Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65136

⸱

15 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vector-borne Infectious Diseases, Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4National Center for Microbiology, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Streszczenie

Transgeniczne komary często wykazują koszty sprawności w porównaniu do swoich dzikich odpowiedników. W związku z tym badania nad kosztami sprawności fizycznej polegają na zbieraniu danych o parametrach życia komarów modyfikowanych genetycznie i porównywaniu ich z komarami pozbawionymi transgenów o tym samym tle genetycznym. Ten manuskrypt ilustruje, jak mierzyć typowe cechy historii życia komara Aedes aegypti, w tym płodność, rozmiar i kształt skrzydeł, płodność, stosunek płci, żywotność, czas rozwoju, wkład samców i długowieczność dorosłych. Parametry te zostały wybrane, ponieważ odzwierciedlają sukces reprodukcyjny, są łatwe do zmierzenia i są powszechnie opisywane w literaturze. Reprezentatywne wyniki określają ilościowo koszty sprawności związane z nokautem genu lub pojedynczą insercją elementu napędu genowego. Standaryzacja sposobu zbierania danych o parametrach życia jest ważna, ponieważ takie dane mogą być wykorzystane do porównania stanu zdrowia komarów transgenicznych generowanych w ramach badań lub do modelowania szybkości fiksacji transgenu w symulowanej populacji komarów typu dzikiego. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla transgenicznych Aedes aegypti, może być również stosowany w odniesieniu do innych gatunków komarów lub innych eksperymentalnych warunków leczenia, z zastrzeżeniem, że niektóre konteksty biologiczne mogą wymagać specjalnych adaptacji.

Wprowadzenie

Przetrwanie najlepiej przystosowanych to darwinowska idea, że osoby, które posiadają geny najlepiej przystosowane do swojego środowiska, przekażą te geny kolejnym pokoleniom1. Oznacza to, że to sprawność fizyczna decyduje o tym, czy ich geny przetrwają. Ta licząca ponad 150 lat koncepcja jest prawdopodobnie najważniejszym wyznacznikiem inżynierii skutecznego napędu genowego u transgenicznych komarów. Napędy genowe, czyli super-mendlowski wzorzec dziedziczenia samolubnego elementu genetycznego, który pozwala mu rozprzestrzeniać się w populacjach2, są badane pod kątem genetycznego zwalczania szkodników3. W kontekście kontroli wektorów strategia ta ma na celu albo zastąpienie stawonogów typu dzikiego (WT) tymi odpornymi na patogeny (modyfikacja populacji), albo wyeliminowanie ich wszystkich razem (tłumienie populacji)4. Jednak transgeniczne komary często wykazują koszty sprawności (zwane również obciążeniem genetycznym) w porównaniu z ich odpowiednikami WT, co oznacza, że transgen zostanie utracony w populacjach, które mogą je pokonać. Sprzężenie transgenów z systemem napędu genowego jest zatem konieczne, aby zrównoważyć wszelkie koszty przystosowania i przepchnąć transgen przez populację na poziomie wyższym niż oczekiwano od typowego dziedziczenia mendlowskiego4.

Badania laboratoryjne nad gatunkami komarów-wektorów wykazały, że transgeny często wykazują koszty sprawności5,6,7. Na przykład Irvin i wsp. zmierzył różne parametry życia Aedes (Ae.) aegypti zmodyfikowanych do ekspresji genów wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP) lub transpozazy pod promotorami aktyny Drosophila 5C lub syntetycznych promotorów 3XP3 i porównał je z dzikim szczepem Orlando (to samo tło genetyczne, z którego pochodziły)5. Przede wszystkim odkryli, że wszystkie transgeniczne szczepy znacznie obniżyły sprawność reprodukcyjną5. W zależności od transgenu, niektóre komary Anopheles (An.) wykazujące ekspresję transgenów, które hamowały rozwój pasożyta Plasmodium, również wykazywały koszty przystosowania6. W szczególności An. stephensi wykazujący ekspresję fosfolipazy jadu pszczelego (PLA2) pod konstytutywnymi lub indukowanymi mączką krwiopochodną promotorami składał znacznie mniej jaj w porównaniu z kontrolami6. Autorzy ci odkryli również, że transgeniczne Anopheles wykazujące ekspresję innego transgenu, tetrameru dodekapeptydu SM1, nie wykazywały kosztów przystosowania, co doprowadziło ich do wniosku, że koszty dopasowania wynikające z transgenu są zależne, przynajmniej częściowo, od efektu wytworzonego białka transgenicznego6. Rzeczywiście, koszty dopasowania można przypisać produktom transgenowym, efektom pozycyjnym, efektom off-target, mutagenezie insercyjnej lub efektom chowu wsobnego w szczepach hodowanych w laboratorium7. Napędy genowe muszą być zatem wystarczająco solidne, aby zrównoważyć te koszty sprawności wywołane przez transgeny, jednocześnie unikając rozwoju insercji i delecji (indeli), które blokują sam napęd.

