Artykuł metodologiczny

Przerwanie bariery krew-rdzeń kręgowy za pomocą zogniskowanych ultradźwięków o niskiej intensywności w modelu szczurzym

DOI:

10.3791/65113

⸱

10 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 3HEPIUS Innovation Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Electrical Engineering and Computer Science, Johns Hopkins University, 5Department of Mechanical Engineering, Johns Hopkins University, 6Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakłócenie bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) można z powodzeniem osiągnąć poprzez dożylne podawanie mikropęcherzyków i zastosowanie ultradźwięków o niskiej intensywności (LIFU). Protokół ten szczegółowo opisuje otwieranie BSCB za pomocą LIFU w modelu gryzoni, w tym konfigurację sprzętu, wstrzykiwanie mikropęcherzyków, lokalizację celu i wizualizację zakłóceń BSCB.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skoncentrowane ultradźwięki o niskiej intensywności (LIFU) wykorzystują pulsacje ultradźwiękowe o mniejszej intensywności niż ultradźwięki i są testowane jako odwracalna i precyzyjna technologia neuromodulacyjna. Chociaż otwarcie bariery krew-mózg (BBB) za pośrednictwem LIFU zostało szczegółowo zbadane, do tej pory nie ustalono żadnej znormalizowanej techniki otwierania bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB). W związku z tym protokół ten przedstawia metodę skutecznego rozerwania BSCB za pomocą sonikacji LIFU w modelu szczurzym, w tym opisy przygotowania zwierząt, podawania mikropęcherzyków, wyboru i lokalizacji celu, a także wizualizacji i potwierdzenia zakłóceń BSCB. Przedstawione tutaj podejście jest szczególnie przydatne dla badaczy, którzy potrzebują szybkiej i opłacalnej metody testowania i potwierdzania docelowej lokalizacji i precyzyjnego zakłócenia BSCB w małym modelu zwierzęcym za pomocą zogniskowanego przetwornika ultradźwiękowego, oceny skuteczności BSCB parametrów sonikacji lub badania zastosowań LIFU w rdzeniu kręgowym, takich jak dostarczanie leków. immunomodulacja i neuromodulacja. Zaleca się optymalizację tego protokołu do indywidualnego użytku, szczególnie w celu rozwoju przyszłych prac przedklinicznych, klinicznych i translacyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak bariera krew-mózg (BBB), bariera krew-rdzeń kręgowy (BSCB) reguluje ruch krążących substancji rozpuszczonych, komórek i składników osocza do miąższu rdzeniowego1. Ta funkcja ochronna jest wynikiem wyspecjalizowanego systemu ściśle związanych, niefenestrowanych komórek śródbłonka wyściełających naczynia włosowate kręgosłupa2. Zazwyczaj tylko cząsteczki lipofilowe o niskiej masie i ładunku dodatnim mogą przekroczyć obie bariery3. Pomimo badań, które sugerują, że BSCB ma nieco wyższą przepuszczalność niż BBB, obie bariery ograniczają dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego4. Opracowano kilka strategii mających na celu zwiększenie transportu leków przez BSCB, w tym techniki zwiększania ciśnienia osmotycznego w naczyniach włosowatych kręgosłupa, opracowywanie leków, które oddziałują z receptorami bradykininy oraz tworzenie funkcjonalizowanych nanocząstek5.

zakłócenie BSCB można również osiągnąć poprzez dożylne podanie mikropęcherzyków (MBs), a następnie ultradźwięki o niskiej intensywności (LIFU) sonikacja6. Pole akustyczne generowane przez przetwornik ultradźwiękowy powoduje oscylacje MB, które z kolei wywierają nacisk na ścianę śródbłonka i rozluźniają szczelne połączenia7. Ścisłe rozluźnienie połączenia tworzy przejściowe luki w naczyniach włosowatych, umożliwiając terapiom przenikanie do miąższu rdzenia kręgowego (Ryc. 1). Proces ten może również tworzyć otwory przezśródbłonkowe, zwiększać transcytozę i obniżać poziom transporterów kasetowych wiążących ATP, takich jak P-glikoproteina8,9. Kluczową zaletą tej techniki jest możliwość zminimalizowania efektów off-target poprzez skierowanie ogniskowego obszaru sonikacji do interesującego miejsca w rdzeniu kręgowym. W kilku badaniach klinicznych oceniano skuteczność otwarcia BBB za pośrednictwem LIFU w leczeniu patologii ośrodkowego układu nerwowego, w tym glejaków, stwardnienia zanikowego bocznego, choroby Alzheimera i choroby Parkinsona. Chociaż zakłócenia BSCB za pośrednictwem LIFU nie są tak szeroko scharakteryzowane, jak zakłócenia BBB za pośrednictwem LIFU, kilka grup zgłosiło udane zakłócenie BSCB w modelach gryzoni, królików i świń10,11,12. Ogólnie rzecz biorąc, zainteresowanie tą techniką szybko rośnie, zwłaszcza jako realną drogą dostarczania leków.

W tym protokole opisana jest technika zakłócania BSCB za pośrednictwem LIFU w modelu szczurzym. Procedura zawiera szczegółowe opisy przygotowania zwierząt, konfiguracji sprzętu LIFU, podawania MB, lokalizacji docelowej i ekstrakcji rdzenia kręgowego. Potwierdzenie lokalizacji docelowej i zakłócenia BSCB ocenia się poprzez wynaczynienie niebieskiego barwnika Evansa (EBD) do rdzenia kręgowego. EBD jest nietoksycznym związkiem, który wiąże się z albuminą surowicy i można go zidentyfikować po bogatym niebieskim kolorze wizualnym i czerwonej autofluorescencji pod mikroskopem13.

Kroki wymienione tutaj stanowią szybką i tanią alternatywę dla tradycyjnych systemów LIFU sterowanych ultrasonografią (US) lub rezonansem magnetycznym (MR). W rezultacie, metoda ta jest przydatna dla badaczy zainteresowanych szybkim testowaniem i potwierdzaniem możliwości ich przetwornika LIFU w zakresie celowania i zakłócania BSCB przed zakupem dodatkowego sprzętu i materiałów lub realizacją zastosowań LIFU w rdzeniu kręgowym, takich jak dostarczanie leków, immunomodulacja i neuromodulacja.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (IACUC RA20M223). Do niniejszego badania wykorzystano wyłącznie dorosłe samice szczurów rasy Sprague-Dawley (średnia waga: 250 g; wiek: 11 tygodni).

