Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64926

⸱

16 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity, Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science, Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Streszczenie

Makrofagi rezydujące w tkance otrzewnej pełnią szerokie funkcje w utrzymaniu homeostazy i biorą udział w patologiach w obrębie lokalnych i sąsiednich tkanek. Ich funkcje są podyktowane sygnałami mikrośrodowiskowymi; Dlatego konieczne jest zbadanie ich zachowania w niszy fizjologicznej in vivo. Obecnie specyficzne metodologie celowania w makrofagi otrzewnowej wykorzystują modele transgeniczne całych myszy. W tym miejscu opisano protokół skutecznej modulacji in vivo ekspresji mRNA i małych gatunków RNA (np. mikroRNA) w makrofagach otrzewnowych przy użyciu cząstek lentiwirusa. Preparaty lentiwirusowe wytwarzano w HEK293T komórkach i oczyszczano na pojedynczej warstwie sacharozy. Walidacja in vivo skuteczności lentiwirusa po wstrzyknięciu dootrzewnowym wykazała dominujące zakażenie makrofagów ograniczone do tkanki miejscowej. Celowanie w makrofagi otrzewnowe było skuteczne podczas homeostazy i zapalenia otrzewnej wywołanego tioglikolanem. Omówiono ograniczenia protokołu, w tym stan zapalny o niskim poziomie wywołany dootrzewnowym podawaniem lentiwirusa oraz ograniczenia czasowe dla potencjalnych eksperymentów. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przedstawia szybki i przystępny protokół szybkiej oceny funkcji genów w makrofagach otrzewnowych in vivo.

Wprowadzenie

Makrofagi rezydujące w tkankach (Mφ) to niejednorodna populacja fagocytarnych komórek odpornościowych, które wyczuwają i reagują na atakujące patogeny1,2. Ponadto odgrywają istotną rolę w rozwoju, przebudowie i utrzymaniu homeostazy tkanek1,3. Wiele tkanek Mφ pochodzi od komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas embriogenezy i utrzymuje się w tkance przez całe życie4,5. Fenotyp i funkcje tych komórek są podyktowane wspólnymi i hierarchicznymi interakcjami określonych czynników transkrypcyjnych oraz lokalnego mikrośrodowiska6,7,8,9. Coraz lepsze zrozumienie tej zależności zwiększa zapotrzebowanie na skuteczne metody manipulacji genami Mφ in vivo w ich fizjologicznie istotnej niszy.

wektory lentiwirusowe są często wykorzystywanym narzędziem do manipulowania kwasami nukleinowymi w określonych populacjach komórek in vivo10,11,12, szczególnie ze względu na ich zdolność do infekowania zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek oraz do stabilnej integracji z genomem gospodarza13,14. W ciągu ostatnich dwóch dekad technologia dostarczania lentiwirusa została zoptymalizowana, a alternatywne koperty i syntetyczne promotory zostały zbadane w celu zwiększenia celowania specyficznego dla linii8,15. Ze względu na szeroki tropizm komórkowy, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej otacza glikoproteinę (VSV-G)16,17 stał się "złotym standardem" otoczki stosowanej w technologii lentiwirusów.

W tym protokole18, pseudotypowane cząstki lentiwirusowe VSV-G są wykorzystywane do demonstracji ukierunkowanego i skutecznego dostarczania krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) i mikroRNA (miR) do mysiego Mφ (pMφ) in vivo, w stanie ustalonym19. Ekspresja transgenu była napędzana przez promotor wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV). Produktywne zakażenie komórek zdefiniowano na podstawie ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (GFP) pochodzącego z lentiwirusa. Zastosowanie tego podejścia umożliwiło łatwy odczyt na potrzeby eksperymentów in vivo lentiwirusa w celu określenia optymalnej dawki i ram czasowych eksperymentu. Wreszcie, prowokacja lentiwirusowa in vivo myszy podczas zapalenia wywołanego tioglikolanem ujawniła naturalną skłonność do selektywnego zakażenia pMφ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucji i Ministerstwa Spraw Wewnętrznych Wielkiej Brytanii.

