Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64902

⸱

29 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Taras Shevchenko National University of Kyiv, 2Bienta/Enamine, 3Karlsruhe Institute of Technology, 4Lumobiotics

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Streszczenie

Fotokontrolowane, biologicznie aktywne związki to wyłaniająca się klasa "inteligentnych" kandydatów na leki. Zapewniają one dodatkowe bezpieczeństwo w chemioterapii ogólnoustrojowej ze względu na ich precyzyjną aktywację czasoprzestrzenną poprzez skierowanie łagodnego, niejonizującego światła w określone miejsce w ciele pacjenta. W pracy przedstawiono zestaw metod oceny siły działania i skuteczności ex vivo fotoaktywacji fotokontrolowanych, biologicznie czynnych związków in vitro oraz skuteczności in vivo we wczesnych stadiach rozwoju leku. Metodologię tę stosuje się do przeciwnowotworowych peptydów cytotoksycznych, a mianowicie zawierających diaryleten analogów znanego antybiotyku, gramicydyny S. Eksperymenty przeprowadza się przy użyciu hodowli komórkowych 2D (komórki adherentne) i 3D (sferoidy) linii komórek nowotworowych (rak płuc Lewisa, LLC), żywych substytutów tkanek (mięso mielone wieprzowe) oraz modelu raka alloprzeszczepu (podskórna LLC) u myszy immunokompetentnych. Dobór najskuteczniejszych związków i oszacowanie realistycznych okien fototerapeutycznych odbywa się za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Skuteczność fotoaktywacji przy różnych schematach oświetlenia jest określana na różnych głębokościach w tkance modelowej, a optymalna dawka światła jest stosowana w końcowym eksperymencie terapeutycznym in vivo.

Wprowadzenie

W ostatnich dziesięcioleciach fotokontrolowane związki biologicznie czynne stały się obiecującym elementem bezpiecznych chemioterapii chorób ludzkich oraz swoistej eradykacji złośliwych guzów litych1. Związki te zawierają odwracalnie fotoizomeryzowalne fragmenty (molekularne przełączniki światła) i mogą przełączać się między nieaktywnymi a aktywnymi fotoizomerami po naświetleniu światłem o różnych długościach fal.

W porównaniu z ich analogami niepodlegającymi fotokontroli, leki fotokontrolowane mogą być bezpieczniejsze, ponieważ mogą być wprowadzane systemowo do organizmu pacjenta w formach mniej aktywnych i zasadniczo nietoksycznych, a następnie aktywowane światłem tylko tam, gdzie jest to konieczne, np. w guzach, owrzodzeniach i ranach. Choć w ostatnich pracach akademickich można znaleźć wiele interesujących demonstracji takich prototypowych cząsteczek leków2,3,4,5,6,7, dziedzina farmakologii światła (fotofarmakologii) w ujęciu klinicznym – czyli zastosowanie zatwierdzonych kombinacji leków, wyrobów medycznych i jednostek chorobowych – jeszcze nie istnieje. Fotofarmakologia znajduje się obecnie na etapie odkrywania leków, a systematyczne badania przedkliniczne nie są znane.

Dopiero niedawno wykazaliśmy przewagę bezpieczeństwa in vivo w przypadku niektórych fotokontrolowanych peptydów przeciwnowotworowych, a mianowicie analogów peptydowego antybiotyku gramicydyny S8. Te fotokontrolowane pochodne zawierają fotoprzełącznik diaryletenowy (DAE), który ulega odwracalnym transformacjom wywołanym światłem pomiędzy tzw. formą „otwartego pierścienia” generowaną przez światło czerwone a formą „zamkniętego pierścienia” generowaną przez promieniowanie UV (zilustrowano to na Rysunku 1 dla jednej z pochodnych, związku LMB002).

Schemat reakcji fotochemicznej, formy LMB002 DAE, indukowane światłem UV i czerwonym, zmiana strukturalna.
Rycina 1: Fotokontrolowany peptyd cytotoksyczny LMB002 i jego fotoizomeryzacja. Fragment diaryletenu zaznaczono na czerwono. Skrót: DAE = diaryleten. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyszukiwanie trafień oraz przeprowadzanie optymalizacji hit-to-lead często wymagają przesiewania odpowiednich bibliotek związków in vitro oraz in vivo9,10. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię odpowiednią do systematycznego wysokoprzepustowego badania cytotoksyczności związków sterowanych światłem. Określamy również efektywność fotoizomeryzacji, szacujemy dawkę światła w tkankach modelowych oraz oceniamy skuteczność in vivo najlepiej działających kandydatów. Podejście to jest zgodne z zasadami bioetyki i opieki nad zwierzętami.

W niniejszej pracy tradycyjne metody przedkliniczne zostały zmodyfikowane, aby zapobiec niekontrolowanej fotoizomeryzacji badanych związków. Ogólnym celem zastosowania tych zmodyfikowanych metod jest opracowanie ogólnej strategii, która jest prosta i szybka oraz dostarcza statystycznie istotnych danych, pozwalających na wiarygodne porównanie aktywności in vitro i uzasadnienie testowania skuteczności in vivo związków fotoprzełączalnych w celu identyfikacji wiodących struktur i ich dalszego rozwoju.

Strategia składa się z trzech kolejnych etapów. Pierwszy etap obejmuje wyznaczenie IC50 (pozorną 50% przeżywalność komórek) w rozcieńczeniach seryjnych dla aktywnych i nieaktywnych fotoform wybranych fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych, z wykorzystaniem dwuwymiarowych (2D, monowarstwa) i trójwymiarowych (3D, sferoidy) kultur komórkowych oraz konfokalnej, wysokoprzepustowej zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Okna fototerapeutyczne są porównywane pod kątem różnicy wartości IC50 między dwiema fotoformami, a następnie wybierane są najlepiej rokujące kandydaty. Zastosowanie zautomatyzowanej mikroskopii oraz innych platform przesiewowych cytotoksyczności (testów) nie daje specyficznej przewagi w ocenie toksyczności11; na tym etapie można by łatwo wdrożyć bardziej złożone komórkowe modele nowotworów12.

W przypadku związków wybranych w kroku 1, drugim etapem jest realistyczna ocena ich wydajności fotoprzełączania wewnątrz tkanek w zależności od głębokości od powierzchni napromieniowanej tkanki poprzez ilościowe określenie wydajności fotoprzełączania mniej aktywnych fotoform w substytucie tkanki z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją UV ekstraktów z napromieniowanych próbek. Wydajność fotoprzełączania mogłaby być badana in vivo, jednak proponujemy zastosowanie prostego substytutu tkanki – siekanego mięsa wieprzowego. Sprawdziliśmy zasadność tego podejścia. Zmierzyliśmy konwersję naszych związków fotoprzełączalnych in vivo na modelu raka u myszy i zaobserwowaliśmy zbliżoną fotokonwersję na głębokościach zmierzonych w poprzednich eksperymentach z myszami8. Można by użyć dowolnej odpowiedniej alternatywnej sztucznej tkanki13, tkanki/organu wydrukowanego biologicznie w 3D14, materiałów z biopsji lub innego zwolnionego z ograniczeń materiału zwierzęcego. Jednakże ten układ stanowi dobry kompromis, ponieważ jest ekonomiczny, szybki i etyczny.

Trzecim krokiem jest oznaczenie skuteczności przeciwnowotworowej in vivo w mysim modelu raka. Do tego eksperymentu wybiera się związki, które wykazały lepsze właściwości w badaniach in vitro oraz efektywnie przełączają się pod wpływem światła na głębokości co najmniej 1-1,5 cm w tkankach modelowych.