1. Montaż i konfiguracja ultradźwięków o niskiej intensywności

  1. Zaopatrz się w zogniskowany system przetworników ultradźwiękowych o specyfikacjach wystarczających do osiągnięcia otwarcia BSCB u szczurów. Sugerowane parametry z literatury obejmują częstotliwość centralną w zakresie 0,25-4 MHz oraz zdolność do wytwarzania ciśnień szczytowych w zakresie 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Upewnij się, że system zawiera sprzęt sterujący/sterujący, który obejmuje co najmniej generator fal/sygnału, napęd/wzmacniacz mocy o częstotliwości radiowej (RF) i pasującą sieć (Rysunek 2A).
    UWAGA: Opisana tutaj konfiguracja wykorzystuje dostępny na rynku przetwornik wieloelementowy o częstotliwości centralnej 250 kHz i średnicy 64 mm (Rysunek 2B).
  2. Przymocuj wydrukowany w 3D uchwyt sondy i stożek wodny na przetworniku (Rysunek 2C). Upewnij się, że stożek jest wodoszczelny między stożkiem a przetwornikiem.
    UWAGA: Niestandardowy stożek i uchwyt sondy zostały dołączone do przetwornika używanego w tym eksperymencie. Stożek i uchwyt sondy mocują się do przetwornika za pomocą, które również są dołączone.
  3. Wysterylizuj akustycznie przezroczystą membranę poliestrową o grubości 50 μm i przymocuj do dna stożka wodnego za pomocą gumki recepturki.
  4. Napełnij stożek wodny odgazowaną i zdejonizowaną wodą za pomocą rurki wlotowej i wylotowej. Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza wewnątrz stożka, ponieważ mogą one zakłócić sprzężenie akustyczne między przetwornikiem a celem. Membrana poliestrowa powinna być lekko napompowana.
    UWAGA: Aby usunąć pęcherzyki powietrza ze stożka, poprowadź bąbelki do zaworu wylotowego, jednocześnie napełniając stożek wodą przez zawór wlotowy. Jeśli obecnych jest wiele małych pęcherzyków, zamknij wszystkie zawory i obracaj stożek, aż pozostanie jedna duża bańka. Skieruj tę bańkę do zaworu wylotowego i wznów napełnianie stożka.
  5. Podłącz sprzęt sterujący, który obejmuje generator fal i wzmacniacz napędu RF, do przetwornika. przetwornika połączy się ze stroną wyjściową sieci dopasowującej, a generator sygnału/wzmacniacz mocy połączy się ze stroną wejściową sieci dopasowującej. powinny być podłączone do odpowiedniego numeru kanału (Rysunek 2D-G).
    UWAGA: W systemie komercyjnym wykorzystanym w tym badaniu, generator fal i wzmacniacz napędu RF są składnikami wyjściowej mocy przetwornika (TPO) (Rysunek 2D).
  6. Przymocuj uchwyt sondy do ramienia stereotaktycznego. Przymocuj ramię stereotaktyczne do zespołu płytki mocującej. Pozwoli to na precyzyjne ustawienie przetwornika nad gryzoniem podczas sonikacji.

2. Przygotowanie zwierząt i chirurgiczna laminektomia

  1. Znieczulić szczura mieszaniną izofluranu i powietrza medycznego w komorze indukcyjnej przymocowanej do kanistra z filtrem węglowym. Ustaw natężenie przepływu gazu na 400 ml/min, a parownik izofluranu w zakresie 1,5%-2,5% w celu indukcji znieczulenia. Ilość czasu spędzonego w komorze przed całkowitą sedacją jest zmienna, choć zwykle waha się od 3 do 6 minut.
  2. Zapisz wagę szczura pod wpływem środków uspokajających i wykonaj test szczypania palca u nogi. Jeśli w odpowiedzi na szczypnięcie zaobserwuje się szarpnięcie lub ruch, umieść szczura z powrotem w komorze indukcyjnej na dodatkowy 1 minutę i powtórz test szczypania palców. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że szczur jest i pozostaje w pełni znieczulony.
  3. Umieść poduszkę grzewczą i sterylną wkładkę chłonną na płytce mocującej. Umieść szczura na podkładce chłonnej, nałóż maść do oczu i umieść termometr doodbytniczy, aby monitorować temperaturę ciała.
    UWAGA: Podczas trwania zabiegu chirurgicznego należy monitorować temperaturę i tętno szczura (idealnie, tętno powinno wynosić od 330 do 480 uderzeń na minutę, a temperatura od 35,9 do 37,5 °C)18,19. Odpowiednio wyreguluj izofluran lub poduszkę grzewczą, aby zapobiec przedwczesnej śmierci. Poduszkę grzewczą można ustawić na temperaturę około 37 °C i należy ją włączać i wyłączać w razie potrzeby, aby utrzymać optymalną temperaturę ciała.
  4. Zbadaj palpacyjnie ostatnie żebro szczura, które jest przymocowane do kręgosłupa na 13. kręgu piersiowym (T13). Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby zgolić sierść z powierzchni grzbietowej między ostatnim żebrem a szyją. Przetrzyj odsłoniętą skórę gazą zamoczoną w 10% jodopowidonie.
  5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki i przeprowadź sekcję przez powięź, aż zostaną odsłonięte wyrostki kolczyste i blaszka. Usuń kość za pomocą obcęgów do kości z przesuniętym ostrzem i nożyczek do tęczówki z kątowym ostrzem, aż rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty20. Długość laminektomii i nacięcia różni się w zależności od liczby różnych celów, które mają być poddane sonizacji. W tym badaniu wykonano trzypoziomową laminektomię przy użyciu 3 cm nacięcia.
    UWAGA: Unikaj dotykania lub wywierania nacisku na rdzeń kręgowy podczas usuwania kości, aby zapobiec urazom. Jeśli tylne kończyny szczura szarpią się podczas laminektomii, oznacza to, że użyto zbyt dużej siły na rdzeń lub korzenie nerwowe.
  6. Przymocuj szczura do płytki mocującej, zaciskając wyrostki kolczyste przylegające do laminektomii. Lekko pociągnij kręgosłup napięty, aby zminimalizować krzywiznę przed zablokowaniem zacisków.

