Artykuł metodologiczny

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

DOI:

10.3791/65086

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3CelVivo ApS

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół, który opisuje właściwości i zalety korzystania z samodzielnego inkubatora klinostatu do hodowli, leczenia i monitorowania kultur komórkowych 3D. Klinostat naśladuje środowisko, w którym komórki mogą gromadzić się jako wysoce powtarzalne sferoidy o niskich siłach ścinających i aktywnej dyfuzji składników odżywczych. Wykazaliśmy, że zarówno hepatocyty nowotworowe, jak i nienowotworowe (linie komórkowe HepG2/C3A i THLE-3) wymagają 3 tygodni wzrostu, zanim osiągną funkcje porównywalne z komórkami wątroby. Protokół ten podkreśla wygodę korzystania z inkubatorów do komórek 3D z kamerami monitorującymi wzrost komórek, ponieważ podczas leczenia można wykonywać migawki w celu zliczenia i zmierzenia sferoid. Opisujemy porównanie linii komórkowych THLE-3 i HepG2/C3A, pokazując, w jaki sposób można hodować nienowotworowe linie komórkowe, a także unieśmiertelnione komórki rakowe. Pokazujemy i ilustrujemy, w jaki sposób eksperymenty proteomiczne można przeprowadzić z kilku sferoid, które można zebrać bez zakłócania sygnalizacji komórkowej, tj. Nie jest wymagana trypsynizacja. Pokazujemy, że analiza proteomiczna może być wykorzystana do monitorowania typowego fenotypu wątroby metabolizmu łańcucha oddechowego i produkcji białek zaangażowanych w detoksykację metali oraz opisania półautomatycznego systemu do liczenia i pomiaru obszaru sferoidy. Podsumowując, protokół przedstawia zestaw narzędzi, który obejmuje charakterystykę fenotypową za pomocą przechwytywania obrazu oraz proces proteomiki do eksperymentowania na modelach hodowli komórkowych 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udowodniono, że hodowle komórkowe in vitro są niezbędne i nieocenione w zdobywaniu podstawowej wiedzy z biologii. Znaczna część wiedzy naukowej w biologii, a w szczególności w raku, pochodzi z systemu hodowli 2D, czyli komórek rosnących w monowarstwie. Chociaż hodowla 2D jest dominującym systemem hodowli komórek, ma wiele wad, które mogą potencjalnie zahamować dalszy postęp biologiczny. Na przykład w hodowlach 2D brakuje interakcji komórka-komórka ważnych dla sygnalizacji komórkowej i proliferacji1. Do tej pory wykazano, że systemy hodowli 3D lepiej modelują różnicowanie, reakcję na leki, inwazję guza i biologię2,3,4,5. Modelowanie 3D nowotworów złośliwych jest szczególnie istotne ze względu na wzrost starzejącej się populacji i śmiertelność z powodu nowotworów. Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie i często ma fatalne rokowania6. Wiadomo, że HCC ma niski wskaźnik wyleczeń, słabą odpowiedź na lek i wysoki wskaźnik nawrotów6,7,8. Opracowano kilka modeli 3D dla prawidłowej wątroby i HCC, które naśladują fizjologię normalnej i złośliwej tkanki wątroby in vivo9,10.

Niektóre z obecnych systemów 3D obejmują płynne nakładki, bioreaktory, hydrożel, rusztowania i struktury drukowane w 3D. Sferoidy generowane w bioreaktorach zapewniają unikalne korzyści, ponieważ naśladują rozkład guza w zakresie ekspozycji na składniki odżywcze, wymiany gazowej i proliferacji/spoczynku komórek11. Bioreaktory są szczególnie odpowiednie dla modeli nowotworowych ze względu na ich łatwość użycia, dużą skalowalność, dyfuzję składników odżywczych i dostępność11. Ponadto bioreaktory mogą pozwolić na przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, większą odtwarzalność i zmniejszenie liczby błędów ludzkich. Bioreaktor użyty w tym badaniu jest wyjątkowy, ponieważ symuluje system o zmniejszonej grawitacji, który minimalizuje zakłócające siły ścinające stosowane w typowych bioreaktorach, co pozwala na lepszą odtwarzalność12. Dookólna grawitacja i zmniejszenie sił ścinających pozwalają komórkom rozwijać się w bardziej fizjologiczny sposób. Jako dowód, komórki HepG2/C3A hodowane zgodnie z tą metodologią rozwijają kuliste organelle, które wytwarzają in vivo poziomy ATP, kinazy adenylanowej, mocznika i cholesterolu13,14. Ponadto leczenie farmakologiczne w tym systemie 3D jest bardziej zaawansowane i zautomatyzowane w porównaniu z hodowlami 2D. W hodowlach 2D leczenie farmakologiczne często musi trwać krótko ze względu na konieczność trypsynizacji i utrzymania zdrowia komórek. Jednak w naszym przypadku możemy prowadzić długotrwałe leczenie farmakologiczne sferoid bez konieczności zaburzania struktury i fizjologii komórek. W związku z tym konieczne jest przejście z kultur 2D na 3D, aby lepiej modelować zjawiska biologiczne in vivo i dalej rozwijać się naukowo.

