Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Podsumowanie

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Streszczenie

Makrofagi rezydujące w tkance otrzewnej pełnią szerokie funkcje w utrzymaniu homeostazy i biorą udział w patologiach w obrębie lokalnych i sąsiednich tkanek. Ich funkcje są podyktowane sygnałami mikrośrodowiskowymi; Dlatego konieczne jest zbadanie ich zachowania w niszy fizjologicznej in vivo. Obecnie specyficzne metodologie celowania w makrofagi otrzewnowej wykorzystują modele transgeniczne całych myszy. W tym miejscu opisano protokół skutecznej modulacji in vivo ekspresji mRNA i małych gatunków RNA (np. mikroRNA) w makrofagach otrzewnowych przy użyciu cząstek lentiwirusa. Preparaty lentiwirusowe wytwarzano w HEK293T komórkach i oczyszczano na pojedynczej warstwie sacharozy. Walidacja in vivo skuteczności lentiwirusa po wstrzyknięciu dootrzewnowym wykazała dominujące zakażenie makrofagów ograniczone do tkanki miejscowej. Celowanie w makrofagi otrzewnowe było skuteczne podczas homeostazy i zapalenia otrzewnej wywołanego tioglikolanem. Omówiono ograniczenia protokołu, w tym stan zapalny o niskim poziomie wywołany dootrzewnowym podawaniem lentiwirusa oraz ograniczenia czasowe dla potencjalnych eksperymentów. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przedstawia szybki i przystępny protokół szybkiej oceny funkcji genów w makrofagach otrzewnowych in vivo.

Wprowadzenie

Makrofagi rezydujące w tkankach (Mφ) to niejednorodna populacja fagocytarnych komórek odpornościowych, które wyczuwają i reagują na atakujące patogeny^1,2. Ponadto odgrywają istotną rolę w rozwoju, przebudowie i utrzymaniu homeostazy tkanek^1,3. Wiele tkanek Mφ pochodzi od komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas embriogenezy i utrzymuje się w tkance przez całe życie^4,5. Fenotyp i funkcje tych komórek są podyktowane wspólnymi i hierarchicznymi interakcjami określonych czynników transkrypcyjnych oraz lokalnego mikrośrodowiska^6,7,8,9. Coraz lepsze zrozumienie tej zależności zwiększa zapotrzebowanie na skuteczne metody manipulacji genami Mφ in vivo w ich fizjologicznie istotnej niszy.

wektory lentiwirusowe są często wykorzystywanym narzędziem do manipulowania kwasami nukleinowymi w określonych populacjach komórek in vivo^10,11,12, szczególnie ze względu na ich zdolność do infekowania zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek oraz do stabilnej integracji z genomem gospodarza^13,14. W ciągu ostatnich dwóch dekad technologia dostarczania lentiwirusa została zoptymalizowana, a alternatywne koperty i syntetyczne promotory zostały zbadane w celu zwiększenia celowania specyficznego dla linii^8,15. Ze względu na szeroki tropizm komórkowy, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej otacza glikoproteinę (VSV-G)^16,17 stał się "złotym standardem" otoczki stosowanej w technologii lentiwirusów.

W tym protokole¹⁸, pseudotypowane cząstki lentiwirusowe VSV-G są wykorzystywane do demonstracji ukierunkowanego i skutecznego dostarczania krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) i mikroRNA (miR) do mysiego Mφ (pMφ) in vivo, w stanie ustalonym¹⁹. Ekspresja transgenu była napędzana przez promotor wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV). Produktywne zakażenie komórek zdefiniowano na podstawie ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (GFP) pochodzącego z lentiwirusa. Zastosowanie tego podejścia umożliwiło łatwy odczyt na potrzeby eksperymentów in vivo lentiwirusa w celu określenia optymalnej dawki i ram czasowych eksperymentu. Wreszcie, prowokacja lentiwirusowa in vivo myszy podczas zapalenia wywołanego tioglikolanem ujawniła naturalną skłonność do selektywnego zakażenia pMφ.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucji i Ministerstwa Spraw Wewnętrznych Wielkiej Brytanii.

UWAGA: Wszystkie badania in vivo z lentiwirusem powinny być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach, a także przestrzegać wszystkich przepisów związanych z używaniem materiałów zakaźnych kategorii II. Dobrostan zwierząt powinien być również monitorowany zgodnie z lokalnymi przepisami. Na tym etapie protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z cząstkami lentiwirusowymi i ostrymi narzędziami.

1. Przygotowanie komórek HEK293T do transfekcji

UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kolektorem bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej.

1. Przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (cDMEM) firmy Dulbecco dla komórek HEK293T, łącząc 450 ml DMEM z 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą (50 ml) i końcowym stężeniem 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
2. Rozmrażaj komórki HEK293T co najmniej 1 tydzień przed planowaną transfekcją. Utrzymuj zdrowe warunki wzrostu i pasażu co 2-3 dni za pomocą trypsyny + EDTA do odłączenia komórek od kolby.
3. Na dzień przed transfekcją ostrożnie odessać pożywkę wzrostową z komórek i delikatnie umyć komórki sterylnym DPBS. Dodać 1-5 ml trypsyny do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 przez} 2-5 minut.
4. Dodać 5-10 ml cDMEM i wirować komórki w temperaturze 350 x g przez 5 minut. Usuń płyn i ponownie zawieś osad komórek w 10 ml cDMEM. Policz komórki i zasiej 10-11 x 10⁶ żywotnych komórek HEK293T na kolbę T175 w 20 ml cDMEM.
5. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 przez} noc, aby umożliwić komórkom HEK293T osiągnięcie zbiegu 70%-80%.
6. Następnego dnia potwierdź zbieg komórek pod mikroskopem świetlnym.
7. Usunąć pożywkę z kolby za pomocą paski serologicznej o pojemności 25 ml, nie naruszając monowarstwy komórek.
8. Delikatnie dodaj 10 ml DPBS i kołysz płytką, aby umyć komórki, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy komórek.
9. Usunąć DPBS za pomocą 25 ml paski serologicznej.
10. Dodać 15 ml nowego cDMEM na ściankę do kolby T175, aby nie naruszyć monowarstwy komórek, i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