UWAGA: Wszystkie badania in vivo z lentiwirusem powinny być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach, a także przestrzegać wszystkich przepisów związanych z używaniem materiałów zakaźnych kategorii II. Dobrostan zwierząt powinien być również monitorowany zgodnie z lokalnymi przepisami. Na tym etapie protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z cząstkami lentiwirusowymi i ostrymi narzędziami.

1. Przygotowanie komórek HEK293T do transfekcji

UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kolektorem bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej.

  1. Przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (cDMEM) firmy Dulbecco dla komórek HEK293T, łącząc 450 ml DMEM z 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą (50 ml) i końcowym stężeniem 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
  2. Rozmrażaj komórki HEK293T co najmniej 1 tydzień przed planowaną transfekcją. Utrzymuj zdrowe warunki wzrostu i pasażu co 2-3 dni za pomocą trypsyny + EDTA do odłączenia komórek od kolby.
  3. Na dzień przed transfekcją ostrożnie odessać pożywkę wzrostową z komórek i delikatnie umyć komórki sterylnym DPBS. Dodać 1-5 ml trypsyny do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 2-5 minut.
  4. Dodać 5-10 ml cDMEM i wirować komórki w temperaturze 350 x g przez 5 minut. Usuń płyn i ponownie zawieś osad komórek w 10 ml cDMEM. Policz komórki i zasiej 10-11 x 106 żywotnych komórek HEK293T na kolbę T175 w 20 ml cDMEM.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez noc, aby umożliwić komórkom HEK293T osiągnięcie zbiegu 70%-80%.
  6. Następnego dnia potwierdź zbieg komórek pod mikroskopem świetlnym.
  7. Usunąć pożywkę z kolby za pomocą paski serologicznej o pojemności 25 ml, nie naruszając monowarstwy komórek.
  8. Delikatnie dodaj 10 ml DPBS i kołysz płytką, aby umyć komórki, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
  9. Usunąć DPBS za pomocą 25 ml paski serologicznej.
  10. Dodać 15 ml nowego cDMEM na ściankę do kolby T175, aby nie naruszyć monowarstwy komórek, i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

2. Transfekcja komórek HEK293T za pomocą odczynnika do transfekcji lipidów nieliposomalnych

  1. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przygotuj składniki lentiwirusowe: 2 μg plazmidu lentiwirusowego, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) i 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) z buforem EC (zestaw odczynników do transfekcji) do końcowej objętości 600 μl.
  2. Dodać 36 μl roztworu wzmacniacza. Wymieszać składniki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, kilkakrotnie zasysając część płynu i umieszczając ją z powrotem kropla po kropli bezpośrednio na pozostały roztwór. Pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Dodać 120 μl odczynnika do transfekcji i wymieszać jak wyżej około 20 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 5,2 ml cDMEM i wymieszać jak powyżej z 5 ml pasków serologicznych.
  5. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami bezpośrednio na monowarstwę komórek HEK293T (omijając ścianki kolby), rozprowadzając mieszaninę w różnych miejscach kolby.
  6. Rozprowadzić plazmid, delikatnie kołysząc kolbą z boku na bok. Nie dopuścić do dostania się płynów do pokrywy kolby.
  7. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5 % CO2 przez 48 godzin. Potwierdzić skuteczną transfekcję HEK293T komórek poprzez pojawienie się markera fluorescencyjnego, w tym przypadku GFP, w ciągu 24 godzin od transfekcji, monitorowanego pod mikroskopem fluorescencyjnym do obrazowania komórek.
    UWAGA: W przypadku konstruktów bez markera fluorescencyjnego, komórki HEK293T muszą zostać przebadane pod kątem obecności użytego genu markerowego lub zmiany ekspresji w genie/białku będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą odpowiednich technik, np. qPCR. Alternatywnie, udana transfekcja może być pośrednio zweryfikowana podczas testowania kolekcji lentiwirusa na komórkach Jurkat na późniejszych etapach protokołu za pomocą powyższych technik.
    UWAGA: Transfekowane komórki HEK293T są uważane za zakaźne i podczas obchodzenia się z tymi komórkami należy wdrożyć odpowiednie środki ostrożności. Należy przestrzegać lokalnych przepisów, które zazwyczaj mogą obejmować pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii II, stosowanie podwójnych rękawic i odpowiedniego roztworu odkażającego do dezynfekcji, na przykład zwiększone stężenie wybielacza odpadowego (2000 ppm) lub równoważnego roztworu zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie roztwory i tworzywa sztuczne mające kontakt z preparatem lentiwirusa powinny być dezynfekowane zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.