3. Lokalizacja celu za pomocą naprowadzania laserowego

  1. Dostosuj położenie przetwornika za pomocą ramienia stereotaktycznego, aż znajdzie się dokładnie nad laminektomią (Rysunek 3A). Rama umożliwia ruch w osiach x, y i z, a także obrót o 180° w płaszczyźnie pionowej i obrót o 360° w płaszczyźnie poziomej.
  2. Przymocuj urządzenie laserowe do dna stożka wodnego i opuść je, aż punkt lasera będzie widoczny. Dostosuj boczne położenie przetwornika, aż punkt lasera znajdzie się nad miejscem, które jest celem zakłócenia BSCB ( Rysunek 3B, C).
    UWAGA: Plik projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) dla aparatu laserowego znajduje się w sekcji dodatkowej (Rysunek uzupełniający 1).
  3. Wyjmij aparat laserowy i wypełnij przestrzeń między stożkiem a rdzeniem kręgowym odgazowanym żelem ultradźwiękowym (Rysunek 3D). Aby uzyskać maksymalne sprzężenie, upewnij się, że w żelu nie ma pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: W tym badaniu przetwornik z przymocowanym stożkiem wodnym został opuszczony, aż znajdzie się 1 cm nad przewodem. Ponieważ stożek wodny miał 30 mm długości, całkowita odległość od przetwornika do przewodu wynosiła 40 mm. Stożek wodny umieszczono w odległości 1 cm od rdzenia kręgowego, ponieważ skóra, powięź i mięśnie szczura po obu stronach nacięcia uniemożliwiają bezpośredni kontakt między czubkiem stożka a pępowiną. Używanie liczb na osi y ramienia stereotaktycznego może być pomocne w śledzeniu pionowej odległości, w której stożek znajduje się 1 cm od sznurka, zwłaszcza, że żel utrudni wizualne potwierdzenie odległości stożka od sznurka.
  4. Ustaw parametry sonikacji na TPO. Do osiągnięcia skutecznego zakłócenia BSCB można użyć szeregu wartości. Aby uzyskać maksymalną moc, ustaw częstotliwość sonikacji blisko częstotliwości środkowej przetwornika. Wartości użyte w tym badaniu są wymienione w tabeli 1.
    UWAGA: Wymienione tutaj parametry zostały zaadaptowane z wcześniejszej pracy z LIFU, z częstotliwością środkową 500 kHz, czasem trwania impulsu tonu 500 μs, cyklem pracy 50% i czasami sonikacji 5 lub 10 minut, aby bezpiecznie neuromodulować rdzeń kręgowy gryzoni21. Na podstawie badań, które z powodzeniem doprowadziły do zakłócenia BSCB, inne parametry, które można zastosować, to częstotliwości centralne między 500 kHz-1 MHz, ciśnienia 0,2-2,1 MPa, długości impulsów 10-25 ms i czasy sonikacji 2-5 min6,10,11,22.
szt. pkt. . szt.
parametrwartość
Częstotliwość (kHz)Z kolei 250
Odległość ostrości (mm)Rozdział 40
Szczytowe ciśnienie akustyczne (MPa)0,47
Cykl40 proc
Długość impulsu (ms)400
Okres(y)1
Czas sonikacji (min)5

Tabela 1: Parametry sonikacji używane do zakłócania BSCB.

4. Podawanie mikropęcherzyków

  1. Przygotuj roztwór MB zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Unikaj wprowadzania powietrza do roztworu.
    UWAGA: Pojemniki są kruche i zlepiają się ze sobą w pobliżu górnej części fiolki/strzykawki, jeśli pozostają nieruchome przez kilka minut. Regularnie wstrząsać fiolką i strzykawką, aby zapobiec nierównomiernemu rozproszeniu MB. MB mają krótką żywotność; Zapoznaj się z przewodnikiem producenta, aby określić czas wygaśnięcia.
  2. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej 22 G i przepłukać 0,2 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej (500 j.m./ml)23. Aby zwiększyć szanse na pomyślne cewnikowanie żyły ogonowej, zanurz ogon w ciepłej wodzie i umieść opaskę uciskową u podstawy ogona, aby zwiększyć średnicę żyły.
    UWAGA: Cewnikowanie żył ogonowych można przeprowadzić przed laminektomią, pozycjonowaniem i celowaniem u zwierząt, aby zaoszczędzić czas badania.
  3. Wstrzyknąć 1 ml/kg 3% EBD do cewnika. Przepłukać 0,2 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej. Kończyny i oczy szczura zmienią kolor na niebieski. Potwierdź pomyślne cewnikowanie żyły ogonowej, sprawdzając, czy w żyle grzbietowej kręgosłupa szczura zmieniła się niebieska zmiana koloru (Rysunek 4).
    UWAGA: EBD można wstrzyknąć na długo przed wstrzyknięciem MB i nie będzie to miało wpływu na sonikację. Ponadto, ponieważ Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) obecnie nie zatwierdziła sonikacji z lekami już znajdującymi się w systemie, EBD może być również podawana po sonikacji. Spowoduje to mniejszy wychwyt barwnika, ale może być bardziej istotne klinicznie.
  4. Wstrzyknąć 0,2 ml bolusa MBs do cewnika i przepłukać 0,2 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej. Sonikację należy rozpocząć 1-2 minuty po wstrzyknięciu MBs. Użyta tutaj konfiguracja nie zbiera informacji zwrotnych o sonikacji w czasie rzeczywistym.
    UWAGA: W badaniach dotyczących zaburzeń BSCB zazwyczaj stosuje się wyższe stężenie MB niż wskazane w diagnostyce obrazowej. Niektóre stężenia popularnych marek MB stosowanych do zakłócania BBB i BSCB w modelach szczurzych obejmują 0,02-0,2 ml/kg i 200 μl bolusów10,15,24,25.

5. Ekstrakcja rdzenia kręgowego i przetwarzanie tkanek

  1. Po zakończeniu sonikacji, przekrwić szczura przezsercowo 100 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aż krew będzie całkowicie czysta. Wątroba, która ma bogaty niebieski kolor ze względu na barwnik, powinna wyblaknąć do jasnobrązowo-niebieskiego26.
    UWAGA: Celem perfuzji jest usunięcie nadmiaru krwi z układu naczyniowego rdzenia kręgowego. Ponieważ EBD wiąże się z albuminą, usuwa to również nadmiar EBD. Gwarantuje to, że każda EBD wykryta wizualnie lub za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w rdzeniu kręgowym pochodzi z wynaczynienia barwnika do miąższu rdzeniowego.
  2. Perfuzja przezsercowa ze 100 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA). Kończyny szczura będą drgać podczas tej fiksacji, jeśli zostaną wykonane dokładnie. Ta perfuzja z PFA powoduje eutanazję szczura.
  3. Usunąć rdzeń kręgowy i umieścić go w 4% PFA w temperaturze 4 °C na noc. Następnego dnia zastąp PFA PBS.

