Artykuł metodologiczny

Optymalizacja wydajności tubuliny z tkanki mózgowej świni

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64925

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Veterinary Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę wysokowydajnej izolacji tubuliny z mózgu świni, zoptymalizowaną pod kątem oprzyrządowania na małą skalę. Procedury izolacji są uzupełnione procedurami oznaczania aktywności polimeryzacji tubuliny in vitro przy użyciu testów kosedymentacyjnych i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Tkanka neuronalna z dowolnego źródła jest doskonałym materiałem do izolacji tubuliny, ponieważ dendryty i aksony neuronów są bogate w mikrotubule. W tym miejscu przedstawiamy procedurę ekstrakcji tubuliny, którą można zastosować, z niewielkimi modyfikacjami, do tkanki nerwowej z wielu źródeł. W przedstawionym protokole wprowadzono nowy etap klarowania surowego lizatu, który doprowadził do znacznego zmniejszenia początkowej ilości nierozpuszczalnych zanieczyszczeń przed wystąpieniem pierwszego etapu polimeryzacji. Ten dodatkowy etap pozwolił na przetworzenie dodatkowej tkanki przy użyciu tego samego oprzyrządowania, a tym samym zwiększenie względnej objętości przetwarzanego homogenatu. Nowo wprowadzony etap nie ma istotnego wpływu na jakość oczyszczonej tubuliny, co potwierdzają badania aktywności in vitro i transmisyjna mikroskopia elektronowa. Opisana procedura obejmuje wszystkie kluczowe etapy, w tym pobranie tkanki, transport, homogenizację tkanek, cykle izolacji tubuliny i końcowe polerowanie za pomocą chromatografii jonowymiennej przy użyciu FPLC i późniejszych testów pomiaru aktywności. Jednorodność oczyszczonej tubuliny wyniosła ponad 97%, co potwierdziła analiza MS/MS z wykorzystaniem jonizacji elektronrozpylającej i MALDI-TOF.

Wprowadzenie

Mikrotubule, puste włókna białkowe (o średnicy 24 nm) utworzone przez heterodimery alfa- i beta-tubuliny, biorą udział w różnych istotnych procesach komórkowych. Uczestniczą w tworzeniu struktur wewnątrzkomórkowych, ruchliwości, podziale komórek, różnicowaniu komórek, transporcie komórkowym, utrzymaniu kształtu i wydzielaniu1. Na funkcje komórkowe mikrotubul mogą wpływać bezpośrednie lub pośrednie interakcje z białkami związanymi z mikrotubulami (MAP) i innymi białkami lub poprzez złożone modyfikacje potranslacyjne zdefiniowane w kodowaniu tubuliny2.

Włókna tubuliny powstają w wyniku dynamicznych oddziaływań niekowalencyjnych między podjednostkami alfa i beta w mechanizmie zarodkowania-wydłużenia. Powstają krótkie mikrotubule, a późniejszy wzrost włókien tubuliny uzyskuje się poprzez odwracalne wydłużenie na obu końcach, tworząc cylindry składające się z heterodimerów tubuliny ułożonych w równoległe protofilamenty2. Niestabilność dynamiczna odnosi się do faktu, że złożone mikrotubule często nie są w równowadze ze swoimi podjednostkami, ale mogą przechodzić przejście fazowe między wydłużonym okresem wzrostu i kurczenia się, utrzymując stan ustalony1,2.

Dynamiczna niestabilność włókien tubuliny jest głównie wykorzystywana w wielu procedurach separacji i oczyszczania tubuliny przy użyciu cykli wysokotemperaturowej polimeryzacji i niskotemperaturowej depolimeryzacji w środowisku wysokiej czystości glicerolu, DMSO, GTP/ATP, Mg2+, lub innych środków chemicznych (takich jak taksol lub polikationy)3. Większość procedur separacji4 jest przeprowadzana przez chromatografię białek5,6,7,8,9, co zapewnia separację białek związanych z tubuliną z difosfokinazą nukleozydową i aktywnością ATPazy5. Podobne wyniki można uzyskać, wykorzystując o wysokiej zawartości soli10. Wiele źródeł, w tym neural11,12,13,14 i non-neural15 tkanki, ryby16 (zarówno słodkowodne, jak i morskie), drożdże lub warianty rekombinowane17 nadekspresja w różnych szczepach produkcyjnych11,12,13,14, oraz inne źródła9,18 były używane do frakcjonowania i oczyszczania.

Prezentowany protokół wykorzystuje chromatografię precypitacji i białek do wyizolowania tubuliny z mózgu świni do wysokiej jednorodności (Rysunek 1). Główną zaletą jest stosunkowo wysoka wydajność osiągana dzięki oprzyrządowaniu dostępnemu w laboratoriach wyposażonych do rutynowych eksperymentów biologii molekularnej.