Niniejszy protokół można zastosować do związków posiadających różne rodzaje przełączników fotochemicznych, pod warunkiem, że ich fotoformy (lub ich stanu fotostacjonarnego, PSS) są stabilne przez odpowiednio długi czas (kilka dni lub dłużej). W celach ilustracyjnych wykorzystano wcześniej opisany LMB002 pochodny od DAE15. Fotoformy LMB002 są stabilne termicznie i mogą być przechowywane w temperaturze −20 °C przez co najmniej rok bez znaczącej degradacji. Do demonstracji in vitro oraz in vivo wybrano komórki raka płuc Lewisa (LLC), jednak nie wprowadzono żadnych ograniczeń co do typu komórek. Komórki LLC są adhezyjne, łatwo hodowane w 3D i wykorzystywane do generowania tumoroiderów (zgodnie z opisem w literaturze16). Komórki LLC in vivo są wykorzystywane do modelowania procesów przerzutowych i mogą łatwo tworzyć guzy lite u myszy z zachowaną odpornością immunologiczną po wstrzyknięciu podskórnym. Tę metodologię in vivo można uniwersalnie zastosować do innych modeli nowotworowych17,18. Szczegółowa implementacja tej strategii została opisana poniżej.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z lokalnymi i międzynarodowymi przepisami dotyczącymi realizacji projektów badawczych z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych (Ustawa Ukrainy „O ochronie zwierząt przed okrucieństwem”, Europejska konwencja o ochronie kręgowców wykorzystywanych do celów eksperymentalnych i innych celów naukowych (Konwencja europejska, Strasburg, 1986), Dyrektywa 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych). Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną firmy Bienta. W eksperymentach wykorzystano myszy C57BL/6NCrl (dorosłe samice o masie ciała ok. 20 g każda). Specyficzne materiały, odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Ocena IC50 dla LMB002 (formy „zamkniętego pierścienia” i „otwartego pierścienia”) z wykorzystaniem 2D i 3D kultur komórek LLC