3. Zbiór cząsteczek lentiwirusowych

  1. Przygotuj roztwór do odkażania, roztwór wybielacza (podchloryn sodu) o wysokim stężeniu (2 000 ppm) lub równoważny środek zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego w wiadrze i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Przygotuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego, usuwając wszelkie nadmiarowe przedmioty, takie jak puste stojaki na probówki itp.
  3. Wstępnie oznaczyć probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na kolbę HEK293T komórek T175 i zdjąć pokrywkę z probówki wirówkowej. Umieść rurki w stabilnym stojaku.
  4. Pobrać kolbę z inkubatora i potwierdzić ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z laserem o długości fali 488 nm (Rysunek 1A). Intensywność sygnału zależy od skuteczności transfekcji zabiegu i użytych konstrukcji.
  5. Zebrać pożywkę z komórek do wstępnie oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechylić kolbę T175 HEK293T z transfekowanymi komórkami tak, aby pożywka zebrała się w dolnym rogu kolby. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, zebrać pożywkę bez naruszania monowarstwy komórek. Niektóre pływające komórki mogą być widoczne w tym momencie. Przenieś pożywkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i zamknij pokrywę.
    1. Używając 25 ml pasiaka serologicznego, dodać 25 ml świeżego, ciepłego cDMEM do kolby. Upewnij się, że strumień medium jest skierowany na ścianki kolby, aby nie naruszyć monowarstwy komórek. Kolbę z transfekowanymi komórkami HEK293T umieścić z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2 ).
      UWAGA: Drugie pobranie lentiwirusa i dalsze oczyszczanie można przeprowadzić po dodatkowych 24 godzinach, postępując zgodnie z procedurą opisaną w powyższych krokach.
  6. Gdy pobieranie lentiwirusa zostanie zakończone po 24 godzinach lub 48 godzinach, dodaj roztwór odkażający do komórek, upewniając się, że pokrywa on monowarstwę komórki. Kolbę należy trzymać poziomo przez następne 24 godziny, a następnie wyrzucić ją zgodnie z odpowiednimi przepisami kategorii II.

