Artykuł metodologiczny

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

DOI:

10.3791/65134

⸱

19 maja 2023

 ,  , 
1Graduate School of Medicine, Yamaguchi University, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Neurotherapeutics, Yamaguchi University of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja bariery krew-mózg (BBB) jest patologicznym znakiem rozpoznawczym wielu chorób neurodegeneracyjnych i neurozapalnych wpływających na ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Ze względu na ograniczony dostęp do próbek BBB związanych z chorobą, nadal nie wiadomo dokładnie, czy nieprawidłowe funkcjonowanie bariery krew-mózg jest przyczyną rozwoju choroby, czy raczej konsekwencją procesu neurozapalnego lub neurodegeneracyjnego. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) stanowią zatem nową okazję do stworzenia modeli BBB in vitro od zdrowych dawców i pacjentów, a tym samym do zbadania specyficznych dla choroby cech bariery krew-mózg u poszczególnych pacjentów. Ustalono kilka protokołów różnicowania w celu uzyskania komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC) z hiPSC. Rozważenie konkretnego pytania badawczego jest niezbędne do prawidłowego wyboru odpowiedniego protokołu różnicowania BMEC. W tym miejscu opisujemy metodę rozszerzonej hodowli komórek śródbłonka (EECM), która jest zoptymalizowana pod kątem różnicowania hiPSC w komórki podobne do BMEC o dojrzałym fenotypie immunologicznym, co pozwala na badanie interakcji komórka odpornościowa - BBB. W tym protokole hiPSC są najpierw różnicowane w śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) poprzez aktywację sygnalizacji Wnt / β-kateniny. Otrzymana hodowla, która zawiera komórki przypominające mięśnie gładkie (SMLC), jest następnie sekwencyjnie pasażowana w celu zwiększenia czystości komórek śródbłonka (EC) i wywołania właściwości specyficznych dla bariery krew-mózg. Jednoczesna hodowla EECM-BMEC z tymi SMLC lub kondycjonowaną pożywką z SMLC pozwala na odtwarzalną, konstytutywną i regulowaną cytokiną ekspresję cząsteczek adhezyjnych EC. Co ważne, komórki podobne do EECM-BMEC mają właściwości barierowe porównywalne z pierwotnymi ludzkimi BMEC, a ze względu na ekspresję wszystkich cząsteczek adhezyjnych EC, komórki podobne do EECM-BMEC różnią się od innych modeli BBB pochodzących z hiPSC in vitro. Komórki podobne do EECM-BMEC są zatem modelem z wyboru do badania potencjalnego wpływu procesów chorobowych na poziomie bariery krew-mózg, z wpływem na interakcję komórek odpornościowych w spersonalizowany sposób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) w centralnym układzie nerwowym (OUN) składa się z wysoce wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego (ECs), perycytów osadzonych w błonie podstawnej śródbłonka, jak również błony podstawnej miąższu i stóp końcowych astrocytów1. W obrębie NVU komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są kluczowymi elementami tworzącymi barierę krew-mózg (BBB). BMEC tworzą złożone i ciągłe połączenia ścisłe i mają wyjątkowo niską aktywność pinocytotyczną w porównaniu z mikronaczyniowymi EC w narządach obwodowych, co pozwala BBB hamować wolną parakomórkową dyfuzję cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie do OUN. Ekspresja specyficznych transporterów napływu i pomp odpływowych przez BMEC zapewnia pobieranie i eksport składników odżywczych i szkodliwych cząsteczek, odpowiednio, z klasy CNS2. Ponadto bariera krew-mózg ściśle kontroluje wnikanie komórek odpornościowych do OUN poprzez ekspresję niskich poziomów cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, kluczowych dla transportu komórek odpornościowych do CNS3. W warunkach fizjologicznych poziomy ekspresji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni BMEC, takich jak cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezji komórek naczyniowych-1 (VCAM-1), są niskie, ale poziomy te wzrastają w niektórych zaburzeniach neurologicznych2. Rozkład morfologiczny i funkcjonalny bariery krew-mózg występuje w wielu chorobach neurologicznych, takich jak udar mózgu4, stwardnienie rozsiane (MS)5 i kilka chorób neurodegeneracyjnych6,7,8. Szczegółowe badania charakterystyki komórkowej i molekularnej BMEC zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych są podejściem do identyfikacji nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na barierę krew-mózg.

Do niedawna do badania BBB używano podstawowych lub nieśmiertelnych BMEC ludzi i gryzoni. Nie jest jednak jasne, czy wnioski oparte na zwierzęcych modelach BBB można łatwo zastosować do ludzkiego BBB, ponieważ ekspresja kilku ważnych cząsteczek, w tym cząsteczek adhezyjnych i rozpuszczonych białek nośnikowych, różni się między ludźmi a gryzoniami9,10. Chociaż ludzkie linie BMEC, takie jak hCMEC/D3, wyrażają odpowiednie poziomy cząsteczek adhezyjnych11, te unieśmiertelnione BMEC na ogół nie mają skomplikowanych ścisłych połączeń i solidnych właściwości barierowych12. Podstawowe ludzkie BMEC są przydatne do badania funkcji barierowych13, ale nie są łatwo dostępne dla wszystkich badaczy. Co więcej, pierwotne BMEC od pacjentów mogą być trudne do uzyskania, ponieważ muszą być one pobrane za pomocą biopsji mózgu lub operacji, która jest wykonywana tylko w określonych warunkach klinicznych.

Ostatnie postępy w technologii komórek macierzystych umożliwiły różnicowanie różnych typów komórek ludzkich, wynikających ze źródeł komórek macierzystych, takich jak ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC). Modele pochodzące z hiPSC pozwalają nam ustalić modele patofizjologiczne przy użyciu próbek pochodzących od pacjenta. Kilka typów komórek pochodzących z hiPSC można połączyć w celu stworzenia autologicznych kokultur lub organoidów, które lepiej naśladują warunki fizjologiczne. Kilka powszechnie stosowanych protokołów14,15,16,17,18,19 mogą być używane do różnicowania komórek podobnych do BMEC pochodzących z hiPSC, które mają silne właściwości bariery dyfuzyjnej z ekspresją transporterów specyficznych dla BBB i pomp wypływowych, i są przydatne do badania parakomórkowej dyfuzji małych Molekuły, mechanizmy transportu molekularnego i dostarczanie leków do mózgu20,21. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że szeroko stosowane komórki podobne do BMEC pochodzące z hiPSC nie mają ekspresji kluczowych cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, w tym VCAM-1, selektyn i ICAM-2, które są odpowiedzialne za pośredniczenie w interakcjach między komórkami odpornościowymi a klasą BBB22. Ponadto doniesiono, że poprzednie BMEC pochodzące z hiPSC wykazują mieszane cechy śródbłonka i nabłonka na poziomie transkrypcji23. W związku z tym opracowaliśmy metodę rozszerzonej hodowli komórek śródbłonka (EECM), nowatorski protokół, który umożliwia różnicowanie hiPSC w komórki podobne do BMEC, które przypominają pierwotne ludzkie BMEC pod względem morfologii, charakterystyki bariery i ekspresji cząsteczki adhezyjnej śródbłonka. Protokół ten opisuje szczegółowe procedury metodologiczne różnicowania hiPSC do komórek podobnych do BMEC wykazujących dojrzały fenotyp immunologiczny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu. W manuskrypcie przedstawiono krok po kroku protokół różnicowania hiPSC w komórki podobne do EECM-BMEC. Odpowiednie schematy przedstawiają populacje komórek na każdym kroku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Linia hiPSC, HPS1006, została dostarczona przez RIKEN BRC za pośrednictwem Narodowego Projektu Zasobów Biologicznych MEXT/AMED, Japonia.