6. Wizualizacja zakłóceń BSCB

  1. Odizoluj 2-centymetrowy odcinek otaczający miejsce sonikacji za pomocą żyletki. Podziel sekcję wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza i podziel ją na sekcje o grubości 10 μm za pomocą mikrotomu. W celu wizualizacji w jasnym polu należy zabarwić barwnikiem hematoksylino-eozyny (H&E).
    UWAGA: Próbki rdzenia kręgowego H&E pokazane w tym badaniu były barwione hematoksyliną przez 3 minuty i eozyną przez 1 minutę27.
  2. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej należy odparafinować szkiełka zawierające odcinki rdzenia kręgowego i wybarwić przeciwbarwnie 25 μl 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozpuszczonego w podłożu montażowym (0,5 μg/ml). Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut. Unikaj światła, aby zapobiec wybielaniu.
    UWAGA: Deparafinowanie można zastąpić za pomocą kriostatu w celu uzyskania zamrożonych skrawków.
  3. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobrazować wszystkie szkiełka. Autofluorescencja EBD (wzbudzenie: 470 nm i 540 nm; emisja: 680 nm) jest widoczna w kanale czerwonym, natomiast DAPI jest obecna w kanale niebieskim. Użyj mikroskopu świetlnego, aby zobrazować szkiełka H&E.
    UWAGA: Chociaż protokół ten opisywał procedurę bez przeżycia, została ona również wykonana przy użyciu technik chirurgicznych przetrwania. W przypadku operacji przetrwania należy zdezynfekować skórę przed nacięciem za pomocą 3 naprzemiennych aplikacji jodopowidonu i podać buprenorfinę podskórnie (0,05 mg/kg) przed zabiegiem. Kontynuuj podawanie podskórnej buprenorfiny co 12 godzin przez co najmniej 3 dni po operacji, z dodatkowymi dniami, jeśli szczur wykazuje oznaki bólu. Jeśli dojdzie do urazu rdzenia kręgowego, szczury mogą wykazywać zatrzymanie moczu lub nieprawidłowy chód. Objawia się to przeciąganiem lub opóźnionym ruchem kończyn tylnych lub wyczuwalnymi, rozdętymi pęcherzami. Jeśli tak się stanie, szczury domowe powinny być karmione odżywczo wzbogaconym żelem wodnym do jedzenia i nawadniania oraz ręcznie odciągać pęcherze dwa razy dziennie, aż do odzyskania odruchowego oddawania moczu. Jeśli dojdzie do całkowitego paraliżu tylnych kończyn lub nieuleczalnego bólu, należy poddać szczura eutanazji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł pokazuje, że jednoczesne stosowanie sonikacji LIFU i podawania MB jest skuteczną techniką dla zlokalizowanych zakłóceń BSCB. Na otwarcie BSCB wskazuje obecność wynaczynienia EBD do miąższu rdzeniowego. Zmiany są widoczne zarówno wizualnie, jak i pod mikroskopem fluorescencyjnym. Unaczynienie rdzenia kręgowego jest widoczne po laminektomii i pokazuje tylną żyłę rdzeniową z wieloma mniejszymi naczyniami promieniście rozchodzącymi się promieniście (Ryc. 4A). Dożylne wstrzyknięcie EBD przez cewnik do żyły ogonowej powoduje, że to naczynie krwionośne jest wzbogacone w niebieski barwnik (Ryc. 4B). Jest to dobry punkt w procedurze, aby sprawdzić, czy laminektomia nie spowodowała pęknięcia któregokolwiek z naczyń krwionośnych kręgosłupa, ponieważ spowodowałoby to gromadzenie się niebieskiej krwi nad rdzeniem. Po sonikacji, nad docelowym miejscem powinna stać się widoczna niebieska plamka, wskazująca na wynaczynienie EBD do miąższu białego z powodu zakłócenia BSCB (Rysunek 4C). Wielkość tego miejsca różni się w zależności od wielu czynników, w tym wielkości obszaru ogniskowego przetwornika i czasu po sonikacji. Aby zwiększyć szanse na wynaczynienie EBD, należy wydłużyć czas między sonifikacją a ekstrakcją rdzenia kręgowego.

Chociaż perfuzja PFA nie jest koniecznym krokiem do wykonania przed ekstrakcją pępowiny i późniejszą analizą tkanki, usuwa krew z próbki i zwiększa kontrast między białym miąższem rdzenia kręgowego a obszarami zabarwionymi na niebiesko przez EBD. Wszystkie szczury, które otrzymały podanie MB i sonikację LIFU, wykazują pozorne wynaczynienie EBD do rdzenia kręgowego, podczas gdy grupy kontrolne negatywne, które otrzymały MB i EBD bez sonikacji LIFU, nie wykazują takiego objawu. Reprezentatywne obrazy są pokazane w Rysunek 5. Strzałkowe cięcia w tkankach ujawniają, że wynaczynienie EBD jest nie tylko powierzchowne, ale rozciąga się dobrze do samej pępowiny. Jest to oczekiwane, ponieważ obszar ogniskowy przetwornika użytego w tym badaniu jest większy niż średnica rdzenia kręgowego szczura. Czasami w nacięciach strzałkowych można zobaczyć niewielkie ilości krwotoku. Może to być spowodowane laminektomią lub ultrasonografią. Jeśli krwotok znajduje się blisko grzbietowego obwodu rdzenia, jest to bardziej prawdopodobne z powodu laminektomii.

Aby dokładniej ocenić wynaczynienie EBD, strzałkowe odcinki rdzenia kręgowego zostały zabarwione DAPI (markerem jądrowym) i zobrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie sznury, które otrzymały sonikację LIFU (n = 3) wykazały znacznie większą intensywność autofluorescencji EBD (p = 0,016) niż sznury, które nie otrzymały sonikacji, przy podobnej intensywności DAPI obecnej w obu (Ryc. 6). Analiza H&E nie wykazała ponadto żadnych uszkodzeń neuronów, krwotoku ani zmian w jamie ustnej obecnych w miejscach poddanych sonikacji, co potwierdza bezpieczeństwo tej procedury. Przykłady uszkodzonych rdzeni w wyniku niewłaściwej obsługi chirurgicznej i sonikacji o dużej mocy są pokazane jako porównanie. Krwotok, uszkodzenie tkanek, zmiany w jamie ustnej i możliwa wakuolizacja są oznaczone. Chociaż przykład sonikacji o dużej mocy nie wykazuje krwotoku, został on również zgłoszony jako efekt zakłócenia ultradźwięków.

Ponadto, przeprowadzono analizę behawioralną na szczurach, które otrzymały sonikację MBs, EBD i LIFU. Chociaż metoda ta nie wyklucza całkowicie uszkodzenia tkanek, sprawdza, czy w wyniku tej procedury wystąpiły deficyty motoryczne. Szczury chodziły w klatce przez 5 minut każdego dnia przez okres 5 dni, a funkcje lokomotoryczne oceniano na podstawie skali lokomotorycznej Basso Beattie Bresnahan (Supplemental Video File 1). Wszystkie szczury (n = 5) otrzymały najwyższy wynik przed sonikacją, po sonikacji i każdego dnia okresu przeżycia (Ryc. 7).

Na koniec, efekty termiczne parametrów sonikacji użytych w tym badaniu zostały zmierzone przy użyciu dwóch próbek rdzenia kręgowego szczurów ex vivo i cyfrowej sondy termometru z cienką końcówką włożoną do rdzenia. Temperatura próbek rdzenia kręgowego była śledzona przez 5 minut przed, w trakcie i po sonikacji, w sumie przez 15 minut. Zaobserwowano minimalne zmiany temperatury. W rzeczywistości w obu próbkach nastąpiła zmiana ≤1,3 °C spowodowana sonikacją, zmniejszając prawdopodobieństwo uszkodzenia hipertermicznego w wyniku sonikacji (Rysunek 8).