  1. Przygotowanie buforów i roztworów stokowych związków
    UWAGA: Przygotuj bufory zgodnie ze standardowymi procedurami. Alternatywnie użyj roztworów dostępnych komercyjnie.
    1. Przygotuj 10-krotny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), dodając 14,2 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl i 2 g KCl do 1 L wody destylowanej. Autoklawuj przygotowany 10x PBS i rozcieńcz go do roztworu 1x, dodając 100 mL roztworu 10x do 900 mL wody destylowanej. Następnie przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj DPBS (Dulbecco's PBS), dodając 4,78 g proszku DPBS do 1 L wody destylowanej. Mieszaj roztwór do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego, sprawdź pH za pomocą pH-metru i skoryguj je, dodając 1 M NaOH lub 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Po osiągnięciu pożądanego poziomu pH przefiltruj medium przez filtr próżniowy 0,22 µm w komorze sterylnej. Przechowuj w 4 °C.
    3. Przygotuj 1 M roztwór buforowy kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), dodając 238,3 g HEPES do 1 L wody destylowanej. Dostosuj pH roztworu za pomocą 1 M NaOH do wartości 7,5. Przefiltruj przez filtr próżniowy 0,22 µm w komorze sterylnej. Przechowuj w 4 °C.
    4. Przygotuj 1-krotny roztwór trypsyny-EDTA (EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy) poprzez rozcieńczenie roztworu 10x. W tym celu dodaj 5 mL 10x Trypsyny-EDTA do 45 mL roztworu 1x PBS w sterylnej probówce o pojemności 50 mL. Przechowuj w 4 °C.
    5. Przygotuj podstawowe medium DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), dodając 13,4 g proszku DMEM z wysoką zawartością glukozy oraz 3,7 g Na2CO3 do 1 L wody destylowanej w cylindrze z mieszadłem magnetycznym umieszczonym na mieszalniku. Mieszaj roztwór do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego, sprawdź pH za pomocą pH-metru i skoryguj je, dodając 1 M NaOH lub 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Po osiągnięciu pożądanego pH przefiltruj medium przez filtr próżniowy 0,22 µm w komorze sterylnej i przechowuj w 4 °C.
    6. Przygotuj pełne medium DMEM, dodając 100 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mL roztworu penicyliny-streptomycyny, 10 mL roztworu L-glutaminy oraz 10 mL buforu HEPES 1 M do 900 mL podstawowego medium DMEM. Przechowuj w 4 °C.
    7. Przygotuj roztwory stokowe dla badanych związków.
      1. Dla każdego związku odważ dwie porcje po 5,12 mg (np. LMB002) w formie fotoizomeru o zamkniętym pierścieniu do dwóch probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL (jedna z przezroczystymi, a druga z czarnymi, nieprzezroczystymi ściankami). Odważ 2,28 mg kontroli pozytywnej (np. gramicydyny S) do probówki z przezroczystymi ściankami. Do każdej próbki dodaj 100 µL czystego DMSO i mieszaj w vortexie przez 30 s.
      2. Przeprowadź fotoizomeryzację roztworu stokowego (LMB002) w probówce z przezroczystymi ściankami z formy „zamkniętej” na formę „otwartą”, naświetlając roztwór laserem 660 nm (gęstość mocy światła 0,6 W/cm2) z jednoczesnym mieszaniem w vortexie w celu zapewnienia dokładnego wymieszania. Kontynuuj do momentu, aż kolor wyraźnie zmieni się z ciemnofioletowego na jasnobrązowy. Chroń przed światłem, używając folii aluminiowej.
  2. Eksperyment z hodowlą komórek 2D – wysiewanie komórek (dzień 1)
    1. Przenieś 10 mL pełnego medium DMEM z kolby T-75 z hodowlą komórek LLC do sterylnej probówki o pojemności 15 mL. Odessaj pozostałe medium za pomocą pompy próżniowej.
    2. Przemyj hodowlę komórkową 5 mL 1x DPBS i odessaj roztwór pompą próżniową.
    3. Przykryj komórki 3 mL roztworu 1x trypsyny-EDTA i inkubuj kolbę przez 2-3 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
    4. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 6 mL medium DMEM (wcześniej przeniesionego do sterylnej probówki) do kolby z hodowlą komórkową zawierającej roztwór 1x trypsyny-EDTA i pipetuj zawiesinę kilka razy, aby odczepić komórki od ścianek kolby.
    5. Przenieś zawiesinę do probówki 15 mL i odwiruj przy 200 × g przez 4 min. Po wirowaniu odessaj nadsącz pompą próżniową. Unikaj dotykania granulatu komórkowego na dnie probówki.
    6. Resuspenduj komórki, dodając 2 mL świeżego pełnego medium DMEM i pipetując kilka razy.
    7. Policz komórki, pobierając około 15 µL zawiesiny do probówki 0,5 mL, dodając 15 µL 0,4% błękitu trypanu i przenosząc otrzymaną mieszaninę do komory do liczenia komórek.
    8. Po policzeniu przygotuj 25 mL zawiesiny komórkowej na jeden punkt czasowy. Wysiej 5 000-10 000 (średnio 8 000) komórek LLC/dołek w 200 µL DMEM w centralnych 60 dołkach płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem i czarnymi nieprzezroczystymi ściankami. Pozostałe 36 dołków wypełnij czystym DMEM.
    9. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Pod spód podłóż plastikowe pokrywki od płytek, aby zapobiec niernomiernemu nagrzewaniu się dna płytki.
  3. Eksperyment z hodowlą komórek 2D – dodawanie związków (dzień 2)
    1. Monitoruj komórki na płytkach za pomocą mikroskopii świetlnej, aż osiągną 70%-80% konfluencji.
    2. Odessaj medium z dołków za pomocą pompy próżniowej w komorze sterylnej. Dodaj 100 µL świeżego, uprzednio podgrzanego medium DMEM i umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowej.
    3. Przygotuj rozcieńczenia seryjne badanych związków i kontroli pozytywnej w autoklawowanych, przezroczystych płytkach polipropylenowych. Przygotuj następujące roztwory dla pomiarów w poszczególnych punktach czasowych:
      UWAGA: Zacznij od roztworów stokowych w DMSO i rozcieńczaj w DMEM, ale nie przekraczaj 1% v/v DMSO w końcowym najwyższym stężeniu.
      1. Aby otrzymać roztwór gramicydyny S o stężeniu 128 µM, dodaj 1,3 µL roztworu stokowego 20 mM do 198,7 µL DMEM.
      2. Aby otrzymać roztwór LMB002 w formie „otwartej” o stężeniu 256 µM, dodaj 1,3 µL roztworu 40 mM do 198,7 µL DMEM.
      3. Aby otrzymać roztwór LMB002 w formie „zamkniętej” o stężeniu 512 µM, dodaj 2,6 µL roztworu stokowego 40 mM do 197,4 µL DMEM.
    4. Wykonaj trzy dodatkowe powtórzenia, aby uzyskać cztery zestawy dla każdego punktu stężenia. Przygotuj serię dwukrotnych rozcieńczeń, odsysając 100 µL z każdego początkowego dołka, przenosząc do dołka z 100 µL DMEM i dokładnie mieszając.
      UWAGA: Praca ze związkami fotoprzełączalnymi wymaga dostosowania oświetlenia, aby zapobiec odwrotnej fotoizomeryzacji. Zaleca się wyłączanie światła w komorach sterylnych.
    5. Uzyskaj końcowe stężenia związków w dołkach (5-150 µM), przenosząc za każdym razem 100 µL przygotowanych roztworów do 56 dołków zawierających 100 µL wcześniej dodanego DMEM. Do czterech dołków dodaj za każdym razem 100 µL DMEM, aby służyły jako kontrola negatywna.
    6. Przykryj płytki folią aluminiową lub plastikową nieprzezroczystą osłoną ochronną, aby zapobiec niekontrolowanemu fotoprzełączaniu. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C (używając dodatkowych plastikowych pokrywek pod spodem) na wybrany czas inkubacji (10 min, 60 min, 24 h lub 72 h).
  4. Eksperyment z hodowlą komórek 2D – barwienie i obrazowanie (dni 2-5)
    1. Po inkubacji ze związkami przez różne okresy, dodaj 50 µL roztworu barwiącego na dołek do płytek, które były inkubowane ze związkami przez 10 i 60 min. Inkubuj płytki w 37 °C przez 20 min.
      UWAGA: Przygotuj stokowe roztwory barwiące dla każdego punktu czasowego, dodając 8 µL roztworu Hoechst 33342 20 mM (stężenie końcowe 5 µM), 32,5 µL roztworu jodku propidyny (PI) 1 mM (stężenie końcowe 1 µM) i 650 µL niesterylnej FBS do 5 810 µL niesterylnego 1x PBS. Podgrzej FBS i PBS w kąpieli wodnej w 37 °C, aby zapobiec szokowi termicznemu komórek.
    2. Wykonaj zautomatyzowane obrazowanie fluorescencyjne przy użyciu obiektywu 20x.
    3. Powtórz tę samą procedurę barwienia i obrazowania (kroki 1.4.1 - 1.4.2) dla płytek, które były inkubowane ze związkami przez 24 (dzień 3) i 72 (dzień 5) h.
      UWAGA: Typowe mapy płytek 2D przedstawiono na Rysunku 2.
  5. Eksperyment z hodowlą komórek 3D – wysiewanie komórek (dzień 1)
    ​UWAGA: Kroki w tej sekcji są identyczne z tymi opisanymi dla eksperymentu 2D – przygotowanie hodowli komórkowej, inkubacja z badanymi związkami i obrazowanie (kroki 1.1-1.4.). Jednak w tym przypadku komórki są przygotowywane jako zwarte dojrzałe sferoidy w 384-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji i czarnymi, nieprzezroczystymi ściankami. Użycie płytki o takim rozmiarze pozwala na porównanie dwóch związków w jednym eksperymencie.
    1. Powtórz kroki 1.2.1-1.2.9 z protokołu eksperymentu 2D dla hodowli komórek LLC.
    2. Po policzeniu komórek przygotuj 25 mL zawiesiny komórkowej. Wysiej 1 000 komórek na dołek we wszystkich dołkach w 50 µL DMEM w 384-dołkowej płytce o niskim wiązaniu z dnem w kształcie litery U.
    3. Odwiruj przy 40 × g przez 30 s i potrząśnij na wstrząsarce do płytek przy 250 obr./min przez 1 min, aby odczepić komórki od ścianek dołków i przesunąć je na dno.
    4. Umieść płytki w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2 na dodatkowych plastikowych pokrywkach od płytek, aby zapobiec niernomiernemu nagrzewaniu się dna płytki, na 48 h.
  6. Eksperyment z hodowlą komórek 3D – dodawanie związków (dzień 3)
    1. Monitoruj komórki na płytkach za pomocą mikroskopii, aby upewnić się, że utworzyły się zwarte dojrzałe sferoidy.
    2. Przygotuj rozcieńczenia seryjne badanych związków w autoklawowanych, przezroczystych płytkach polipropylenowych. W tym przypadku dołącz dodatkowy związek. Przygotuj następujące roztwory dla pomiarów w poszczególnych punktach czasowych:
      1. Aby otrzymać roztwory gramicydyny S o stężeniu 175 µM i 350 µM, dodaj odpowiednio 1,8 µL roztworu stokowego 20 mM do 198,2 µL DMEM oraz 3,6 µL roztworu stokowego do 196,4 µL DMEM.
      2. Aby otrzymać roztwory LMB002 w formie „otwartej” o stężeniu 175 µM i 350 µM, dodaj odpowiednio 1 µL roztworu stokowego 40 mM do 199 µL DMEM oraz 1,8 µL roztworu stokowego do 198,2 µL DMEM.
      3. Aby otrzymać roztwory LMB002 w formie „zamkniętej” o stężeniu 350 µM i 1 750 µM, dodaj odpowiednio 1,8 µL roztworu stokowego 40 mM do 198,2 µL DMEM oraz 8,8 µL roztworu stokowego do 191,2 µL DMEM.
    3. Wykonaj trzy dodatkowe powtórzenia, aby uzyskać cztery zestawy dla każdego punktu stężenia. Uzyskaj rozcieńczenia seryjne, pobierając 20 µL z każdego początkowego dołka, przenosząc do dołka z 180 µL DMEM i dokładnie mieszając.
      ​UWAGA: Praca ze związkami fotoprzełączalnymi wymaga dostosowania oświetlenia, aby zapobiec odwrotnej fotoizomeryzacji. Zaleca się wyłączanie światła w komorach sterylnych.
    4. Uzyskaj końcowe stężenia związków w dołkach, przenosząc za każdym razem 20 µL przygotowanych roztworów do 128 dołków zawierających 50 µL DMEM. Do trzech dołków dodaj za każdym razem 20 µL DMEM, aby służyły jako kontrola. Przykryj płytki folią aluminiową lub plastikową osłoną ochronną, aby zapobiec fotoprzełączaniu lub parowaniu.
    5. Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowej na plastikowych pokrywkach od płytek na wybrany czas inkubacji.
  7. Eksperyment z hodowlą komórek 3D – barwienie i obrazowanie (dni 3-6)
    1. Przygotuj roztwór barwiący dla każdego punktu czasowego, dodając 13 µL roztworu kalceiny AM 1 mM (stężenie końcowe 1 µM), 22 µL roztworu Hoechst 33342 20 mM (stężenie końcowe 33 µM), 40 µL roztworu PI 1 mM (stężenie końcowe 3 µM), 300 µL niesterylnej FBS do 2 625 µL niesterylnego 1x PBS. Podgrzej FBS i PBS w kąpieli wodnej w 37 °C, aby zapobiec szokowi termicznemu komórek.
    2. Po inkubacji ze związkami przez różne okresy, dodaj 20 µL roztworu barwiącego na dołek do dołków, które były inkubowane ze związkami przez 10 min. Inkubuj w 37 °C przez 2 h.
    3. Wykonaj konfokalne obrazowanie fluorescencyjne przy użyciu obiektywu 20x.
    4. Powtórz tę samą procedurę barwienia i obrazowania dla dołków, które były inkubowane ze związkami przez 24 (dzień 4) i 72 (dzień 6) h.
      UWAGA: W tym eksperymencie kalceina AM jest używana jako trzeci składnik wielokolorowego roztworu barwiącego. Obrazy uzyskane z eksperymentów 2D i 3D są analizowane za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do analizy obrazu instrumentu. Komórki współbarwione barwnikami Hoechst i jodkiem propidyny są uznawane za martwe nekrotycznie, a ich frakcja w funkcji stężenia jest wykorzystywana do obliczenia wartości IC50.

