Artykuł metodologiczny

Standaryzacja transferu między laboratoriami między cytometrami przepływowymi w celu wykrywania limfocytów u dzieci zaszczepionych japońskim zapaleniem mózgu

DOI:

10.3791/64949

⸱

10 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd, 2Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 3Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opracowano metodę ułatwiającą przenoszenie ustawień eksperymentalnych i szablonów analizy między dwoma cytometrami przepływowymi w dwóch laboratoriach do wykrywania limfocytów u dzieci zaszczepionych japońskim zapaleniem mózgu. Metoda standaryzacji eksperymentów z cytometrem przepływowym pozwoli na efektywne prowadzenie projektów badawczych w wielu ośrodkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej laboratoriów musi zbierać dane z wielu cytometrów przepływowych, szczególnie w przypadku projektów badawczych prowadzonych w wielu ośrodkach. Wyzwania związane z używaniem dwóch cytometrów przepływowych w różnych laboratoriach obejmują brak znormalizowanych materiałów, problemy ze zgodnością oprogramowania, niespójności w konfiguracji przyrządów oraz stosowanie różnych konfiguracji dla różnych cytometrów przepływowych. Aby ustanowić standaryzowany eksperyment cytometrii przepływowej w celu osiągnięcia spójności i porównywalności wyników eksperymentalnych w wielu ośrodkach, opracowano szybką i wykonalną metodę standaryzacji do przenoszenia parametrów między różnymi cytometrami przepływowymi.

Metody opracowane w tym badaniu pozwoliły na transfer ustawień eksperymentalnych i szablonów analizy między dwoma cytometrami przepływowymi w różnych laboratoriach do wykrywania limfocytów u dzieci zaszczepionych japońskim zapaleniem mózgu (JE). Stałą intensywność fluorescencji uzyskano między dwoma cytometrami za pomocą standardowych kulek fluorescencyjnych w celu ustalenia ustawień cytometru. Porównywalne wyniki uzyskano w dwóch laboratoriach z różnymi typami instrumentów. Korzystając z tej metody, możemy ustandaryzować analizę w celu oceny funkcji immunologicznej dzieci zaszczepionych JE w różnych laboratoriach za pomocą różnych instrumentów, zmniejszyć różnice w danych i wynikach między cytometrami przepływowymi w wielu ośrodkach i zapewnić wykonalne podejście do wzajemnej akredytacji wyników laboratoryjnych. Metoda standaryzacji eksperymentów z cytometrem przepływowym zapewni efektywną realizację projektów badawczych w wielu ośrodkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standaryzacja cytometrii przepływowej jest przydatna dla porównywalności wyników uzyskanych z różnych cytometrów w różnych laboratoriach i ośrodkach badawczych oraz sprzyja wzajemnemu uznawaniu wyników w celu poprawy efektywności pracy. Coraz więcej scenariuszy wymaga standaryzacji. Podczas procesu opracowywania leku ważna jest standaryzacja cytometrii przepływowej, ponieważ opracowany i zwalidowany test będzie wspierał cały proces opracowywania leku, od analizy przedklinicznej po kliniczną. Metody cytometrii przepływowej są często przenoszone między przemysłem farmaceutycznym a współpracującymi laboratoriami1. Ponadto niezbędne jest uzyskanie porównywalnych danych z wieloośrodkowych badań klinicznych. Na przykład w ramach Wieloośrodkowego Projektu Badań Klinicznych Systemowych Chorób Autoimmunologicznych opracowano proces standaryzacji w celu uzyskania porównywalnych danych z wieloośrodkowej cytometrii przepływowej2.

Standaryzacja metod cytometrii przepływowej jest wyzwaniem. Wyzwania napotykane w laboratoriach przypisuje się brakowi znormalizowanych materiałów, problemom ze zgodnością oprogramowania, niespójnościom w konfiguracji przyrządów oraz stosowaniu różnych konfiguracji różnych cytometrów przepływowych i rozbieżnym strategiom bramkowania między ośrodkami3,4. Dlatego ważne jest, aby przeprowadzić analizę luk między laboratoriami. Dostęp do próbek, systemy jakości, kwalifikacje personelu i konfiguracja przyrządu muszą zostać poddane przeglądowi, aby upewnić się, że wymagania są spełnione.