Protokół

Skład wszystkich rozwiązań i oprzyrządowania jest opisany w Tabeli Materiałów. Wszystkie roztwory zostały przygotowane przy użyciu środków chemicznych klasy FPLC i przefiltrowane przez filtr 0,22 μm przed użyciem. Podczas wszystkich operacji stosowano środki ochrony indywidualnej, np. fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Wszystkie narzędzia były czyste i wolne od śladów detergentów. Podczas zabiegów przestrzegane były odpowiednie wytyczne dotyczące pielęgnacji zwierząt (zatwierdzone przez instytucję). Cały materiał biologiczny, w tym tkanka mózgowa, został zakupiony z rzeźni jako surowiec. Na żadnym etapie protokołu nie wykorzystano żadnych żywych zwierząt.

1. Aktywacja kolumny fosfocelulozowej do szybkiej chromatografii cieczowej białek

  1. Do 15 g suchej żywicy fosfocelulozowej dodać 700 ml 50% etanolu i delikatnie wymieszać łyżką w zlewce.
  2. Wlać zawiesinę do odpowiedniej kolumny chromatograficznej o odpowiedniej objętości (700 ml). Zamknij kolumnę za pomocą tłoków wyposażonych w fryty. Pozostaw co najmniej 10% pustego miejsca nad głową.
    UWAGA: Można stosować inne zbiorniki, ale kolumna FPLC w połączeniu z pompą perystaltyczną znacznie skraca czas niezbędny do aktywacji żywicy i strat żywicy.
  3. Inkubować na wytrząsarce kołyskowej z prędkością 60 obr./min przez 30 min.
  4. Pozwól żywicy osiąść i usuń nadmiar 50% etanolu za pomocą pompy perystaltycznej o przepływie ustawionym na 3 ml/min. Nie pozwól, aby żywica wyschła.
  5. Zdejmij górny tłok i dodaj 300 ml 50% etanolu. Zamknij kolumnę, krótko nią potrząśnij i usuń nadmiar etanolu za pomocą pompy perystaltycznej.
  6. Usuń pozostały etanol. Dodaj 300 ml ultraczystej wody do kolumny, zamknij kolumnę tłokiem i przechyl, aż żywica zostanie ponownie zawieszona. Usuń nadmiar płynu za pomocą pompy perystaltycznej. Powtórz ten krok trzy razy.
  7. Otwórz kolumnę u góry, dodaj 500 ml 0,5 M HCl, zamknij kolumnę i ponownie zawieś żywicę, delikatnie przechylając. Inkubować na wytrząsarce kołyskowej z prędkością 60 obr./min przez 30 min.
    1. Usuń nadmiar płynu za pomocą pompy perystaltycznej. Dodać 300 ml 0,5 M HCl, ponownie zawiesić żywicę i usunąć nadmiar płynu.
  8. Usuń pozostały HCl. Dodaj 300 ml ultraczystej wody do kolumny, zamknij kolumnę tłokiem i przechyl, aż żywica zacznie się zawiesić. Usuń nadmiar płynu za pomocą pompy perystaltycznej. Powtórz ten krok trzy razy.
  9. Wlać 700 ml buforu MES (25 mM MES, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2) do kolumny i ponownie zawiesić żywicę przez przechylenie. Wlać zawiesinę do zlewki, dostosować pH do 6,1 za pomocą 1 M NaOH i pozostawić do inkubacji na 2 godziny pod delikatnym mieszaniem.
  10. Pozostawić żywicę do opadnięcia, zdekantować płyn, dodać 300 ml buforu MES o pH 6,4 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Zdekantować nadmiar cieczy, dodać 96% etanolu do 20% stężenia końcowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Upakowanie kolumny fosfocelulozowej

  1. Wlać 12 ml aktywowanej żywicy do czystej kolumny chromatograficznej z zamkniętą zatyczką dolną. Niech żywica opadnie. Objętość osiadłej żywicy wynosi około 5 ml. Usuń górną warstwę żywicy (około 2-3 mm), w której mogą osadzać się lżejsze, połamane fragmenty matrycy.
  2. Wyjmij dolny korek i pozwól roztworowi do przechowywania swobodnie spłynąć, kropla po kropli. Nie pozwól, aby żywica wyschła.
  3. Zamknij kolumnę i podłącz ją do systemu FPLC. Przemyć kolumnę buforem PEM (100 mM RURY pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4) przy 1 ml/min (maks. ciśnienie 1 bar) przez 30 min, wyregulować wysokość tłoka, obrócić kolumnę do góry nogami i myć kolumnę w tych samych warunkach przez następne 30 minut w przepływie wstecznym.
  4. Przechowywać kolumnę wypełnioną aktywowaną fosfocelulozą w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