1. Indukcja różnicowania hiPSC do śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC)

  1. Płytki i odczynniki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)
    1. Przygotować 12-dołkowe płytki pokryte matrycą błony podstawnej, rozdzielając 2,5 mg żelu matrycowego do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml w celu przechowywania w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 30 ml zimnej mieszanki pożywki i składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, zmodyfikowanej przez Dulbecco, która była przechowywana w lodówce (4 °C), do probówki. Delikatnie mieszać, pipetując, aż żel się rozmrozi, a następnie dodać 500 μl roztworu do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na co najmniej 1 h.
      UWAGA: Żel matrycowy membrany podstawnej jest wrażliwy na temperaturę i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi porcjowania i powlekania płyty. Stężenie białek macierzy zewnątrzkomórkowej może się różnić w zależności od partii. W celu zapewnienia dokładności, dokładne stężenie powinno być podane na karcie świadectwa jakości dla konkretnej partii, podając numer partii. Na przykład, jeśli dokładne stężenie wynosi 10,0 mg/ml, użyj 250 μl żelu, co daje łącznie 2,5 mg.
    2. Przygotować roztwór podstawowy inhibitora kinazy rolowej (ROCK), rozpuszczając inhibitor ROCK w sterylnej wodzie do stężenia 10 mM (Tabela 1). Podwielokrotnić roztwór podstawowy w objętości 100-200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
    3. Przygotować roztwór podstawowy kwasu L-askorbinowego o stężeniu 100 mg/ml rozpuszczając 5 g kwasu L-askorbinowego w 50 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze -20 °C (Tabela 1). Dodaj 6,25 ml glutaminy i 305 μl roztworu podstawowego kwasu L-askorbinowego do 500 ml zaawansowanego DMEM/F12, aby uzyskać pożywkę LaSR 24 (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 2 tygodni.
    4. Przygotować CHIR99021 roztwór, rozpuszczając CHIR99021 w nierozcieńczonym dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mM (Tabela 1). Roztwór podzielić na 100-200 μl objętości, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Porcje robocze roztworu podstawowego przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    5. Przygotować pożywkę DMEM/F12-10, dodając 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do 450 ml DMEM/F12. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 1 miesiąca (Tabela 1).
    6. Przygotować bufor przepływowy-1, dodając 33,3 ml 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 467 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) firmy Dulbecco (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 6 miesięcy.
  2. Zasiewanie pojedynczych hiPSC i ekspansja w celu różnicowania EPC (dzień -3 do dnia -1)
    1. Rozpocznij różnicowanie, gdy kolonie hiPSC na 6-dołkowej płytce nie wykazują spontanicznego różnicowania i mają odpowiednią gęstość do pasażowania, zwykle około 80% konfluencji (2,5-3,5 x 106 komórek). Uważnie monitoruj spontanicznie różnicujące się komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, czy do wyeliminowania komórek niezróżnicowanych wymagane jest wiele pasaży. Zapoznaj się z uwagą podaną poniżej kroku 1.4.15, aby uzyskać informacje dotyczące pożywki do hodowli komórkowych i macierzy zewnątrzkomórkowej.
    2. Zassać pożywkę i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do studzienek i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C. Odessać i wyjąć komórki, delikatnie pipetując roztwór odczynnika dysocjacyjnego na powierzchnie studzienek dwa lub trzy razy.
    3. Przenieść odłączone komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki podtrzymującej hiPSC i dokładnie zawiesić komórki. Zarezerwować 10 μl podwielokrotności do zliczania komórek.
    4. Osadzać komórki przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C. Policzyć komórki i obliczyć wymaganą objętość, aby osiągnąć odpowiednią gęstość hiPSC (75-400 x 103 na studzienkę) na 12-dołkowej płytce pokrytej matrycą membrany podstawnej (etap 1.1.1).
    5. Odessać roztwór powlekający ze studzienek i dodać 1 ml pożywki hiPSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do każdej studzienki (rozcieńczenie 1:1 000). Po odwirowaniu odessać supernatant i dysocjować osad w 1 ml pożywki hiPSC.
    6. Dodać wymaganą objętość hiPSC, oznaczoną w kroku 1.2.4, do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Dwie do czterech płytek 12-dołkowych może być wystarczające do rozróżnienia klonu hiPSC. Patrz krok 1.2.4, aby określić liczbę płytek wymaganych do wysiewu komórek.
    7. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie przesuwając płytkę do przodu i do tyłu, a następnie na boki w inkubatorze.
    8. Następnego dnia (tj. w dniu -2) należy wymienić pożywkę na 2 ml pożywki podtrzymującej hiPSC pozbawionej inhibitora ROCK. Następnego dnia (dzień -1) należy wymienić pożywkę na 2 ml świeżej pożywki podtrzymującej hiPSC.
  3. Indukcja EPC za pomocą inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK-3) CHIR99021 (Dzień 0 do Dzień 5)