Schemat testu mikrorozcieńczeń w układzie szachownicy; oddziaływanie LMB002 i gramicydyny S; badanie synergizmu antybiotyków.
Rycina 2: Przykład typowych map płytek dla eksperymentów z kulturą 2D. Podano kody kolorystyczne dla związków i kontroli. Stężenia badanych związków (liczby wewnątrz studzienek) podano w µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Wyznaczenie wydajności przełączania fotochemicznego w substytucie tkanki

  1. Zmontuj układ optyczny do naświetlania próbki zgodnie z Rysunkiem 3 (składający się z kabla optycznego z laserowego źródła światła, soczewki o zmiennej ogniskowej, strzykawki z nieprzezroczystą osłoną i płaskim ciętym końcem).
    1. Poprzez zmianę ogniskowej i apertury soczewki uzyskaj płaską wiązkę światła o średnicy o 1-1,5 mm większej od średnicy wewnętrznej użytej strzykawki, która nadal mieści się w jak największym stopniu w aperturze.
  2. Użyj strzykawki o pojemności 5 mL z ciętym końcem i średnicą wewnętrzną 12,4 mm, osłoniętej nieprzezroczystą plastikową osłoną. Przy mocy wyjściowej lasera 200 mW ustaw gęstość mocy na wyjściu układu optycznego na poziomie ~103 mW/cm2, zmierzoną fotometrem.
    UWAGA: Wszystkie kolejne czynności muszą być wykonywane w zaciemnionym pomieszczeniu przy minimalnym możliwym oświetleniu stanowiska pracy.
  3. Przygotuj 3 mL roztworu zapasowego LMB002 (forma „zamknięta”) w PBS o stężeniu 1 mg/mL.
  4. Przygotuj w plastikowym pojemniku modelową próbkę tkanki obciążonej nieaktywną fotoformą LMB002. W typowym przebiegu 5 g świeżego, zmielonego mięsa wieprzowego miesza się mechanicznie z 277 µL roztworu zapasowego LMB002 oraz 260 µL PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mg/kg w próbce oraz stosunek tkanka/PBS wynoszący ~9/1 (v/v).
  5. Wypełnij strzykawkę przygotowaną próbką, upewniając się, że wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza, i uformuj płaską powierzchnię na końcu naświetlanym (ciętym).
    UWAGA: Cylinder próbki w strzykawce musi zajmować ~40 mm wzdłuż osi.
  6. Naświetlaj próbkę w układzie optycznym zgodnie z Rysunkiem 3 przez 9 min 44 s, co odpowiada dawce ekspozycji ~60 J/cm2.
  7. Po naświetlaniu przygotuj plastry próbki o grubości 4 mm, wypychając ją ze strzykawki za pomocą tłoka i wycinając skalpelem. Zważ plastry, umieść je w osobnych probówkach i oznacz średnią odległością (mm) od powierzchni naświetlanej.
  8. Przygotuj dwie próbki kontrolne (optymalna ilość, 0,5-0,7 g) w probówkach: w jednej zmielone mięso zmieszane z 10% (objętościowo) PBS (54 µL), a w drugiej modelową próbkę tkanki uzyskaną w kroku 2.4, naświetloną światłem lasera o mocy 500 mW przez 10 min, aby zapewnić konwersję wszystkich cząsteczek LMB002 formy „zamkniętej” do formy „otwartej”.
  9. Do każdego plastra i próbek kontrolnych dodaj mieszaninę acetonitrylan-woda (70%/30% v/v, uzupełnioną o 0,01% kwasu trifluorooctowego (TFA), 1,4 mL/g). Zawartość dokładnie wymieszaj szklaną bagietką.
  10. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 min, a następnie wiruj mieszaniny przy 5220 x g przez 20 min lub wiruj przy 20 x g przez 30 min dwukrotnie, aby usunąć nierozpuszczalny materiał i zebrać nadfiltr.
  11. Ostrożnie zbierz nadfiltry (~0,7 mL) i ponownie je odwiruj przy 16 000 x g przez 30 min.
  12. Zbierz nadfiltry (po ~0,5 mL każdy) i przeanalizuj je za pomocą odwrotnej fazy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (RP HPLC) z kolumną analityczną C18, liniowym gradientem A:B 3,46% B/min, szybkością przepływu 2,0 mL/min i objętością wtrysku 100 µL. Zarejestruj chromatogramy wykrywane UV przy 570 nm (detekcja formy „zamkniętej”) i 270 nm (detekcja formy „otwartej”). Użyj próbek nienaświetlanych (krok 2.4) i kontrolnych naświetlanych (krok 2.8), aby wyznaczyć specyficzne czasy retencji obu fotoform (eluent A: wodny 0,1% TFA; eluent B: 90% acetonitrylan-woda, 0,1% TFA) i skalibrować metodę.
  13. Wyznacz rzeczywiste ilości fotoform LMB002 w analizowanych próbkach przy użyciu krzywych kalibracyjnych uzyskanych poprzez rejestrację i analizę chromatogramów roztworów LMB002 o znanych stężeniach. Do kalibracji przygotuj roztwory LMB002 formy „zamkniętej” poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego (krok 2.3) mieszaniną acetonitrylan-woda (70%/30% v/v uzupełnioną o 0,01% TFA), aby uzyskać 0,36, 0,9 i 3,6 µg na 100 µL (objętość wtrysku); gradient eluentu i szybkość przepływu są takie same jak w kroku 2.12.
  14. Powtórz eksperyment (kroki 2.4-2.12) trzy razy i nanieś znormalizowany procent każdej fotoformy na wykres (procent) w funkcji odległości (od powierzchni naświetlanej tkanki). Oblicz statystyki (tj. odchylenie standardowe dla każdego punktu stężenia).