4. Oczyszczanie lentiwirusa

  1. Przefiltruj pożywkę zbiorczą z kroku 3.5.
    1. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 50 ml i włożyć do końcówki strzykawki sterylny filtr z polieterosulfonu lub polifluorku winylidenu 0,45 μm o niskiej zawartości wiązania z białkami. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, dodać do strzykawki zebraną pożywkę z kroku 3.5.1 i delikatnie wcisnąć tłok.
    2. Powoli wciskaj korek, aby przepuścić medium przez filtr do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli przepływ znacznie się zmniejszy, należy ustawić strzykawkę z filtrem skierowanym do góry i wyciągnąć tłok na tyle, aby usunąć medium z filtra.
    3. Ostrożnie wymienić filtr w strzykawce na nowy, a zużyty filtr wyrzucić do roztworu odkażającego. Kontynuuj filtrację pożywki. Po zakończeniu należy odkazić filtr i strzykawkę, zanurzając filtr i napełniając strzykawkę roztworem odkażającym.
  2. Wstępnie schłodzić ultrawirówkę, ustawiając temperaturę na 4 °C i zamknąć pokrywę, aby temperatura się przyczyniła.
  3. Dodać 3 ml 20% roztworu sacharozy (20% w/v w ultraczystej wodzie, przefiltrować wysterylizowane przy użyciu filtra 0,22 μm) na dno stożkowej probówki ultrawirówki.
  4. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, nałożyć przefiltrowaną pożywkę na warstwę sacharozy, uważając, aby nie naruszyć warstw.
    1. Użyj najniższego ustawienia prędkości w pipetowniku. Ustawić stożkową probówkę ultrawirówki pod kątem około 45° i powoli dodawać przefiltrowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa z kroku 4.1 do ścianki probówki. Upewnij się, że podłoże i sacharoza nie mieszają się ze sobą i widoczne jest wyraźne oddzielenie warstw (Rysunek 1B). Wraz ze wzrostem objętości warstwy pożywki powoli przechylaj probówkę ultrawirówki z powrotem do pozycji pionowej.
  5. Jeśli całkowita objętość, łącznie z sacharozą i pożywką, w probówce ultrawirówki jest mniejsza niż 29 ml, uzupełnij ją świeżym cDMEM, aby uniknąć zapadnięcia się probówki podczas wirowania. W przypadku wielu kolekcji T175 ml należy wymieszać przefiltrowane preparaty pożywki i użyć wielu probówek ultrawirówek. W razie potrzeby uzupełnij ostatnią probówkę ultrawirówki pożywką.
  6. Upewnij się, że wiadra do ultrawirówek są czyste; na dnie wiadra lub nakrętkach nie ma średnich pozostałości. W razie potrzeby przetrzeć ~70% alkoholem. Umieść odpowiednie adaptery probówek na dnie każdego wiadra (Rysunek 1C) i delikatnie opuść probówki ultrawirówki do wiader.
  7. Szczelnie zamknij wiadra i zawieś je w wyznaczonych miejscach na wirniku wirującym.
  8. Upewnij się, że wiadra są zrównoważone tymi samymi objętościami sacharozy i podłoża. Wirnik wirujący nigdy nie może być uruchamiany bez łyżek, chociaż przeciwległe łyżki mogą pozostać puste20 (Rysunek 1D).
  9. Ostrożnie włóż wirnik do ultrawirówki i włącz próżnię. Ustaw szybkość przyspieszania i zwalniania ultrawirówki na najniższe ustawienie i uruchom preparaty lentiwirusowe przy 85 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Poczekaj, aż ultrawirówka osiągnie wymaganą prędkość (około 3-5 minut) przed odejściem, aby upewnić się, że wirnik jest prawidłowo włożony, a wirowanie się nie zakończy.
  11. Podczas pracy ultrawirówki należy posprzątać miejsce pracy zgodnie z wymogami bezpieczeństwa kategorii II i przygotować przestrzeń do kolejnych kroków.
  12. Po zakończeniu wirowania wyłącz próżnię i ostrożnie wyjmij wirnik, aby nie naruszyć próbek.
  13. Zbadaj ultrawirówkę pod kątem wycieków i upewnij się, że nie ma wycieków z wiader. W przypadku rozlania należy założyć dwie rękawice i odkazić wirówkę oraz zewnętrzną powierzchnię wiader produktami przeciwwirusowymi.
  14. Wyjmij wiadra z ultrawirówki i ostrożnie przetransportuj wiadra do szafki bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.
    UWAGA: Cząsteczki lentiwirusa gromadzą się na dnie probówki ultrawirówkowej. Śrut nie jest widoczny gołym okiem.
  15. Wlej sacharozę i pożywkę jednym płynnym ruchem bezpośrednio do pojemnika na odpady z roztworem do odkażania.
  16. Trzymając probówkę ultrawirówki odwróconą, przenieś ją na podwójną warstwę tkanki i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. W międzyczasie wytrzyj wnętrze wiader chusteczką nasączoną wodą i wysusz na powietrzu do góry nogami.
  17. Ostrożnie osusz pozostałą ciecz z krawędzi probówki ultrawirówki chusteczką przed obróceniem jej do pozycji pionowej. Zdezynfekuj tkankę i powierzchnię pod spodem.
  18. Zawiesić osad wirusa w 1 ml pożywki lub roztworu bez surowicy, wymaganego do dalszych eksperymentów, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół. Pozostaw na 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.
  19. Delikatnie wymieszać preparaty lentiwirusa za pomocą pipety o pojemności 1 ml przed rozdzieleniem na 1,5 ml zakręcane probówki (np. krioprobówki). Przygotować podwielokrotności do pracy in vivo (wielokrotność 100 μl) i do miana lentiwirusa w limfocytach T Jurkata (1 x 20 μl) (patrz etap 5).
  20. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania; preparaty lentiwirusowe można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy bez negatywnego wpływu na zakaźność.