3. Separacja i oczyszczanie tubuliny

UWAGA: Tubulina jest bardzo podatna na degradację i ważne jest, aby postępować szybko. Wszystkie roztwory, instrumenty i sprzęt powinny być wcześniej przygotowane, schłodzone lub podgrzane, jeśli to konieczne. Procedury są wrażliwe na zmiany zalecanych temperatur. Tkanka mózgowa powinna być przetworzona jak najszybciej po sekcji, biorąc pod uwagę ilość odpadów biologicznych wytwarzanych podczas oczyszczania. Procedura została zoptymalizowana pod kątem wirnika z sześcioma kuwetami ultrawirowania o pojemności 75 ml. Ilość przetwarzanej tkanki można zwiększać lub zmniejszać w zależności od dostępnej ultrawirówki.

  1. Transport tkanek
    1. Umieścić 500 g świeżo wypreparowanych mózgów wieprzowych (6-8 sztuk) do 3-litrowego naczynia transportowego i wlać lodowaty bufor transportowy (4,1 mM MES pH 7, 320 mM sacharozy, 1 mM EGTA) aż do całkowitego zanurzenia. Odstawić na lód na 5 minut i wymienić bufor transportowy na nowy, aby ułatwić odprowadzanie ciepła. Szybki transport na lodzie w celu dalszej obróbki.
  2. Homogenizacja tkanek
    UWAGA: Homogenizację tkanek przeprowadza się na lodzie w chłodni. Wszystkie narzędzia powinny być wstępnie schłodzone, aby zapobiec spontanicznej polimeryzacji. Głównym źródłem tubuliny jest istota szara, a reszta jest usuwana w kolejnych krokach.
    1. Wlać 100 ml buforu ekstrakcyjnego (4,1 mM MES pH 7, 520 mM sacharozy, 1 mM EGTA, 1 mM ATP i 0,1 mM GTP) do plastikowej zlewki o pojemności 1 l i określić masę W1 (g) łącznie z naczyniem. ATP i GTP dodaje się tuż przed użyciem.
    2. Wyjmij mózg świni z naczynia transportowego i usuń palcami cały móżdżek, tłuszcz, duże kawałki istoty białej, opony mózgowe i naczynia krwionośne, stosując niewielką siłę. Można również użyć nożyczek lub pęsety. Umieść mózgi świń pozbawione niechcianej tkanki w zlewce ze 100 ml zimnego buforu ekstrakcyjnego. Kontynuuj, aż cała tkanka zostanie przetworzona.
    3. Zważyć zlewkę z przetworzoną tkanką mózgową i określić wagę W2 (g).
    4. Dodać bufor ekstrakcyjny zgodnie ze wzorem, Masa buforu ekstrakcyjnego = W2 - W1 (np. na 400 g tkanki dodaje się 300 g dodatkowego buforu ekstrakcyjnego).
    5. Przenieś tkankę mózgową z buforem ekstrakcyjnym do wstępnie schłodzonego blendera kuchennego i zmiksuj w 4-8 krótkich, trzysekundowych impulsach.
    6. Częściowo zhomogenizowaną tkankę należy przetwarzać za pomocą wysokoobrotowego homogenizatora dyspersyjnego (18 000 obr./min) przez 1 min. Zawiesinę pozostawić na lodzie na 3-5 minut, od czasu do czasu mieszając łyżką. Powtórzyć pięć razy lub aż do całkowitej homogenizacji.
    7. Wlać do wstępnie schłodzonych probówek ultrawirówek i wirować przez 10 minut, w temperaturze 4 °C i 50 000 x g. Zachować supernatant i wyrzucić osad. Powtarzać tę czynność, aż zbierze się 430 ml oczyszczonego ekstraktu.
    8. Wlać sklarowany ekstrakt do wstępnie schłodzonych probówek ultrawirówek (po 70 ml każda) i wirować w temperaturze 4 °C i 75 000 x g przez 60 minut. Zebrać supernatant i oznaczyć objętość S1,
      UWAGA: Jeśli istnieje tylko jeden wirnik, podgrzej go w ciepłej łaźni wodnej do następnego etapu wirowania (37 °C).
  3. Pierwsza polimeryzacja
    1. Dodać 10x bufor MEM (1 M MES pH 6,8, 10 mM EGTA, 10 mM MgCl2) według wzoru V = S1/9 ml (na 585 ml supernatantu dodać 65 ml 10x buforu MEM). Dobrze wymieszać i dodać glicerol do 3,5 M i GTP do 0,1 mM końcowego stężenia. Wlać zawiesinę do probówek do ultrawirówek (objętość supernatantu przekracza objętość probówek; resztę odrzuca się).
    2. Inkubować probówki z supernatantem w łaźni wodnej przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Wirować probówki przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 75 000 x g. Zmierz objętość supernatantu (S2), aby określić objętość buforu MEM, dodaj go do osadów w kroku 3.3.4, a następnie odrzuć supernatant. Trzymaj osad w miejscu, w którym zawarta jest spolimeryzowana tubulina.
    4. Przygotuj 0,5 x objętość S2 lodowatego buforu 1x MEM. Dodaj równą ilość 1x buforu MEM do każdej probówki ultrawirówki z osadem. Ponownie zawiesić granulki w dodanym buforze 1x MEM, przenieść zawiesiny do cylindra z podziałką i określić całkowitą objętość.