2. Transfekcja komórek HEK293T za pomocą odczynnika do transfekcji lipidów nieliposomalnych

1. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przygotuj składniki lentiwirusowe: 2 μg plazmidu lentiwirusowego, 1,5 μg pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) i 1 μg pMD2.G (pCMV-MD2.G) z buforem EC (zestaw odczynników do transfekcji) do końcowej objętości 600 μl.
2. Dodać 36 μl roztworu wzmacniacza. Wymieszać składniki za pomocą pipety o pojemności 1 ml, kilkakrotnie zasysając część płynu i umieszczając ją z powrotem kropla po kropli bezpośrednio na pozostały roztwór. Pozostaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Dodać 120 μl odczynnika do transfekcji i wymieszać jak wyżej około 20 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodać 5,2 ml cDMEM i wymieszać jak powyżej z 5 ml pasków serologicznych.
5. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami bezpośrednio na monowarstwę komórek HEK293T (omijając ścianki kolby), rozprowadzając mieszaninę w różnych miejscach kolby.
6. Rozprowadzić plazmid, delikatnie kołysząc kolbą z boku na bok. Nie dopuścić do dostania się płynów do pokrywy kolby.
7. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5 % CO₂ przez 48 godzin. Potwierdzić skuteczną transfekcję HEK293T komórek poprzez pojawienie się markera fluorescencyjnego, w tym przypadku GFP, w ciągu 24 godzin od transfekcji, monitorowanego pod mikroskopem fluorescencyjnym do obrazowania komórek.
   UWAGA: W przypadku konstruktów bez markera fluorescencyjnego, komórki HEK293T muszą zostać przebadane pod kątem obecności użytego genu markerowego lub zmiany ekspresji w genie/białku będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą odpowiednich technik, np. qPCR. Alternatywnie, udana transfekcja może być pośrednio zweryfikowana podczas testowania kolekcji lentiwirusa na komórkach Jurkat na późniejszych etapach protokołu za pomocą powyższych technik.
   UWAGA: Transfekowane komórki HEK293T są uważane za zakaźne i podczas obchodzenia się z tymi komórkami należy wdrożyć odpowiednie środki ostrożności. Należy przestrzegać lokalnych przepisów, które zazwyczaj mogą obejmować pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii II, stosowanie podwójnych rękawic i odpowiedniego roztworu odkażającego do dezynfekcji, na przykład zwiększone stężenie wybielacza odpadowego (2000 ppm) lub równoważnego roztworu zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie roztwory i tworzywa sztuczne mające kontakt z preparatem lentiwirusa powinny być dezynfekowane zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.

3. Zbiór cząsteczek lentiwirusowych

1. Przygotuj roztwór do odkażania, roztwór wybielacza (podchloryn sodu) o wysokim stężeniu (2 000 ppm) lub równoważny środek zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego w wiadrze i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Przygotuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego, usuwając wszelkie nadmiarowe przedmioty, takie jak puste stojaki na probówki itp.
3. Wstępnie oznaczyć probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na kolbę HEK293T komórek T175 i zdjąć pokrywkę z probówki wirówkowej. Umieść rurki w stabilnym stojaku.
4. Pobrać kolbę z inkubatora i potwierdzić ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z laserem o długości fali 488 nm (Rysunek 1A). Intensywność sygnału zależy od skuteczności transfekcji zabiegu i użytych konstrukcji.
5. Zebrać pożywkę z komórek do wstępnie oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przechylić kolbę T175 HEK293T z transfekowanymi komórkami tak, aby pożywka zebrała się w dolnym rogu kolby. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, zebrać pożywkę bez naruszania monowarstwy komórek. Niektóre pływające komórki mogą być widoczne w tym momencie. Przenieś pożywkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i zamknij pokrywę.
   1. Używając 25 ml pasiaka serologicznego, dodać 25 ml świeżego, ciepłego cDMEM do kolby. Upewnij się, że strumień medium jest skierowany na ścianki kolby, aby nie naruszyć monowarstwy komórek. Kolbę z transfekowanymi komórkami HEK293T umieścić z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5 % CO_{2 )}.
      UWAGA: Drugie pobranie lentiwirusa i dalsze oczyszczanie można przeprowadzić po dodatkowych 24 godzinach, postępując zgodnie z procedurą opisaną w powyższych krokach.
6. Gdy pobieranie lentiwirusa zostanie zakończone po 24 godzinach lub 48 godzinach, dodaj roztwór odkażający do komórek, upewniając się, że pokrywa on monowarstwę komórki. Kolbę należy trzymać poziomo przez następne 24 godziny, a następnie wyrzucić ją zgodnie z odpowiednimi przepisami kategorii II.

4. Oczyszczanie lentiwirusa

1. Przefiltruj pożywkę zbiorczą z kroku 3.5.
   1. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 50 ml i włożyć do końcówki strzykawki sterylny filtr z polieterosulfonu lub polifluorku winylidenu 0,45 μm o niskiej zawartości wiązania z białkami. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, dodać do strzykawki zebraną pożywkę z kroku 3.5.1 i delikatnie wcisnąć tłok.
   2. Powoli wciskaj korek, aby przepuścić medium przez filtr do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jeśli przepływ znacznie się zmniejszy, należy ustawić strzykawkę z filtrem skierowanym do góry i wyciągnąć tłok na tyle, aby usunąć medium z filtra.
   3. Ostrożnie wymienić filtr w strzykawce na nowy, a zużyty filtr wyrzucić do roztworu odkażającego. Kontynuuj filtrację pożywki. Po zakończeniu należy odkazić filtr i strzykawkę, zanurzając filtr i napełniając strzykawkę roztworem odkażającym.
2. Wstępnie schłodzić ultrawirówkę, ustawiając temperaturę na 4 °C i zamknąć pokrywę, aby temperatura się przyczyniła.
3. Dodać 3 ml 20% roztworu sacharozy (20% w/v w ultraczystej wodzie, przefiltrować wysterylizowane przy użyciu filtra 0,22 μm) na dno stożkowej probówki ultrawirówki.
4. Używając pasetki serologicznej o pojemności 25 ml, nałożyć przefiltrowaną pożywkę na warstwę sacharozy, uważając, aby nie naruszyć warstw.
   1. Użyj najniższego ustawienia prędkości w pipetowniku. Ustawić stożkową probówkę ultrawirówki pod kątem około 45° i powoli dodawać przefiltrowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa z kroku 4.1 do ścianki probówki. Upewnij się, że podłoże i sacharoza nie mieszają się ze sobą i widoczne jest wyraźne oddzielenie warstw (Rysunek 1B). Wraz ze wzrostem objętości warstwy pożywki powoli przechylaj probówkę ultrawirówki z powrotem do pozycji pionowej.
5. Jeśli całkowita objętość, łącznie z sacharozą i pożywką, w probówce ultrawirówki jest mniejsza niż 29 ml, uzupełnij ją świeżym cDMEM, aby uniknąć zapadnięcia się probówki podczas wirowania. W przypadku wielu kolekcji T175 ml należy wymieszać przefiltrowane preparaty pożywki i użyć wielu probówek ultrawirówek. W razie potrzeby uzupełnij ostatnią probówkę ultrawirówki pożywką.
6. Upewnij się, że wiadra do ultrawirówek są czyste; na dnie wiadra lub nakrętkach nie ma średnich pozostałości. W razie potrzeby przetrzeć ~70% alkoholem. Umieść odpowiednie adaptery probówek na dnie każdego wiadra (Rysunek 1C) i delikatnie opuść probówki ultrawirówki do wiader.
7. Szczelnie zamknij wiadra i zawieś je w wyznaczonych miejscach na wirniku wirującym.
8. Upewnij się, że wiadra są zrównoważone tymi samymi objętościami sacharozy i podłoża. Wirnik wirujący nigdy nie może być uruchamiany bez łyżek, chociaż przeciwległe łyżki mogą pozostać puste²⁰ (Rysunek 1D).
9. Ostrożnie włóż wirnik do ultrawirówki i włącz próżnię. Ustaw szybkość przyspieszania i zwalniania ultrawirówki na najniższe ustawienie i uruchom preparaty lentiwirusowe przy 85 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
10. Poczekaj, aż ultrawirówka osiągnie wymaganą prędkość (około 3-5 minut) przed odejściem, aby upewnić się, że wirnik jest prawidłowo włożony, a wirowanie się nie zakończy.
11. Podczas pracy ultrawirówki należy posprzątać miejsce pracy zgodnie z wymogami bezpieczeństwa kategorii II i przygotować przestrzeń do kolejnych kroków.
12. Po zakończeniu wirowania wyłącz próżnię i ostrożnie wyjmij wirnik, aby nie naruszyć próbek.
13. Zbadaj ultrawirówkę pod kątem wycieków i upewnij się, że nie ma wycieków z wiader. W przypadku rozlania należy założyć dwie rękawice i odkazić wirówkę oraz zewnętrzną powierzchnię wiader produktami przeciwwirusowymi.
14. Wyjmij wiadra z ultrawirówki i ostrożnie przetransportuj wiadra do szafki bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.
    UWAGA: Cząsteczki lentiwirusa gromadzą się na dnie probówki ultrawirówkowej. Śrut nie jest widoczny gołym okiem.
15. Wlej sacharozę i pożywkę jednym płynnym ruchem bezpośrednio do pojemnika na odpady z roztworem do odkażania.
16. Trzymając probówkę ultrawirówki odwróconą, przenieś ją na podwójną warstwę tkanki i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. W międzyczasie wytrzyj wnętrze wiader chusteczką nasączoną wodą i wysusz na powietrzu do góry nogami.
17. Ostrożnie osusz pozostałą ciecz z krawędzi probówki ultrawirówki chusteczką przed obróceniem jej do pozycji pionowej. Zdezynfekuj tkankę i powierzchnię pod spodem.
18. Zawiesić osad wirusa w 1 ml pożywki lub roztworu bez surowicy, wymaganego do dalszych eksperymentów, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół. Pozostaw na 15 minut w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.
19. Delikatnie wymieszać preparaty lentiwirusa za pomocą pipety o pojemności 1 ml przed rozdzieleniem na 1,5 ml zakręcane probówki (np. krioprobówki). Przygotować podwielokrotności do pracy in vivo (wielokrotność 100 μl) i do miana lentiwirusa w limfocytach T Jurkata (1 x 20 μl) (patrz etap 5).
20. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania; preparaty lentiwirusowe można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy bez negatywnego wpływu na zakaźność.