figure-results-1
Rysunek 1: Mechanizm otwierania bariery krew-rdzeń kręgowy za pośrednictwem ultradźwięków o niskiej intensywności. (A) Schematyczny przegląd ultradźwięków o niskiej intensywności (LIFU) sonikacji rdzenia kręgowego szczura. (B) Mechanizm otwierania bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) poprzez sonikację LIFU dożylnych mikropęcherzyków (MB). MB oscylują w odpowiedzi na LIFU, powodując poszerzenie ścisłych połączeń między komórkami śródbłonka. To zakłócenie BSCB pozwala na wynaczynienie nanocząstek, leków terapeutycznych lub niebieskiego barwnika Evansa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja i łączność z ultrasonografem o niskiej intensywności. (A) Schematyczne przedstawienie przedstawiające typowe zogniskowane składowe ultradźwiękowe. (B) Obraz poglądowy zogniskowanej konfiguracji ultradźwiękowej, w tym: 1. moc wyjściowa przetwornika (TPO), 2. pasująca sieć, 3. Przetwornik LIFU, 4. instrument stereotaktyczny, 5. Zaciski mobilne. (C) Przetwornik, w tym: 1. uchwyt sondy, 2. przetwornik pierścieniowy, 3. stożek wodny, 4. rurka doprowadzająca wodę, 5. rurka odprowadzająca wodę, 6. membrana zabezpieczona gumką. (D) Przód TPO, w tym: 1. Obudowa ekranowana RF, 2. dotykowy panel wyświetlacza przedniego z regulowanym menu, 3. pokrętło obrotowe do regulacji parametrów, 4. przełącznik wyjścia start / stop. (E) Tył TPO, w tym: 1. złącza wyjściowe kanału, 2. masa, 3. port wejściowy USB do sterowania oprogramowaniem, 4. wyzwalacz wewnętrzny, 5. złącze wyjściowe synchronizacji, 6. gniazdo wejściowe zasilania i zasilanie, 7. włącznik / wyłącznik zasilania. (F) Dopasowywanie wyjścia sieciowego, z przewodami pasującymi do numerów kanałów. (G) Pasujące wejście XDR sieci, z przewodami pasującymi do numerów kanałów Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Lokalizacja celu za pomocą laserowego naprowadzania. (A) Stereotaktyczne ramię z zakresem ruchu we wszystkich trzech osiach i możliwością obrotu. Jest on przymocowany do poniższej płytki mocującej. (B) Aparatura laserowa do identyfikacji strefy ogniskowej. Laser jest umieszczony na końcówce przetwornika i znajduje się w jednej linii z obszarem ogniskowej. (C) Ilustracja przedstawiająca laser na odsłoniętym rdzeniu kręgowym, wskazująca, że obszar ogniskowy przetwornika jest teraz skierowany w to miejsce. (D) Przetwornik jest opuszczany, aż końcówka stożka znajdzie się 1 cm nad sznurkiem, a szczelina zostanie wypełniona żelem, aby zapewnić maksymalne sprzężenie. Odległość od przetwornika do rdzenia kręgowego wynosi 40 mm (odległość ogniskowa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wynaczynienie niebieskim barwnikiem Evansa w rdzeniu kręgowym po sonikacji. (A) Zdjęcie nacięcia laminektomii u szczura T9-T11, z wyraźnie widocznym odsłoniętym rdzeniem kręgowym i tylną żyłą grzbietową. (B) Otaczająca tkanka i unaczynienie rdzenia kręgowego stają się niebieskie po dożylnym wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa (EBD). (C) Wynaczynienie EBD do miąższu rdzenia kręgowego w miejscu sonikacji, wskazujące na zaburzenie BSCB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ekstrakcja rdzenia kręgowego i wizualizacja otwarcia BSCB po perfuzji. (A) Wycięty rdzeń kręgowy od szczura kontrolnego bez leczenia LIFU. Ten szczur otrzymał tylko MB i EBD. Środkowy strzałkowy wycinek sznura zanurzony w parafinie jest pokazany we wstawce i nie widać wynaczynienia EBD. (B) Wycięty rdzeń kręgowy od szczura za pomocą LIFU. Szczur ten otrzymał również MB i EBD. Kolumna wynaczynienia EBD jest widoczna i zlokalizowana w obszarze sonikowanym. Środkowy strzałkowy wycinek sznura zanurzonego w parafinie jest pokazany we wstawce, ze strzałką wskazującą stężenie EBD widoczne wewnątrz sonikowanego miejsca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wykrywanie i ocena otwarcia BSCB. (A) Rdzeń kręgowy zabarwiony DAPI (marker jądrowy, niebieski). Widoczna jest minimalna autofluorescencja EBD (czerwona). Ten szczur nie otrzymał LIFU. (B) Rdzeń kręgowy poplamiony DAPI (marker jądrowy, niebieski). Widoczna jest zlokalizowana autofluorescencja EBD (czerwona) w miejscu docelowym sonikowanym. Szczur ten otrzymał LIFU i MBs. (C) Rdzeń kręgowy szczura bez LIFU wybarwiony hematoksyliną (barwienie kwasem nukleinowym) i eozyną (niespecyficzne barwienie białka) (H&E). Nie widać uszkodzeń neuronów, krwotoków ani zmian w jamie ustnej. (D) Rdzeń kręgowy szczura z LIFU zabarwiony H&E. Nie widać uszkodzeń neuronów, krwotoku ani zmian w jamie ustnej. (E) Rdzeń kręgowy szczura z urazem chirurgicznym poplamionym H&E. Strzałki wskazują na obfity krwotok i uszkodzenie tkanek. (F) Rdzeń kręgowy szczura z uszkodzeniem w wyniku sonikacji o dużej mocy zabarwiony H&E. Strzałki wskazują na zmiany w jamie, a wstawka pokazuje możliwą wakuolizację. (G) Wykresy słupkowe przedstawiające intensywność DAPI i EBD w rdzeniu kręgowym szczurów z sonikacją LIFU i bez niej. Intensywność EBD występuje znacznie większa w rdzeniu kręgowym LIFU w porównaniu z kontrolą ujemną (p = 0,016), pomimo podobnej intensywności DAPI (p > 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Test behawioralny przed i po sonikacji. (A) Konfiguracja aparatury Basso, Beattie, Bresnahan, w której zarejestrowano szczury chodzące przez 5 minut od dołu. (B) Nieruchomy obraz z nagranego filmu. Ten film został wykorzystany do oceny koordynacji ruchowej i chodu szczura w skali Basso, Beattie, Bresnahan. (C) Wykres skrzynkowy (n = 5) nie wykazujący zmian w wynikach motorycznych przed sonikacją, po sonikacji lub podczas 5-dniowego okresu przeżycia u szczurów, które otrzymały leczenie MB i LIFU (p > 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Analiza temperatury przy użyciu rdzenia kręgowego ex vivo. Wykres przedstawiający zmiany temperatury w dwóch próbkach rdzenia kręgowego ex vivo w ciągu 5 minut przed sonikacją, w jej trakcie i po sonikacji. Parametry stosowane do sonikacji są wymienione w tabeli 1. Dla próbki 1 średnie temperatury przed, w trakcie i po sonikacji wynosiły odpowiednio 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C oraz 22,0 °C ± 0,1 °C. Dla próbki 2 temperatury przed, w trakcie i po sonikacji wynosiły odpowiednio 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C i 22,4 °C ± 0,2 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Plik CAD laserowego aparatu do celowania. (A) Widok aparatu laserowego od dołu. Każdy laser można umieścić w centralnym otworze pośrodku. (B) Widok boczny aparatu laserowego. (C) Wymiary aparatu laserowego, z jednostkami w calach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik wideo 1: Film przedstawiający szczura chodzącego w aparacie Basso, Beattie, Bresnahan. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano sprzęt i kroki wymagane do skutecznego i ukierunkowanego zakłócenia BSCB przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków o niskiej intensywności (LIFU) w połączeniu z podawaniem mikropęcherzyków (MB). Protokół ten jest elastyczny i może być zoptymalizowany do indywidualnego użytku z przetwornikami o różnych specyfikacjach. Inne techniki zakłócania BSCB za pośrednictwem LIFU opierają się na wykorzystaniu systemów obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) do lokalizacji docelowej, co jest kosztownym zasobem16. Zalety przedstawionej tutaj techniki polegają na szybkim wizualnym potwierdzeniu w czasie rzeczywistym zakłóceń BSCB oraz łatwości celowania ze względu na otwarty charakter procedury. Ponadto urządzenie laserowe jest proste w obsłudze i konstrukcji, a plik CAD znajduje się w sekcji dodatkowej. W rezultacie, naukowcy zainteresowani przeprowadzeniem wstępnych testów możliwości celowania ich przetwornika LIFU na małym modelu zwierzęcym mogą wykorzystać ten protokół jako narzędzie do szybkiego potwierdzenia położenia strefy ogniskowej w miejscu zainteresowania. Technika ta może być również stosowana przez laboratoria rozpoczynające badania klinicznych zastosowań LIFU, takich jak dostarczanie leków, przed zainwestowaniem w bardziej złożone metody naprowadzania, takie jak systemy US lub MR. Obecnie metody stosowane w Stanach Zjednoczonych stanowią bardziej obiecującą i opłacalną ścieżkę w porównaniu z systemami MR, chociaż te ostatnie są częściej spotykane w literaturze.