      1. Dodać GTP do 1 mM stężenia końcowego. Przenieść zawiesinę do homogenizatora ze szkła Dounce i homogenizować roztwór co około 10 minut przez 45 minut na lodzie. Tłok musi być obsługiwany ostrożnie, ponieważ może łatwo pęknąć.
        UWAGA: W międzyczasie schłodź wirnik w wodzie z lodem.
    5. Wlać homogenizowany roztwór do wstępnie schłodzonych probówek ultrawirówek i wirować w temperaturze 75 000 x g i temperaturze 4 °C przez 60 minut. Po odwirowaniu oznaczyć objętość supernatantu (S3).
  4. Druga polimeryzacja
    1. Zmieszać supernatant z 0,35 x S3 ml glicerolu i dodać GTP do 1 mM końcowego stężenia. Wlać sklarowany osad do probówek ultrawirówek i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W międzyczasie rozgrzej wirnik do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Odwirować spolimeryzowany supernatant z kroku 3.4.1 przez 60 minut w temperaturze 75 000 x g i temperaturze 37 °C. Oznaczyć objętość supernatantu (S4).
      UWAGA: Jest to opcjonalny punkt zatrzymania. Osad z tubuliną można zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Pozwól zamrożonym granulkom powoli rozmrażać się na lodzie przez 30 minut. Przygotuj 0,25 x S4 ml buforu PIPES (500 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP), podziel równomiernie na probówki z granulkami, ponownie zawieś granulki łyżką i przenieś roztwór do homogenizatora szklanego Dounce. Homogenizować co 10 minut na lodzie przez 45 min.
      UWAGA: W międzyczasie schłodź wirnik w wodzie z lodem.
    4. Wlać roztwór ze zdepolimeryzowaną tubuliną do probówek ultrawirówek i wirować przez 60 minut w temperaturze 4 °C i 75 000 x g.
  5. Trzecia polimeryzacja
    1. Oznaczyć objętość supernatantu (S5) i dodać S5/9 ml DMSO. Wlać zawiesinę do probówek ultrawirówek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C do polimeryzacji.
      UWAGA: W międzyczasie rozgrzej wirnik do 30 °C w łaźni wodnej.
    2. Odwirować spolimeryzowaną tubulinę przez 60 minut w temperaturze 75 000 x g i temperaturze 30 °C. Oznaczyć objętość supernatantu (S6) i zachować granulki.
    3. Rozpuść granulki w 0,25 x S6 ml buforu PEM (100 mM RURY pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP). Użyj homogenizatora ze szkła odbitego, aby zwiększyć rozpuszczalność. Dodawaj bufor PEM, aż granulki całkowicie się rozpuszczą (nie są już widoczne opalizujące cząstki).
  6. Oczyszczanie metodą chromatografii jonowymiennej
    UWAGA: Chromatografia odwróconej wymiany jonowej jest stosowana do usuwania białek związanych z mikrotubuliną. Tubulina swobodnie przepływa przez kolumnę przy danym pH, a białka zanieczyszczające są zatrzymywane na żywicy fosfocelulozowej. Wszystkie czynności wykonywane są w temperaturze bliskiej 4°C lub na lodzie. Nie należy klarować ekstraktu tubuliny przed oczyszczeniem FPLC, ani przez filtrację, ani przez odwirowanie.
  7. Zrównoważyć FPLC i kolumnę z buforem PEM (100 mM RURY pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP). Użyj co najmniej 10 objętości kolumn do równoważenia. Przepływ pompy nie powinien przekraczać przepływu używanego do wypełniania kolumn (1 ml/min).
  8. Powoli załadować zawiesinę tubuliny (0,5 ml/min) do kolumny i zebrać niezwiązane białko przepływające przez żywicę.
  9. Dodać 10 μl 100 mM GTP do każdej 1 ml frakcji zawierającej białko tubuliny.
  10. Frakcje zawierające tubulinę zamrozić w ciekłym azocie i natychmiast przenieść je do pojemnika z ciekłym azotem. W takich warunkach tubulina może być przechowywana przez kilka lat. Stabilność zmniejsza się gwałtownie w ciągu kilku miesięcy, jeśli tubulina jest przechowywana w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Podczas etapów separacji i oczyszczania pobrano próbki do elektroforezy SDS-PAGE, a następnie przeanalizowano je za pomocą barwienia błękitem Coomassiego (Rysunek 2). 20 µL każdej próbki zmieszano z 10 µL buforu do próbek Laemmliego (188 mM Tris-HCl pH 6.8, 3% SDS (w/w), 30% glicerolu (v/v), 0,01 błękitu bromofenolowego (w/w), 15% β-merkaptoetanolu) i inkubowano w temperaturze 95 °C przez 15 min. 4 µL każdej próbki naniesiono na 12,5% żel akrylamidowy SDS i rozdzielono przy stałym prądzie 30 mA na żel w warunkach redukujących i denaturujących.