Schemat wzbudzenia optycznego i układ do spektroskopii absorpcji przejściowej z laserami i soczewkami.
Rysunek 3: Układ eksperymentalny do wyznaczania wydajności fotokonwersji w tkance modelowej. (A) Schemat i (B) fotografia; 1, kabel optyczny z laserowego źródła światła; 2, soczewka o zmiennej ogniskowej; oraz 3, mieszanina mielonego mięsa-LMB002-fosforanu sodu (PBS) umieszczona w 4, strzykawce z nieprzezroczystą osłoną i uciętym przodem (pokazana na (B) bez osłony). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Wyznaczenie skuteczności przeciwnowotworowej in vivo

UWAGA: Harmonogram eksperymentu i punkty końcowe przedstawiono na Rysunku 4. Standardy opieki nad zwierzętami w okresie po leczeniu powinny być zgodne z zasadami 3R – zakwaterowanie powinno obejmować odpowiednią gęstość obsady klatek oraz dostępność zasobów. W miarę możliwości należy stosować nieawersyjne metody obchodzenia się ze zwierzętami, takie jak użycie tunelu lub chwytaka.

Schemat osi czasu eksperymentu leczenia nowotworu; konfiguracja napromieniowania guza; badanie na modelu mysim.
Rysunek 4: Harmonogram eksperymentu terapeutycznego in vivo. Wyznaczenie grup eksperymentalnych, szczegóły terapii, punkty końcowe oraz harmonogramy analiz post mortem. Skróty: LLC = rak płuca Lewisa; IV = dożylnie; SC = podskórnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie komórek nowotworowych do inokulacji podskórnej (dzień 0).
    1. Prowadzić pasaż komórek LLC w medium DMEM (4,5 g/L glukozy) z dodatkiem 10% FBS, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    2. Zebrać komórki za pomocą 0,05% roztworu trypsyny-EDTA, odwirować i zawiesić w medium DMEM bez surowicy.
    3. Policzyć komórki i określić ich żywotność za pomocą hemocytometru i testu wykluczania trypanu niebieskiego.
    4. Przygotować końcową zawiesinę komórkową o stężeniu 10 × 106 komórek/mL w mieszaninie DMEM i Matrigelu (1:1). Przed wstrzyknięciem przechowywać zawiesinę w lodzie.
  2. Inokulacja komórek LLC (dzień 0)
    1. Umieścić dorosłą samicę myszy C57BL/6NCrl (o masie ~20 g) w komorze indukcyjnej aparatu do znieczulenia izofluranem. Przeprowadzić sedację przy użyciu 5% izofluranu i poczekać do pełnej utraty przytomności zwierzęcia.
    2. Usunąć sierść z miejsca inokulacji komórek poprzez zgolenie.
    3. Wstrzyknąć 5 × 105 komórek LLC w ~100 µL mieszaniny DMEM:Matrigel (1:1) do prawej kończyny tylnej.
      UWAGA: W miarę możliwości przestrzegać zasady jednorazowego użycia igły.
  3. Podanie związku i fotoirradiacja
    UWAGA: W 5-8 dniach po inokulacji zwierzęta są gotowe do leczenia, gdy guzy są wyczuwalne w dotyku i osiągnęły objętość ~50-100 mm3. Wszystkie kolejne operacje z LMB002 oraz pracę z myszami traktowanymi tym związkiem należy przeprowadzać w warunkach półmroku (jedna lampa LED 4 W w odległości co najmniej 5 m od miejsca pracy).
    1. Rozpuścić LMB002 (forma „ring-closed”) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do stężenia 1 mg/mL dla dawki 5 mg/kg (IV), aby uzyskać ciemnoniebieskie, jednorodne roztwory.
    2. Przed irradiacją utworzyć losowo cztery grupy po osiem zwierząt i usunąć sierść z obszaru guza oraz okolicznych części ciała poprzez zgolenie.
    3. Umieścić mysz w uchwycie do wtrysków IV i rozgrzać ogon zwierzęcia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby żyła ogonowa była widoczna.
      UWAGA: Rozważyć zastosowanie analgezji przedoperacyjnej.
    4. Wstrzyknąć związek z prędkością 5 mL/kg do żyły ogonowej. W dwóch grupach kontrolnych wstrzyknąć do każdego zwierzęcia (masa ciała 20 g) 100 µL soli fizjologicznej (dożylnie). Upewnić się, że zwierzęta w dwóch grupach eksperymentalnych otrzymały badany związek w nieaktywnej fotoformie (1 mg/mL w soli fizjologicznej).
      UWAGA: W miarę możliwości przestrzegać zasady jednorazowego użycia igły.
    5. Następnie, 2 h 45 min po wstrzyknięciu związku, poddać mysz znieczuleniu. Indukować sedację 3%-4% izofluranem w tlenie. Utrzymać znieczulenie przez 15 min przy użyciu 0,5%-1% izofluranu w tlenie.
    6. Przykryć mysz czarną maską z otworem eksponującym na światło tylko obszar guza.
    7. Włączyć moduł diody laserowej z laserem 650 nm, ustawiając moc czerwonego lasera na 200 mW, a niebieskiego/UV lasera prowadzącego na 2 mW.
      UWAGA: Podczas pracy urządzenia laserowego używać niebieskich okularów ochronnych.
    8. Zmierzyć fotometrem strumień światła czerwonego lasera (z dala od myszy) i wyznaczyć odległość od kabla optycznego, przy której strumień światła wynosi 100 mW/cm2. Przymocować kabel do statywu, aby źródło światła znajdowało się w wyznaczonej odległości od guza, a światło obejmowało cały obszar nowotworu. Podczas tej procedury używać światła niebieskiego/UV lasera prowadzącego.
    9. Włączyć czerwony laser, aby naświetlać obszar guza przez 20 min.
    10. Po irradiacji wyłączyć przepływ izofluranu, zwrócić zwierzę do klatki i uważnie obserwować jego stan przez kolejne 30 min.
      UWAGA: Po podaniu związku trzymać myszy w ciemności przez 2 dni. Należy zmienić jedynie cykl dobowy światła; wszystkie pozostałe warunki utrzymania zwierząt powinny pozostać niezmienione.
  4. Obserwacje po leczeniu
    1. Obserwować zwierzęta codziennie, mierząc masę i wymiary ich guzów. Pomiar objętości guza i odnotować postęp nekrozy.
      UWAGA: Standardy opieki nad zwierzętami w okresie po leczeniu powinny być zgodne z zasadami 3R – zakwaterowanie powinno obejmować odpowiednią gęstość obsady klatek i dostępność zasobów.
    2. Wykorzystać dane zebrane w poprzednim kroku do oceny śmiertelności. Wyznaczyć wskaźnik przeżywalności zgodnie ze standardową procedurą.
      UWAGA: Zwierzęta należy uśmiercić i zaliczyć jako martwe w przypadku wystąpienia ciężkich objawów klinicznych (utrata masy ciała o więcej niż 15%, niegojąca się w ciągu 7 dni owrzodzenie guza oraz wokalizacja) lub gdy objętość guza osiągnie 2 500 mm3.