5. Miareczkowanie produkcji lentiwirusa w limfocytach T Jurkata

1. Przygotuj kompletną pożywkę Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) dla limfocytów T Jurkat, uzupełniając 500 ml RPMI-1640 10% (v/v) płodową surowicą cielęcą i końcowym stężeniem 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
2. Aby zapewnić zdrową hodowlę limfocytów T Jurkat, należy utrzymywać komórki w hodowli do 1 tygodnia przed zakażeniem.
3. W dniu miareczkowania lentiwirusa należy umieścić żywe limfocyty T Jurkat na 24-dołkowej płytce w ilości 2 x 10⁵ komórek/dołek w 200 μl na studzienkę cRPMI-1640.
4. Użyć świeżo pobranego lentiwirusa lub rozmrozić fiolkę z lentiwirusem zawierającą 20 μl na lodzie i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
5. Stosując seryjne rozcieńczanie w cRPMI-1640, zainfekuj limfocyty T Jurkat 0,25 μl, 0,5 μl, 1 μl, 2,5 μl, 5 μl i 10 μl lentiwirusa. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie lentiwirusa. Niezakażone limfocyty T Jurkata służą jako kontrola negatywna.
6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C. Po 4 godzinach uzupełnić każdą studzienkę cRPMI do całkowitej objętości 400 μl. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 dni.
7. Po 48 godzinach od zakażenia potwierdź ekspresję GFP w systemie obrazowania fluorescencyjnego.
8. 3 dni po zakażeniu zebrać każdą studzienkę z 24-dołkowej płytki do oddzielnych probówek zbiorczych o pojemności 1,5 ml i odwirować komórki w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
9. Odrzucić supernatant. Zawiesić granulat w 300 μl 2% paraformaldehydu (PFA) przygotowanego do 2% (w/v) w DPBS i pozostawić na 15 minut na lodzie w ciemności.
10. Odwirować komórki w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w buforze do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (sterylny DPBS + 4% FCS + 1 mM sterylny EDTA).
11. Przeanalizuj częstotliwość ekspresji GFP i średnią intensywność fluorescencji zakażonego lentiwirusem i jego komórek kontrolnych za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2).

6. Zakażenie in vivo lentiwirusem makrofagów otrzewnowych rezydujących w tkance

1. Do komory bezpieczeństwa biologicznego kategorii II należy umieścić igły insuliny o łącznej objętości 200 μl pożywki niezawierającej surowicy zawierającej wymaganą ilość lentiwirusa (należy używać igieł jednorazowego użytku, 30 G ze względu na dobrostan zwierząt i w celu uniknięcia utraty płynu w igle).
2. Umieścić osłonkę igły z powrotem na igle, używając techniki czerpania jedną ręką. Trzymać igłę na lodzie i wstrzyknąć w ciągu 30 minut.
3. W pomieszczeniu dla zwierząt przed wstrzyknięciami należy założyć komorę bezpieczeństwa biologicznego kategorii II (Rysunek 1E).
   1. Połóż arkusz czystej chusteczki. Poluzować osłonkę igły insulinowej zawierającej lentiwirusa.
   2. Przygotuj szalkę Petriego zawierającą małe kawałki tkanki i środek dezynfekujący na bazie glukonianu chlorheksydyny, probówkę o pojemności 50 ml zawierającą roztwór odkażający (roztwór wybielacza 2000 ppm) oraz ostry bezpieczny pojemnik.
4. Powstrzymaj mysz, chwytając skórę na karku²¹. Prawidłowo unieruchomiona mysz jest nieruchoma, co jest wymagane ze względów bezpieczeństwa.
5. Z brzuchem skierowanym do góry, skieruj głowę zwierzęcia lekko w dół. Wstrzyknąć lentiwirusa dootrzewnowo w prawy dolny kwadrant jamy brzusznej. Ma to na celu uniknięcie wstrzyknięcia do jakichkolwiek narządów jamy otrzewnej.
6. Przed uwolnieniem myszy napełnij strzykawkę roztworem odkażającym i bezpiecznie wyrzuć ją do ostrego sejfu.
7. Przetrzyj miejsce wstrzyknięcia na brzuchu myszy chusteczką nasączoną środkiem dezynfekującym i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
8. Mysz z wstrzykniętym lentiwirusem należy przechowywać w skantainerze kategorii II lub w klatkach wentylowanych indywidualnie (IVC) (izolowane klatki z wysokowydajną filtracją powietrza) przez co najmniej 72 godziny po wstrzyknięciu. Umieść odpowiednią kartę informacyjną z przodu klatki.
9. Przenieś mysz do nowej klatki kategorii I po 72 godzinach od zakażenia, w zależności od lokalnych atestów bezpieczeństwa. Monitoruj myszy codziennie przez łącznie 3 dni od wstrzyknięcia.