Wyniki potwierdziły stopniowy wzrost względnego stężenia tubuliny, któremu towarzyszył spadek ilości zanieczyszczających białek. Ponadto nie odnotowano istotnej utraty tubuliny w klarownym lizacie podczas pierwszej wirowki (krok 3.2.7) w porównaniu do pominięcia tego etapu (Rysunek 2A,B).

Stężenie białka określono za pomocą trzech niezależnych metod: testu BCA, testu Bradforda oraz analizy densytometrycznej żelu SDS-PAGE19 (Rycina 3). Całkowita wydajność tubuliny przy zastosowaniu opisanego protokołu wyniosła 123 mg oczyszczonej tubuliny z 250 g tkanki nerwowej. Podczas pomiarów należy wziąć pod uwagę, że wysokie stężenie DTT w buforze do przechowywania ma istotny wpływ na test BCA. Zarówno bufor PEM, jak i bufor PBS z dodatkiem DTT zwiększają absorbancję tła o około 0,900 A595, co znacząco zmniejsza zakres pomiarowy testu BCA (Rycina 3A). Negatywny wpływ DTT jest wykrywalny nawet po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu czystą wodą (dane nie zostały przedstawione). Test Bradforda nie wydawał się być podatny na wpływ buforu do przechowywania (Rycina 3B), co potwierdzono analizą densytometryczną.

Czystość preparatu tubuliny zweryfikowano za pomocą analizy spektrometrią mas w dwóch niezależnych placówkach (VRI Brno, Czechy; CEITEC MU Brno, Czechy), wykorzystując jonizację elektrorznawczą oraz MALDI-TOF. Obie analizy potwierdziły obecność świńskich tubulin alfa i beta w kilku izoformach. Ogólna czystość przekraczała 97,07% (PSMs 1065), przy czym najczęstsze zanieczyszczenia pochodziły z keratyny typu II Homo sapiens (PSMs 246, 2,24% zanieczyszczeń), które zostały wprowadzone najprawdopodobniej podczas izolacji tubuliny i przygotowania próbki do analizy MS/MS. Inne zanieczyszczenia obejmowały 322 PSM, a zidentyfikowano jedynie albuminę surowiczą, aktynę gamma i trypsynogen pochodzące od Sus scrofa z rozdzielczością jednego peptydu (0,0069%).

W kolejnych eksperymentach zweryfikowano zachowanie zdolności do polimeryzacji po szybkim zamrażaniu i przechowywaniu w ciekłym azocie. Alikwot o stężeniu 10 mg/mL wyjęto z ciekłego azotu i powoli rozmrożono na lodzie. Próbki o różnych stężeniach (10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 4 mg/mL i 2 mg/mL) przygotowano poprzez rozcieńczenie alikwotów w buforze PEM zawierającym DTT, ATP i GTP na potrzeby eksperymentu samozłożenia. Jedną serię rozcieńczeń inkubowano w temperaturze 37 °C przez 60 min, a drugą inkubowano na lodzie przez 60 min. Obie serie wirowano przez 60 min przy 21 000 x g w odpowiedniej temperaturze (4 °C lub 37 °C). Pobrano 30 µL supernatantu i wykorzystano go do analizy SDS-PAGE. Pozostały supernatantu ostrożnie usunięto pipetą i odrzucono. Osady krótko przemyto, dodając 100 µM buforu PEM, a następnie niezwłocznie usuwając go pipetą. Następnie osady resuspendowano w 50 µL 1x skoncentrowanego buforu do ładowania SDS, aby zachować względną koncentrację osadu i supernatantu. Do każdego supernatantu dodano 10 µL buforu do ładowania SDS. Wszystkie próbki przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie (Rysunek 4). Objętość każdej próbki naniesionej na żel SDS-PAGE dostosowano do stężenia początkowego, aby różnica w precypitacji wynikająca ze stężenia była bardziej widoczna. Test samozłożenia tubuliny w buforze PEM potwierdził zdolność do tworzenia włókien tubuliny w sposób zależny od temperatury.