Obecnie dzieci zaszczepione szczepionką przeciwko japońskiemu zapaleniu mózgu (JE) mają znacznie zmniejszoną częstość występowania JE5. Monitorowanie komórek odpornościowych krwi obwodowej może pomóc w zrozumieniu zmian w odporności nabytej za pośrednictwem komórek po szczepieniu oraz korelacji między zmianami w podzbiorach limfocytów krwi obwodowej a skutkami szczepienia. Ze względu na ograniczoną stabilność próbek krwi pełnej, oceny skuteczności szczepionki są często przeprowadzane w wielu ośrodkach. Na potrzeby tej analizy zdefiniowaliśmy naiwne limfocyty T CD8 + lub CD4 + jako CD27 + CD45RA+, komórki T pamięci centralnej (TCM) jako CD27 + CD45RA, limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) jako CD27-CD45RA, a ostatecznie zróżnicowane limfocyty T pamięci efektorowej (TEMRA) jako CD27-CD45RA+. Limfocyty B CD19 + można podzielić na populacje, które wyrażają CD27 w porównaniu z IgD6,7, naiwne limfocyty B wyrażają pamięć CD27n Komórki B (mBC) można zidentyfikować na podstawie ekspresji IgD6, a limfocyty T regulatorowe (Tregs) można zidentyfikować jako CD4 + CD25 + CD127low 8. Aby ustanowić standaryzowany eksperyment cytometrii przepływowej w celu osiągnięcia spójności i porównywalności wyników eksperymentalnych w wielu ośrodkach, opracowano szybką i wykonalną metodę standaryzacji, aby ułatwić transfer protokołów między różnymi cytometrami przepływowymi w celu wykrywania limfocytów w pełnej krwi dzieci szczepionych JE. Sześcioro zdrowych dzieci (w wieku 2 lat) zostało zrekrutowanych z Pekińskiego Szpitala Dziecięcego Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Po otrzymaniu szczepienia typu prime i boost żywym atenuowanym szczepionką JE SA14-14-2 mniej niż 6 miesięcy wcześniej, od ochotników pobrano próbki krwi obwodowej. Wysoce porównywalne dane uzyskano z różnych instrumentów zgodnie ze standardowymi procedurami, co jest pomocne w ocenach wieloośrodkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Dziecięcego w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego (Numer zatwierdzenia: 2020-k-85). Zrezygnowano ze świadomej zgody ludzi, ponieważ w tym badaniu wykorzystano tylko próbki szczątkowe po testach klinicznych. W badanie zaangażowane są dwa laboratoria. Laboratorium transferowe to miejsce, w którym opracowano znormalizowaną metodę przy użyciu jednego cytometru przepływowego. Cytometr w tym laboratorium jest dalej określany jako cytometr A. Laboratorium metody badawczej to laboratorium, które otrzymuje metody przy użyciu innego cytometru przepływowego, a cytometr w tym laboratorium jest dalej określany jako cytometr B.

1. Pobieranie próbek krwi obwodowej i przygotowanie komórek

  1. Pobrać próbki krwi obwodowej (2 ml) od dzieci zaszczepionych JE i dzieci nieszczepionych w probówkach z antykoagulacjąEDTA-K 2 za pomocą standardowego nakłucia dożylnego.
  2. Wymieszaj próbkę krwi pełnej, obracając probówki do góry nogami 10x. Dodaj 100 μl krwi pełnej do probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm. Wykonaj każdą próbkę w dwóch egzemplarzach.
  3. Dodać 10 μl brylantowego buforu do barwienia (buforu BV) do probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm. Dodać po 5 μl każdego przeciwciała (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; współczynnik rozcieńczenia: 1:20) i 20 μl przeciwciała (CD25, CD45RA; współczynnik rozcieńczenia: 1:5) do buforu BV. Wiruj delikatnie.
    UWAGA: Objętości i informacje o odczynnikach z przeciwciałami przedstawiono w Tabeli 1.
  4. Dodaj koktajl przeciwciał do probówki z próbką krwi pełnej. Delikatnie wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.
  5. Rozcieńczyć 10x roztwór lizujący 1:10 wodą destylowaną, aby przygotować 1x roztwór lizujący. Lizować próbki krwi, dodając 2 ml 1x roztworu do lizy. Delikatnie wirować i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  6. Odwirować przy sile 300 × g przez 5 minut i zdekantować supernatant.
  7. Zawiesić osad w 2 ml 1x PBS, odwirować przy 300 × g przez 5 minut i zdekantować supernatant.
  8. Zawiesić osad w 0,5 ml 1x PBS i dokładnie wymieszać. Przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C. Próbki należy przesłać do dwóch laboratoriów w celu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Próbka kontroli ujemnej i kontrola pojedynczo barwiona komórką muszą być przetwarzane jednocześnie.