Ten artykuł przedstawia metodologię hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności (Rysunek 1 i Rysunek 2) i pokazuje półautomatyczny system do fenotypowego charakteryzowania struktur 3D (Rysunek 3). Na poziomie obrazu podajemy informacje na temat zliczania i mierzenia powierzchni sferoid (Rysunek 3). Korzystając z metod spektrometrii mas, pokazujemy, w jaki sposób proteomika może być wykorzystana do oceny określonych funkcji biologicznych (Rysunek 4). Zbierając i analizując te dane, mamy nadzieję poprawić zrozumienie biologii stojącej za systemami hodowli komórkowych 3D.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. i odczynniki

  1. Pożywka do wzrostu komórek HepG2 / C3A: Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Ball firmy Dulbecco (DMEM, 4,5 g / l glukozy) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aminokwasy endogenne (1% v / v), L-glutaminę (1% v / v) i penicylinę / streptomycynę (0,5 % v / v). Przechowywać pożywkę wzrostową w temperaturze 4 °C.
  2. Pożywka do wzrostu komórek THLE-3: Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli [BEGM] zawierającą jej suplementy (ekstrakt z przysadki bydlęcej [BPE], hydrokortyzon, ludzki naskórkowy czynnik wzrostu [hEGF], adrenalinę, transferynę, insulinę, kwas retinowy, trójjodotyroninę, siarczan gentamycyny-amfoterycynę [GA]) oraz 10% FBS, 5 ng/ml hEGF i 70 ng/ml fosfoetanolaminę.
  3. 500 mM DL-ditiotreitol (DTT): Aby przygotować 10 ml, ponownie zawieś 0,771 g DTT w 10 ml wody klasy HPLC. Przechowywać 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
  4. 200 mM jodoacetamid: Aby przygotować 1 ml, ponownie zamieszaj 36 mg jodoacetamidu w 1 ml 50 mM wodorowęglanu amonu. Nie przechowywać zawiesiny jodoacetamidu.
  5. 5% dodecylosiarczan sodu (SDS): Aby przygotować 50 ml, ponownie zamieszaj 2,5 g SDS w 50 ml 50 mM wodorowęglanu amonu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. 12% kwas fosforowy: Aby przygotować 100 ml, rozcieńczyć 14,1 ml 85% kwasu fosforowego w 85,9 ml wody klasy HPLC. Przechowywać w szklanej butelce w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Bufor wiążący: Aby przygotować 1 l, dodaj 900 ml stężonego metanolu do 100 ml 10 mM wodorowęglanu amonu lub TEAB.
  8. 0,1% roztwór kwasu trifluorooctowego (TFA): Dodać 1 ml stężonego TFA do 999 ml wody klasy HPLC. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. 60% roztwór acetonitrylu/0,1% TFA: Dodać 600 ml acetonitrylu klasy HPLC (60% v/v) do 399 ml wody klasy HPLC. Następnie dodać 1 ml stężonego tłuszczu tłuszczowego do tego roztworu, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  10. Ruchoma faza A (MPA) - 0,1% kwas mrówkowy: Dodaj 1 ml stężonego kwasu mrówkowego do 999 ml wody klasy HPLC i dobrze wymieszaj.
  11. Ruchoma faza B (MPB) - 80% acetonitrylu klasy HPLC + 0,1% kwas mrówkowy: Dodaj 800 ml acetonitrylu klasy HPLC do 199 ml wody klasy HPLC. Następnie dodaj 1 ml stężonego kwasu mrówkowego do tego roztworu i wymieszaj.

2. Przygotowanie sferoid

UWAGA: Rysunek 1A przedstawia początkowe etapy przygotowania i hodowli sferoid 3D z linii komórkowych.

  1. Rozmrozić zamrożone komórki HepG2/C3A i THLE-3 i wyhodować je jako monowarstwę przy użyciu standardowych pożywek wzrostowych w kolbie lub naczyniu do hodowli tkankowej, aż osiągną około 80% zbieżności.
    UWAGA: Gdy komórki osiągną zbieg, sprawdź ogólną morfologię komórek i wzorce wzrostu za pomocą mikroskopu. Nie zaleca się używania komórek o dużej liczbie pasaży.
  2. Umyj komórki dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS, użyj 5 ml na kolbę T75 cm2 lub naczynie 10 cm).
  3. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej w HBSS (rozcieńczenie 1:2) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Użyj mikroskopu, aby ocenić oderwanie komórek i dodaj 3 ml FBS lub pożywki wzrostowej (zawierającej 10% FBS), aby zneutralizować reakcję trypsyny.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 270 x g przy RT przez 5 minut.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
    UWAGA: Jeśli jest zbyt wiele komórek, rozcieńczyć zawiesinę komórek przed liczeniem.
  6. Policz liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek w kompletnej pożywce wzrostowej, aby uzyskać 1 x 106 w maksymalnej objętości 1,5 ml.
  7. Zrównoważyć 24-dołkową okrągłą płytkę denną o bardzo niskim mocowaniu, zawierającą mikrodołki.
    1. Umyj studzienki 0,5 ml pożywki wzrostowej.
    2. Odwirować płytkę o sile 3 000 x g przez 5 minut (w ten sposób usunięto pęcherzyki powietrza z powierzchni studzienek).
  8. Przenieść zawiesinę komórkową (przygotowaną w kroku 1.4) na płytkę i wirować przez 3 minuty przy 120 x g.
    UWAGA: Objętość zawiesiny komórek może się różnić w zależności od liczby komórek, ale ważne jest, aby ograniczyć ją do 1,5 ml.
  9. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby rozpocząć tworzenie sferoidów.

3. Hodowla sferoidów w bioreaktorach (Rysunek 2)

UWAGA: Aby zachować strukturę sferoid, używaj końcówek o szerokim otworze podczas obsługi sfer 3D.