Przeprowadzono test montażu tubuliny20,21 indukowany przez MAP2c w celu weryfikacji zdolności tubuliny do oddziaływania z innymi białkami22. Przygotowano rozcieńczenia seryjne MAP2c, w których 100 µL alikwotów tubuliny o stężeniu 1 mg/mL zmieszano z MAP2c do stężenia końcowego w zakresie od 0 µM do 8 µM. Wszystkie próbki przygotowano na lodzie poprzez rozcieńczenie w świeżo przygotowanym buforze PEM z dodatkiem 1 mM DTT i 1 mM GTP. Tubulinę inkubowano przez 15 min w temperaturze 37 °C z różnymi stężeniami MAP2c, a następnie wirowano przez 60 min przy 21 000 x g w temperaturze 37 °C. Ostateczne przemycie osadu wykonano dwukrotnie za pomocą 100 µL buforu PEM. Eksperyment potwierdził zdolność przygotowanej tubuliny do polimeryzacji indukowanej przez MAP2c, ponieważ tylko próbka bez MAP2c nie utworzyła osadu (Rysunek 5).

Do potwierdzenia obecności filamentów tubuliny w eksperymentach kopolimeryzacji wykorzystano dodatkowo transmisyjną mikroskopię elektronową. Zawiesiny oczyszczonej tubuliny wytrąconej za pomocą MAP2c przygotowano do transmisyjnej mikroskopii elektronowej z zastosowaniem barwienia negatywowego. Próbki adsorbowano na miedzianych siatkach powlekanych Formvarem i stabilizowanych węglem. Następnie siatki poddano barwieniu negatywowemu 2% NH4MoO4 i badano pod mikroskopem elektronowym przy powiększeniu 18 000x i napięciu przyspieszającym 80 kV. Obecność jednorodnych mikrotubul o wyraźnej strukturze filamentowatej i odpowiednim rozmiarze potwierdziła zdolność do tworzenia mikrotubul w konformacji natywnej (Rysunek 6).

