentatywne obrazy trzech 8-tygodniowych samic myszy NOD-scid z przeszczepionymi dwoma graftami w różnych punktach czasowych znajdują się na Rysunku 3A.
Rycina 2: Zrzuty ekranu poleceń oprogramowania do obrazowania graftów bioluminescencyjnych. (A) Przed obrazowaniem wybierz Initialize, aby przygotować instrument. Obrazy mogą być automatycznie zapisywane w wybranym folderze poprzez wybór Acquisition | Auto-save to… (B) Przegląd parametrów obrazowania. Po umieszczeniu myszy w instrumencie wybierz Acquire. (C) Zrzut ekranu okna dialogowego, które pojawia się podczas obrazowania. Tutaj można wprowadzić szczegóły, takie jak punkt czasowy i szczep myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
7. Analiza danych
- Ilościowo określ sygnał bioluminescencyjny w dowolnym czasie po obrazowaniu. Otwórz oprogramowanie powiązane z urządzeniem do obrazowania. Wybierz File | Open i wybierz plik ClickInfo.txt powiązany z analizowaną myszą.
- W Palecie narzędzi (Tool Palette) wybierz Narzędzia ROI (ROI Tools) (Rycina 3B, krok 1). Z rozwijanego menu owalu (oval) (Rycina 3B, krok 1, czerwona strzałka) wybierz liczbę przeszczepów, które zostały wszczepione myszy.
- Przesuń owale tak, aby obejmowały sygnał bioluminescencyjny z każdego przeszczepu, a następnie wybierz Pomiar ROI (Measure ROIs) (Rycina 3B, krok 2).
- Zapisz Całkowitą liczbę impulsów (Total Count) dla każdego przeszczepu (Rycina 3B, krok 3).
- Dla każdego przeszczepu podziel sygnał bioluminescencyjny zmierzony w każdym punkcie czasowym przez sygnał zmierzony w pierwszym punkcie czasowym. Przedstaw przeżywalność przeszczepu jako proporcję lub procent pozostałego sygnału bioluminescencyjnego w stosunku do początkowego sygnału bioluminescencyjnego.
UWAGA: Jeśli przeszczepy powiększą się po transplantacji, stosunek lub procent przeżywalności przeszczepu będzie odpowiednio większy niż 1 lub 100%. Wszystkie myszy, które otrzymały przeszczepy, powinny być monitorowane pod kątem niepożądanych efektów zdrowotnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Można porównać przeżywalność dwóch linii komórkowych, np. mutanta i kontroli nietarczującej (non-targeting control), lub zmierzyć przeżywalność jednej linii komórkowej w wielu grupach myszy, np. myszy leczone lekiem w porównaniu z kontrolami leczonymi nośnikiem (vehicle). Rysunek 3A przedstawia trzy 8-tygodniowe samice myszy NOD-scid z przeszczepioną linią komórkową kontrolną nietarczującą (lewa strona) oraz mutante...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Cukrzyca typu 1 jest wyniszczającą chorobą, na którą obecnie nie ma lekarstwa. Terapia zastępcza komórek beta stanowi obiecujące leczenie dla pacjentów z tą chorobą, ale krytyczną barierą dla tej strategii jest możliwość nawrotu ataku autoimmunologicznego na przeszczepione komórki beta. Inżynieria genetyczna komórek SC-beta w celu zmniejszenia ich widoczności immunologicznej lub podatności jest jednym z potencjalnych rozwiązań tego problemu. Opisano tutaj protokół nieinwazyjnego obrazowania przeszczepionych komórek beta ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr Erica P. Cai i dr Yuki Ishikawa za opracowanie metody opisanej w tym protokole (patrz odnośnik 11). Badania w laboratoriach S.K. i P.Y. są wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute i Beatson Foundation. T.S. był wspierany przez stypendium podoktorskie z National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), a K.B. był częściowo wspierany przez stypendium Fundacji Mary K. Iacocca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% trypsyna, 0,53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Szybko rosnący, wysoce transfekcyjny izolat klonalny pochodzący z ludzkich embrionalnych komórek nerkowych przekształconych za pomocą dużego antygenu T SV40 |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Podkładki nasączone alkoholem, 70% alkoholu izopropylowego | B08NWF31DX pierwszej pomocy Amazon/Ever Ready | ||
| Strzykawka BD 5ml Końcówka Luer-Lok Igła do strzykawek | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Końcówka strzykawkowa | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Sitko komórkowe premium SureStrain, 70 µ m, sterylne | Southern Labware | C4070 | Lub użyj podobnego sterylnego sitka o wielkości porów 40-70um |
| Automatyczny licznik komórek CellDrop | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Lub użyj podobnego urządzenia do liczenia komórek |
| Corning 100 ml roztworu penicyliny-streptomycyny, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Jednorazowe pipety aspiracyjne, polistyren, sterylne, pojemność = 2 ml | VWR | 414004-265 | Lub użyj podobnej pipety zasysającej |
| D-Lucyferin, Sól potasowa, Klasa biologii molekularnej, Proszek, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy | Probówki Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD, 50 ml | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10437-028 | |
| Kleszcze premium do tkanek, 1 x 2 zęby 5 cali, German | Steel Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Pasek testowy glukozy w moczu | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Lub użyj podobnego paska testowego do pomiarów glukozy w moczu/krwi |
| GlutaMAX– 1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Lampa grzewcza na podczerwień | Cole Parmer | 03057-00 | Lub użyj podobnej lampy na podczerwień |
| Strzykawka insulinowa 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 w | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum system obrazowania in vivo | Perkin Elmer | 124262 | Instrument do nieinwazyjnego zbierania bioluminescencyjnych obrazów przeszczepionych komórek |
| Oprogramowanie do analizy żywego obrazu | Perkin Elmer | 128113 | Oprogramowanie do zbierania i ilościowego oznaczania sygnału bioluminescencyjnego |
| Probówki do mikrowirówek seal-rite, 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5510 | Lub użyj podobnych sterylnych probówek do mikrowirówek |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Trzustkowa linia beta-celll pochodząca od myszy NOD / Lt |
| NOD. Cg-Prkdcscid/J | Myszy z 001303 Jackson Laboratory | homozygotyczne pod względem ciężkiej spontanicznej mutacji złożonego niedoboru odporności Prkdcscid, potocznie określany jako scid, charakteryzują się brakiem funkcjonalnych limfocytów T i limfocytów B, limfopenią, hipogammaglobulinemią i normalnym mikrośrodowiskiem krwiotwórczym. | |
| NOD/ShiLtJ | Laboratorium Jacksona | 001976 | Szczep myszy NOD/ShiLtJ (powszechnie nazywany NOD) jest poligenicznym modelem autoimmunologicznej cukrzycy typu 1 |
| PBS, pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | Bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-lucyferazy-blast | Wykonany we własnym | Plazmid dostępny na życzenie | Zobacz plik uzupełniający 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polietyleninina, liniowa, MW 25 000, klasa transfekcji (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Ogranicznik dla gryzoni, runda 1 w stylu miotły w | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Nożyczki z ostrym zakończeniem | Fisher Scientific | 08-940 | Lub użyj innych nożyczek wykonanych z chirurgicznej stali nierdzewnej |
| Naczynia hodowlane poddane kulturom tkankowym | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Lub użyj innych sterylnych szalek Petriego poddanych hodowli komórkowych |
| Pęseta/Kleszcze, precyzyjna ze średnią końcówką | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Bibliografia
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538(2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