    1. W dniu 0 zastąpić pożywkę podtrzymującą hiPSC w każdym studzience 2 ml pożywki LaSR zawierającej 8 μM CHIR99021.
    2. W dniu 1 odessać pożywkę i dodać 2 ml świeżej pożywki LaSR zawierającej 8 μM CHIR99021.
    3. W dniach 2, 3 i 4 zastąp pożywkę 2 ml świeżej pożywki LaSR bez CHIR99021.
  4. Magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (MACS) w celu oczyszczenia EPC CD31+ (dzień 5)
    1. W dniu 5 odessać pożywkę, a następnie dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do każdego dołka, przed inkubacją przez 6-8 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Zdysocjuj i pojedynczo wyizoluj komórki za pomocą mikropipety i przepuść przez sitko o wielkości 40 μm, aby przefiltrować zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki DMEM/F12-10. Przefiltrować zawiesinę komórek zebraną z więcej niż dwóch płytek 12-dołkowych do co najmniej dwóch probówek o pojemności 50 ml.
    3. Zatrzymaj reakcję trawienia, dodając pożywkę DMEM/F12-10 (do 50 ml). Dokładnie odpipetować i zarezerwować 10 μl do zliczenia komórek. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C.
    4. Po usunięciu supernatantu dodać 10 ml pożywki DMEM/F12-10 i przenieść zawiesinę komórek do świeżych probówek o pojemności 15 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w buforze przepływowym-1 o gęstości 1,0 x 107 komórek na 100 μl buforu.
    6. Dodać odczynnik blokujący FcR w stosunku 1:100 i inkubować przez 5 minut przed dodaniem przeciwciała CD31 znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) rozcieńczonego w stosunku 1:200. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20-25 °C.
    7. Dodać 10 ml buforu przepływowego-1, rezerwując 10 μl zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej w celu określenia frakcji komórek CD31 + (Rysunek 2).
    8. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić do gęstości 1,0 x 107 komórek na 100 μl roztworu buforu przepływowego-1. Dodać koktajl selekcyjny FITC (5 μl na 100 μl zawiesiny komórek). Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze 20-25 °C.
    9. Dodać 5 μl nanocząstek magnetycznych na 100 μl zawiesiny komórek, dobrze odpipetować i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 20-25 °C.
    10. Przenieś zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml i dodaj bufor przepływowy-1, aby uzyskać całkowitą objętość 2,5 ml. Umieść rurkę do cytometrii przepływowej w magnesie na 5 minut.
    11. W ruchu ciągłym odwróć magnes i zdekantuj zawiesinę komórek zawierającą komórki, które nie zostały znakowane przeciwciałem FITC-CD31. Utrzymuj magnes i rurkę w pozycji odwróconej przez 2-3 sekundy, a następnie usuń pozostały płyn. Zassać wszelkie kropelki na krawędzi rurki przed przywróceniem rurki do pozycji pionowej.
    12. Podnieś rurkę do cytometrii przepływowej z magnesu i dodaj 2,5 ml buforu przepływowego-1, aby umyć pozostałe komórki CD31 +. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół dwa lub trzy razy. Umieść rurkę przepływową w magnesie na 5 minut.
    13. Powtórz kroki 1.4.11-1.4.12 trzy razy, a następnie krok 1.4.11 jeszcze raz, w sumie cztery prania.
    14. Wyjmij rurkę przepływową z magnesu i dodaj wskazaną ilość odpowiedniego podłoża (np. pożywki wolnej od ludzkiej śródbłonka [hECSR] do rozszerzonej hodowli EC lub pożywki do zamrażania) do probówki w celu ponownego zawieszenia oczyszczonych komórek CD31+. Zarezerwuj dwie podwielokrotności zawiesiny o objętości 10 μl, jedną do zliczania komórek, a drugą do przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek CD31 + w próbkach po MACS (Rysunek 2). Jeżeli cytometr przepływowy nie jest dostępny od razu, należy przechowywać podwielokrotność w temperaturze 4 °C do czasu analizy.
    15. Jeśli kolejne kroki (do kroku 2) nie mogą być wykonane natychmiast, zamroź w tym momencie EPC CD31+. W przypadku rozszerzania i selektywnego pasażowania EPC przejdź do kroku 2.
      UWAGA: Vitronectin25-dołkowe płytki 12-dołkowe pokryte powłoką 25 i bardziej stabilne podłoże konserwacyjne hiPSC (mTeSR plus) mogą być stosowane zamiast płytek pokrytych matrycą membrany podstawnej i podłoża konserwacyjnego hiPSC (mTeSR1). Aby przygotować 12-dołkowe płytki pokryte witronektyną, należy rozcieńczyć witronektynę buforem rozcieńczającym do końcowego stężenia 10 μg/ml, a następnie przenieść 500 μl rozcieńczonego roztworu do każdego dołka z płytek 12-dołkowych. Pozostawić płytki w temperaturze 20-25 °C na co najmniej 1 godzinę. Gęstość wysiewu pojedynczych hiPSC jest porównywalna z gęstością zasiewu stosowanego do płytek pokrytych matrycą błony podstawnej. Zmiana pożywki hodowlanej lub składu matrycy może mieć wpływ na proliferację i spontaniczne różnicowanie hiPSC, które zwykle potrzebują 1-2 tygodni na przystosowanie się do nowych warunków hodowli. Jeśli do utrzymania hiPSC używana jest bardziej stabilna pożywka podtrzymująca hiPSC, może ona być używana do różnicowania EPC zamiast pożywki podtrzymującej hiPSC. W takim przypadku bardziej stabilną pożywkę podtrzymującą hiPSC należy wymienić w dniu -2 w celu usunięcia inhibitora ROCK, a wymianę w dniu -1 można pominąć.