2. Przygotowanie koralików kompensacyjnych i kontroli jednobarwnej

  1. Etykieta V500-anty-CD45 pojedynczo barwione, APC-H7-anty-CD3 barwione pojedynczo, FITC-anty-CD4 barwione pojedynczo, R718-anty-CD8 barwione pojedynczo, BV605-anty-CD27 barwione pojedynczo, APC-anty-CD45RA barwione pojedynczo, PE-anty-CD25 barwione pojedynczo, BV421-anty-CD127 barwione pojedynczo, BB700-anty-CD19 barwione pojedynczo i PE-CY7-anty-IgD barwione pojedynczo.
  2. Dodaj 100 μl 1x bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierający 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  3. Dodać 50 μl kulek ujemnych i 50 μl kulek anty-mysich Ig, κ do każdej probówki i wiru.
  4. Dodać 2 μl każdego znakowanego przeciwciała (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) do pojedynczo barwionej probówki. Delikatnie zmieszać mieszaninę i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (20 °C do 25 °C).
  5. Zawiesić kulki w 2 ml 1x PBS, odwirować przy 300 × g przez 5 minut i zdekantować supernatant.
  6. Ponownie zawiesić kulki w 0,5 ml 1x PBS i dokładnie wymieszać. Przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C.

3. Używanie identycznych nazw konfiguracji na różnych cytometrach w dwóch laboratoriach

  1. Utwórz nową konfigurację w oprogramowaniu cytometru A. Kliknij przycisk Cytometr i wybierz view Konfiguracje, aby wyświetlić okno konfiguracji.
  2. Na liście konfiguracji kliknij prawym przyciskiem myszy folder konfiguracji podstawowych, wybierz polecenie Nowy folder i zmień jego nazwę.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy konfigurację podstawową i wybierz polecenie kopiuj.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowy folder i wklej konfigurację podstawową, aby utworzyć nową konfigurację. Zmień nazwę nowej konfiguracji na "Standardized Method Transfer".
  5. Przeciągnij nazwę parametru, taką jak FITC, z listy Parametry do odpowiedniego detektora (530/30).
  6. Edytuj dodatkowe parametry (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 i BV605) do nowej konfiguracji.
  7. Postępuj zgodnie z tą metodą, aby utworzyć nową konfigurację na innym modelu cytometru przepływowego o tej samej nazwie "Transfer metody standardowej". Upewnij się, że konfiguracja zawiera te same parametry dla każdego detektora.
    UWAGA: Aby pomyślnie zidentyfikować szablon eksperymentu w dwóch różnych modelach cytometru przepływowego, upewnij się, że nazwa jest spójna.
  8. W konfiguracjach cytometru użyj koralików do ustawiania i śledzenia cytometru (CST), aby zdefiniować linię bazową cytometru i śledzić działanie cytometru. Kliknij przycisk Cytometr i wybierz CST, aby wyświetlić konfigurację cytometru i obszar śledzenia workspace.
  9. Dodaj trzy krople (150 μl) kulek do 0,5 ml 1x PBS w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml. Umieść rurkę z koralikami na cytometrze.
  10. W oknie Setup Control (Formant konfiguracji) wybierz opcję Define Baseline (Definiuj linię bazową) i kliknij przycisk Run (Uruchom).