Schemat przetwarzania tkanki nerwowej: polimeryzacja, depolimeryzacja, chromatografia wymiany jonowej.
Rysunek 1: Schemat separacji i oczyszczania tubuliny. Liczby w nawiasach odnoszą się do kroków protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE dla oczyszczania białek. Przedstawiono markery masy cząsteczkowej.
Rycina 2: Rozdział i oczyszczanie tubuliny. (A) Analiza SDS-PAGE próbek pobranych podczas rozdziału tubuliny z wykorzystaniem polimeryzacji indukowanej temperaturą (3 µL na linię). Widoczny jest spadek ilości zanieczyszczeń przy jednoczesnym stabilnym wzroście względnej zawartości tubuliny (około 50 kDa). Numery nad każdą linią odpowiadają numerowi kroku w protokole. (B) Analiza SDS-PAGE frakcji uzyskanych po chromatografii białek na żywicy fosfo-celulozowej (4 µL na linię). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy stężenia białka w stosunku do absorbancji; warunki PEM, PBS; analiza danych dotyczących zachowania absorbancji.
Rysunek 3: Stężenie białka. Porównano szereg rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 mg/mL w buforze PEM lub PBS z szeregami rozcieńczeń BSA zawierającymi oddzielnie 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT lub ich kombinację (0,1 mM ATP, 1 mM GTP i 1 mM DTT) w buforze PEM lub PBS. (A) W przypadku zastosowania testu BCA zaobserwowano znaczną zmianę tła w próbkach zawierających DTT (symbole wypełnione). (B) Efekt ten nie został wykryty podczas pomiaru stężeń w teście Bradforda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki elektroforezy żelowej oczyszczania białek; standard MW, porównanie prążków białkowych w zakresie 70-50 kDa.
Rycina 4: Analiza samoorganizacji tubuliny. Analiza SDS-PAGE badania samoorganizacji potwierdziła zdolność przechowywanej tubuliny inkubowanej w temperaturze (A) 4 °C lub (B) 37 °C do polimeryzacji w sposób zależny od temperatury w szerokim zakresie stężeń. (P – pellet, S – nadsącz; odpowiednie stężenie tubuliny jest zaznaczone nad każdą parą linii; ilość naniesionej każdej próbki wynosiła 10 µg). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat żelu SDS-PAGE pokazujący rozdział białek według masy cząsteczkowej, z gradientem stężeń.
Rysunek 5: Analiza współsedymentacji tubuliny. Analiza SDS-PAGE montażu tubuliny wspomaganego przez MAP2c potwierdziła zdolność przechowywanej tubuliny do polimeryzacji napędzanej interakcją z białkiem powiązanym z mikrotubulami w sposób zależny od stężenia. Stężenie molowe MAP2c jest wskazane nad każdą linią. (P – osad, S – nadsącz). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe mikrotubul; analiza strukturalna; skala nanometryczna; porównanie obrazów A i B.
Rysunek 6: Mikroskopia elektronowa transmitująca. Mikrofotografie TEM pokazują, że tubulina montuje się (A) w mikrotubule o odpowiedniej średnicy (B), składające się z jednorodnych filamentów tubuliny udekorowanych białkami MAP2c. Pasek skali odpowiada 1000 nm (A) oraz 200 nm (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Tkanka nerwowa z dowolnego źródła jest doskonałym materiałem do izolacji tubuliny, ponieważ dendryty i aksony neuronów są bogate w mikrotubule (do 40%)23. Tkankę mózgową można stosunkowo łatwo uzyskać w wystarczających ilościach. Główną wadą może być nieokreślony poziom modyfikacji potranslacyjnych, co może mieć wpływ na kolejne eksperymenty24,25. W przeciwnym razie jedynym problemem jest szybka degradacja materiału wyjściowego, zwłaszcza w ciepłych warunkach. Zastosowaliśmy kilka wymian transferowo-buforowych, aby zwiększyć rozpraszanie ciepła przed transportem i szybki transport do przetwarzania, które rozpoczyna się tak szybko, jak to możliwe. Świeża tkanka jest preparowana w warunkach uniemożliwiających ogrzewanie i homogenizowana w buforze zawierającym GTP i glicerol, który dodatkowo stabilizuje tubulinę26.

W przedstawionym protokole wprowadzono etap klarowania (etap 3.2.7) surowego lizatu. Przedłużone wirowanie przed pierwszą polimeryzacją generalnie nie jest zalecane ze względu na podatność tubuliny na nieodwracalne modyfikacje i proteazy. Z drugiej strony, obecne eksperymenty wykazały, że krótkie wirowanie przy dużym przeciążeniu zmniejsza ilość zanieczyszczeń, a tym samym zwiększa względną objętość przetworzonego homogenatu bez znaczącego wpływu na jakość tubuliny.

Dokładne określenie stężenia białka jest niezbędne do dalszych eksperymentów, głównie gdy badane są interakcje z białkami lub inhibitorami wiążącymi tubulinę. W trakcie prowadzonych badań stwierdzono istotne różnice w wynikach testów stężenia białek. Głównym powodem była obecność DTT, GTP i ATP w wysokich stężeniach zakłócających testy. Test BCA został przesunięty do górnych limitów ze względu na dużą ilość DTT w buforze magazynowym, co zmniejszyło zdolność testu. Co więcej, podobne maksima absorbancji białek i ATP lub GTP powodowały niespójności w oznaczaniu stężenia białek przy użyciu absorbancji przy 280 nm. Ten sam problem był zauważalny w odczytach z detektora UV FPLC. Najbardziej wiarygodnym testem, ze stabilnymi wynikami, był test białka Bradforda, w którym nie zaobserwowano wpływu związków buforowych. Niemniej jednak konieczne jest przygotowanie serii rozcieńczeń wzorca białka w buforze do przechowywania.