Wyniki

W niniejszej pracy przeprowadzono eksperymenty komórkowe 2D i 3D w celu wyznaczenia wartości IC50 dla form „ring-closed” (zamknięty pierścień) i „ring-open” (otwarty pierścień) LMB002 (patrz Rycina 1) przy różnych czasach inkubacji. Wartości te porównano z wynikami uzyskanymi dla peptydu prototypowego, gramicydyny S (użytej jako kontrola pozytywna). Typowy zestaw obrazów inkubacji w hodowli LLC w 2D po barwieniu przedstawiono na Rycynie 5. Podwójne barwienie Hoechst 33342 (niebieski) i jodkiem propidyny (czerwony), skutkujące różnymi odcieniami fioletu w większej frakcji komórek w przypadku zastosowania formy „ring-open” w porównaniu do formy „ring-closed”, wskazuje na zauważalną różnicę w cytotoksyczności między dwiema formami, którą można łatwo ilościowo określić. Przedstawiony przykład udanego eksperymentu oparto na danych zebranych przy użyciu płytek 96-dołkowych, do których dodano warianty peptydów w różnych stężeniach, jak pokazano na Rycynie 2. Podobne dane można uzyskać za pomocą płytek 384-dołkowych i płytek o wysokiej gęstości. Jednak ze względu na mniejsze objętości w każdym dołku, błędy techniczne i systematyczne, a w konsekwencji dokładność wyznaczania IC50, będą maleć wraz ze wzrostem gęstości dołków.

Wyniki testu żywotności komórek, mikroskopia fluorescencyjna, działanie LMB002 i Gramicydyny S w czasie.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy z testu cytotoksyczności w monowarstwie LLC. Komórki barwiono Hoechst 33342 (niebieski) oraz jodkiem propidyniowym (czerwony). Wskazane czasy: 10 min, 60 min, 24 h i 72 h to czasy inkubacji z związkami. Paski skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fotokonwersję LMB002 pod wpływem naświetlania laserowego w tkance modelowej – świeżym mielonym mięsie wieprzowym – określono przy użyciu próbki składającej się z mielonego mięsa zmieszanego z LMB002 w formie „zamkniętego pierścienia” (nieaktywnej) rozpuszczonej w PBS, a następnie mierząc konwersję tej nieaktywnej formy w formę „otwartego pierścienia” (aktywną) LMB002 w kierunku propagacji promieniowania. Próbkę umieszczono w strzykawce i naświetlono z jednej strony płaską wiązką promieniowania laserowego przez czas ekspozycji wynoszący ~10 min (zazwyczaj stosowany w eksperymentach in vivo ), jak pokazano na Rycine 3. Po ekspozycji walec z próbką podzielono na części, naciskając tłok strzykawki i wycinając plasterki o tej samej wysokości za pomocą skalpela. Stężenie LMB002 w formie „otwartego pierścienia” w ekstraktach z plasterków oznaczono metodą RP HPLC.

Rysunek 6 przedstawia krzywe dawka-efekt Rysunek 6A-D uzyskane z analizy danych. Aby określić procent martwych komórek z jednoczesnym barwieniem jąder barwnikami Hoechst 33342 i PI, zastosowano wbudowane narzędzie klasyfikujące, które ustawia progi numeryczne dla wybranych mierzonych parametrów w celu podzielenia wszystkich zliczeń komórek na kilka kategorii. Na przykład, gdy sygnał w kanale czerwonym (jodek propidyny) w kontroli znajdował się na poziomie progu (około 110-130 jednostek), komórki mogły zostać zaklasyfikowane jako PI-dodatnie, uznane za martwe, lub PI-ujemne, uznane za niepodatne na działanie związków. W przypadku LMB002 widoczne są sigmoidalne zależności procentu komórek dodatnich pod względem jodku propidyny od stężenia związku. Na podstawie tych danych można wyznaczyć wartości IC50.

Analiza żywotności komórek, krzywe dawka-odpowiedź, wykres, związki LMB002, komórki PI-dodatnie, stężenie.
Rycina 6: Analiza cytotoksyczności w hodowli 2D. Dopasowania sigmoidalne otrzymane dla hodowli LLC w przedziałach czasowych inkubacji ze związkami wynoszących (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h oraz (D) 72 h. Dopasowanie pozwala na dokładne wyznaczenie wartości IC50 (nie pokazano). Słupki błędów oznaczają SEM. Skróty: LLC = rak płuca Lewisa; PI = jodek propidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Biorąc pod uwagę uzyskane wartości IC50, można wywnioskować, że toksyczność wszystkich trzech związków wzrastała wraz z czasem inkubacji. Nasz eksperyment wykazał, że forma „otwartego pierścienia” LMB002 jest mniej toksyczna o około jeden stopień rozcieńczenia niż peptyd prototypowy, gramicydyna S. Natomiast forma „zamkniętego pierścienia” wykazuje toksyczność niższą o trzy do czterech stopni rozcieńczenia, co zwiększa się wraz z czasem inkubacji. Różnica między tymi dwoma stopniami rozcieńczenia nie jest zależna od wydłużenia czasu inkubacji i może być stosowana numerycznie jako eksperymentalnie wyznaczone okno fototerapeutyczne6 do porównania z innymi związkami w potencjalnym skriningu biblioteki. Wartość IC50 dla gramicydyny S została przyjęta jako punkt odniesienia w celu korekty błędów eksperymentalnych lub zróżnicowanych wyników w biologicznych powtórzeniach.

Eksperymenty na komórkach 3D dostarczyły tego samego rodzaju surowych danych – obrazów sferoidów z rozdzielczością pojedynczych komórek, z jednym obrazem na każdą studzienkę. Zastosowanie kalceiny jako trzeciego barwnika umożliwia ilościowe oznaczenie frakcji komórek metabolicznie aktywnych (obserwowanych w kanale zielonym). Dzięki zastosowaniu płytek 384-dołkowych, zwiększeniu liczby powtórzeń technicznych, wykluczeniu nadmiarowych punktów czasowych wspólnej inkubacji oraz zmianie stopnia rozcieńczenia, byliśmy w stanie bezpośrednio porównać kilka związków w ramach jednego przebiegu testowego (przy użyciu jednej płytki), co zilustrowano na mapie płytki na Rysunku 7.

Wykres testu żywotności komórek w zależności od czasu; stężenia leków, od 10 min do 72 h, dane oznaczone kolorami.
Rycina 7: Mapa płytki dla eksperymentu z hodowlą 3D z wykorzystaniem dwóch związków. Podano kody kolorystyczne dla związków oraz kontroli. Liczby w dołkach oznaczają stężenia w µM. 10 min, 24 h oraz 72 h to czasy inkubacji. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 8 przedstawia obrazy wybranych powtórzeń technicznych sferoidów LLC hodowanych w gęstości 1 sferoidu/studzienkę w obecności testowanych związków oraz sferoidów kontrolnych zarejestrowane po barwieniu.

Analiza immunofluorescencyjna; odpowiedź komórkowa na LMB002 i gramicydynę S; poklatkowe obrazy mikroskopowe.
Rycina 8: Reprezentatywne obrazy z analizy cytotoksyczności w kulturze 3D. Obrazy przedstawiają 48-godzinne sferoidy LLC barwione Hoechst 33342 (niebieski), calceiną AM (zielony) i jodkiem propidyny (czerwony) po 10 min, 24 h i 72 h wspólnej inkubacji z fotoformami LMB002 oraz gramicydyną S. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przy użyciu oprogramowania instrumentu uzyskano krzywe dawka-efekt, analogiczne do tych z eksperymentu 2D, na podstawie stosów obrazów z serii z-stack (Rysunek 9A). Dodatkowo, zwarte i nienaruszone sferoidy w hodowlach 3D można było scharakteryzować za pomocą średnicy całego sferoidu (Rysunek 9B). Zauważono również, że całkowita średnica sferoidów zmienia się w zależności od stężenia związku.