7. Pobieranie komórek otrzewnej od myszy zakażonej lentiwirusem

UWAGA: W przypadku pobierania w ciągu 72 godzin od wstrzyknięcia lentiwirusa, postępuj zgodnie z instytucjonalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego kategorii II. Ściółka i klatka, w której trzymano zakażone zwierzęta w ciągu pierwszych 72 godzin po wstrzyknięciu lentiwirusa, muszą zostać odkażone zgodnie z instytucjonalnymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego kategorii II.

1. Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi, na przykład poprzez wdychanie rosnącego stężenia CO_{2 ,} a następnie potwierdzenie śmierci przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Oczyść brzuch myszy 70% izopropanolem i ostrożnie przeciąć skórę, aby odsłonić błonę jamy otrzewnej.
3. Przepłukać jamę otrzewnej 6 ml lodowatego buforu FACS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 23 G. Unikaj nakłuwania jakichkolwiek narządów.
4. Delikatnie masuj otrzewną, aby usunąć komórki do bufora FACS.
5. Zebrać płyn otrzewnowy za pomocą tej samej strzykawki i igły.
6. Wyjąć igłę i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
7. Płukanie otrzewnowe należy przechowywać na lodzie.
8. Należy pobrać inne wymagane narządy i przechowywać je zgodnie z potrzebami badania.
9. Zwłoki zwierzęce należy utylizować zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zwierząt i bezpieczeństwa.

8. Barwienie i analiza komórek otrzewnej

1. Odwirować płukanie otrzewnowe w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, odrzucić supernatant do roztworu odkażającego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS.
2. Policz zebrane komórki i płytkę 4 x 10⁵ komórek na dołek w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V.
3. Barwienie żywotności należy wykonać za pomocą odczynnika do utrwalania (np. zestawu do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni używanego tutaj) zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Jeśli komórki zostały zakażone w ciągu ostatnich 72 godzin, utrwal komórki w 2% PFA przez 15 minut na lodzie. Dodać równą objętość zimnego DPBS i ponownie odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
5. Przygotować bufor blokujący: Wymieszać 4 μg/ml przeciwciała 2,4G2 w 10% (v/v) surowicy szczura w buforze FACS do barwienia powierzchni lub buforze przepuszczalnym do barwienia wewnątrzkomórkowego.
6. Zawiesić ponownie każdą studzienkę zawierającą osad komórkowy w 50 μl buforu blokującego i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
7. Przygotować mieszaninę przeciwciał w 50 μl buforu FACS (do barwienia powierzchni) lub buforu permeabilizacji (do barwienia wewnątrzkomórkowego) na każdą próbkę. Ostateczna objętość barwienia dla każdej próbki wynosi 100 μl, w tym 50 μl buforu blokującego. Obliczyć odpowiednio stężenia przeciwciał (tabela 1).
8. Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał do próbek i 50 μl próbek kontrolnych izotypu i buforu kontrolnego do próbek kontrolnych. Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności. W razie potrzeby dołącz niebarwione komórki i kontrole izotypu.
9. Przemyć każdą studzienkę 100-200 μl lodowatego DPBS i odwirować płytkę o sile 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórz ten krok, aby zmyć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego.

9. Pobieranie komórek z organów

1. Przygotuj 1 ml mieszanki trawiennej na narząd: Wymieszaj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), 2 mg/ml kolagenazy typu IV i 0,03 mg/ml DNazy I (w tym 1,5 mg/ml hialuronidazy do trawienia płuc).
2. Przenieś pobrany narząd do 1 ml mieszanki trawiącej i zmiel go nożyczkami.
3. Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
4. W przypadku izolowania komórek z płuc, śledziony lub wątroby należy lizować czerwone krwinki za pomocą buforu do lizy ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
5. Wybarwić i przeanalizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 8.

Wyniki

Przy pełnym i prawidłowym przestrzeganiu, ten protokół daje w sumie 1,5 ml wysokiej jakości zapasu lentiwirusa na pojedynczy preparat, wystarczający do dwunastu wstrzyknięć in vivo w optymalnej objętości określonej w tym badaniu¹⁸. Powodzenie transfekcji można ocenić na wczesnym etapie protokołu. Zdrowe i zlewające się komórki HEK293T powinny wykazywać, jeśli są obecne w plazmidach, łatwo wykrywalny sygnał markerowy (np. GFP użyty w tym badaniu) po 48 godzinach od transfekcji plazmidu (Figura 1A). Niska intensywność sygnału, nadmierne oderwanie komórek i niska konfluencja na wczesnych etapach protokołu mogą wskazywać na śmierć komórki i skutkować niską wydajnością preparatu lentiwirusa. Część odklejenia komórek przed opcjonalnym pobraniem II (krok 3.5.1.) jest widoczna i oczekiwana.

Trzy plazmidy są używane w tym protokole do generowania cząsteczek lentiwirusa: pCMV-ΔR8.91 pakujący plazmid kodujący strukturalne białko HIV-1 (Gag), białka pomocnicze Tat i Rev oraz polimerazę odwrotnej transkryptazy (Pol)²²; pMD2.G kodujący VSV-G envelop pod CMV promoter¹³; oraz plazmid pHR'SIN-cPPT-SEW (kodujący wzmocniony marker GFP)¹⁹ odpowiednio zmodyfikowane pod kątem ekspresji shRNA lub mikroRNA.

preparaty lentiwirusa są miareczkowane w linii komórek T Jurkat ze względu na ich wysoką zakaźność²³. Skuteczne przygotowanie lentiwirusa pozwoli osiągnąć wskaźnik infekcji ponad 95% przy dawce tak małej, jak 5 μl (Rysunek 2A). Średnia intensywność fluorescencji zakażonych komórek nadal rośnie wraz z wyższymi dawkami (Rysunek 2B,C). W razie potrzeby miana wirusa można zmierzyć za pomocą PCR w czasie rzeczywistym zintegrowanych składników wirusa, np. promotora SFFV, który korelował liniowo z procentowymi komórkami wykazującymi ekspresję GFP i logarytmicznie z GFP MFI (Figura 2D). W zależności od konstrukcji, szczególnie tych z dużą wstawką²⁴, niektóre preparaty lentiwirusa mogą wykazywać zmniejszoną zakaźność w limfocytach T Jurkat, jak wykazano dla konstruktu Cre-GFP użytego w tym badaniu (Rysunek 2E,F). W takim przypadku wiele preparatów cząstek lentiwirusa można połączyć i ponownie zawiesić w 1 ml. Zalecamy walidację odpowiedzi immunologicznej na te preparaty in vivo przed eksperymentami. Naturalnie, preparaty lentiwirusa z alternatywnymi receptorami wejściowymi do VSV-G mogą wykazywać różną skuteczność infekcji w linii komórek T Jurkat, w zależności od ekspresji receptora na komórkach. Linie komórkowe używane do miareczkowania powinny być tak dobrane, aby wyrażały receptor wykorzystywany przez cząstki lentiwirusa do wnikania do komórek i preferencyjnie nie wykazywały lub miały bardzo niską ekspresję czynników ograniczających²⁵.