2. Rozszerzona metoda hodowli komórek śródbłonka (EECM) do różnicowania komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (komórki podobne do BMEC) i komórek podobnych do mięśni gładkich (SMLC)

  1. Przygotowanie płytek pokrytych kolagenem i odczynników
    1. Przygotuj 6-dołkowe płytki pokryte kolagenem, rozpuszczając 5 mg skrystalizowanego kolagenu typu IV w 5 ml sterylnej wody. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C przed porcjowaniem i przechowywaniem w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć kolagen IV w proporcjach 1:100 w sterylnej wodzie, aby uzyskać roztwory 10 μg/ml i dodać 1 ml roztworów kolagenowych dożylnych 10 μg/ml do każdego dołka z 6-dołkowych płytek. Inkubować płytki przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Płytki można przechowywać w temperaturze 37 °C do 1 tygodnia.
    2. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), rozpuszczając 500 μg FGF w 5 ml PBS firmy Dulbecco, dodać 7,5% BSA do końcowego stężenia 0,1% i podzielić roztwór podstawowy na objętości 20-200 μl. Można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy (tabela 1). Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca; Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania. Przygotować pożywkę hECSR, dodając 2 ml suplementu B-27 i 20 μl FGF2 do 98 ml pożywki hECSR (Tabela 1). Pożywka hECSR może być przechowywana w temperaturze 2-8 °C przez okres do 2 tygodni.
    3. Przygotować pożywkę do zamrażania dla EPC, komórek podobnych do EECM-BMEC i SMLC, dodając 15 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml DMSO i 25 μl roztworu inhibitora ROCK do 30 ml pożywki hECSR (Tabela 1). Zamrażarkę można przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Wysiew EPC w celu przedłużonej hodowli komórek śródbłonka
    1. Usuń roztwór kolagenu z płytek 6-dołkowych. Następnie przenieś 1,0-2,0 x 105 oczyszczonych EPC CD31 + w 2 ml pożywki hECSR zawierającej 5 μM inhibitora ROCK (rozcieńczenie 1:2,000). Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie przesuwając płytki do przodu i do tyłu, a następnie z boku na bok.
    2. Następnego dnia należy usunąć pożywkę hECSR zawierającą inhibitor ROCK i dodać 2 ml świeżej pożywki hECSR bez inhibitora ROCK. Wymieniaj pożywkę hECSR co drugi dzień, aż do osiągnięcia 100% zbieżności.
      UWAGA: Jeśli nie można utrzymać regularnego harmonogramu karmienia w weekend, pożywkę można wymienić wieczorem ostatniego dnia roboczego tygodnia i ponownie wcześnie rano po weekendzie.
  3. Selektywne pasaż w celu oczyszczenia komórek podobnych do EECM-BMEC i SMLC
    1. Usunąć pożywkę hECSR z płytek 6-dołkowych zawierających mieszaninę populacji EC i populacji niebędących EC. Dodaj 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do każdej studzienki.
    2. Uważnie monitoruj morfologię komórek pod mikroskopem. Gdy EC (ale nie inne EC) wydają się jasne i okrągłe (zwykle w ciągu 2-5 minut), odłącz je, stukając w krawędź płytki. Większość elementów innych niż EC pozostaje przymocowana do płyty.
    3. Pobrać odłączone EC za pomocą mikropipety, uważając, aby nie wymieszać ponownie EC innych niż EC. Przenieść EC do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml zawierającej 4 ml DMEM/F12-10 na 1 ml odczynnika dysocjacyjnego.
    4. Dodać 2 ml pożywki hECSR do studzienek zawierających pozostałe przyłączone substancje niebędące EC, aby uzyskać SMLC. Umieścić płytkę w inkubatorze.
    5. Odpipetować zawiesinę EC w probówce wirówkowej, aby dokładnie wymieszać i zachować 10 μl zawiesiny do zliczenia komórek. Odwirować pozostałe komórki przez 5 minut w temperaturze 200 x g w temperaturze 20-25 °C. Usunąć supernatant z osadu i dodać 2 ml pożywki hECSR na 1,0-2,0 x 105 ECs.
    6. Po wyjęciu roztworu kolagenu dożylnego z nowej 6-dołkowej płytki, dodać 2 ml zawiesiny EC do każdej studzienki, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce, delikatnie przesuwaj ją w przód iw tył oraz na boki na półce inkubatora.
    7. Pożywkę hECSR należy wymieniać co drugi dzień, aż EC osiągną 100% zbieżność.
    8. Powtarzać kroki 2.3.1-2.3.7 aż do uzyskania czystej monowarstwy EC. Jeśli nie można wykonać następujących kroków, zamroź CD31+ EC (patrz krok 2.4.2). Aby przeanalizować funkcje EC, przejdź do kroku 3.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, potrzebne są dwa lub trzy selektywne pasaże, aby uzyskać prawie czyste kultury EC, które nadają się do analiz funkcjonalnych, a my uważamy te komórki za komórki podobne do EECM-BMEC. Po więcej niż pięciu lub sześciu pasażach proliferacja komórek zwykle zwalnia, chociaż ta zmienna zależy od linii hiPSC.
    9. Aby wyhodować SMLC, należy wymieniać pożywkę hECSR co drugi dzień. Aby zebrać pożywkę kondycjonowaną SMLC (CM), należy przepuścić zebrane medium przez filtr 0,22 μm przy każdej zmianie medium. CM może być używany do zwiększania ekspresji VCAM-1 w komórkach podobnych do EECM-BMEC. Łącz SMLC-CM, aż SMLC osiągną 100% zbieżności.
  4. EPC, komórka podobna do EECM-BMEC oraz kriokonserwacja i rozmrażanie SMLC
    1. Aby zamrozić EPC, po ostatnim płukaniu MACS (krok 1.4.13), ponownie zawiesić EPC w pożywce zamrażającej, a nie w pożywce hECSR, o gęstości 1,0-2,0 x 106 komórek/ml. Rozprowadzić 1 ml zawiesiny komórkowej do krioprobówek. Umieść krioprobówki w urządzeniu do zamrażania z kontrolowaną szybkością i szybko przenieś je do -80 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania rurki należy przenieść do zbiornika z ciekłym azotem od 24 do 48 godzin po zamrożeniu.
    2. Aby zamrozić komórki podobne do EECM-BMEC i SMLC, po usunięciu pożywki z dołków, dodać odczynnik dysocjacyjny (1 ml / dołek) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do oderwania komórek (5-7 min i 20-30 minut odpowiednio dla komórek podobnych do EECM-BMEC i SMLC). Zebrać komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml zawierającej 4 ml DMEM/F12-10 na 1 ml odczynnika dysocjacyjnego.
    3. Dokładnie odpipetować w celu wymieszania i zarezerwowania 10 μl zawiesiny komórek do zliczenia komórek. Granulować komórki przez odwirowywanie w stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C. Usunąć supernatant i dokładnie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej do gęstości 1,0-2,0 x 106 komórek/ml. Rozprowadzić 1 ml zawiesiny komórkowej do świeżych krioprobówek.
    4. Umieścić krioprobówki w urządzeniu do zamrażania z kontrolowaną szybkością i natychmiast przenieść je do -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania probówki można przenieść do zbiornika ciekłego azotu od 24 do 48 godzin po zamrożeniu.
    5. W przypadku rozmrażania EPC, komórek podobnych do EECM-BMEC i SMLC należy toczyć fiolki z krioprobówkami między rękami lub inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż komórki zostaną prawie całkowicie rozmrożone. Dodać 500 μl DMEM/F12-10 i delikatnie przenieść zawiesinę komórek do 15 ml probówki zawierającej 4 ml pożywki DMEM/F12-10. Umyć krioprobówkę raz, dodając 1 ml DMEM/F12-10, a następnie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki hECSR zawierającej 5 μM inhibitora ROCK (rozcieńczenie 1:2 000) do gęstości 1,0-2,0 x 105 komórek na 2 ml dla EPC i 2,0-3,0 x 105 komórek na 2 ml dla komórek podobnych do EECM-BMEC i SMLC. Rozprowadzić zawiesinę komórkową między dołkami 6-dołkowych płytek pokrytych kolagenem po zaessaniu roztworu kolagenu.
    7. Delikatnie przesuwać płytki do przodu i do tyłu, a następnie z boku na bok, na półce inkubatora w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 , aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzienkach.
    8. Następnego dnia należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę hECSR pozbawioną inhibitora ROCK. Wymieniaj pożywkę hECSR co drugi dzień, aż do osiągnięcia 100% zbieżności. Następnie należy przejść do selektywnego pasażowania dla EPC (patrz krok 2.3) i analiz funkcjonalnych dla komórek podobnych do EECM-BMEC (patrz krok 3). Przed wykonaniem charakterystyki molekularnej i testów funkcjonalnych, komórki podobne do EECM-BMEC powinny być w 100% zlewne, co zwykle osiąga się 2-3 dni po rozmrożeniu.