Wykresy żywotności komórek i wielkości sferoidów w zależności od stężenia; test PI; analiza danych time-lapse.
Rysunek 9: Ocena cytotoksyczności w hodowlach 3D. (A) Krzywe dopasowania cytotoksyczności zależnej od stężenia oraz (B) wykresy średnicy sferoidów zależnej od stężenia, uzyskane w hodowlach 3D LLC inkubowanych wspólnie z gramicydyną S przez 10 min, 24 h i 72 h i zarejestrowane przed barwieniem. Słupki błędów oznaczają SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z Kroku 2 umożliwia oznaczenie stężeń LMB002 dla obu fotoform z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją UV. Wydajność fotokonwersji w tkankach modelowych została łatwo oceniona i ilościowo określona przy użyciu tego układu (Rysunek 3). Dane uzyskano z analizy ilościowej chromatogramów ekstraktów z próbek. W tych eksperymentach testowych chromatogramy LMB002 wykrywano spektroskopowo przy 270 nm i 570 nm. Przy 270 nm zaobserwowano wiele dodatkowych sygnałów, które przypisano związkom współekstrahowanym z tkanki modelowej (zweryfikowano na podstawie ekstraktu kontrolnego bez związku). Obie fotoformy różniły się znacząco czasami retencji i absorbancją. Jednakże sygnał formy „otwartej” LMB002 był oddzielony od sygnałów tła do linii bazowej (patrz reprezentatywny chromatogram na Rysunku 10A). W związku z tym sygnał ten można bez problemu zintegrować. Przy 570 nm chromatogramy zawierały jedynie sygnał formy „zamkniętej” LMB002 (Rysunek 10B). Tutaj wykonaliśmy oznaczenie stężenia za pomocą RP HPLC. Niemniej jednak, stosując LC/MS jako metodę analityczną, można uzyskać jeszcze wyższą dokładność i niższe granice detekcji.

Wyniki chromatografii; wykresy widm UV-VIS pokazujące piki rozdzielenia związków w funkcji czasu.
Rycina 10: Reprezentatywne chromatogramy LMB002 wyekstrahowanego z tkanek modelowych. (A) Próbka w odległości 2 mm od naświetlonej powierzchni, rejestrowana przy 270 nm (obliczony całkowy obszar piku dla formy „otwartej” LMB002); (B) próbka w odległości 38 mm od naświetlonej powierzchni, rejestrowana przy 570 nm (obliczony całkowy obszar piku dla formy „zamkniętej” LMB002). Wartości czasu retencji (podane na wykresach) dodatkowo potwierdziły tożsamość związku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dane uzyskane po zintegrowaniu odpowiednich sygnałów ze wszystkich zebranych próbek wykorzystano do sporządzenia wykresów zależności stężenia od głębokości, przedstawionych na Rysunku 11. Na podstawie tych wykresów łatwo oceniono wydajność fotokonwersji na różnych głębokościach tkanki modelowej. Potwierdza to, że nasze źródło czerwonego światła indukuje fotokonwersję LMB002 do formy „zamkniętego pierścienia” na głębokości do 1 c w substytucie tkanki, jakim jest mielone mięso (przy mocy około 103 mW/cm2).

Wykres stężenia substancji aktywowanych i nieaktywowanych A (mg/kg) w funkcji odległości L (mm).
Rycina 11: Ocena wydajności fotokonwersji. Stężenie (A, mg/kg) form „zamkniętego pierścienia” (nieaktywowana, niebieskie kropki) oraz „otwartego pierścienia” (aktywowana, pomarańczowe kropki) LMB002 w różnych odległościach od naświetlonej powierzchni modelowej tkanki (L, mm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki eksperymentu in vivo – krok 3 naszej metodologii, przeprowadzonego zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 4 – przedstawiono na wykresach obrazujących wzrost guza w funkcji czasu (Rysunek 12) oraz krzywych przeżycia Kaplana-Meiera (Rysunek 13).

Wykres wzrostu guza; porównanie grup naświetlanych z placebo i LMB002 w ciągu 20 dni; objętość względem czasu.
Rycina 12: Dynamika wzrostu guza u zwierząt. Zwierzęta leczone LMB002 w porównaniu do zwierząt leczonych placebo (podskórny model allograftu LLC u myszy C57BL/6NCrl, dawka związku 7 mg/kg, IV, inkubacja przez 2 h 40 min, następnie naświetlanie przy 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres przeżywalności Kaplana-Meiera; grupa kontrolna (vehicle) naświetlona vs. leczenie LMB002, dni po zastosowaniu leczenia.
Rysunek 13: Krzywe śmiertelności zwierząt. Zwierzęta leczone LMB002 w porównaniu do zwierząt leczonych placebo (model allograftu LLC podskórnego u myszy C57BL/6NCrl, dawka związku 7 mg/kg, IV, inkubacja przez 2 h 40 min, następnie naświetlanie falą o długości 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Związki kontrolowane w świetle nie mają precedensu w opracowywaniu leków; Nie ustalono jednak metod ich oceny przedklinicznej i klinicznej. Najbliższa analogia monoterapii, terapia fotodynamiczna (PDT), jest metodą leczenia raka do użytku klinicznego przyjętą przez wiele krajów i jest w trakcie opracowywania dla innych wskazań19,20. Podobnie jak fotofarmakologia, PDT również opiera się na wykorzystaniu światła do aktywacji substancji bioaktywnej (tlenu singletowego). W związku z tym niektóre metody eksperymentalne stosowane w badaniach przedklinicznych i klinicznych w PDT można zastosować w fotofarmakologii. Na przykład źródła światła, podejścia do dostarczania światła i urządzenia medyczne są dobrze opracowane i zatwierdzone do PDT; Mogą być bezpośrednio wykorzystywane do oceny leków kontrolowanych w świetle reflektorów. Jednak PDT i fotofarmakologia mają wiele różnic między sobą4, co uzasadnia konieczność ustalenia konkretnych metod dla tej ostatniej.

Po pierwsze, nieaktywowana substancja w PDT (tlenie) jest zawsze obecna w żywych tkankach w nietoksycznych stężeniach. Natomiast nieaktywowane fotokontrolowane związki biologicznie czynne mogą mieć aktywność resztkową i niepożądaną toksyczność. Dlatego idealne leki fotofarmakologiczne powinny mieć zminimalizowaną aktywność biologiczną w podawanej postaci i muszą być wysoce aktywne w postaci generowanej światłem, a "okno fototerapeutyczne"21 musi być jak największe. Znalezienie trafienia i przeprowadzenie optymalizacji typu hit-to-lead wymaga identyfikacji odpowiednich związków i badań przesiewowych stosunkowo dużych bibliotek, już na wczesnych etapach rozwoju leku. W tym przypadku zaproponowaliśmy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową konfokalną mikroskopię fluorescencyjną w celu zidentyfikowania wydajnych związków fotoprzełączających.

Wybrana metoda oceny cytotoksyczności pozwala na łatwą realizację najbardziej krytycznego wymogu - utrzymania PSS lub stabilności światłoczułego fotoizomeru światłoczułego na światło widzialne. Dzieje się tak dlatego, że po jego wdrożeniu ekspozycja na światło jest zminimalizowana. Dlatego przy wyborze metod alternatywnych należy preferować metody automatyczne. Takie podejście jest wiarygodne i pouczające. Zastosowanie hodowli komórkowych 3D (sferoidów) na tym etapie zapewnia całościowe zrozumienie reakcji komórki na leczenie w bardziej realistycznym mikrośrodowisku przypominającym tkankę. Ponadto cenne informacje na temat mechanizmu działania związków można uzyskać przy użyciu mikroskopii jako metody bezpośredniej. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna z odpowiednim protokołem barwienia pozwala na wizualną ocenę morfologii komórek i sferoid; Można również wykryć ważne szczegóły dotyczące śmierci komórki i zmian wewnątrz komórek.