5. Miareczkowanie produkcji lentiwirusa w limfocytach T Jurkata

  1. Przygotuj kompletną pożywkę Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) dla limfocytów T Jurkat, uzupełniając 500 ml RPMI-1640 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą i końcowym stężeniem 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
  2. Aby zapewnić zdrową hodowlę limfocytów T Jurkat, należy utrzymywać komórki w hodowli do 1 tygodnia przed zakażeniem.
  3. W dniu miareczkowania lentiwirusa należy umieścić żywe limfocyty T Jurkat na 24-dołkowej płytce w ilości 2 x 105 komórek/dołek w 200 μl na studzienkę cRPMI-1640.
  4. Użyć świeżo pobranego lentiwirusa lub rozmrozić fiolkę z lentiwirusem zawierającą 20 μl na lodzie i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
  5. Stosując seryjne rozcieńczanie w cRPMI-1640, zainfekuj limfocyty T Jurkat 0,25 μl, 0,5 μl, 1 μl, 2,5 μl, 5 μl i 10 μl lentiwirusa. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie lentiwirusa. Niezakażone limfocyty T Jurkata służą jako kontrola negatywna.
  6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C. Po 4 godzinach uzupełnić każdą studzienkę cRPMI do całkowitej objętości 400 μl. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 dni.
  7. Po 48 godzinach od zakażenia potwierdź ekspresję GFP w systemie obrazowania fluorescencyjnego.
  8. 3 dni po zakażeniu zebrać każdą studzienkę z 24-dołkowej płytki do oddzielnych probówek zbiorczych o pojemności 1,5 ml i odwirować komórki w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  9. Odrzucić supernatant. Zawiesić granulat w 300 μl 2% paraformaldehydu (PFA) przygotowanego do 2% (w/v) w DPBS i pozostawić na 15 minut na lodzie w ciemności.
  10. Odwirować komórki w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w buforze do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (sterylny DPBS + 4% FCS + 1 mM sterylny EDTA).
  11. Przeanalizuj częstotliwość ekspresji GFP i średnią intensywność fluorescencji zakażonego lentiwirusem i jego komórek kontrolnych za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2).