O udanej produkcji cząstek lentiwirusowych świadczy infekcja pMφ (zdefiniowana jako populacja CD11b⁺ F4/80⁺ i Tim4⁺)¹⁸ (Rysunek 3A). Ustaliliśmy, że dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 μl preparatu lentiwirusa (w całkowitej objętości 200 μl pożywki wolnej od surowicy) daje najwyższy procent i intensywność sygnału GFP w tych komórkach (Figura 3B, C). Iniekcje większych dawek (150 μL i 200 μL preparatu lentiwirusa) nie miały korzystnego wpływu na ekspresję GFP w pMφ. Eksperymenty przeprowadzone w ciągu 4 godzin, 3 dni, 7 dni i 14 dni po wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p) lentiwirusa 100 μl wykazały znaczny odsetek rezydenta pMφ z ekspresją GFP w dniach 3 i 7, a następnie zniknięcie zakażonej populacji w dniu 14 (Rysunek 3D, E). Co ciekawe, pMφ wykazujące ekspresję GFP w większości zanika do 14 dnia po zakażeniu, częściowo z powodu immunologicznego rozpoznania markera GFP. Rzeczywiście, eksperymenty lentiwirusowe z markerem GFP w selektywnych T-Reg, myszach Foxp3-DTR-eGFP zapobiegają odrzuceniu zakażonego rezydenta pMφ do co najmniej 21 dnia (Figura 3F). W przypadku preparatów lentiwirusa o zmniejszonej skuteczności w komórkach Jurkata wymagana byłaby większa ilość, aby osiągnąć oczekiwany wskaźnik infekcji in vivo. Jednak, jak wykazano w przypadku preparatu lentiwirusa Cre-GFP, w zależności od konstrukcji konstrukcji, nawet dawka 300 μl po 7 dniach od wstrzyknięcia dożylnego może dać zły wynik (Rysunek 3G). Wcześniej wykazaliśmy udane zastosowanie tego protokołu do nadekspresji i knockdownu genów in vivo u myszy pMφ, w tym knockdown Map3k8 i Gata6 za pośrednictwem lentiwirusowego shRNA oraz nadekspresji Gata6¹⁹. Tutaj pokazujemy, że protokół ten może być również z powodzeniem stosowany do nadekspresji mysiego mikroRNA 146b (mmu-miR-146b) i do knockdown międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej 1 (ICAM1, CD54) za pomocą shRNA pochodzącego z lentiwirusa w rezydentnym pMφ (Figura 3H,I).

Infekcja komórek pierwotnych, takich jak makrofagi, wymaga większego wkładu lentiwirusa, przypuszczalnie ze względu na obecność czynników ograniczających w tych komórkach. Czynniki restrykcyjne są naturalnymi mechanizmami ochronnymi komórek, które zakłócają etapy cyklu życia wirusa, takie jak odwrotna transkrypcja lub integracja, prowadząc do zahamowania ekspresji genów z konstruktów.

Dalsza walidacja protokołu in vivo wykazała brak wpływu dostarczania i.p lentiwirusa na żywotność komórek odpornościowych otrzewnowej (Rysunek 4A) i wskazała na wyraźną zakaźność rezydentnych subpopulacji pMφ (zdefiniowanych przez ekspresję markerów CD73 i Tim4) (Rysunek 4B,C). Co ważne, produktywne zakażenie lentiwirusem było ograniczone do rezydentnego Mφ w miejscu wstrzyknięcia, o czym świadczy brak znaczącej ekspresji GFP w krezkowym węźle chłonnym (mLN), płucach, wątrobie lub śledzionie Mφ po 7 dniach od prowokacji (Figura 4D). Biorąc pod uwagę, że w wielu przypadkach genetyczne celowanie Mφ musi być wykonywane w stanach zapalnych, zbadaliśmy skuteczność tego protokołu u myszy prowokowanych dootrzewnowo 0,1 ml 4% tioglikolanu. Wstrzyknięcie tioglikolanu powoduje napływ zapalnych komórek Mφ pochodzących z monocytów i komórek monocytowych, które można podzielić na 5 odrębnych populacji (Rysunek 4E). Analiza cytometrii przepływowej ujawniła oporny fenotyp komórek monocytowych (populacje Ly6C^hi 1 i 2) na zakażenie lentiwirusem, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami dotyczącymi komórek ludzkich²⁶. Natomiast rezydentne Mφ i monocyty (grupy 3-5) pozostały najbardziej podatne na infekcję (Rysunek 4F).

Szczegółowa analiza cytometryczna przepływowa wykryła ekspresję GFP głównie w rezydentnym Mφ otrzewnej i głównym kompleksie zgodności tkankowej (MHC) klasy II⁺ rezydentnym pMφ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (do 60% w 3 dniu po wstrzyknięciu) (Rysunek 5A). Niewielki lub żaden sygnał GFP nie wykryto w innych populacjach komórek otrzewnej, w tym Mφs/DC pochodzących ze szpiku kostnego (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), limfocytach B (CD19+), limfocytach T (CD3⁺), komórkach tucznych (CD11b^-, FcεR1⁺), eozynofilach (Siglec-F⁺), komórkach NK (CD19^-, NK1.1⁺) i neutrofilach (Ly6G⁺) (Figura 5A,B). Długowieczność wyrażenia GFP (Rysunek 5C) we wszystkich populacjach podążała za rezydentem otrzewnowej Mφ (Rysunek 1D). Przejściowy wzrost częstości występowania neutrofili odnotowano po 4 godzinach od wstrzyknięcia 100 μl (w całkowitej objętości 200 μl pożywki wolnej od surowicy) lentiwirusa (Ryc. 5D), wskazując na wczesny łagodny stan zapalny obecny u prowokowanych zwierząt. Wreszcie, rezydent pMφ doświadczył znacznego spadku częstości między 7 a 14 dniem po zakażeniu (Figura 5E), co sugeruje najlepsze okno eksperymentalne między 3 a 7 dniem po wstrzyknięciu.