  1. Zrównoważyć bioreaktor, wypełniając komorę wilgotnościową 25 ml sterylnej wody, a komorę komórkową 9 ml pożywki wzrostowej na 24 godziny przed przeniesieniem do niej sferoid (Rysunek 2A). Pamiętaj, aby użyć strzykawki o pojemności 10 ml połączonej z długą igłą podczas napełniania komór wilgotnościowych i komórek.
  2. Inkubować bioreaktor, obracając się (15 obr./min) w inkubatorze 3D (Rysunek 2D, F), przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Używając końcówek o szerokim otworze o pojemności 1 ml, delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć sferoidy od bardzo niskiej płytki mocującej i przenieść sferoidy do naczynia do hodowli tkankowej.
  4. Umyj płytkę o bardzo niskim nasadce 0,5 ml wstępnie podgrzanego podłoża wzrostowego, aby uchwycić resztki sferoid i przenieść je do tego samego naczynia z kroku 3.3.
  5. Oceń wielkość, zwartość i okrągłość sferoid za pomocą mikroskopu świetlnego (4-krotne powiększenie) i wybierz te, które są wystarczająco uformowane.
    UWAGA: Komórki są wystarczająco uformowane, gdy są zwarte i nie rozpadają się podczas przenoszenia. Ważne jest również, aby sferoidy były pojedynczą jednostką i nie były ze sobą zbite. Rozmiar sferoidy między 100-200 μm jest preferowany po przeniesieniu do bioreaktora.
  6. Przenieść sferoidy do zrównoważonego bioreaktora wypełnionego 5 ml świeżej pożywki wzrostowej. Po przeniesieniu sferoid całkowicie napełnij bioreaktor świeżą pożywką wzrostową i pamiętaj, aby unikać dodawania pęcherzyków do bioreaktora podczas napełniania go pożywką.
  7. Umieść bioreaktor w inkubatorze 3D i wyreguluj prędkość obrotową za pomocą jednostki sterującej (Rysunek 2C). W przypadku sferoid HepG2/C3A ustaw prędkość obrotową na 10-11 obr./min; dla sferoid THLE-3 ustaw go na 11-12 obr./min.
    UWAGA: Prędkość obrotowa jest prawidłowo ustawiona, gdy sferoidy są równomiernie rozmieszczone w środku bioreaktora i nie dotykają jego ścianek. Rysunek 2E przedstawia obracający się bioreaktor.
  8. Wymieniaj pożywki wzrostowe co 2-3 dni, usuwając 10 ml starych pożywek i zastępując je 10 ml świeżymi podłożami; pamiętaj, aby nie usuwać sferoid podczas wymiany pożywki (Rysunek 2B).
    UWAGA: Zaleca się rutynową wymianę nośników (na przykład 48 godzin/48 godzin/72 godziny) i prowadzenie szczegółowej dokumentacji.
  9. Dostosuj prędkość obrotową za każdym razem, gdy zmieniany jest nośnik. Zwiększaj prędkość w miarę wzrostu rozmiaru i liczby sferoid.
  10. Po 15 dniach w hodowli rozdziel sferoidy na dwa nowe bioreaktory.
    UWAGA: W zależności od linii komórkowej i szybkości wzrostu, czas może się różnić i powinien być optymalizowany indywidualnie.
  11. Po 20 dniach sferoidy są gotowe do zbioru.

4. Przechwytywanie obrazów i liczenie sferoid

UWAGA: Uproszczony potok do liczenia sferoid jest pokazany w Rysunek 3A. W przypadku zliczania sferoid i określania powierzchni (sekcja 5) kluczowe znaczenie ma ocena zwartości struktur 3D. Przyczyni się to do zwiększenia kontrastu kolorów, który jest niezbędny, aby metoda była dokładna.

  1. Otwórz aplikację 3D zainstalowaną na tablecie.
  2. Wybierz bioreaktor i zrób migawkę.
    UWAGA: Alternatywnie można zrobić zdjęcie. Należy wziąć pod uwagę następujące parametry.
    1. Umieść czarne tło za bioreaktorem (czarne podparcie znajduje się w pudełku z bioreaktorem).
    2. Upewnij się, że nie ma odbicia światła w komorze ogniwa.
    3. Zrób zdjęcie jak najbliżej bioreaktora.
  3. Otwórz jedno zdjęcie na FIDŻI (ImageJ).
  4. Przygotuj obraz do analizy:
    1. Wybierz narzędzie Owal. Narysuj okrąg wokół wtyczki.
    2. Kliknij Usuń na klawiaturze, aby wszystko wewnątrz okręgu było czarne. Narysuj okrąg wokół komory komórki. Upewnij się, że wszystkie sferoidy znajdują się wewnątrz okręgu.
  5. Uruchom makro, aby policzyć sferoidy:
    1. Kliknij Wtyczki > Makro > Nagraj. Skopiuj tekst makra z pliku uzupełniającego 1 do rejestratora.
    2. Naciśnij Utwórz, a otworzy się nowe okno. Naciśnij Uruchom, aby przeanalizować otwarty obraz.
    3. Otworzy się nowe okno z wynikami (liczba, powierzchnia całkowita, średni rozmiar i powierzchnia procentowa).
  6. Zamknij obraz i powtórz kroki 4.4 i 4.5 dla każdego obrazu, dla którego potrzebna jest liczba sferoidów. Aby ułatwić i przyspieszyć przetwarzanie, zapisz makro i uruchom je, klikając Wtyczki > Makro > Uruchom i wybierz zapisane makro.

5. Planimetryczne określenie obszaru sferoidalnego

UWAGA: Uproszczony potok do wyznaczania obszaru sferoidy jest pokazany w Rysunek 3B.

  1. Zrób zdjęcia zgodnie z opisem w kroku 3.5.
  2. Przed rozpoczęciem ustaw skalę globalną, aby zmierzyć powierzchnię sferoid.
    1. Otwórz na FIDŻI obrazek ze skalą o żądanym powiększeniu. Wybierz narzędzie linii. Narysuj podziałkę liniową (linia musi być tak długa, jak podziałka liniowa).
    2. Otwórz okno Analizuj > ustaw skalę. Zapisz znaną odległość (długość linii jest automatycznie wprowadzana w polu Odległość w pikselach. Upewnij się, że zaznaczyłeś opcję Globalne.
    3. Naciśnij przycisk OK. Teraz skala jest ustawiana dla obrazu, który będzie analizowany.
  3. Aby rozpocząć wyznaczanie planimetryczne, uruchom makro (Plik uzupełniający 2).
    1. Kliknij opcję Process (Przetwarzaj> Grupowe > makra). Wybierz folder zawierający zdjęcia do analizy. Ten folder będzie danymi wejściowymi.
    2. Wybierz folder utworzony w kroku 5.3.1 jako Dane wyjściowe. Naciśnij przycisk Proces.
  4. W ramach kontroli jakości oceń, czy zmierzony obszar sferoidalny odpowiada oryginalnemu obrazowi.
    UWAGA: Makro nie obejmuje sferoid na krawędzi, w których można zmierzyć tylko część sferoidy.