3. Walidacja ogniw podobnych do EECM-BMEC i SMLC

  1. Test przepuszczalności dla znaczników małocząsteczkowych
    1. Oceń integralność bariery komórkowej podobnej do EECM-BMEC, mierząc przepuszczalność fluoresceiny sodu, zgodnie z opisem Nishihara et al.26. Umieść komórki podobne do EECM-BMEC na wkładach filtracyjnych, aby uzyskać kompletne monowarstwy i zmierzyć przepuszczalność fluoresceiny sodu.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny kluczowych cząsteczek.
    1. Do barwienia immunofluorescencyjnego w celu monitorowania ekspresji cząsteczek złączowych, cząsteczek adhezyjnych lub białek cytoszkieletu komórek podobnych do EECM-BMEC w monowarstwach lub SMLC należy używać szkiełek komorowych, płytek 96-dołkowych lub membran z filtrami wkładkowymi. Oceń ekspresję komórkową podobną do EECM-BMEC cząsteczek adhezyjnych powierzchni komórki ze stymulacją cytokin zapalnych lub bez niej, zgodnie z opisem Nishihara i wsp.26.
  3. Cytometria przepływowa do analizy ekspresji cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórki na komórkach podobnych do EECM-BMEC
    1. Użyj cytometrii przepływowej, aby ocenić półilościową ekspresję cząsteczek adhezyjnych powierzchni komórek zaangażowanych w migrację komórek odpornościowych do OUN, w tym ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, selektyny P, selektyny E, CD99 i cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM-1), zgodnie z opisem Nishihara i wsp.26. Hodowla komórek podobnych do EECM-BMEC za pomocą pożywki kondycjonowanej SMLC w obecności i bez cytokin zapalnych przez 16-18 godzin.
  4. Test adhezji komórek odpornościowych w warunkach statycznych w celu oceny ekspresji funkcjonalnych cząsteczek adhezyjnych
    1. Użyj metody opisanej przez Nishihara et al.26, aby określić, czy cząsteczki adhezyjne powierzchni komórek podobnych do EECM-BMEC są funkcjonalne.
    2. Krótko mówiąc, zasiej komórki podobne do EECM-BMEC na szkiełku komorowym o wymiarach 5,5 x 104/cm2 i rosną do konfluencji. Około 24 godziny później zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę kondycjonowaną SMLC w obecności lub braku cytokin prozapalnych i inkubuj komórki podobne do EECM-BMEC przez dodatkowe 16 godzin.
    3. W dniu eksperymentu rozmrozić kriokonserwowane komórki odpornościowe (np. Limfocyty T lub komórki jednojądrzaste krwi obwodowej [PBMC]) buforem do płukania komórek T (Tabela 1) i znakować barwnikami fluorescencyjnymi (np. barwnikami śledzącymi komórki) w pożywce z komórek T (Tabela 1). Optymalizacja pożywki dla komórek odpornościowych powinna być dostosowana do konkretnego typu badanych komórek odpornościowych.
    4. W 16-dołkowym szkiełku komorowym dodaj 2 x 104 komórek Th1 do komórek podobnych do EECM-BMEC. W szczególności podczas pracy z efektorowymi limfocytami T, takimi jak komórki Th1, zaobserwowano, że wykazują one większe przywiązanie do komórek podobnych do EECM-BMEC w porównaniu z PBMC (Nishihara. i in. [2022]). W związku z tym liczba PBMC, które mają zostać dodane do komórek podobnych do EECM-BMEC, musi być wyższa w porównaniu z czystymi efektorowymi limfocytami T.
    5. Inkubować komórki odpornościowe z monowarstwą komórek podobnych do EECM-BMEC przez 30 minut w pożywce do oznaczania migracji (Tabela 1). Po 30 minutach delikatnie umyć szkiełko, dwukrotnie, zanurzając je w słoiku zawierającym PBS firmy Dulbecco, a następnie utrwalić 2,5% roztworem aldehydu glutarowego w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    6. Po utrwaleniu umyć szkiełko dwukrotnie, zanurzając je w słoiku zawierającym PBS firmy Dulbecco i zamocować za pomocą szkiełka nakrywkowego. Następnie uzyskaj obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej środka monowarstwy na szkiełkach do liczenia komórek odpornościowych przyłączonych do monowarstw komórkowych podobnych do EECM-BMEC.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test przepuszczalności
Przepuszczalność fluoresceiny sodu obliczono, mierząc intensywność fluorescencji pożywki pobranej z dolnej komory po 15, 30, 45 i 60 minutach. W każdym punkcie czasowym pobiera się łącznie 150 μl pożywki, a brakującą objętość 150 μl zastępuje się pożywką hECSR. intensywność fluorescencji odczytuje się za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie 485 nm/emisja 530 nm), a prawidłowe sygnały, objętości luzu i przepuszczalności oblicza się za pomocą opisanego wcześniej wzoru18 (Tabela 2). Zaleca się potwierdzenie, czy intensywność fluorescencji fluoresceiny sodu wzrasta z czasem. Do jednego testu należy użyć wielu filtrów - co najmniej trzech - w celu zapewnienia odtwarzalności. W przypadku zdrowych komórek podobnych do EECM-BMEC pochodzących z grupy kontrolnej przepuszczalność fluoresceiny sodu (376 Da) powinna wynosić poniżej 0,3 x 10-3 cm/min. Aby potwierdzić tworzenie się zlewającej się monowarstwy komórek podobnych do EECM-BMEC, po tym teście należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne białek połączeniowych komórek podobnych do EECM-BMEC każdego filtra stosowanego w testach przepuszczalności.

Barwienie immunofluorescencyjne
Barwienie immunofluorescencyjne cząsteczek łączących komórki podobne do EECM-BMEC, w tym klaudyny-5, okludyny i VE-kadheryny1, zastosowano do oceny morfologii komórek i obecności ciągłych i dojrzałych połączeń (Rysunek 4). Monowarstwy komórek podobnych do EECM-BMEC na membranach wkładów filtracyjnych utrwalono zimnym metanolem (-20 °C) przez 20 s, zablokowano buforem blokującym (tabela 1), a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Komórki podobne do EECM-BMEC wykazywały wrzecionowate kształty i zygzakowate połączenia, które są charakterystycznymi cechami morfologicznymi BMECs27. Stymulacja komórek podobnych do EECM-BMEC wysiewanych na szkiełkach komorowych cytokinami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) i γ interferonu (INF-γ) (0,1 ng/ml TNF-α + 2 IU/ml IFN-γ) rozcieńczone w kondycjonowanym pożywce pochodzącej z SMLC, zwiększyła ekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 i VCAM-128 (Rysunek 5). Reprezentatywne obrazy markerów komórek mięśni gładkich, w tym aktyny α mięśni gładkich (SMA), kalponiny i białka mięśni gładkich 22-alfa (SM22a)29, są pokazane w Rysunek 6. SMLC wysiane na szkiełku komory utrwalono 4% paraformaldehydem przez 10 minut, zablokowano buforem blokującym, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.

Analiza cytometrii przepływowej ekspresji cząsteczki adhezyjnej powierzchni komórki przez komórki podobne do EECM-BMEC
Reprezentatywne wyniki ekspresji powierzchni komórkowej cząsteczek adhezyjnych śródbłonka na komórkach podobnych do EECM-BMEC są wyświetlane w Rysunek 7. Stymulacja cytokinami prozapalnymi, takimi jak TNF-α i INF-γ, zwiększyła ekspresję na powierzchni komórki kilku cząsteczek adhezyjnych, w tym ICAM-1, VCAM-1 i selektyny P. Hodowla komórek podobnych do EECM-BMEC z pożywką kondycjonowaną przez SMLC zwiększoną ekspresję powierzchni śródbłonka VCAM-1. Efekt indukcji ekspresji powierzchni komórki VCAM-1 może się różnić w zależności od partii pożywki kondycjonowanej SMLC. Zaleca się, aby podczas różnicowania SMLC przechowywano kilka partii kondycjonowanej pożywki zebranej z SMLC, pochodzących z tego samego źródła hiPSC, w celu sprawdzenia, która partia indukuje odpowiednią ekspresję VCAM-1.