Rysunek 1: Produkcja lentiwirusa w komórkach HEK293T. (A) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne komórek HEK293T 48 godzin po udanej transfekcji (mikroskop fluorescencyjny [pik wzbudzenia 488 nm, pik emisji 510 nm], powiększenie 20x, podziałka = 400 μm). (B) Fotografia stożkowej probówki ultrawirówki zawierającej warstwę 20% sacharozy (na dole, przezroczysta) oraz warstwę pożywki pobranej z transfekowanych komórek HEK293T (u góry, kolor czerwony). (C) Fotografia przedstawiająca prawidłowe włożenie stożkowej ultrawirówki do wiadra wraz z adapterem. (D) Fotografie przedstawiające prawidłowe i nieprawidłowe wyważenie wirnika ultrawirówki. (E) Fotografia przedstawiająca optymalne ustawienie szafki kat. II i materiałów do iniekcji in vivo dla osoby praworęcznej. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ipseiz N et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Miareczkowanie lentiwirusa w limfocytach T Jurkat. (A) Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływu limfocytów T Jurkat 72 godziny po zakażeniu rosnącymi dawkami lentiwirusa zawierającego plazmid GFP, pokazująca procent komórek GFP⁺ (GFP⁺), (B) średnią intensywność fluorescencji (MFI) komórek GFP⁺ oraz (C) reprezentatywny histogram ekspresji GFP. (D) Wykres punktowy przedstawiający MFI (po lewej stronie Y) i odsetek komórek zakażonych lentiwirusem wykazującym ekspresję GFP (po prawej stronie Y) w porównaniu z liczbą kopii wirusa wykrytego na pg DNA (oś x). (E) Reprezentatywny histogram zakażenia limfocytami T Jurkat suboptymalnym preparatem lentiwirusa Cre-GFP (Cre-GFP LV) i kontrolą lentiwirusa GFP (GMP LV) oraz (F) dane podsumowujące przedstawiające odsetek limfocytów T Jurkat zakażonych lentiwirusem Cre-GFP (GFP⁺). Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ipseiz N et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Skuteczność infekcji rezydenta pMФ. (A) Strategia bramkowania rezydentnych komórek pMφ (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) i Tim4^-, F4/80⁺. Komórki bramkowano na singletach, a następnie CD11b⁺. (B) Reprezentatywne wykresy kropkowe oraz (C) podsumowanie częstości zakażeń (% komórek GFP+) i intensywności (MFI) komórek GFP⁺ wyizolowanych 3 dni po zakażeniu in vivo różnymi ilościami preparatu lentiwirusa GFP. (D) reprezentatywny wykres punktowy oraz (E) podsumowanie częstości zakażeń (% komórek GFP+) i intensywności (MFI) komórek GFP+ wyizolowanych w różnych punktach czasowych po zakażeniu in vivo 100 μl lentiwirusa w całkowitej objętości 200 μl pożywki wolnej od surowicy. (F) Podsumowanie liczby komórek w dniach 7, 14 i 21 po dostarczeniu lentiwirusa z ekspresją GFP do otrzewnej u myszy Foxp3-DTR-eGFP, pokazujące liczbę pMφ eksprymujących GFP oraz makrofagi zapalne i komórki dendrytyczne (InfMØ / DC [^{F480 niski}]). (n = 1-2 na grupę). (G) Reprezentatywny wykres punktowy suboptymalnego zakażenia in vivo Gata6-KO ^{mye 19} resident pMφ za pomocą 300 μl lentiwirusa Cre-GFP 7 dni po wstrzyknięciu i.p. (H) Kwantyfikacja RT-qPCR ekspresji mmu-miR-146b-5p rezydentnego Mφ otrzewnej prowokowanego in vivo za pomocą 100 μl lentiwirusa kodującego mysi mikroRNA-146b (miR-146b) lub kontrolny (C). Rezydentne pMφ (białe kółka) i komórki Tim4^-, F4/80⁺ (szare kółka). (I) Reprezentatywny wykres punktowy udanej regulacji w dół ICAM1 na pMφ u samic myszy 129S6, 7 dni po wstrzyknięciu i.p. lentiwirusa zawierającego celowane shRNA. Pokazano kontrolne shRNA. Nakładka pokazuje kontrolę izotypu. Dane wyrażone jako średnia ± SEM, n≥2 myszy. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ipseiz N et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Skuteczność infekcji w subpopulacjach rezydentów pMφ. (A) Odsetek wszystkich pojedynczych komórek i rezydentnych Mφ zdolnych do przeżycia 7 dni po wstrzyknięciu 100 μl pożywki wolnej od surowicy (-) lub lentiwirusa GFP (+) i.p. (B) Strategia bramkowania przedstawiająca cztery główne populacje pMφ znalezione in vivo: CD73^+Tim4+, CD73-Tim4^-, CD73⁺Tim4^-, CD73-Tim4+, oraz (C) odpowiadającą częstości infekcji (% komórek GFP+) i intensywności (MFI komórek GFP+) tych populacji. (D) Odsetek komórek GFP+ w wielu narządach 7 dni po wstrzyknięciu 100 μl lentiwirusa i.p. Skróty: mLN, węzeł chłonny krezkowy. (E) Myszom wstrzykiwano i.p 0,1 ml 4% tioglikolanu przez 5 dni, a następnie wstrzykiwano i.p lentiwirusem. Strategia bramkowania pMφ i monocytów po 3 dniach od wstrzyknięcia lentiwirusa i.p. (F) Częstość infekcji, MFI i analiza liczby komórek monocytów GFP+ (Ly6C⁺) i Mφ (Ly6C^-). Dane wyrażone jako średnia ± SEM, n≥3 myszy. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ipseiz N et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wpływ iniekcji lentiwirusa na zapalenie otrzewnej. Myszom wstrzyknięto in vivo i.p z ekspresją GFP lentiwirusa. (A) Częstość zakażeń populacji komórek w jamie otrzewnej po wstrzyknięciach różnych ilości lentiwirusa (50 μl, 100 μl, 150 μl lub 200 μl). (B) Intensywność ekspresji GFP w produktywnie zakażonych populacjach komórek po 7 dniach od wstrzyknięcia dożylnego. (C) Częstość zakażeń populacji komórek w jamie otrzewnej w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu i.p. (D) i (E) Procent komórek w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu i.p. Wszystkie wstrzyknięcia lentiwirusa wykonano z tą samą całkowitą objętością 200 μl, uzupełnioną pożywką bez surowicy. O ile nie określono inaczej, zastosowano dawkę 100 μl lentiwirusa. Myszy kontrolne ("C") otrzymały 200 μl czystej, bezsurowicowej pożywki. Dane wyrażone jako średnia ± SEM, n≥3 myszy. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Ipseiz N et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. ) szt. ) ) szt. powiedział: szt. pkt. powiedział: szt. powiedział: powiedział: szt. : powiedział: szt. pkt. szt. powiedział: TGL pkt. szt. TGL pkt. szt. pkt. szt. powiedział: szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. szt. powiedział: powiedział: szt.

Docelowe przeciwciało	Fluorofor	klon	Zastosowane rozcieńczenie	stężenie końcowe [μg/ml]
Antygen rdzeniowy HIV-1	Kanał RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0,5
Ly6G (Ły6G	PerCpCy5.5	Pozycja 1A8	1/400	0,5
CD3e (biblioteka CD3e	PerCpCy5.5	Zobacz materiał 17A2	1/200	1
CD3e (biblioteka CD3e	PE/CY7	Zobacz materiał 500A2	1/400	0,5
Płyta CD11c	PE/CY7	N418	1/800	0,25
Płyta CD11c	Zobacz materiał BV605	N418	1/400	0,5
CD226	AF647	10 E 5	1/400	Wydanie orzeczenia 1,25
Tym4 powiedział	AF647	Zobacz materiał RTM4-54	1/600	0,83
Płyta CD4	Apc	Zobacz materiał GK1.5	1/400	0,5
Płyta CD11b	AF700	Zobacz materiał M1/70	1/700	0,71
Płyta CD11b	PerCpCy5.5	Zobacz materiał M1/70	1/400	0,5
Rozmiar F4/80	Błękit Pacyfiku	Zobacz materiał BM8	1/700	0,71
Rozmiar F4/80	Zobacz materiał BV605	Zobacz materiał BM8	1/400	0,25
Rozmiar F4/80	Zobacz materiał BV711	Zobacz materiał BM8	1/400	0,5
Płyta CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	Rozdział 2.5
Płyta CD19	Zobacz materiał V450	1D3	1/400	0,5
Płyta CD19	Apc	1D3	1/400	0,5
Płyta CD8a	eFluor450	53-6,7	1/400	0,5
SiglecF powiedział:	Zobacz materiał BV421	E50-2440	1/400	0,5
NK1.1	APC/CY7	Zobacz materiał PK136	1/400	0,5
FceR1	eFluor450	1 marca	1/400	0,5
Protokół ICAM1	Pe	Pozycja 1A29	1/100	cyfra arabska
Szczur IgG1, kontrola izotypu κ	Pe		1/100	cyfra arabska