6. Kolekcja sferoid

UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby sferoidy były zbierane za pomocą końcówek o szerokim otworze, aby zachować ich strukturę 3D. Zbieranie danych można przeprowadzić za pomocą wtyczki znajdującej się z przodu bioreaktora (Rysunek 2A).

Wielkość sferoid podczas zbierania może się różnić w zależności od linii komórkowej, początkowej liczby komórek i procesu podziału (dni w hodowli, liczba sferoid na bioreaktor i współczynnik podziału).

  1. Aby zebrać sferoidy, usuń 5 ml pożywki z bioreaktora przez górny port za pomocą strzykawki połączonej z długą igłą. Upewnij się, że sferoidy opadają do dolnej środkowej części bioreaktora (w pobliżu dolnego portu).
  2. Otwórz przedni port i zbierz sferoidy za pomocą końcówki o szerokim otworze 1 ml. Umieść sferoidy w probówkach do mikrowirówek. Odwirować sferoidy o masie 500 x g przez 5 minut i wyrzucić pożywkę.
  3. Przemyć sferoidy 200 μl HBSS w celu usunięcia FBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Zawiesiny sferoidalne należy zamrozić w mgnieniu oka ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.

7. Żywotność sferoid

UWAGA: Żywotność sferoidów została określona poprzez pomiar aktywności kinazy adenylanowej (AK) uwalnianej przez uszkodzone komórki (Rysunek 4A). Ze względu na gradient dyfuzji, pomiar AK jest skuteczny, gdy sferoidy mają średnicę mniejszą niż 900 μm12. Jeśli sferoidy stają się większe lub jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do pomiaru żywotności, można przeprowadzić test ATP15.

  1. Zebrać supernatant sferoidalny i przenieść 20 μl na 96-dołkową płytkę o białych ściankach (płaskie dno przezroczyste). Dodać 100 μl odczynnika do wykrywania kinazy adenylanowej do każdej studzienki i homogenizować, delikatnie pipetując w górę iw dół.
  2. Usunąć pęcherzyki przez odwirowanie w próżni prędkości przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Inkubować płytki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść płytkę w luminometrze (czytnik płytek, tryb luminescencji) i zainicjuj program. Ustaw parametry zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
    UWAGA: W testach żywotności bioluminescencyjnej do obliczenia odpowiedzi komórki można wykorzystać bezpośredni strumień świetlny luminometru (zwykle RLU). Ponieważ kinaza adenylanowa wycieka tylko z komórek, których integralność komórkowa została naruszona, możliwe jest osiągnięcie całkowitej kontroli kinazy adenylanowej za pomocą odczynnika do lizy.

8. Ekstrakcja białka

UWAGA: Rysunek 1B przedstawia przebieg przetwarzania sferoidów i ekstrakcji białek.

  1. Zbierz sferoidy (sekcja 6) w 36 dniu. Ponownie zawiesić sferoidy w 25 μl 5% SDS, aby zlizować komórki.
    1. Po dodaniu 5% SDS homogenizować granulki, pipetując w górę iw dół. W niektórych przypadkach, gdy liza sferoid jest trudna, użyj małego tłuczka.
  2. Inkubować próbki z 20 mM DTT przez 1 godzinę w celu redukcji białek. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
  3. Próbki inkubować z 40 mM jodoacetamidem przez 30 minut, chroniąc przed światłem do alkilowania białek. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
  4. Dodać 12% roztwór kwasu fosforowego (10x) do próbek o końcowym stężeniu 1,2%.
  5. Rozcieńczyć próbki w sześciu objętościach buforu wiążącego i delikatnie wymieszać.
  6. Załadować próbkę do płyty filtracyjnej S-Trap i odwirować z prędkością 500 x g przez 30 s.
    UWAGA: Jeśli całkowita objętość próbki w kroku 8.4 przekracza objętość kolumny, należy załadować próbki partiami i powtarzać krok 8.6, aż wszystko zostanie przepuszczone przez kolumnę.
  7. Przepłukać próbki dwukrotnie 150 μl buforu wiążącego. Po każdym praniu odwirować z prędkością 500 x g przez 30 s i wylać przepływ.
  8. Próbki inkubować z 1 μg trypsyny do sekwencjonowania rozcieńczonej w 50 mM wodorowęglanie amonu przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Jako materiał wyjściowy do kompleksowej analizy proteomu zaleca się co najmniej 20 μg białka. W tym celu 1 μg trypsyny to idealna ilość dla efektywnego trawienia. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między buforem a łożem kolumny.
  9. Wyeluować peptydy za pomocą 40 μl 50 mM wodorowęglanu amonu i umieścić w tej samej probówce zbiorczej.
  10. Odwiruj w dół przy 500 x g przez 30 s. Elute peptydy z 40 μl 0,1% TFA i połącz je w tej samej probówce zbiorczej.
  11. Wirować w dół przy 500 x g przez 30 s. Eluować peptydy za pomocą 40 μl 60% acetonitrylu i 0,1% TFA i połączyć je w tej samej probówce zbiorczej.
  12. Wirować w dół przy 500 x g przez 30 s. Suche eluaty w próżni prędkości i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.

9. Oczyszczanie próbki

UWAGA: Zanim przejdziesz do analizy proteomicznej, konieczne jest usunięcie soli obecnej w próbkach. Sole mogą zakłócać analizę metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (HPLC-MS), ponieważ jonizują podczas elektrorozpylania, tłumiąc sygnał z peptydów. Konfiguracja do odsalania zastosowana w tym badaniu została wcześniej zademonstrowana przez Josepha-Chowdhury'ego i współpracowników16.