Zdolność oczyszczonej tubuliny do tworzenia odpowiednich układów jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia kolejnych eksperymentów. Tubulina jest z natury wysoce podatna na degradację nawet w środowisku bogatym w glicerol-GTP, co skutkuje zmniejszoną zdolnością do tworzenia jednorodnych włókien. Bardzo ważne jest, aby śledzić proces oczyszczania i eksperymentalnie zweryfikować zdolność przechowywanej tubuliny do polimeryzacji w stabilne regularne włókna. Wprowadzono kilka niezależnych metod weryfikujących stan tubuliny in vivo i in vitro. Do najbardziej znanych należą: spektroskopia dichroizmu kołowego27, test powierzchniowego rezonansu plazmonowego28, test przesunięcia termicznego29, test hamowania polimeryzacji30, barwienie immunofluorescencyjne31,32, koprecipitacja22,33 i analiza transmisyjnego mikroskopu elektronowego32 można wymienić. Test polimeryzacji i współstrącanie tubuliny stosowane w tym protokole są łatwe do wykonania. Można je szybko ocenić za pomocą granulek znajdujących się na dnie probówki lub za pomocą SDS-PAGE. Z drugiej strony wytrącona tubulina może mieć postać agregatów. Bardziej wyrafinowane metody, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, muszą być uwzględnione, aby potwierdzić obecność włókien mikrotubul w celu kontroli jakości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Agencję Technologiczną Republiki Czeskiej (projekt nr. TN02000017 - Krajowe Centrum Biotechnologii w Medycynie Weterynaryjnej - NaCeBiVet).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 ml------Probówki
10 ml------Probówki 50
ml------Wspólny materiał
ATPROTHHN35.2Klasa analityczna
DMSOROTHA994.2
Homogenizator ze szkła DounceP-LABH244043Homogenizator
DTTROTH6908.1Klasa analityczna
EGTAROTH3054.3Klasa analityczna
EtanolPENTA70390-11001Klasa analityczna
GlicerolROTH6967.2Klasa analityczna
Zlewki z podziałką------Wspólne wyposażenie
Cylindry z podziałką------Wspólne wyposażenie
GTPMERCK36051-31-7Bardzo wysoka jakość
HClPENTA19360-11000Klasa
analityczna Izolowana skrzynka do transportu tkanek------Wspólne wyposażenie
Blender kuchennyWaring7011HBNaczynie szklane lub plastikowe
Ciekły azot------Wspólny materiał
MES ROTH6066.4Klasa analityczna
MgCl2MERCK814733 Klasa analityczna
MgSO4PENTA43180-31000Klasa analityczna
NaOHPENTA15650-11000Klasa analityczna
Optima XPN100Beckman Coulter A94469Ultrawirówka
Kolumna fosfocelulozowaVWRGENO786-1291Pusta kolumna
Żywica fosfocelulozowaCreative - Biomart, incFosforan-001CŻywica jonowymienna
RURYROTH9156.2Klasa analityczna
SacharozaPENTA24970-31000Wagi klasy
analitycznej------ Wspólny sprzęt
Nożyczki------Wspólne wyposażenie
Łyżki ------Plastikowy lub szklany
wirnik Ti45Beckman Coulter 339160Wirnik do pęsety do ultrawirówek
------Wspólne wyposażenie
Ultra turrax IKA T18 basicIKA356 1000Dozownik laboratoryjny
Łaźnia wodna 37 ° C------Mieszany
klasy analitycznej

Bibliografia

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog. Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).
  3. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).
  4. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  5. Roychowdhury, S., Gaskin, F. Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure. J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).
  6. Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain. Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).
  7. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).
  8. Jacobs, M., Huitorel, P. Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase. Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).
  9. Munguía, B., et al. Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography. Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).
  10. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).
  11. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  12. Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization. Parasite. 25, 62(2018).
  13. Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells. STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).
  14. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. JVisExp. (165), e61826(2020).
  15. Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. Isolating tubulin from nonneural sources. Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).
  16. Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish. Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).
  17. Fourest-Lieuvin, A. Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells. Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).
  18. MacRae, T. H., Gull, K. Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei. Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).
  19. Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: www.gelanalyzer.com (2024).
  20. Jansen, S., et al. Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau. JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).
  21. Melková, K., et al. Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences. Biomolecules. 9 (3), E105(2019).
  22. Herzog, W., Weber, K. Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro. Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).
  23. Castle, A. G., Crawford, N. Isolation of tubulin from pig platelets. FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).
  24. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).
  25. Lafanechère, L., Job, D. The third tubulin pool. Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).
  26. Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides. J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).
  27. Mahaddalkar, T., et al. Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).
  28. Chen, H., et al. Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties. J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).
  29. Yao, D., et al. Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo. Pharmacol Res. 152, 104605(2020).
  30. Sweetnam, P. M., et al. The role of receptor binding in drug discovery. JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).
  31. Qi, Z. -Y., et al. Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors. Bioorg Chem. 94, 103392(2020).
  32. Sáez-Calvo, G., et al. Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin. Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).
  33. Bellocq, C., et al. Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae. EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja tubulinyekstrakcja mikrotubultkanka nerwowaoczyszczanie bia ekchromatografia wymiany jonowejultrawirowaniehomogenizator Dounce atransmisyjna mikroskopia elektronowaanalizy in vitro

Powiązane artykuły