4. Standaryzacja eksperymentu z użyciem cytometru A w laboratorium transferowym

  1. Przeprowadź kontrolę działania przy użyciu konfiguracji cytometru i kulek śledzących, aby sprawdzić, czy cytometr działa dobrze.
  2. W oknie przeglądarki oprogramowania kliknij prawym przyciskiem myszy ustawienia cytometru i wybierz Ustawienia aplikacji, aby utworzyć arkusz.
  3. Używając niebarwionej próbki, wyreguluj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) FSC, SSC i wszystkich parametrów fluorescencji. Certyfikat FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; Transporter opancerzony: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; oraz BV605: 505.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy ustawienia cytometru eksperymentalnego i wybierz ustawienia aplikacji, aby je zapisać.
  5. Kliknij przycisk eksperymentu i wybierz menu ustawień kompensacji. Następnie wybierz opcję Utwórz formanty wynagrodzeń, aby automatycznie dodać kontrolki wynagrodzeń.
  6. Rejestruj dane dla wszystkich koralików kontrolnych kompensacji.
  7. Kliknij eksperyment i wybierz konfigurację wynagrodzenia. Następnie należy automatycznie obliczyć wysokość odszkodowania.
  8. Rejestrowanie danych dla kontrolek z pojedynczym barwieniem komórek.
  9. Użyj APC CD45RA, aby zmienić wartość kompensacji R718 na 15% APC. Użyj CD19 BB700, aby zmienić wartość kompensacji APC-H7 na 14% BB700. Użyj CD8 R718, aby zmodyfikować wartość kompensacji APC-H7 na 60% R718.
  10. Zapisz dane dla koralików CST.
  11. Utwórz globalny arkusz z szablonem wartości docelowej dla jasnych koralików CST.
  12. Korzystając z wykresu FSC/SSC, narysuj bramkę wielokątną dla jasnych koralików CST. Uzyskaj wykresy histogramu 10 kanałów fluorescencyjnych dla jasnych koralików CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 i BV605. Utwórz bramki interwałowe na wykresach histogramu. Utwórz widok statystyk, pokazując medianę bramek interwałowych.
  13. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym; zbierz w sumie 25 000 limfocytów.
  14. Utwórz globalny arkusz szablonu analizy dla próbek.
  15. Użyj następującej przykładowej strategii bramkowania:
    1. Korzystając z wykresu punktowego CD45/bocznego obszaru rozproszenia (SSC-A), narysuj bramkę wielokąta, aby zidentyfikować nienaruszoną populację limfocytów, wykluczając zanieczyszczenia.
    2. Korzystając z wykresu punktowego CD3 / CD19, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki T CD3 + i komórki B CD19 +.
    3. Korzystając z wykresu punktowego CD4 / CD8, narysuj poczwórną bramkę, aby wybrać limfocyty T CD4 + lub CD8 + (komórki o wysokiej fluorescencji odpowiednio dla tych markerów).
    4. Korzystając z wykresu punktowego CD45RA / CD27, narysuj poczwórną bramkę, aby podzielić komórki T CD8 + lub CD4 + na komórki naiwne (CD27 + CD45RA +), TCM (CD27 + CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA) i TEMRA (CD27-CD45RA+).
    5. Korzystając z wykresu punktowego CD25 / CD127, narysuj poczwórną bramkę, aby podzielić limfocyty T CD4 + na komórki Treg (CD4 + CD25 + + CD127 niski
      6. ).
    6. Korzystając z wykresu punktowego CD27 / IgD, narysuj poczwórną bramkę, aby podzielić komórki B CD19 + na naiwne komórki B (CD27-IgD +) i komórki B pamięci (CD27 + IgD-).
  16. Zapisz szablon eksperymentalny na cytometrze A.
  17. Użyj dysku CD-ROM, aby wyeksportować szablon eksperymentalny.

5. Przenoszenie wzorca eksperymentalnego do cytometru B w laboratorium metody testowej

UWAGA: Szablon eksperymentalny zawiera ustawienia instrumentu, szablon analizy oraz szablon wartości docelowej mediany intensywności fluorescencji (MFI).