  1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że jest czysta 96-dołkowa płytka zbiorcza, przez którą można zebrać przepływ podczas wykonywania kolejnych czynności. Wymieszaj żywicę C18 (50 mg/ml w 100% acetonitrylu) na magnetycznej płytce mieszającej.
  2. Dodać 70 μl zawiesiny żywicy C18 do dołka 96-dołkowej płytki filtracyjnej, zrobić to szybko, aby upewnić się, że żywica C18 nie gromadzi się na dnie pipety.
  3. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Wyrzucić przepływ zebrany na 96-dołkowej płytce zbiorczej.
  4. Umyj żywicę 100 μl 0,1% TFA. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu się i mieszaniu próbek, a następnie wyrzuć przepływ.
  5. Zawiesić każdą próbkę w 100 μl 0,1% TFA. Sprawdź i upewnij się, że pH wynosi 2-3.
  6. Załaduj każdą próbkę do każdej studzienki płyty filtracyjnej. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu się i mieszaniu próbek, a następnie wyrzuć przepływ.
  7. Umyć 100 μL 0,1% TFA. Delikatnie włącz odkurzacz, aby zapobiec rozpryskiwaniu się i mieszaniu próbek. Odrzuć przepływ.
  8. Zastąp 96-dołkową płytkę nową 96-dołkową płytką w celu zebrania odsolonych próbek.
  9. Dodać 60 μl acetonitrylu/0,1% TFA do dołka. Aby usunąć próbki z żywicy C18, delikatnie włącz próżnię, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
  10. Zebrać przepływ i wysuszyć w próżni o prędkości obrotowej w temperaturze pokojowej. Przejść do LC-MS/MS lub przechowywać płytkę w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie gotowa do przetworzenia próbek.

10. Analiza proteomiczna za pomocą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas

UWAGA: Do wygenerowania danych do tego manuskryptu użyto systemu nLC-MS/MS z dwukolumnową konfiguracją systemu z kolumną pułapką C18 o średnicy 300 μm x 0,5 cm i nanokolumną analityczną C18-AQ (3 μm) o średnicy 75 μm x 25 cm, zapakowaną wewnętrznie.

  1. Przygotuj fazy ruchome do uruchomienia na HPLC:
    Faza ruchoma A (MPA): 0,1% kwas mrówkowy w wodzie klasy HPLC
    Ruchoma faza B (MPB): 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu klasy HPLC
  2. Zaprogramuj metodę HPLC w następujący sposób: 4%-34% MPB przez 120 min, 34%-90% MPB przez 5 min, izokratyczna 90% MPB przez 5 min; natężenie przepływu: 300 nL/min.
  3. Skonfiguruj metodę akwizycji MS, aby przeprowadzić akwizycję niezależną od danych (DIA) w celu wygenerowania widm MS/MS wykrytych sygnałów peptydowych.
  4. Ponownie zawiesić 1 μg próbek w 10 μl 0,1% TFA przed umieszczeniem próbek w automatycznym podajniku próbek nLC.
  5. Uruchom metodę nLC-MS zgodnie z programem do kanonicznej akwizycji proteomicznej:
    1. Ustaw pełne skanowanie MS na 300-1100 m/z w orbicie, z rozdzielczością 120 000 (przy 200 m/z) i celem automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 125.
    2. Ustaw MS/MS w orbicie z sekwencyjnym oknem izolacji 50 m/z z celem AGC 400 i energią dysocjacji zderzeniowej o wyższej energii (HCD) wynoszącą 30.

11. Analiza danych

  1. Zaimportuj surowe pliki danych nLC-MS/MS do oprogramowania do wykrywania szczytów kompatybilnego z używaną platformą MS.
  2. Wybierz odpowiednią bazę danych (człowiek, mysz itp.).
  3. Ustaw N-końcową acetylację jako modyfikację zmienną, a karbamidometylocysteinę jako modyfikację ustaloną.
  4. Określ trypsynę jako enzym trawienny z dozwolonymi dwoma pominiętymi cięciami.
  5. Ustaw tolerancję masy zgodnie z analizatorem masy używanym do akwizycji widm.
  6. Wyeksportuj analizę jako arkusz kalkulacyjny i przetwarzaj dane dalej w razie potrzeby.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy właściwości innowacyjnego, bezstresowego inkubatora komórek 3D, systemu zaprojektowanego specjalnie do hodowli sferoid 3D (Rysunek 2). Zoptymalizowaliśmy protokół hodowli 3D linii komórkowych THLE-3 i HepG2/C3A. Opisany tutaj protokół jest prosty w użyciu i pozwala na odtwarzalność i opłacalność hodowli > 100 sferoid na bioreaktor. Po umieszczeniu w bioreaktorze sferoidy są traktowane podobnie jak komórki utrzymywane w hodowli 2D. Optymalne warunki wzrostu osiąga się poprzez wymianę pożywek dwa do trzech razy w tygodniu (Rysunek 2B) i dostosowanie prędkości obrotowej do wzrostu i wielkości sferoid (Rysunek 2C). Ten system, w którym sferoidy 3D są hodowane w obracających się bioreaktorach (Rysunek 2E,F), zapewnia optymalne środowisko wzrostu dla struktur 3D poprzez wystawienie sferoidy na równą i bardzo niską siłę ścinającą.