Tabela 1: Lista przeciwciał

Dyskusja

Makrofagi rezydujące w tkankach pełnią szereg funkcji homeostatycznych i zapalnych specyficznych dla tkanek ^1,2 podyktowanych ich środowiskiem fizjologicznym ^6,7,8,9. W protokole tym wprowadzono skuteczną metodę¹⁸ manipulacji makrofagami rezydującymi w otrzewnej in vivo przy użyciu cząstek lentiwirusa w celu zbadania funkcji makrofagów w ich biologicznym mikrośrodowisku.

Dla powodzenia protokołu niezbędne jest wykorzystanie zdrowych komórek HEK293T. Najlepszą praktyką jest rozmrażanie komórek co najmniej tydzień przed rozpoczęciem tego protokołu, aby zapewnić regenerację komórek i dobrą liczbę. Komórki powinny być wysiane w odpowiedniej objętości pożywki na jeden dzień przed planowaną transfekcją i powinny osiągnąć około 80% zbiegu w dniu transfekcji. Niedostatecznie lub nadmiernie zlewające się preparaty komórkowe spowodują zmniejszenie wydajności lentiwirusa. W celu uzyskania najlepszych rezultatów zalecamy transfekcję HEK293T komórek odczynnikiem do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Podstawowe etapy transfekcji obejmują odpowiednie wymieszanie plazmidów i odczynników oraz kroplowe dodawanie mieszaniny bezpośrednio do monowarstwy komórek HEK293T. W tym protokole można zastosować transfekcję fosforanu wapnia komórek HEK293T^27,28. Użytkownik powinien jednak mieć świadomość, że skuteczność tej metody może się różnić i może skutkować zmniejszoną wydajnością transfekcji.

Środki ostrożności powinny być uwzględnione w protokole od dnia transfekcji komórek HEK293T. Obejmują one pracę w komorze bezpieczeństwa kategorii II, noszenie podwójnych rękawic podczas pracy z zanieczyszczonym materiałem oraz odpowiednie wybielanie skażonego materiału (roztworem odkażającym, na przykład roztworem wybielającym o stężeniu 2 000 ppm) przez co najmniej 4 godziny. Użytkownicy powinni zapoznać się ze swoimi regulacjami instytucjonalnymi dotyczącymi pracy z patogenami i odpadami kategorii II.

W tym protokole preparat lentiwirusa jest najpierw oczyszczany za pomocą filtra 0,45 μm w celu usunięcia HEK293T resztek komórek. Należy unikać stosowania mniejszych filtrów (0,22 μm) i membran z estrów celulozy, ponieważ spowoduje to utratę cząsteczek lentiwirusa. Zaleca się stosowanie filtrów polieterosulfonowych lub fluorku winylidenu o niskiej zdolności wiązania białek²⁹. Drugi etap oczyszczania przeprowadza się na pojedynczej 20% warstwie sacharozy w ultrawirówce w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń, co jest szczególnie ważne dla późniejszego podawania in vivo preparatu lentiwirusa. W instytucjach, w których ultrawirówka nie jest dostępna, inne³⁰ opisało oczyszczanie lentiwirusa na bazie sacharozy przy użyciu standardowej wirówki laboratoryjnej. Można to zaimplementować w tym protokole jako alternatywę. Preparat lentiwirusa jest miareczkowany w limfocytach T Jurkat na podstawie ekspresji sygnału markerowego (np. GFP stosowanego w tym protokole). W przypadku konstruktów bez markerów, fizyczne cząstki lentiwirusa można ocenić poprzez kwantyfikację białka p24gag HIV-1 za pomocą zestawu ELISA³¹, analizę cytometrii przepływowej antygenu rdzeniowego^{HIV-1 18} lub pomiar zmian w docelowym genie (preferencyjnie przy użyciu metod umożliwiających pomiar zmian w poszczególnych komórkach, np. cytometrii przepływowej lub mikroskopii). Jeżeli miareczkowanie kontroli i lentiwirusa różni się znacznie w limfocytach T Jurkat, objętości wykorzystane w badaniach in vivo można dostosować tak, aby osiągnąć najbardziej porównywalne zakażenie między preparatami lentiwirusa.

Głównym ograniczeniem protokołu jest obserwowany zanik Mφ otrzewnej rezydenta GFP⁺ w ciągu 14 dni od wstrzyknięcia lentiwirusa ip. W przypadku badań długoterminowych należy wziąć pod uwagę linie myszy ze stabilnymi zmianami genetycznymi w określonym typie komórek lub tkanek³². Na przykład, ponieważ makrofagi otrzewnowe nie wyrażają Foxp3 (białka T-Reg), wykorzystaliśmy myszy Foxp3-DTR-eGFP³³ i potwierdziliśmy, że ekspresja GFP utrzymuje się w otrzewnowym Mφ po 21 dniach od infekcji (Figura 3F). Należy jednak zauważyć, że lentiwirusy zawierają inne obce składniki, a to wydłużenie trwałości zakażonych komórek u myszy Foxp3-DTR-GFP może nie być trwałe. Dodatkowym słabym punktem tej metody jest niski poziom stanu zapalnego, który można zaobserwować w jamie otrzewnej po wstrzyknięciu lentiwirusa, czego dowodem jest napływ neutrofili po 4 godzinach od wstrzyknięcia (ryc. 5D), co może oznaczać, że powtarzające się infekcje przyspieszyłyby związaną ze stanem zapalnym utratę Mφ rezydenta otrzewnej wyrażającego GFP. Chociaż nie wykryliśmy interferonów typu I (IFN) w jamie otrzewnej, wcześniej wykazano, że cząstki lentiwirusa pseudotypowane VSV-G indukują niektóre geny stymulowane przez IFN w ludzkim Mφ przy braku wykrywalnych IFN³⁴. Należy to wziąć pod uwagę przy stosowaniu tego protokołu do eksperymentów badających przeciwwirusowe odpowiedzi immunologiczne. Wystąpienie ostrego i utrzymującego się stanu zapalnego po wstrzyknięciu doiniegdzie preparatu lentiwirusa może wskazywać na zanieczyszczenie preparatu.