6. Zakażenie in vivo lentiwirusem makrofagów otrzewnowych rezydujących w tkance

  1. Do komory bezpieczeństwa biologicznego kategorii II należy umieścić igły insuliny o łącznej objętości 200 μl pożywki niezawierającej surowicy zawierającej wymaganą ilość lentiwirusa (należy używać igieł jednorazowego użytku, 30 G ze względu na dobrostan zwierząt i w celu uniknięcia utraty płynu w igle).
  2. Umieścić osłonkę igły z powrotem na igle, używając techniki czerpania jedną ręką. Trzymać igłę na lodzie i wstrzyknąć w ciągu 30 minut.
  3. W pomieszczeniu dla zwierząt przed wstrzyknięciami należy założyć komorę bezpieczeństwa biologicznego kategorii II (Rysunek 1E).
    1. Połóż arkusz czystej chusteczki. Poluzować osłonkę igły insulinowej zawierającej lentiwirusa.
    2. Przygotuj szalkę Petriego zawierającą małe kawałki tkanki i środek dezynfekujący na bazie glukonianu chlorheksydyny, probówkę o pojemności 50 ml zawierającą roztwór odkażający (roztwór wybielacza 2000 ppm) oraz ostry bezpieczny pojemnik.
  4. Powstrzymaj mysz, chwytając skórę na karku21. Prawidłowo unieruchomiona mysz jest nieruchoma, co jest wymagane ze względów bezpieczeństwa.
  5. Z brzuchem skierowanym do góry, skieruj głowę zwierzęcia lekko w dół. Wstrzyknąć lentiwirusa dootrzewnowo w prawy dolny kwadrant jamy brzusznej. Ma to na celu uniknięcie wstrzyknięcia do jakichkolwiek narządów jamy otrzewnej.
  6. Przed uwolnieniem myszy napełnij strzykawkę roztworem odkażającym i bezpiecznie wyrzuć ją do ostrego sejfu.
  7. Przetrzyj miejsce wstrzyknięcia na brzuchu myszy chusteczką nasączoną środkiem dezynfekującym i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
  8. Mysz z wstrzykniętym lentiwirusem należy przechowywać w skantainerze kategorii II lub w klatkach wentylowanych indywidualnie (IVC) (izolowane klatki z wysokowydajną filtracją powietrza) przez co najmniej 72 godziny po wstrzyknięciu. Umieść odpowiednią kartę informacyjną z przodu klatki.
  9. Przenieś mysz do nowej klatki kategorii I po 72 godzinach od zakażenia, w zależności od lokalnych atestów bezpieczeństwa. Monitoruj myszy codziennie przez łącznie 3 dni od wstrzyknięcia.

7. Pobieranie komórek otrzewnej od myszy zakażonej lentiwirusem

UWAGA: W przypadku pobierania w ciągu 72 godzin od wstrzyknięcia lentiwirusa, postępuj zgodnie z instytucjonalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego kategorii II. Ściółka i klatka, w której trzymano zakażone zwierzęta w ciągu pierwszych 72 godzin po wstrzyknięciu lentiwirusa, muszą zostać odkażone zgodnie z instytucjonalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.

  1. Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi, na przykład poprzez wdychanie rosnącego stężenia CO2 , a następnie potwierdzenie śmierci przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Oczyść brzuch myszy 70% izopropanolem i ostrożnie przeciąć skórę, aby odsłonić błonę jamy otrzewnej.
  3. Przepłukać jamę otrzewnej 6 ml lodowatego buforu FACS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 23 G. Unikaj nakłuwania jakichkolwiek narządów.
  4. Delikatnie masuj otrzewną, aby usunąć komórki do bufora FACS.
  5. Zebrać płyn otrzewnowy za pomocą tej samej strzykawki i igły.
  6. Wyjąć igłę i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  7. Płukanie otrzewnowe należy przechowywać na lodzie.
  8. Należy pobrać inne wymagane narządy i przechowywać je zgodnie z potrzebami badania.
  9. Zwłoki zwierzęce należy utylizować zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zwierząt i bezpieczeństwa.

8. Barwienie i analiza komórek otrzewnej

  1. Odwirować płukanie otrzewnowe w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, odrzucić supernatant do roztworu odkażającego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS.
  2. Policz zebrane komórki i płytkę 4 x 105 komórek na dołek w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V.
  3. Barwienie żywotności należy wykonać za pomocą odczynnika do utrwalania (np. zestawu do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni używanego tutaj) zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Jeśli komórki zostały zakażone w ciągu ostatnich 72 godzin, utrwal komórki w 2% PFA przez 15 minut na lodzie. Dodać równą objętość zimnego DPBS i ponownie odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  5. Przygotować bufor blokujący: Wymieszać 4 μg/ml przeciwciała 2,4G2 w 10% (v/v) surowicy szczura w buforze FACS do barwienia powierzchni lub buforze przepuszczalnym do barwienia wewnątrzkomórkowego.
  6. Zawiesić ponownie każdą studzienkę zawierającą osad komórkowy w 50 μl buforu blokującego i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  7. Przygotować mieszaninę przeciwciał w 50 μl buforu FACS (do barwienia powierzchni) lub buforu permeabilizacji (do barwienia wewnątrzkomórkowego) na każdą próbkę. Ostateczna objętość barwienia dla każdej próbki wynosi 100 μl, w tym 50 μl buforu blokującego. Obliczyć odpowiednio stężenia przeciwciał (tabela 1).
  8. Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał do próbek i 50 μl próbek kontrolnych izotypu i buforu kontrolnego do próbek kontrolnych. Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności. W razie potrzeby dołącz niebarwione komórki i kontrole izotypu.
  9. Przemyć każdą studzienkę 100-200 μl lodowatego DPBS i odwirować płytkę o sile 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórz ten krok, aby zmyć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego.