Test adhezji komórek odpornościowych w warunkach statycznych
Liczba przyłączonych komórek odpornościowych korelowała z poziomem ekspresji funkcjonalnych cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek podobnych do EECM-BMEC. Stymulacja cytokinami zapalnymi zwiększała ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka i promowała zwiększoną liczbę komórek odpornościowych, które przylegały do monowarstw komórek podobnych do EECM-BMEC (Ryc. 8). Obecny eksperyment wykazał funkcjonalność cząsteczek adhezyjnych na komórkach podobnych do EECM-BMEC, dzięki czemu model ten nadaje się do badania interakcji komórka odpornościowa - EC.

figure-results-1
Rysunek 2: Oczyszczanie EC CD31+. Wykresy punktowe reprezentatywnych danych cytometrii przepływowej z bramkowania rozproszonego EC i barwienia CD31 populacji komórek znakowanym FITC przed (etap 1.4.7) i po (krok 1.4.14) MACS. MACS poprawia czystość CD31+ EPC w populacji. Skróty: SSC = rozproszenie boczne; FSC = rozproszenie do przodu; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Przepuszczalność jednowarstwowej warstwy EECM-BMEC (10-3 cm/min) obliczona na podstawie intensywności surowej fluorescencji fluoresceiny sodu. Nachylenie liniowe objętości luzu oblicza się za pomocą regresji liniowej dla każdego filtra (Rysunek 3A). Przepuszczalność fluoresceiny sodu oblicza się za pomocą dwóch wzorów (Rysunek 3B). (A) Nachylenie liniowe objętości luzu w funkcji czasu obliczono przy użyciu regresji liniowej dla filtra 1 (m c1) i filtra ślepego (m f). Mc1 i mf są współczynnikami odpowiednio Xc1 i Xf. (B) Wzór na obliczenie przepuszczalności fluoresceiny (Pe) przy użyciu mc i mf (wzór 1). Jednostki Pe zostały przeliczone przy użyciu pola powierzchni filtra (Formuła 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Komórki podobne do EECM-BMEC wykazują dojrzałe połączenia komórkowe. Barwienie immunofluorescencyjne dla klaudyny-5, okludyny lub kadheryny VE (czerwonej) w komórkach podobnych do EECM-BMEC hodowanych na błonach filtrów wsadowych. Jądra barwiono za pomocą 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (kolor niebieski). Barwienie przeprowadzono na dokładnie tych samych wkładach filtracyjnych, które są używane do testów przepuszczalności. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Ekspresja cząsteczek adhezyjnych śródbłonka przez komórki podobne do EECM-BMEC. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono na komórkach podobnych do EECM-BMEC hodowanych na błonach wkładów filtracyjnych w obecności CM pochodzącego z SMLC. Barwienie immunologiczne dla ICAM-1 lub VCAM-1 (czerwone) pokazano dla komórek niestymulowanych i 1 ng/ml TNF-α + 20 IU / ml stymulowanych IFN-γ. Jądra barwiono DAPI (na niebiesko). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 6: Charakterystyka SMLC. Przedstawiono immunocytochemię aktyny α mięśni gładkich (SMA), kalponiny lub białka 22-alfa mięśni gładkich (SM22a) (czerwonego) dla SMLC hodowanych na szkiełkach komorowych. Jądra barwiono DAPI (na niebiesko). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 7: Ekspresja cząsteczki adhezyjne na powierzchni komórek śródbłonka na komórkach podobnych do EECM-BMEC. Przedstawiono wyniki analizy cytometrii przepływowej ekspresji cząsteczki adhezji powierzchniowej EC na komórkach podobnych do EECM-BMEC. Komórki podobne do EECM-BMEC hodowano przy użyciu kondycjonowanej pożywki pochodzącej z SMLC. Niebieskie, czerwone i szare linie nakładek histogramu pokazują odpowiednio stan niestymulowany (NS), stan stymulowany TNF-α 1 ng / ml + 20 IU / ml IFN-γ i kontrolę izotypu. Oceniano ekspresję powierzchniową komórek cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, w tym cząsteczki adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), ICAM-2, cząsteczki adhezji komórek naczyniowych 1 (VCAM-1), selektyny P, selektyny E, CD99 i cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM-1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 8: Adhezja komórek odpornościowych na komórkach podobnych do EECM-BMEC. (A) Obrazy znakowanych fluorescencyjnie przylegających komórek odpornościowych na niestymulowanych (NS) i 0,1 ng/ml TNF-α + 2 IU/mL stymulowanych IFN-γ (TNF-α + IFN-γ) monowarstwach komórkowych podobnych do EECM-BMEC. Obrazy odpowiadają środkom studni. Pasek skali = 50 μm. (B) Liczba znakowanych fluorescencyjnie komórek odpornościowych na monowarstwach komórek podobnych do EECM-BMEC NS i TNF-α + IFN-γ. Przylegające komórki odpornościowe/pola widzenia (FOV) były automatycznie zliczane za pomocą oprogramowania FIJI. Kropki reprezentują liczbę dołączonych limfocytów T. Słupki pokazują wartość średnią, a słupki błędów pokazują odchylenie standardowe (SD) ośmiu prób. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Szczegóły dotyczące konkretnych odczynników do testów. Opisana jest nazwa i dokładna ilość składników dla każdego konkretnego odczynnika. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przykład surowych danych z czytnika płytek fluorescencyjnych do obliczeń Pe. Liczby pogrubioną czcionką to surowa intensywność fluorescencji fluoresceiny sodu zmierzona przez czytnik płytkowy. W celu dokładnej analizy danych konieczne jest usunięcie sygnału tła z wartości surowych i uwzględnienie wszelkich strat sygnału wynikających z próbkowania dolnej komory, a następnie skorygowanie sygnału. Na przykład po odjęciu tła próbka 15-minutowa wykazuje sygnał 100 względnych jednostek fluorescencji (RFU), a próbka 30-minutowa wykazuje sygnał 150 RFU. Skorygowany sygnał po 30 minutach to (150 RFU + brakujące wartości po 15 minutach [100 RFU x 150 μL/1,500 μL]), czyli 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Objętość luzu = (1,500 x [SB,t])/(ST,60 min), gdzie 1,500 to objętość dolnej komory (1,500 μL), SB,t jest skorygowanym sygnałem w czasie t, a ST,60 min jest sygnałem górnej komory po 60 minutach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Punkty krytyczne i rozwiązywanie problemów
Przed rozpoczęciem różnicowania EPC badacze powinni upewnić się, że w hodowlach hiPSC nie wystąpiły żadne spontaniczne zdarzenia różnicowania komórek. Brak spontanicznie różnicujących się komórek i zastosowanie czystych kolonii hiPSC ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. Gęstość wysiewu hiPSC w dniu -3 jest ważna dla uzyskania wysokiej czystości EPC CD31+ po MACS. Gęstość wysiewu dla każdej linii hiPSC i każdego przejścia może wymagać optymalizacji. W zależności od linii hiPSC i liczby przejścia, gęstość wysiewu może wynosić od 75 x 103 do 400 x 103 hiPSC na studzienkę płytki 12-dołkowej (20-100 x 103/cm2). Minimalnym punktem kontrolnym zagęszczenia hiPSC jest gęstość komórek w dniu 2. HiPSC powinny osiągnąć 100% zbieżność najpóźniej do dnia 2. Jeśli hiPSC nie zlewają się do dnia 2, czystość EPC CD31 + po MACS będzie zwykle dość niska. W takim przypadku można zwiększyć gęstość wysiewu hiPSC. Jeśli duża liczba różnicujących się komórek oderwie się od płytki około 3 do 5 dnia, początkowa gęstość wysiewu hiPSC może zostać zmniejszona. Z naszego doświadczenia wynika, że CHIR99021 7-8 μM jest optymalnym stężeniem dla zastosowanych tutaj linii hiPSC, ale stężenie może wymagać optymalizacji dla innych linii hiPSC, które mogą inaczej reagować na leczenie inhibitorem. Czystość CD31+ EPC powinna być potwierdzona przed i po MACS. Przed kontynuacją MACS wstępnie posortowana mieszanina komórek powinna składać się z >10% komórek CD31+ . Procent komórek CD31 + wynoszący <6% zwykle powoduje <80% EPC po MACS. W tej sytuacji konieczna jest optymalizacja początkowej gęstości wysiewu i/lub zagęszczenia CHIR99021.