Obszary rozwiązywania problemów obejmują: 1) w przypadku niskiego miana lentiwirusa należy zapewnić zdrowie komórek HEK293T i skuteczną transfekcję (np. ekspresję markera, jeśli jest obecny, w komórkach HEK293T). Jeśli wskaźnik infekcji pozostaje niski, należy wziąć pod uwagę rozmiar konstrukcji. Konstrukty z większymi wstawkami lub bardziej złożonymi strukturami drugorzędowymi mogą wpływać na końcowe miano lentiwirusa i zakaźność²⁴. Dlatego każdy konstrukt powinien być testowany niezależnie i równolegle do odpowiedniego wektora kontrolnego; 2) Jeśli wymagana jest duża ilość lentiwirusa, zaleca się przygotowanie wielu kolb T175 z komórkami HEK293T i odpowiednie zwiększenie produkcji. Aby uniknąć różnic w preparatach lentiwirusa, najlepszą praktyką jest łączenie końcowych kolekcji przed porcjowaniem i przechowywaniem. W przypadku tak dużej produkcji mieszanina plazmidów (sekcja 2) powinna być przygotowana w probówkach o pojemności 50 ml, aby zapewnić skuteczne wymieszanie składników.

Pomimo szerokiego tropizmu, pseudotypowane cząstki lentiwirusa VSV-G głównie celują w makrofagi tkankowe, jak wykazano wcześniej dla pęcherzyków płucnych³⁵, a tutaj¹⁸ dla pMФ, gdy są podawane odpowiednimi drogami. Zmiany w otoczce na cząstkach lentiwirusa mogą w niektórych przypadkach powodować zmniejszoną transdukcję makrofagów in vivo³⁶ i nie są konieczne dla tego protokołu. W porównaniu z innymi podejściami wirusowymi do manipulacji genami in vivo w makrofagach (omówionymi w³⁷), zastosowanie wektorów lentiwirusowych zapewnia stabilną integrację transgenu w makrofagach tkankowych³⁵, wydajną ekspresję transgenu i największy limit wielkości wektora (około 8 Kb).

Mφ otrzewnej odgrywają ważną rolę w zapobieganiu, powstawaniu, progresji i ustępowaniu różnych chorób, w tym raka jamy brzusznej, zapalenia trzustki i zapalenia otrzewnej³⁸. Protokół ten opisuje skuteczne narzędzie do modyfikacji genów u myszy pMφ, umożliwiając badanie procesów biologicznych stojących za tymi patologiami w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku. Podczas gdy wektory lentiwirusowe same w sobie stają się narzędziem zainteresowania w interwencjach klinicznych³⁹, ze względu na pochodzenie od wirusa niedoboru odporności i stabilną integrację genomu, obawy dotyczące bezpieczeństwa utrudniają ich terapeutyczne wdrażanie. Pogłębienie wiedzy na temat odpowiedzi makrofagów na modulację genów lentiwirusa może przyczynić się do rozwoju tego wysoce skutecznego narzędzia w warunkach klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x) (Trypsyna 500 mg/L lub 0,02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0,22 μ m sterylny filtr millex GP	Merck	SLGS033SS
0,45 μ m sterylny filtr millex GP	Merck	SLHP033RS
0,5 ml strzykawka insulinowa U-100 z igłą, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)	BD	324892
1 litrowy pojemnik na ostre	Nie
Przeciwciało 2,4G2 (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m sitko	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (klasa badawcza), AlbuMax Suplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Bufor blokujący	przygotowany we własnym zakresie
Pożywka z tioglikolanu browarniczego	Sigma-Aldrich	B2551	4% roztwór podstawowy przygotowany w wodzie, autoklawowany i przechowywany w stanie zamrożonym.
CD11b	Biolegend	101222	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11b	BD	550993	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11c	Biolegend	117317	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD11c	Biolegend	117333	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD19	BD	560375	Patrz tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia
CD19	Biolegend	152410	tabela 1 w celu sprawdzenia rozcieńczenia i stężenia
CD226	Biolegend	128808	rozcieńczeniem i stężeniem
CD3e	BD	560527	Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
CD3e	Biolegend	152313	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD4	Biolegend	100412	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD73	eBioscience	16-0731-82	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
Kolba do hodowli komórkowych (T175 fask 175, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Probówki wirówkowe, stożkowe probówki denne 25 mm x 89 mm	Wirówki do redlic Beckman Coulter	358126
	Beckman Coulter		i wirówka TC
Kolagenaza typ IV	Sigma-Aldrich	C5138
Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	lub cryotubes
DMEM medium (1x) + 4,5g/L D-glukozy, 400 &mikro; M L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnaza I	Sigma-Aldrich	11284932001
Odczynnik do transfekcji Effectene	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
F4/80	Biolegend	123133	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
F4/80	Biolegend	123147	Patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Patrz Tabela 1 w celu rozcieńczenia i stężenia
Surowicy cielęcej płodu (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	inaktywowany termicznie przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C i sterylne przefiltrowane przez 0,22 μ m filtr
Cytometr przepływowy	Thermo Fisher Scientific
	przygotowany we własnym zakresie
Fluorescencyjny mikroskop do hodowli tkanek	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Kleszcze	N/A	N/A	Preferencje użytkownika
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T linia		komórkowa	uprawiane przez co najmniej tydzień przed transfekcją. Wolny od mykoplazmy
HIV-1 Antygen rdzeniowy	Beckman Coulter	6604667
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3506
Peeling chirurgiczny Hydrex, glukonian chlorheksydu 4% w/v środek do mycia skóry	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Patrz tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
linii			Jurkat hodowanej przez co najmniej tydzień przed użyciem. Wolny od mykoplazmy
ŻYWY/MARTWY zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem
Myszy			używały tutaj samic C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni (Charles Rivers), chyba że określono inaczej
Pipety mikrokapilarne (zakres objętości 0,5-1,000 μ L)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
Paraformaldehydu	Sigma-Aldrich	P6148-500G	przygotowanego do 2% w/v w PBS
pCMV-Δ Plazmid pakujący R8.91	Zuffrey, R., et al. 1997		Oporność na ampicilinę.
Penicylina / Streptomycyna (100x, 10 000 U / ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122
szalka Petriego	Greiner Bio One	664160
plazmid pHR'SIN-cPPT-SEW	Rosas, M. i in. 2014		Koduje marker EGFP za promotorem SFFV i przed wzmacniaczem wirusa hepatitiv Woodchuck. Oporność na ampicilinę.
	pMD2.G	Naldini, L. i wsp. 1996	koduje otoczkę g-glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G). Oporność na ampicilinę.
Kontrola izotypu IgG1 szczura	Becton Dickinson	550617	Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia
Surowica szczura	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Bufor do lizy ACK z krwią czerwoną	przygotowany w domu
RPMI 1640 pożywka (1x) + 400 uM L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem
Podchloryn sodu Tabletki (wybielacz, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterylna 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Greiner Bio One	662160
Sterylny PBS (DPBS) firmy Dulbecco (1x) Mg++ i Ca2+ - bezpłatnie	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterylne EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterylne jednorazowe pipety transferowe VWR (23,0 ml, 30 cm)	VWR	612-4515
Sacharoza		Thermo Fisher Scientific
	N/A	/A	Preferencje użytkownika
Strzykawki (50 ml i 1 0 mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i zatężeniem
96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z dnem U	Greiner Bio One	650180