9. Pobieranie komórek z organów

  1. Przygotuj 1 ml mieszanki trawiennej na narząd: Wymieszaj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), 2 mg/ml kolagenazy typu IV i 0,03 mg/ml DNazy I (w tym 1,5 mg/ml hialuronidazy do trawienia płuc).
  2. Przenieś pobrany narząd do 1 ml mieszanki trawiącej i zmiel go nożyczkami.
  3. Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  4. W przypadku izolowania komórek z płuc, śledziony lub wątroby należy lizować czerwone krwinki za pomocą buforu do lizy ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA pH = 7,4). Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  5. Wybarwić i przeanalizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przy pełnym i prawidłowym zastosowaniu, protokół ten pozwala na uzyskanie łącznie 1,5 mL wysokiej jakości zapasu lentiwirusa z jednego przygotowania, co jest wystarczające do dwunastu wstrzyknięć in vivo w optymalnej objętości określonej w niniejszym badaniu18. Sukces transfekcji można ocenić na wczesnym etapie protokołu. Zdrowe i konfluentne komórki HEK293T powinny wykazywać, jeśli znajdują się w plazmidach, łatwo wykrywalny sygnał markera (np. GFP użytego w tym badaniu) po 48 h od trans...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Makrofagi rezydujące w tkankach pełnią szereg funkcji homeostatycznych i zapalnych specyficznych dla tkanek 1,2 podyktowanych ich środowiskiem fizjologicznym 6,7,8,9. W protokole tym wprowadzono skuteczną metodę18 manipulacji makrofagami rezydującymi w otrzewnej in vivo przy użyciu cząstek lentiwirusa w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane, w całości lub w części, przez Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. PRT jest również wspierany przez brytyjski Instytut Badań nad Demencją. Magister nauk biologicznych jest wspierany przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych Discovery Fellowship (BB/T009543/1). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję praw autorskich CC BY do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia. L.C.D jest wykładowcą na Uniwersytecie w Swansea i honorowym pracownikiem naukowym Uniwersytetu w Cardiff. Praca ta jest wspierana przez prace przeprowadzone przez Ipseiz et al. 202018.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x) (Trypsyna 500 mg/L lub 0,02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0,22 μ m sterylny filtr millex GPMerckSLGS033SS
0,45 μ m sterylny filtr millex GPMerckSLHP033RS
0,5 ml strzykawka insulinowa U-100 z igłą, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)BD324892
1 litrowy pojemnik na ostreNie
Przeciwciało 2,4G2 (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μ m sitkoThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (klasa badawcza), AlbuMax SuplementThermo Fisher Scientific31035025
Bufor blokującyprzygotowany we własnym zakresie
Pożywka z tioglikolanu browarniczegoSigma-AldrichB25514% roztwór podstawowy przygotowany w wodzie, autoklawowany i przechowywany w stanie zamrożonym.
CD11bBiolegend101222Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11bBD550993Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11cBiolegend117317Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11cBiolegend117333Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD19BD560375Patrz tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia
CD19Biolegend152410tabela 1 w celu sprawdzenia rozcieńczenia i stężenia
CD226Biolegend128808rozcieńczeniem i stężeniem
CD3eBD560527Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
CD3eBiolegend152313Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD4Biolegend100412Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD73eBioscience16-0731-82Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD8aeBioscience48-0081-82Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
Kolba do hodowli komórkowych (T175 fask 175, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Probówki wirówkowe, stożkowe probówki denne 25 mm x 89 mmWirówki do redlic Beckman Coulter358126
Beckman Coulteri wirówka TC
Kolagenaza typ IVSigma-AldrichC5138
Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277lub cryotubes