Po drugie, lekka aplikacja wymaga starannego doboru dawki światła. W PDT przedawkowanie światła jest niezwykle szkodliwe dla tkanek22. Terapia fotofarmakologiczna może być korzystna przy nadmiernym napromieniowaniu światłem. Górna granica substancji aktywowanej jest określona przez podaną dawkę substancji nieaktywowanej i jej farmakokinetykę. Jednak dawkowanie światła jest nadal problemem w fotofarmakologii. Należy dołożyć starań, aby gęstość mocy napromieniowania i czas ekspozycji nie były mniejsze niż wymagane dla terapii. Zasadniczo wytwarzanie substancji aktywowanej może być monitorowane in vivo. Jednak ze względów bioetycznych zaproponowaliśmy eksperyment z tkanką modelową (świeże mięso mielone) zmieszaną z nieaktywowanym związkiem15. Ten eksperyment jest prosty i można go zmodyfikować tak, aby używał różnych źródeł światła. Można go również dostosować do fotofizycznego szacowania dawki światła i pomiaru wpływów termicznych. Również w tym przypadku, dzięki zastosowaniu tkanek modelowych, możliwe jest zminimalizowanie ekspozycji na światło, w porównaniu na przykład z dokładniejszym określeniem wydajności fotoprzełączania w warunkach in vivo , co jest alternatywą, która zawsze może być interesująca do rozważenia.

Wreszcie, związki, które wykazują lepsze właściwości w badaniach przesiewowych toksyczności in vitro i skutecznie fotoprzełączają się na głębokość co najmniej 1-1,5 cm w tkance modelowej, mogą być wybrane do kosztownych, pracochłonnych i długotrwałych badań in vivo . W tym protokole użyliśmy tej samej linii komórkowej (LLC), co w ocenie in vitro , do wygenerowania modelu raka przeszczepu allogenicznego. Dynamika wzrostu guza, śmiertelność i liczba przerzutów są parametrami najbardziej odpowiednimi do oceny skuteczności przeciwnowotworowej. W porównaniu z konwencjonalną chemioterapią, w leczeniu fotofarmakologicznym stosuje się dodatkowy czynnik - światło. W związku z tym potrzebne są dwie grupy zwierząt kontrolnych: jedna, która otrzymuje tylko nośnik, a druga, która otrzymuje nośnik i napromienianie. Taki układ umożliwia ocenę wpływu światła na mierzone parametry. W naszym eksperymencie zwierzęta z dwóch grup eksperymentalnych otrzymały nieaktywowany związek, a guzy myszy w jednej grupie zostały napromieniowane. Reżim napromieniania był identyczny dla grupy kontrolnej i leczonej. Porównanie z wzorcową chemioterapią nie jest konieczne na tym etapie, ponieważ głównym celem eksperymentu jest wykazanie połączonego efektu stosowania światła i związku. Związki wykazujące najlepsze wyniki w tym zakresie mogą być następnie wybrane do dalszych badań nad ich toksycznością in vivo i porównane z punktami odniesienia przy podejmowaniu ważnych decyzji dotyczących ich rozwoju. Technicznie rzecz biorąc, opisywany przez nas eksperyment in vivo można łatwo dostosować do badań farmakokinetycznych lub farmakodynamicznych, na przykład związku, który jest już wybrany jako główny lek.

Oświadczenia

IVK, OB, SA i ASU są wynalazcami w wydanej rodzinie patentów: "Peptydomimetyki posiadające fotokontrolowaną aktywność biologiczną" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) licencjonowanych przez Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS i SA są założycielami i udziałowcami Lumobiotics GmbH. IVK jest doradcą naukowym, HK, TM, IP i PB są pracownikami Enamine LLC. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w publikacji, poza tymi, które zostały ujawnione.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie UE przez program H2020-MSCA-RISE poprzez projekty PELICO (#690973) i ALISE (#101007256). Prace te były wspierane przez DFG-GRK 2039 (SA, TS i ASU), program NACIP Towarzystwa Helmholtza (SA i ASU) oraz VIP+ BMBF (OB i ASU). Wyrażamy uznanie dla dr Serhiia Koniewa z Instytutu Technologii w Karlsruhe, który zsyntetyzował związek LMB002, oczyścił go i uprzejmie dostarczył związek do badania. Autorzy dziękują również Chuprynie Maksym, która nakręciła i zmontowała film na Ukrainie, a także wszystkim odważnym obrońcom Ukrainy, którzy umożliwili eksperymentalną pracę, napisanie i sfilmowanie tej publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilarny system LC serii Agilent 1100ALSI-Chrom (dystrybutor Agilent)-
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Linia komórkowa raka płucLewisa ECACC90020104
myszy C57BL/6NCrl, samice, wsobneCharles RiverKod szczepu: 027
CelCulture, inkubator CO2Esco MicroCCL-170B
Corning Matrigel Macierz błony podstawnejMerckCLS354234
Corning, 384-dołkowe mikropłytki sferoidalneMerckCLS3830
Płodowa surowica bydlęcaMerckF7524
Gibco, DPBSThermo Fisher Scientific21600044
Gramicidin SLumobiotykiNiestandardowa synteza
Hyklon, DMEM/wysoka glukozaCytivaSH30003.04
IN Cell Analyzer 6500HS, system obrazowaniaCytiva29240358
Invitrogen, Calcein AMThermo Fisher ScientificC1430
Aparat do znieczulenia izofluranemASAS/N ASA 1305
L-glutamina, roztwór 200 mMMerckG7513
LIKA-chirurg, laserdo chirurgii diodowejFotonika
LumobioticsNiestandardowa synteza
Penicyliny– Streptomycyna, stabilizowana roztworemMerckP4333
PhenoPlate, płytki 96-dołkoweFotometr PerkinElmer6055302
Instrumenty PCE-LED 20PCE PCE-LED 20
Thermo Scientific, Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249
Thermo Scientific, Jodek propidynyThermo Fisher ScientificJ66764-MC
Błękit trypanowy, roztwór 0,4%MerckT8154
Trypsyna– EDTA, 10 x roztwórMerckT4174
UltraCruz Kolby do hodowli komórkowych z wentylowanymi nakrętkami, 75 cm2Santa Cruz Biotechnologysc-200263
- UltraCruz, filtry butelkowe, PES, 0,22 μ mSanta Cruz Biotechnologysc-360882
Vydac 218TP, C18 Kolumna HPLC (4,6 mm i razy; 250 mm, 5 &mikro; m)Altmann Analytik (dystrybutor Avantor)GR5103827
plus-LMB002

Bibliografia

  1. Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
  2. Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. Molecular photoswitches in aqueous environments. Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).
  3. Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
  4. Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. In Vivo Photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
  5. Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
  6. Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682(2023).
  7. Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).
  8. Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28(2020).
  9. Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. Components of successful lead generation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).
  10. Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
  11. Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  12. Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
  13. Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
  14. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536(2020).
  15. Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
  16. De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124(2022).
  17. Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  18. Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19(2017).
  19. Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
  20. Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. In vivo photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
  21. Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
  22. Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zwi zki fotostymulowaneleki fotoprze czalnepeptydy cytotoksyczneocena in vitromikroskopia fluorescencyjnatr jwymiarowa hodowla kom rekwysokosprawna chromatografia cieczowatest wzrostu guza
Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.