  1. Przeprowadź kontrolę działania za pomocą kulek CST, aby sprawdzić, czy cytometr działa dobrze.
  2. Zaimportuj szablon eksperymentalny i utwórz eksperyment dla cytometru B przy użyciu szablonu.
  3. Użyj tej samej partii koralików CST, aby dostosować napięcia parametrów fluorescencyjnych dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby pasowały do poprzedniego instrumentu MFI.
    UWAGA: Wartości MIF wahają się w granicach ±5% (MFI jasnych koralików przed i po transferze przedstawiono w tabeli 2).
  4. W razie potrzeby dostosuj napięcie dla FSC, używając niebarwionej próbki.
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy ustawienia cytometru eksperymentalnego i wybierz ustawienia aplikacji, aby zapisać ustawienia aplikacji.
  6. Użyj APC CD45RA, aby zmienić wartość kompensacji R718 na 15% APC. Użyj CD19 BB700, aby zmienić wartość kompensacji APC-H7 na 24% BB700. Użyj CD8 R718, aby zmodyfikować wartość kompensacji APC-H7 na 60% R718.
  7. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym; zbierz w sumie 25 000 limfocytów.

6. Spójność między wynikami eksperymentalnymi uzyskanymi na dwóch cytometrach

  1. Oceń różnice w podzbiorach limfocytów między instrumentami za pomocą jednoczynnikowej ANOVA (p < 0,05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje globalny arkusz szablonu wartości docelowej dla jasnych koralików CST. Korzystając z wykresu FSC/SSC, rysowana jest bramka wielokątna w celu wybrania jasnych koralików CST. Uzyskano wykresy histogramu 10 kanałów fluorescencyjnych dla jasnych kulek CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 i BV605. Wartość docelowa dla każdego parametru jest wyświetlana poprzez pokazanie mediany w obrębie bramek histogramu w tabeli 2. Zrzuty ekranu szablo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofenotypowanie podzbiorów limfocytów krwi obwodowej może pomóc w zrozumieniu zmian w odporności nabytej za pośrednictwem komórek po szczepieniu u dzieci. W zastosowaniach klinicznych zdarzają się nieoczekiwane sytuacje, takie jak niemożność wykrycia próbek w odpowiednim czasie lub wymiana cytometru przepływowego; Dlatego potrzebne są szybkie, znormalizowane metody, które ułatwiają transfery między cytometrami przepływowymi w różnych laboratoriach 9,10,11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RW był wspierany przez Beijing Natural Science Foundation, Chiny (nr 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr 82002130), XZ był wspierany przez CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr 2019-I2M-5-026).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Zestaw kompensacji cząstek kontroli negatywnejKompensacja552843
BD FACSCanto BD FACSCantocytometria przepływowa A w laboratorium transferowym
BD FACSDiva CS& T Koraliki badawczeBD655051definiowania linii bazowej cytometru przepływowego i śledzenia wydajności cytometru
BD Horizon BV421 Mysz Anti-Human CD127BD562436Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Horizon BV605 Mysz Anti-Human CD27BD562656Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Horizon V500 Mysz Anti-Human CD45BD560777Przeciwciało fluorescencyjne 
BD LSRFortessaBD LSRFortessaCytometria przepływowa B w laboratorium metod badawczych
BD OptiBuild BB700 Mysz Anti-Human CD19BD745907Przeciwciało fluorescencyjne 
BD OptiBuild R718 Mysz Anti-Human CD8BD751953Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Pharmingen APC Mysz Anti-Human CD45RABD550855Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Pharmingen APC-H7 Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD3BD560176Fluorescencyjne 
BD Pharmingen FITC Mysz Anti-Human CD4BD566320Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Pharmingen PE Mysz Anti-Human CD25BD555432Przeciwciało fluorescencyjne 
BD Pharmingen PE-Cy7 Mysie przeciwciało anty-ludzkie IgDBD561314fluorescencyjne 
Brilliant Staining Buffer PlusBD566385Wirówka do bufora do barwienia
Eppendorf5810
Probówka wirówkowaBD FalconBD-35209715Probówka wirówkowa 15 ml
CS& T IVD KoralikiBD662414standardowe kulki do ustawiania ustawień cytometru w różnych cytometrach przepływowych
Roztwór lizujący 10x KoncentratBD349202liza czerwonych krwinek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-023PBS
Probówka okrągłodennaBD Falcon3522355 ml
do wirowania komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
  2. Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567(2020).
  3. Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646(2020).
  4. Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348(2019).
  5. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562(2022).
  6. Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
  7. Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671(2022).
  8. Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
  9. Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
  10. Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
  11. Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flow CytometryLymphocyte DetectionInstrument StandardizationFluorescence IntensityCompensation ControlsCST BeadsAnalysis TemplateMulticenter StudyJapanese EncephalitisImmune Function

Powiązane artykuły