DMEM medium (1x) + 4,5g/L D-glukozy, 400 &mikro; M L-glutaminaThermo Fisher Scientific41965-062
Dnaza ISigma-Aldrich11284932001
Odczynnik do transfekcji EffecteneQiagen301425
F4/80Biolegend123123Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
F4/80Biolegend123133Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
F4/80Biolegend123147Patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia
FceR1eBioscience48-5898-80Patrz Tabela 1 w celu rozcieńczenia i stężenia
Surowicy cielęcej płodu (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106inaktywowany termicznie przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C i sterylne przefiltrowane przez 0,22 μ m filtr
Cytometr przepływowyThermo Fisher Scientific 
przygotowany we własnym zakresie
Fluorescencyjny mikroskop do hodowli tkanekThermo Fisher ScientificEVOS FL
KleszczeN/AN/APreferencje użytkownika
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T liniakomórkowauprawiane przez co najmniej tydzień przed transfekcją. Wolny od mykoplazmy
HIV-1 Antygen rdzeniowyBeckman Coulter6604667
HialuronidazaSigma-AldrichH3506
Peeling chirurgiczny Hydrex, glukonian chlorheksydu 4% w/v środek do mycia skóryEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Patrz tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem
ICAM1Becton Dickinson554970Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
liniiJurkat hodowanej przez co najmniej tydzień przed użyciem. Wolny od mykoplazmy
ŻYWY/MARTWY zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem
Myszyużywały tutaj samic C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni (Charles Rivers), chyba że określono inaczej
Pipety mikrokapilarne (zakres objętości 0,5-1,000 μ L)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
ParaformaldehyduSigma-AldrichP6148-500Gprzygotowanego do 2% w/v w PBS
pCMV-Δ Plazmid pakujący R8.91Zuffrey, R., et al. 1997 Oporność na ampicilinę.
Penicylina / Streptomycyna (100x, 10 000 U / ml)Thermo Fisher Scientific15140122
szalka PetriegoGreiner Bio One664160
plazmid pHR'SIN-cPPT-SEWRosas, M. i in. 2014 Koduje marker EGFP za promotorem SFFV i przed wzmacniaczem wirusa hepatitiv Woodchuck. Oporność na ampicilinę.
pMD2.GNaldini, L. i wsp. 1996koduje otoczkę g-glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G). Oporność na ampicilinę.
Kontrola izotypu IgG1 szczuraBecton Dickinson550617Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
Surowica szczuraSigma-AldrichR9759-10ML
Bufor do lizy ACK z krwią czerwonąprzygotowany w domu
RPMI 1640 pożywka (1x) + 400 uM L-glutaminaThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
Podchloryn sodu Tabletki (wybielacz, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterylna 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio One662160
Sterylny PBS (DPBS) firmy Dulbecco (1x) Mg++ i Ca2+ - bezpłatnieThermo Fisher Scientific14190144
Sterylne EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterylne jednorazowe pipety transferowe VWR (23,0 ml, 30 cm)VWR612-4515
SacharozaThermo Fisher Scientific
N/A/APreferencje użytkownika
Strzykawki (50 ml i 1 0 mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i zatężeniem
96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z dnem UGreiner Bio One650180
przedmioty dotyczy Patrz Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z Ultrawirówka Bufor do cytometrii przepływowej (FACS) Attune NxT komórek T koduje białko Gag-Pol HIV napędzane przez promotor wirusa cytomegalii. zmodyfikowany do badań ekspresji shRNA i miR.Plazmid Nożyczki chirurgiczne 15503022 N

Bibliografia

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146(2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. BeckmanCoulter. , https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023).
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1(2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152(2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875(2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85(2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Makrofagi otrzewnowemodulacja genówdostarczanie in vivokomórki HEK293Twstrzyknięcie dootrzewnoweultrawirowaniefluorescencja GFP
Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.