W tej procedurze jest kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać, aby zapewnić pomyślne zakłócenie BSCB. Konieczne jest unikanie wywierania niepotrzebnego nacisku na rdzeń kręgowy podczas laminektomii chirurgicznej. Zbyt duża fizyczna manipulacja przewodem zwiększa prawdopodobieństwo uszkodzenia BSCB. Uszkodzenie pojawia się jako ciemnobrązowa plama wewnątrz pępowiny po ekstrakcji z powodu krwotoku i zwiększonego wynaczynienia EBD. Ponadto należy zapewnić maksymalne sprzężenie między przetwornikiem a odsłoniętym rdzeniem kręgowym. W związku z tym należy zadbać o usunięcie pęcherzyków z stożka wodnego i żelu ultradźwiękowego. Między dnem stożka wodnego a przewodem nie powinno być żadnych szczelin, aby zapewnić pełną transmisję fali akustycznej. Podczas cewnikowania żyły ogonowej należy unikać przypadkowego przepuszczenia powietrza wraz z roztworami soli fizjologicznej heparynizowanej, EBD lub MB. Wstrzyknięcie powietrza znacznie zwiększa ryzyko wystąpienia zatorowości płucnej, która prowadzi do śmierci gryzoni przed zakończeniem zabiegu28.

Częstym problemem, który może wystąpić podczas tej procedury, jest niepowodzenie udanego wstrzyknięcia EBD. W przypadku osób z minimalnym doświadczeniem w cewnikowaniu żył ogonowych, wykonanie tego kroku przed laminektomią, pozycjonowaniem lub celowaniem u zwierząt pozwoli zaoszczędzić czas. EBD można również wstrzykiwać na długo przed wstrzyknięciem MB bez wpływu na sonikację. Korzystanie z opaski uciskowej i kąpieli w ciepłej wodzie sugerowanych w tym protokole pomoże rozszerzyć żyły ogonowe i zwiększyć wskaźnik sukcesu. Ponadto odwodnienie szczurów zmniejsza prawdopodobieństwo prawidłowego umieszczenia cewnika. Pomocne może być dootrzewnowe wstrzyknięcie soli fizjologicznej na 10-15 minut przed cewnikowaniem żyły ogonowej. Podczas cewnikowania należy rozpocząć 2 powyżej końca ogona i poruszać się w kierunku ogonowym do czaszki. Poruszanie się w przeciwnym kierunku zmniejsza prawdopodobieństwo sukcesu z powodu potencjalnego zapadnięcia się żyły lub krwotoku.

Innym częstym wyzwaniem jest brak wynaczynienia EBD pomimo sonikacji. Może to wskazywać, że parametry używane do sonikacji są niewystarczające do zakłócenia BSCB. Na przykład, jeśli częstotliwość sonikacji jest ustawiona na wartość, która znacznie różni się od częstotliwości centralnej przetwornika, moc sonikacji będzie zbyt niska, aby oscylować MB i spowodować poluzowanie ścisłego złącza. Ponadto, im więcej interfejsów między przetwornikiem a przewodem (np. stożek wodny, membrana, żel, pęcherzyki powietrza w wodzie/żelu), tym niższa będzie rzeczywista intensywność sonikacji w celu. Zminimalizowanie tych granic obecności, na przykład poprzez użycie odgazowanego żelu i dokładne usunięcie pęcherzyków wewnątrz stożka, pomoże w przekazaniu pełnego potencjału sonikacji. Protokół zachęca również do wydłużenia czasu między sonikacją a perfuzją, aby dać więcej czasu na wynaczynienie EBD do miąższu rdzeniowego. Chociaż zakłócenie BSCB jest procedurą przejściową, przerwy są obecne przez kilka godzin przed zamknięciem. Długi czas oczekiwania zwiększa ekspozycję na izofluran, ale powoduje również większe wynaczynienie EBD w pępowinie. Alternatywnie, wynaczynienie EBD może być obecne pomimo braku sonikacji za pomocą LIFU. Aby rozwiązać ten problem, należy zachować ostrożność podczas laminektomii, aby zapobiec przypadkowemu uszkodzeniu BSCB. Potencjalne rozwiązania obejmują podnoszenie kręgosłupa szczura podczas zaciskania w celu zwiększenia ilości przestrzeni między blaszkami a pępowiną, a także krótszą laminektomię. Dokładna perfuzja PFA zmniejsza również barwienie tła poprzez usuwanie krwi wzbogaconej w EBD z naczyń krwionośnych w rdzeniu kręgowym. Podczas perfuzji przezsercowej należy zachować ostrożność, aby zapobiec przypadkowemu pęknięciu serca, co może skutkować wyciekiem PBS lub PFA.

Ważne jest, aby zauważyć, że badanie to reprezentuje pojedyncze doświadczenie w zakresie zakłóceń BSCB za pośrednictwem LIFU. Ponadto protokół ten nie testuje ani nie optymalizuje różnych parametrów energii sonikacji i stężeń MB. W rezultacie, naukowcy są zachęcani do badania różnych parametrów i stężeń podczas wykonywania tej techniki w celu optymalizacji docelowej lokalizacji i zakłóceń BSCB dla ich konkretnych potrzeb badawczych, zwłaszcza jeśli początkowe wyniki wywołują jakiekolwiek niekorzystne skutki. Grupy, które chciałyby, aby na przykład nie zaszły żadne zmiany temperatury, mogą testować różne parametry, aż znajdą zestaw, który spełnia to kryterium i osiągnie wystarczające zakłócenie BSCB. Ponadto można przeprowadzić dodatkowe eksperymenty, aby potwierdzić bezpieczeństwo tej techniki. Na przykład można zwiększyć wielkość próby, wydłużyć okres przeżycia i przeprowadzić badania elektromiograficzne/analizę chodu. W przypadku dłuższych przeżyć należy pamiętać, że niektóre badania pokazują, że wysokie dawki EBD mogą czasami powodować przewlekłą toksyczność ogólnoustrojową, dlatego rozsądne może być stosowanie niższej dawki29.