Wcześniej pokazaliśmy, jak sferoidy mogą być używane do analizy modyfikacji chromatyny16. Tutaj pokazujemy szczegółowo, jak uzyskać sferoidy wątroby i jak można przeprowadzić eksperymenty proteomiczne w celu analizy pełnego proteomu (Rysunek 1). Krótko mówiąc, protokół został zainicjowany przy użyciu płaskich komórek THLE-3 lub HepG2/C3A, aż hodowla osiągnęła 80% konfluencji. Aby wyhodować komórki jako sferoidy, około 2000 komórek zostało posianych na bardzo niskiej płytce mocującej zawierającej mikrodołki, aby umożliwić im samoagregację, a następnie uformowane sferoidy przeniesiono do bioreaktora (Rysunek 1A). Chociaż są one funkcjonalnie aktywne po 3 tygodniach w hodowli, jak wcześniej pokazano17, pokazujemy wyniki ze sferoidów zebranych po 36 dniach w hodowli dla tego protokołu. Po zebraniu sferoidy odwirowano, a zarówno osad, jak i supernatant przechowywano do analizy. Żywotność komórek oceniono na podstawie supernatantu w celu ilościowego określenia kinazy adenylanowej uwalnianej przez uszkodzone komórki, jak opisano wcześniej17. Białka komórkowe wyekstrahowano z osadu komórkowego, a pełny proteom przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1B).

Ten protokół demonstruje również półautomatyczną metodę liczenia sferoid (Rysunek 3A) przy użyciu publicznego programu do przetwarzania obrazów FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Na potrzeby analizy należy wykonać dobrej jakości zdjęcie sferoidy i wziąć pod uwagę niektóre parametry, jak wspomniano w sekcji 5. Następnie, po przygotowaniu obrazu do analizy, do zliczania sferoid używany jest skrypt makr (Plik Uzupełniający 1). Makro działa w ten sposób, że najpierw tworzy folder o nazwie FIJI Spheroids counting, wewnątrz folderu, w którym znajdują się obrazy sferoidalne. W tym folderze zapisywane są wszystkie informacje z analizy; Obejmuje to zdjęcie sferoid, które zostały policzone, z numerem identyfikacyjnym na każdej sferoidzie. Zawiera również plik Excela o nazwie zliczanie sferoidów. Ten plik zawiera obszar piksela i numer identyfikacyjny dla każdego sferoidy, która została zliczona. Dane odpowiadające jednemu analizowanemu obrazowi prezentowane są w każdej zakładce pliku. Zakładka jest oznaczona zgodnie z nazwą analizowanego obrazu. Ponieważ rozmiar sferoidy może być osłabiony przez wiele czynników, w tym liczbę struktur w naczyniu i leczenie farmakologiczne, ważne jest również monitorowanie ich powierzchni (planimetria). Przedstawiony tutaj skrypt makr (Plik uzupełniający 2) działa poprzez pomiar czarnych obszarów, które odpowiadają sferoidom na rysunku (Rysunek 3B). Dane wyjściowe są gromadzone w pliku o nazwie planimetry.xlsx, który zawiera zmierzoną powierzchnię, obwód i średnicę każdej sferoidy. Istnieje również pomiar o nazwie Feret, używany do obliczania średnicy. Feret to najdłuższa możliwa średnica, podczas gdy minFeret jest najkrótsza. Średnica jest średnią z tych dwóch. Wewnątrz folderu wyjściowego, oprócz pliku planimetry.xlsx, znajduje się również zdjęcie sferoid, które zostały zmierzone.