Dla udanego selektywnego pasażowania i generowania czystych monowarstw EC, czystość EPC CD31+ po MACS ma kluczowe znaczenie. Jeśli czystość po MACS wynosi <90%, zaleca się jedno lub dwa dodatkowe prania (kroki 1.4.11-1.4.12). Idealnie, czystość po MACS powinna wynosić >95%. Gęstość wysiewu EPC na płytkach pokrytych kolagenem powinna być zoptymalizowana zgodnie z linią hiPSC, aby osiągnąć 100% zbieżność w ciągu 3-7 dni. Czekanie, aż EC będą w 100% zlewne, zwykle prowadzi do pomyślnego selektywnego przejścia. Jednak nawet w przypadku w 100% zlewających się EC SMLC niektórych linii hiPSC również odłączają się wcześnie. W takim przypadku skuteczne może być selektywne pasażowanie przy niższym zbieganiu (np. ≤80%). Jeśli niektóre SMLC odczepią się wcześniej niż EC, EC często nie mogą zostać uratowane z mieszanej populacji EC-SMLC. W takim przypadku pomocne może być skrócenie czasu aktywacji odczynnika dysocjacyjnego w pasażujących EC i powtarzającym się selektywnym pasażowaniu. Użycie komercyjnego odczynnika dysocjacyjnego zamiast trypsyny jako odczynnika dysocjacyjnego jest korzystne dla selektywnego pasażowania, ponieważ trypsyna nie pozwala na oddzielne odłączenie EC i SMLC. Nasze testy przepuszczalności z wykorzystaniem znaczników małocząsteczkowych oraz testowanie poziomów ekspresji cząsteczek ścisłych i adhezyjnych wskazują, że EPC, komórki podobne do EECM-BMEC i SMLC mogą być przechowywane w ciekłym azocie przez co najmniej 2 lata.

Znaczenie i ograniczenia metody
Metoda różnicuje CD31+ EPC od hiPSC poprzez zastosowanie chemicznych inhibitorów GSK-3 do aktywacji sygnalizacji Wnt / β-kateniny. Po pozytywnej selekcji CD31 + EPC przez MACS, EPC są hodowane w określonym podłożu śródbłonkowym, które sprzyja różnicowaniu się w mieszane populacje śródbłonka i SMLC. Selektywne pasażowanie tych mieszanych populacji o różnych właściwościach adhezyjnych pozwala na oddzielenie EC od SMLC. Po jednym lub dwóch pasażach komórki podobne do EECM-BMEC wykazują właściwości barierowe i ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, które przypominają te z pierwotnych ludzkich BMEC. Jednoczesna hodowla z SMLC lub ich supernatantami indukuje indukowaną cytokiną ekspresję VCAM-1.

In vivo BBB utrzymuje homeostazę OUN poprzez ustanowienie niskiej przepuszczalności cząsteczki w warstwie przykomórkowej i transkomórkowej, poprzez transport składników odżywczych przez specyficzne transportery i kontrolę transportu komórek odpornościowych do OUN. Do badań bariery krew-mózg niezbędny jest odpowiedni model, który wyświetla odpowiednie cząsteczki i funkcje, które są przedmiotem zainteresowania. Produkcja komórek podobnych do EECM-BMEC przy użyciu zdefiniowanych odczynników i próbek od pacjentów lub osób zdrowych zapewnia skalowalny model ludzkiej bariery krew-mózg. Zalety modelu wykorzystującego komórki podobne do EECM-BMEC w porównaniu z innymi modelami BBB to: 1) morfologia i profil transkryptomu śródbłonka30, który przypomina pierwotny ludzki BMEC; 2) obecność dojrzałych połączeń ścisłych; 3) pożądane właściwości barierowe; oraz 4) silna ekspresja cząsteczek adhezyjnych śródbłonka, w tym ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, selektyny E i P, CD99, cząsteczki adhezyjnej komórek czerniaka (MCAM) i aktywowanej cząsteczki adhezji komórek leukocytów (ALCAM)22. W związku z tym model ten jest szczególnie przydatny do badania interakcji między komórkami odpornościowymi a BMEC. Chociaż przepuszczalność znaczników małocząsteczkowych jest wyższa dla komórek podobnych do EECM-BMEC niż wcześniej zgłaszana dla komórek podobnych do BMECpochodzących z iPSC 14,15, właściwości barierowe dość dobrze wypadają w porównaniu z tymi opisanymi dla pierwotnych ludzkich BMEC. To podobieństwo wskazuje, że komórki podobne do EECM-BMEC mogą być dobrym modelem BBB in vitro. Ekspresja selektyny E na komórkach podobnych do EECM-BMEC w warunkach fizjologicznych musi być brana pod uwagę przy użyciu tego modelu do badania niezapalnych barier krew-mózg, które nie mają konstytutywnej ekspresji selektyny E in vivo31. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że komórki podobne do EECM-BMEC mogą fenokopować barierę krew-mózg, jak obserwowano w mózgach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym w odniesieniu do zakłóconych połączeń ścisłych. Powoduje to większą przepuszczalność małych cząsteczek i zwiększoną ekspresję funkcjonalnej cząsteczki adhezyjnej, pośredniczącej w zwiększonej adhezji i transmigracji komórek odpornościowych przez komórki podobne do BMEC32. Ponadto wykazaliśmy, że aktywacja sygnalizacji Wnt / β-kateniny może złagodzić przerwanie połączeń ścisłych i zwiększoną ekspresję VCAM-1 w komórkach podobnych do EECM-BMEC pochodzących z MS32. Wyniki te wskazują, że model jest rzeczywiście przydatny do badania roli bariery krew-mózg w chorobach neuroimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane.