Innym ograniczeniem tej procedury jest inwazyjny charakter laminektomii (która jest wymagana w przypadku każdej techniki, która wykorzystuje LIFU do otwierania BSCB, ponieważ ultradźwięki nie mogą przenikać przez kość). Inwazyjny charakter tej procedury można zmniejszyć, ograniczając długość laminektomii. Wykonanie laminektomii w górnych kręgach piersiowych, które są krótsze i cieńsze, może skrócić czas potrzebny na laminektomię do mniej niż 10 minut. Ze względu na delikatną naturę MBs, a także ich krótki okres półtrwania, czas jest ograniczony podczas tego protokołu. Wstrzyknięcie MB powinno nastąpić 1-2 minuty przed leczeniem LIFU, a nowe MB należy podawać przed każdą sonikacją, jeśli wykonuje się wiele zabiegów LIFU. W przypadku eksperymentów obejmujących zakłócenie BSCB u wielu szczurów może być konieczne przygotowanie kilku fiolek MB. Ponieważ mikropęcherzyki są drogie, preferowana jest zmiana przebiegu chirurgicznego w celu zminimalizowania czasu między sonikacjami w celu zaoszczędzenia liczby używanych MB.

Opisana tutaj technika jest przeznaczona przede wszystkim do użytku jako protokół badawczy. Chociaż laserowy aparat celowniczy nie zastąpi tradycyjnych metod celowania we wszystkich warunkach klinicznych, może być przydatny w innych sytuacjach. W przypadku operacji nieinwazyjnych tradycyjne metody MRI mogą być niezawodnie stosowane do celowaniaw 30. W przypadku operacji inwazyjnych, które obejmują wykonanie laminektomii, laserowy aparat punktowy opisany w tym protokole może być użyty do szybkiej lokalizacji środka ogniskowej strefy sonikacji w określonym regionie (na przykład guzie lub miejscu urazu rdzenia kręgowego) w celu dostarczania leków lub terapii immunomodulującej, jednocześnie uzupełniając wszelkie wskazówki MR, które miałyby miejsce.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje skuteczną i skuteczną technikę zakłócania BSCB i zawiera kilka opcji potwierdzenia otwarcia BSCB, zarówno w czasie rzeczywistym, jak i po przetwarzaniu. Ponieważ BSCB funkcjonuje jako bariera wejścia do miąższu rdzenia kręgowego, przerwanie BSCB jest możliwą metodą poprawy dostarczania leków. Na przykład Weber-Adrian i wsp. użyli LIFU o częstotliwości 1,114 MHz i długości impulsu 10 ms, aby pośredniczyć w dostarczaniu genów do odcinka szyjnegokręgosłupa 6. Podobnie Smith i wsp. wykazali, że LIFU o częstotliwości 580 kHz, średnim szczytowym ciśnieniu akustycznym około 0,46 MPa i długości wybuchu 10 ms może pomóc w dostarczeniu przeciwciała monoklonalnego, trastuzumabu, do rdzenia kręgowego w modelu przerzutów leptomeningealnych u gryzoni10. Większość badań koncentrowała się na wykorzystaniu LIFU, zamiast HIFU, ze względu na zdolność LIFU do przejściowej przepuszczalności BSCB przy jednoczesnym unikaniu uszkodzenia tkanki leżącej pod spodem. Zazwyczaj LIFU używa intensywności w zakresie 0,125-3 W/cm2, podczas gdy HIFU używa intensywności od 100 do 10 000 W/cm2 lub wyższej31. W rezultacie, HIFU wywiera swoje działanie przede wszystkim poprzez ogrzewanie tkanki, podczas gdy LIFU, przy jednoczesnym podawaniu MBs, działa poprzez efekty kawitacji mechanicznej. Jednoczesne podawanie leków z MB może skutkować większym wynaczynieniem leku do miąższu rdzenia kręgowego, a także możliwością obciążenia MB lekiem i lizy MB za pomocą ultradźwięków w celu celowanego dostarczania leku.