Przed przystąpieniem do analizy proteomu, żywotność sferoidów została oceniona w czasie hodowli. Poziomy AK wzrastają do 17 dnia, osiągając około 7% śmierci komórki, a następnie śmierć spada do poziomów poniżej 5% (Rysunek 4A), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi pracami17. Protokół ten pokazuje również pełną analizę proteomu w celu monitorowania fenotypu komórki. W pierwszej kolejności porównano proteomy płaskich komórek i sferoid THLE-3 i HepG2/C3A. Analizując pierwszy główny składnik (PC1), oczywiste jest, że istnieje ścisła separacja próbek sferoidalnych od płaskich hodowli komórkowych i wydaje się, że korelacja typu komórki (THLE-3 i HepG2/C3A) nie jest istotna (Rysunek 4B). Chociaż sferoidy THLE-3 i HepG2/C3A nie grupują się razem, mają podobne profile zgodne z funkcją wątroby. W tym protokole pokazujemy przykład metalotionein, które odgrywają rolę w detoksykacji metali przeprowadzanej przez wątrobę. W analizie proteomicznej zidentyfikowaliśmy 2 izoformy ulegające nadekspresji w sferoidach w porównaniu z płaskimi komórkami (MT1E i MT1X) (Rysunek 4C). Pokazujemy również wzbogacenie ontologii genów (GO) obu linii komórkowych hodowanych jako sferoidy. Proces metabolizmu węglowodanów, który obejmuje cykl kwasów trikarboksylowych (cykl TCA), łańcuch transportu elektronów (oddychanie komórkowe) i metabolizm pirogronianów, jest częstym terminem i jest wzbogacony zarówno w sferoidy HepG2 / C3A, jak i THLE-3 (Rysunek 4D, E). Detoksykacja komórkowa, metabolizm kwasów tłuszczowych i cholesterolu to inne funkcje wzbogacone w obie sferoidy. Razem, funkcje te są znane jako kluczowe dla funkcji wątroby.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy dla hodowli sferoidów i przygotowania próbki. (A) Eksperymentalne podejście do hodowli komórkowych 3D. Płaskie hodowle komórkowe w pożądanym zbiegu, trypsynizowano i wysiewano na 24-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej mikrodołki, gdzie komórki samoorganizują się w sferoidy. Po 24 godzinach sferoidy przeniesiono do bioreaktora i hodowano do momentu, aż będą gotowe do analizy. (B) Po zebraniu sferoidy zostały ogranulowane, a zarówno osad, jak i supernatant hodowlany przechowywano do czasu przetworzenia. Histones16i białka niehistonowe zostały wyekstrahowane, strawione na peptydy i przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Surowe pliki uzyskane ze spektrometrii mas zostały przeszukane w bazie danych ludzi, a dane zostały poddane dalszemu przetwarzaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: System hodowli komórkowych 3D. (A) Części bioreaktora. Bioreaktor składa się z komory wymiany gazowej i nawilżania zawierającej kulki wodne oraz otwieranej komory komórkowej z dwoma korkami do wymiany mediów i zbierania sferoid. (B) Wymiana pożywek w bioreaktorach. Bioreaktor napełnia się 10 ml pożywki wzrostowej za pomocą strzykawki z igłą. (C) Aplikacja do sterowania systemem. Prędkość obrotowa, poziom CO2, temperatura, dziennik alarmów i inne funkcje mogą być kontrolowane za pomocą jednostki sterującej. (D) Umieszczenie bioreaktora w inkubatorze 3D. Każdy bioreaktor ma przypisany silnik, który może powoli obracać bioreaktor. (E) Bioreaktor w ruchu z prędkością (obr./min) kontrolowaną przez tabletkę (C). Prędkość (obr./min) jest regulowana w zależności od wielkości sferoid. (F) Bioreaktory wewnątrz inkubatora 3D. W inkubatorze 3D można umieścić do 6 indywidualnie sterowanych bioreaktorów. Zdjęcie dzięki uprzejmości Jason Torres Photography. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka fenotypowa sferoid za pomocą przechwytywania obrazu. (A) Półautomatyczne liczenie sferoidów. Po wykonaniu zdjęć sferoid w bioreaktorze, obraz jest przygotowywany do analizy na FIDŻI. Każda sferoida jest zliczana, a dla każdej z nich podawany jest numer identyfikacyjny. Używane jest makro, a wyniki są wyświetlane z identyfikatorem zliczanej sferoidy, etykietą (nazwą obrazu, który był analizowany) i obszarem (liczbą pikseli zliczonych w sferoidzie). (B) Planimetryczne określenie obszaru sferoidalnego. Za pomocą makra określa się obszar, obwód i średnicę określonej sferoidy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza proteomu sferoidów wątroby. (A) Żywotność sferoidów została obliczona na podstawie uwolnienia kinazy adenylanowej (AK) na supernatancie hodowli. Wyniki są średnią zduplikowanych punktów danych ± SD. (B) Przeprowadzono analizę głównych składowych (PCA) w celu porównania proteomu płaskich komórek i sferoid THLE-3 i HepG2/C3A. (C) Względna obfitość metalotionein, które są białkami ulegającymi ekspresji w ludzkiej wątrobie. Dane są reprezentowane jako średnie ± SEM. (D) Funkcjonalnie pogrupowana sieć pokazuje wzbogacenie GO dla sferoid HepG2 / C3A i (E) sferoid THLE-3, gdzie pokazana jest tylko etykieta najbardziej znaczącego składnika na grupę. Sieć została zbudowana przy użyciu ClueGo19. Rozmiar węzła reprezentuje znaczenie wzbogacania terminu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Skrypt makra do liczenia sferoidów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Makro do wyznaczania sferoid planimetrycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie biologii stojącej za trójwymiarowymi (3D) strukturami komórkowymi jest niezwykle ważne dla bardziej wszechstronnej wiedzy na temat ich funkcjonalności. Rośnie zainteresowanie wykorzystaniem modeli 3D do badania złożonej biologii i przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności. Podczas hodowli komórek w 3D należy wziąć pod uwagę wiele czynników, w tym ocenę fenotypową systemu modelowego. Fenotyp definiuje się jako grupę obserwowalnych cech określonego organizmu, takich jak morfologia, zachowanie, właściwości fizjologiczne i biochemiczne20.

W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób eksperymenty proteomiczne mogą być przeprowadzane na podstawie kilku sferoid i mogą być wykorzystywane do monitorowania typowego fenotypu wątroby. Spektrometria mas stała się szeroko stosowaną metodą charakterystyki komórek 3D, umożliwiając badanie różnych zagadnień biologicznych 12,16,21,22. Do kompleksowej analizy proteomu zaleca się użycie co najmniej 20 μg białkowego materiału wyjściowego, z którego 1 μg wstrzykuje się do spektrometru mas. Należy wspomnieć, że dodanie mniejszej ilości próbki może prowadzić do utraty czułości, a dodanie większej ilości stopniowo pogorszyłoby jakość chromatografii i ostatecznie doprowadziłoby do zablokowania kolumny. W tym badaniu wykazaliśmy, że sferoidy HepG2/C3A i THLE-3 są wzbogacone w ważne białka z cyklu glikolizy i TCA, które są specyficznymi szlakami wątrobowymi i mają kluczowe znaczenie dla utrzymania poziomu glukozy we krwi i produkcji energii23,24. W rzeczywistości analiza spektrometrii mas dostarcza nie tylko informacji na poziomie białka, ale także pozwala na badanie modyfikacji potranslacyjnych białek, jak wykazano wcześniej w naszej grupie16.