Podsumowując, komórki podobne do EECM-BMEC są obiecującym narzędziem do dogłębnego zrozumienia mechanizmów patofizjologicznych na poziomie bariery krew-mózg oraz jako narzędzie do opracowania nowych celów terapeutycznych dla stabilizacji bariery krew-mózg. W przyszłości model może zostać zastosowany do badania dysfunkcji bariery krew-mózg w szerszym spektrum chorób i może otworzyć drogę do nowatorskich podejść terapeutycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BE otrzymało grant od firmy Biogen na badania nad rozszerzonym dawkowaniem natalizumabu w celu wpływu na migrację limfocytów T przez barierę krew-mózg oraz grant od CSL Behring na zbadanie molekularnych podstaw dysfunkcji bariery krew-mózg w zaburzeniach neurologicznych. HN i BE są wynalazcami tymczasowych amerykańskich zgłoszeń patentowych związanych z ogniwami podobnymi do EECM-BMEC (63/084980 i 63/185815).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HN był wspierany przez Uehara Memorial Foundation, ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS w ramach Wspólnego Programu Badawczego realizowanego we współpracy z SNSF (JRPs) Grant No. Grant JPJSJRP20221507 i KAKENHI nr 22K15711, program JST FOREST (numer grantu JPMJFR2269, Japonia), grant Fundacji YOKOYAMA na rzecz Farmakologii Klinicznej nr YRY-2217, FUNDACJA ICHIRO KANEHARA, Fundacja Badań Neurologicznych Narishige, Fundacja NOVARTIS (Japonia) na rzecz Promocji Nauki oraz FUNDUSZ UNIWERSYTECKI YAMAGUCHI. BE było wspierane przez Szwajcarskie Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego i Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty 310030_189080 i ZLJZ3_214086) oraz grant Strategicznego Japońsko-Szwajcarskiego Programu Nauki i Technologii (SJSSTP) IZLJZ3_214086.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr strzykawkowy 0,22 mmTPP99722
15 mL Probówka wirówkowaFalcon352196
40 μ m Sitko do komórek FalconFalcon 352340
5 ml Probówka okrągłodennaSPL40005
50 ml Probówka wirówkowaFalcon352070
Płytka 96-dołkowa, okrągłodennaSPL34096
AccutaseSigma-AldrichA6964-500ml
Kwas octowySigma-Aldrich695092
DMEM/F12Life Technologies12634
All-in-OneKeyenceBZ-X810
B-27 Suplement (503), bez surowicyThermo Fischer Scientific17504044
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), 7,5% w dPBSSigma-AldrichA8412
Bufor rozcieńczający CellAdhereSTEMCELL TechnologiesST-07183
CellTracker Green CMFDA DyeInvitrogenC7025
Szkiełka komoroweThermo Fischer Scientific178599
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263
Kolagen IV z ludzkiego łożyskaSigma-AldrichC5533
Płytki do hodowli tkankowych Corning (12-dołkowe)Corning3512
Płytki do hodowli tkankowych Corning (6-dołkowe)Corning3506
Wewnętrzna nasadka do probówki kriogenicznej 2,0 mlWatson1396-201S
Dimetylosulfotlenek (DMSO), sterylnySigma-AldrichD2650
DMEM (13), [+] 4,5 g/L D-glukozy, [-] L-glutamina, [-] pirogronianThermo Fischer Scientific31053-028
Dulbecco' s d) PBS (bez wapnia, magnezu)Thermo Fisher14190250
Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 (DMEM-F12)Thermo Fischer Scientific11320074
Zestaw pozytywnej selekcji EasySepFITC IISTEMCELL Technologies18558
EasySepMagnetStemcell Technologies18000
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego0,02% w DPBSSigmaE8008-100ML
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowanaThermo Fischer Scientific10270106
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigma-AldrichF1141
Ficoll-Paque PLUSOprogramowanie Sigma-AldrichGE17144002
FIJI (wersja 2.0.0)Obraz J, USA
FlowJo wersja10BD
Sól sodowa fluoresceinySigma-AldrichF6377
Suplement GlutaMAXThermo Fischer Scientific35050-061
Roztwór aldehydu glutarowegoSigma-AldrichG6257
HCLSigma-AldrichH1758
Roztwór buforowy HEPESThermo Fischer Scientific15630-056
Surowica śródbłonka ludzkiego Free Medium (hESFM)Thermo Fischer Scientific11111-044
Ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)Tocris233-FB-500
iPS ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzysteRiken RBCHPS1006
Siarczan kanamycyny (100x)Thermo Fischer Scientific15160-047
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwinimagnezowa hydratSigma-AldrichA8960-5G
L-Glutamina 200 mM (1003)Thermo Fischer Scientific25030-024
Matrigel, obniżony czynnik wzrostuCorning354230
MEM NEAA (1003)Thermo Fischer Scientific11140-035
MetanolSigma-Aldrich32213
MowiolSigma-Aldrich81381
mTeSR Plus-cGMPSTEMCELL TechnologiesST-100-0276
Kompletny zestaw mTeSR1 (podłoże podstawowe plus suplement 53)STEMCELL Technologies85850
NaClSigma-Aldrich71376
ParaformaldehydMillipore104005
Pen StrepThermo Fischer Scientific15140-122
Rekombinowane ludzkie białko IFN-gammaR& D Systems285-IF-100
Rekombinowane ludzkie białko IL-2BD Biosciences554603
Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfaR& D Systems210-TA-020
Inhibitor ROCK Y-27632Tocris1254
RPMI medium 1640Thermo Fischer Scientific21875-034
SkalpelFEATHER2975-11
Mleko odtłuszczoneBD Biosciences232100
Azydek sodu (NaN3)Sigma-Aldrich71290
Sód pirogronianThermo Fischer Scientific11360-039
- Transwells - Membrana PC, 0,4 mm, 12 mm,Corning3401
Tris baseSigma-Aldrich93362
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Vitronectin XFSTEMCELL Technologies078180
Woda, sterylna, hodowlakomórkowaSigma-AldrichW3500
Zaawansowany mikroskop fluorescencyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372(2019).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
  3. Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
  4. Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
  5. Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
  6. Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
  7. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
  8. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  9. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358(2020).
  10. Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32(2018).
  13. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  14. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  15. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  16. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733(2014).
  17. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9(2017).
  18. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  19. Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
  20. Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
  21. Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25(2019).
  22. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  23. Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118(2021).
  24. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  25. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  26. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).
  27. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  28. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
  30. Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992(2021).
  31. Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
  32. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikronaczyniowe kom rki r db onka m zgubariera krew m zgkom rki progenitorowe r db onkamigracja kom rek odporno ciowychcytometria przep ywowamagnetyczna separacja kom rekpo czenia cis ecz steczki adhezyjne r db onkacytokiny prozapalne

Powiązane artykuły