Parametry sonikacji, stężenie MB i typ przetwornika użytego w tym badaniu mogą być zmieniane w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Na przykład przetwornik o mniejszym obszarze ogniskowym może być preferowany do eksperymentów, w których potrzebna jest większa kontrola nad miejscowym celowaniem, podczas gdy przetwornik o większej mocy może być używany do eksperymentów, które wymagają silnych zakłóceń w krótszym czasie. Ze względu na elastyczność oferowaną przez ten protokół, istnieje ogromny potencjał do wykorzystania w badaniach przedklinicznych, klinicznych i translacyjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów. Amir Manbachi uczy i konsultuje dla BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical i jest wynalazcą wielu zgłoszonych do opatentowania technologii FUS. Betty Tyler ma fundusze na badania z NIH i jest współwłaścicielką Accelerating Combination Therapies (w tym akcji lub opcji). Ashvattha Therapeutics Inc. uzyskała również licencję na jeden z jej patentów i jest udziałowcem Peabody Pharmaceuticals. Nicholas Theodore otrzymuje tantiemy od Globus Medical i posiada w nim udziały. Jest konsultantem Globus Medical i zasiadał w naukowej radzie doradczej/innym biurze Globus Medical. Pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obsługiwane przez T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 oraz R01 HL071568-15 (N.V.T.); Program stypendialny Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars (KL2) (AM). Kilka figur stworzonych za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% heparynizowany chlorek soduBaxterFKB0953GPłukać cewnik do żył ogonowych heparynizowaną solą fizjologiczną, aby zapobiec krzepnięciu.
100 ml strzykawka z końcówką Luer Lock (2)Wilburn MedicalWUSA/120Jedna strzykawka może być używana do wstrzykiwania PBS i jedna do PFA (podczas perfuzji przezsercowej)
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Scientific 10010001Do perfuzji przezsercowej.
Cewnik 22 GMed Vet International50-209-1694Służy do umieszczania cewnika do żyły ogonowej.
97% IsofluraneThermo Scientific Chemicals247-897-7Podczas gdy szczur jest pod wpływem izofluranu, należy uważać, aby nie podać go zbyt dużo. Wysoka dawka może spowodować eutanazję szczura.
Betadine 7,5%Purdue Products4677
Fiolka ze szkła z przezroczystym gwintem klasy AFisherbrand14-955-314Służy do przechowywania ekstrakcji rdzenia kręgowego.
Cyfrowa wagaKent ScientificSCL-4000
Elektryczna maszynka do goleniaWahl Home Products79449-200Golenie sierści ze skóry w miejscu nacięcia przed zabiegiem
Eozyna-Y z floksynąEpredia71304
Niebieski barwnik EvansMP Biomedicals02151108-CFChociaż jest nietoksyczny, zabarwi skórę na niebiesko, jeśli dojdzie do bezpośredniego kontaktu.
Zespół płyty mocującej z kleszczami 0,5 mmPSI Impactors7001-2Przymocuj ramię stereotaktyczne do tej ramy
Gaza Fisherbrand13-761-52 
Poduszka grzewcza Kent ScientificRT-0515
HematoxylinEpredia7211
Nożyczki do irysa z kątowymi ostrzamiProDentUSA12-15315
System indukcyjny izofluranu   Kent ScientificSOMNO-RATKIT
Laserowy aparat do celowaniaNAniestandardowyplik projektowy CAD dostarczony w sekcji uzupełniającej. Wystarczy umieścić laser wewnątrz aparatu utworzonego z pliku. 
Maść nawilżająca do oczuSystaneN/A
Luer Lock 3-drogowy kranSigmaSAS7521-10EAMoże służyć do napełniania stożka wodnego przez zawór wlotowy
Zestaw mikropęcherzyków LumasonBracco0270-7099-16
Szkło osłonowe mikroskopuFisherbrand12-545J
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-15 
MikrotomEpredia23-900-671 
Podłoże montażowe z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)Vector LaboratoriesH-2000-2
Membrana MylarChemplex3016Może przyciąć membranę do odpowiedniego rozmiaru, jeśli jest zbyt duża dla stożka
Przetwornik NeuroFUS 2,52" o średnicy 250 kHzSonic ConceptsCTX-250zawiera niestandardowy stożek wodny i uchwyt sondy
System NeuroFUS PRO v2.0Sonic ConceptsNFS102v2Zawiera moc wyjściową przetwornika, pasującą sieć i powiązane
Offsetowe szczypce do kościNarzędzia do nauki precyzyjnej16101-10Służy do usuwania wyrostków kolczystych i blaszek do laminektomii
Parafina Polysciences24364-1 Można umieścić próbkę rdzenia kręgowego w parafinie, aby pokroić ją na cienkie sekcje w celu badania histologicznego.
Paraformaldehyd (4%)Thermo Scientific J61899-AKDo perfuzji przezsercowej.
Zestaw chirurgiczny dla szczurówKent ScientificINSRATKITSkłada się z pęsety #5, uchwytu na igłę, nożyczek McPherson-Vannas, nożyczek do irysowania, samozabezpieczających się retraktorów ALM, kleszczyków do tęczówki i sondy. Produkty te powinny być wystarczające do wykonania laminektomii.
ŻyletkaFisherbrand12-640Służy do przycinania ekstrakcji rdzenia kręgowego na pożądaną długość i dzielenia sekcji wzdłuż linii środkowej.
Termometr doodbytniczyKent ScientificRET-2Utrzymuj temperaturę szczura w zakresie od 35,9 do 35,9; 37,5 & C
Gumowa opaskaFisherbrand50-205-1983
Waporyzator dla jednego zwierzęciaKent ScientificSF-01
Ramię stereotaktyczneKopf InstrumentsModel 963
Sterylna wkładka chłonnaMcKesson4033-CS150Umieść pod szczurem i powyżej poduszki grzewczej i płytki mocującej przed laminektomią
Żel ultradźwiękowyAquasonicPLI 01-34Upewnij się, że żel jest wolny od pęcherzyków powietrza, najlepiej jak potrafisz.
System przetworników

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopra, N., et al. Blood-spinal cord barrier: Its role in spinal disorders and emerging therapeutic strategies. NeuroSci. 3 (1), 1-27 (2021).
  2. Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M. The blood-spinal cord barrier: morphology and clinical implications. Annals of Neurology. 70 (2), 194-206 (2011).
  3. Hersh, A. M., Alomari, S., Tyler, B. M. Crossing the blood-brain barrier: Advances in nanoparticle technology for drug delivery in neuro-oncology. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4153(2022).
  4. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain and blood-spinal cord barriers to interferons. Journal of Neuroimmunology. 76 (1-2), 105-111 (1997).
  5. Bellettato, C. M., Scarpa, M. Possible strategies to cross the blood-brain barrier. Italian Journal of Pediatrics. 44, 131(2018).
  6. Weber-Adrian, D., et al. Gene delivery to the spinal cord using MRI-guided focused ultrasound. Gene Therapy. 22 (7), 568-577 (2015).
  7. Hersh, A. M., et al. Applications of focused ultrasound for the treatment of glioblastoma: A new frontier. Cancers. 14 (19), 4920(2022).
  8. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
  9. Cho, H., et al. Localized down-regulation of P-glycoprotein by focused ultrasound and microbubbles induced blood-brain barrier disruption in rat brain. Scientific Reports. 6, 31201(2016).
  10. Smith, P., Ogrodnik, N., Satkunarajah, J., O'Reilly, M. A. Characterization of ultrasound-mediated delivery of trastuzumab to normal and pathologic spinal cord tissue. Scientific Reports. 11 (1), 4412(2021).
  11. Montero, A. S., et al. Ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2417-2426 (2019).
  12. Fletcher, S. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
  13. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. BioTechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  14. Fletcher, S. P., Choi, M., Ramesh, R., O'Reilly, M. A. Focused ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening using short-burst phase-keying exposures in rats: A parameter study. Ultrasound in Medicine & Biology. 47 (7), 1747-1760 (2021).
  15. Cross, C. G., et al. Technical note: Quantification of blood-spinal cord barrier permeability after application of magnetic resonance-guided focused ultrasound in spinal cord injury. Medical Physics. 48 (8), 4395-4401 (2021).
  16. Hong, Y. R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Scientific Reports. 12 (1), 3636(2021).
  17. Liao, Y. H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the L4-L5 sections of rats following spinal cord injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 882127(2022).
  18. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
  19. Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
  20. Lin, X. J., et al. Spinal cord lateral hemisection and asymmetric behavioral assessments in adult rats. Journal of Visualized Experiments. (157), e57126(2020).
  21. Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. , (2023).
  22. Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regeneration Research. 12 (12), 2045-2049 (2017).
  23. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. Journal of Visualized Experiments. (146), e59295(2019).
  24. Sabbagh, A., et al. Opening of the blood-brain barrier using low-intensity pulsed ultrasound enhances responses to immunotherapy in preclinical glioma models. Clinical Cancer Research. 27 (15), 4325-4337 (2021).
  25. Dréan, A., et al. Temporary blood-brain barrier disruption by low intensity pulsed ultrasound increases carboplatin delivery and efficacy in preclinical models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 144 (1), 33-41 (2019).
  26. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  27. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  28. Yamamoto, H., Imai, S., Okuyama, T., Tsubura, Y. Pulmonary lesions in rats caused by intravenous injection. Acta Pathologica Japonica. 32 (5), 741-747 (1982).
  29. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultrad wi ki o niskiej intensywno cirozrywanie BSCBpodawanie mikrop cherzyk wdostarczanie lek w do rdzenia kr gowegomikroskopia fluorescencyjnaprocedura laminektomiibarwnik b kit ewansa

Powiązane artykuły