Innym aspektem, który należy wziąć pod uwagę w badaniach fenotypowych 3D, jest liczba i rozmiar sferoid. Oprócz tego, że eksperymenty są bardziej powtarzalne, liczenie sferoid i określanie ich wielkości jest niezbędne do określenia, kiedy należy podzielić kulturę na wiele bioreaktorów, ponieważ liczba struktur 3D w naczyniu może wpływać na rozmiar sferoidów i poziom aktywności metabolicznej. Należy jednak podkreślić, że liczba i rozmiar sferoid zależą od linii komórkowej, początkowej liczby komórek, procesu podziału i czasu pobrania. Szczegóły dotyczące hodowli sferoidalnej HepG2/C3A, takie jak liczba komórek w sferoidach, zawartość białka i wielkość w funkcji wieku, zostały dostarczone przez Fey, Korzeniowska i Wrzesiński25. Aby uzyskać dokładną i skuteczną analizę przy użyciu opisanej tutaj metody półautomatycznej, najważniejszym krokiem jest dobry obraz sferoid. Dla uproszczenia zdjęcie można zrobić telefonem lub tabletem, ale jego rozdzielczość powinna być utrzymana jak najwyższa. Ponieważ obrazy są szybkie do uzyskania, umożliwiają one eksperymenty przesiewowe na dużą skalę w celu wizualizacji określonych cech fenotypowych lub zbadania reakcji na leczenie farmakologiczne. W związku z tym, ze względu na rosnącą liczbę testów opartych na komórkach, w ciągu ostatnich 10 lat opracowano szereg oprogramowania typu open source do analizy obrazu26. W tym protokole opisujemy półautomatyczny system wykorzystujący oprogramowanie FIJI18 do liczenia i mierzenia wielkości sferoid. Przedstawiliśmy skrypty (proste polecenia programistyczne) do zdefiniowania sekwencji operacji algorytmicznych, które można zastosować do zbioru obrazów, dzięki czemu analiza jest łatwym i szybkim procesem. Jednak w zależności od charakterystyki sferoidy należy zastosować pomiar ręczny. Na przykład, jeśli sferoidy są zbyt przezroczyste, pismo FIJI będzie nieprecyzyjne. Nawiasem mówiąc, jednym z najważniejszych kryteriów działania tej metody jest zwartość sferoid. Ta cecha przyczyni się do bardziej wzmocnionego kontrastu kolorów między sferoidami a tłem, co jest niezbędne, aby metoda była dokładna.

Podsumowując, oprócz zaprezentowania metodologii hodowli sferoid o wysokiej odtwarzalności, opisano również półautomatyczny system połączony z charakteryzacją fenotypową za pomocą przechwytywania obrazu i proteomiki. Spodziewamy się, że ten zestaw narzędzi do analizy komórek 3D stanie się bardziej niezawodny dzięki w pełni zautomatyzowanemu oprogramowaniu do analizy obrazu i spektrometrom masowym nowej generacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helle Sedighi Frandsen jest zatrudniona jako pracownik naukowy w firmie CelVivo ApS, produkującej system ClinoStar. Karoline Mikkelsen jest doktorantką przemysłową zatrudnioną w CelVivo ApS i odbywającą studia doktoranckie na SDU w Odense w Danii. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Sidoli z wdzięcznością dziękuje Fundacji Badań nad Białaczką (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (nagroda Sagol Network GerOmics), Deerfield (nagroda Xseed), Relay Therapeutics, Merck, oraz Biuru Dyrektora NIH (1S10OD030286-01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlBio-Rad2239480
strzykawka 10 mlFisher Scientific1481754końcówka Luer lock, wyskalowana do 12 ml
1000 &mikro; L Końcówki do pipet o szerokim otworzeFisher Scientific14222703
200 µ L końcówki do pipet o szerokim otworzeFisher Scientific14222730
96-dołkowa płyta filtracyjna OrochemOrochem OF1100
96-dołkowa płytka przypodłogowaAxygenPCR-96-FS-C
96-dołkowy kolektor próżniowyMilliporeMAVM0960R
Wodorowęglan amonuSigmaA6141-25G
Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEGM)LonzaCC-3170
Woda klasy do hodowli komórkowychCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivoN/ABioreaktor do hodowli komórkowych 3D
Inkubator ClinoStarCelVivoN/AInkubator CO2 do hodowli komórkowych 3D
DTTSigmaD0632-5G
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Elplasia 24-dołkowa okrągłodenna płytka mocująca o bardzo niskim dnie, zawierająca mikrodołkiCorning4441
Surowica bydlęcaFisher ScientificMT35010CV
Kwas mrówkowyThermo28905
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
hEGFCorning354052
HERAcell vios 160iThermo51033557inkubator CO2 do hodowli komórkowych 2D
Acetonitryl klasy HPLCMetanolA955-4
Metanol klasy HPLCFisher ScientificA452-1
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-4
JodoacetamidSigmaI1149-5G
L-glutaminaFisher ScientificMT25015CI
Aminokwasy endogenneFisher ScientificMT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µ m
Orbitrap Fusion Lumos TribridThermoIQLAAEGAAPFADBMBHQSpektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości
Mikroskop PAULALeica
Penicylina-StreptomycynaFisher ScientificMT3002CI
PerkinElmer Victor X2 wieloetykietowy czytnik mikropłytekPerkinElmer
Papier pHHydrion93
FosfoetanolaminaSigmaP0503
Kwas fosforowyFisher ScientificA260-500
Pistolet do pipetEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
Wirówka z chłodzeniemThermo75-217-420
Żywica Reprosil-PurMSWILR13. AQ.003120 & Aring; wielkość porów, faza C18-AQ, 3 μ Rozmiar kulki
M SDSBio-Rad1610301
Trypsyna modyfikowana do sekwencjonowaniaPromegaV511A Koncentrator próżniowy
SpeedVac (płytki 96-dołkowe)Thermo15308325Savant SPD1010
Sterylny kapturThermo1375
Sterylne pipety serologiczneFisher Scientific1367549
S-trapProtifiC02-micro-80
Igła strzykawkowa (18 G)Fisher Scientific14817100długości 3", średnicy 0,05"
Kwas trifluorooctowy (TFA)Thermo28904
Trypsin-EDTAGibco25300-054
KąpielSigma
Fisher Scientific
płodu klasy HPLC Fisher Scientific Spektrometr masowy Waters 186007549 wodna Vortex Z258415 FSGPD10

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
  3. Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
  4. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
  5. Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
  6. Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243(2022).
  7. Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
  8. Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
  9. Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
  10. van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
  11. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  12. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22(2018).
  13. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  14. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
  16. Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606(2022).
  17. Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
  20. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).
  21. Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
  22. Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
  23. Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
  24. Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
  25. Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
  26. Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D Spheroid CulturesClinostat IncubatorHepG2 C3A CellsTHLE 3 CellsProteomics AnalysisSpheroid FormationLC MS ProteomicsImage CaptureCell Viability

Powiązane artykuły