Koszty rozwoju lub sprawności reprodukcyjnej mogą być mierzone w badaniach laboratoryjnych lub klatkach7, z zastrzeżeniem, że nieznane czynniki w tej dziedzinie mogą również mieć wpływ. Niemniej jednak, kontrolowane badania sprawności są ważnym pierwszym krokiem przy planowaniu lub ocenie genetycznie modyfikowanych uwolnień komarów, takich jak program napędu genowego, w celu ustalenia, czy linia transgeniczna utrzyma się przez kolejne pokolenia. Na przykład Hammond i wsp. oceniono Napędy genowe oparte na gambiowym CRISPR/Cas9 mające na celu zakłócenie genów niezbędnych dla płodności kobiet8. Dzięki badaniom klatkowym prowadzonym przez co najmniej 25 pokoleń autorzy odkryli, że komary miały allele oporne na napęd genowy, które blokowały rozszczepienie ukierunkowane na CRISPR i przywracały płodność samic8. Ich wysiłki w zakresie modelowania sugerowały, że płodność u samic heterozygotycznych pod względem napędu genowego miała najbardziej dramatyczny wpływ na utrwalenie napędu genowego w symulowanych warunkach8. Idąc tym tropem, Ae. aegypti (Higgs' White Eye strain, HWE) zmodyfikowany do ekspresji autonomicznych kaset napędu genowego pod różnymi promotorami lub w różnych loci międzygenowych wykazywał różne wskaźniki fiksacji napędu genowego w symulowanych populacjach9. Korzystając z modelowania MGDrivE10, w połączeniu z zmierzonymi wskaźnikami powstawania indel, efektami matczynymi i danymi dotyczącymi parametrów życia zebranymi w laboratorium, autorzy odkryli, że przystosowanie komarów najsilniej wpłynęło na trwałość napędu genowego w symulowanych warunkach9. Koszty sprawności, które najprawdopodobniej pogorszą wydajność napędu genowego, można przypisać somatycznej ekspresji Cas9 (nad) lub genowi, który jest celowany, szczególnie u heterozygot, a nie samemu popędowi wewnętrznemu11,12,13,14,15,16,17.

Biorąc pod uwagę jego znaczenie, dopasowanie jest ważnym czynnikiem dla zdolności linii transgenicznej do przetrwania przez kolejne pokolenia i może być używane jako wskaźnik wszelkich fizjologicznych efektów związanych z transgenem. Na przykład efekty niezgodne z celem mogą być związane z kosztami sprawności. W takim przypadku zaleca się krzyżowanie wsteczne linii transgenicznej przez kilka pokoleń. Co więcej, przekroczenie linii transgenicznej z tą, która odzwierciedla populację terenową, może być również konieczne do zbadania, jak dobrze populacja transgeniczna może konkurować w świecie rzeczywistym. Aby określić ilościowo koszty przystosowania, tak aby można je było porównać, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono proste protokoły pomiaru typowych cech historii życia komarów Ae. aegypti, ze szczególnym naciskiem na koszty przystosowania związane z transgenami, dzięki czemu takie badania można łatwiej odtworzyć. Protokoły obejmują płodność, płodność, stosunek płci, żywotność, czas rozwoju, wkład samców i długowieczność dorosłych. Pomiar długości i powierzchni skrzydeł został również wybrany jako pomiar sprawności, ponieważ koreluje z długością klatki piersiowej18,19 i pomiarami wielkości ciała, co jest bezpośrednio związane z wielkością mączki krwi, płodnością i odpornością20,21. Chociaż istnieje wiele sposobów oceny sprawności, parametry te zostały wybrane, ponieważ odzwierciedlają sukces reprodukcyjny, są łatwe do zmierzenia i są powszechnie opisywane w literaturze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół jest napisany dla transgenicznych i dzikich linii Ae. Aegypti, które zostały wcześniej zatwierdzone i ustalone. Aby uzyskać więcej informacji na temat generowania transgenicznych Ae. aegypti, zobacz Kistler et al.22 oraz Coates et al.23. Wszystkie opisane poniżej eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardowymi procedurami hodowli Ae. aegypti. Komary utrzymywano w temperaturze 28 °C przy wilgotności względnej 75%-80% i cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Do celów statystycznych zdecydowanie zaleca się co najmniej 100 pojedynczych bibułek jajecznych na plamę komarów. Kompleksowe badania sprawności fizycznej trwają około 3 miesięcy (Rysunek 1).

1. Pomiar płodności u samic komarów

  1. Wylęgają się komary transgeniczne i WT (o tym samym tle genetycznym, ale pozbawione transgenu) poprzez umieszczenie bibułek jajowych w sterylnej wodzie na noc w owadzie, zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli. Pozwól larwom żerować ad libitum, podając kilka kropli (każda około 50 μl) zmielonej gnojowicy z pokarmu dla ryb (tetramin) (około 30% w/v). Pierwsze larwy w stadium rozwojowym są rozpoznawalne 1 dzień po wykluciu. Larwy należy umieszczać w większych pojemnikach, aby nie było tłoku, na ogół 100-150 larw można hodować w 1 litrowej objętości wody o powierzchni ok. 250 cm2. Kontynuuj dostarczanie gnojowicy tetraminowej jako źródła pożywienia, umożliwiając larwom żerowanie ad libitum. Dodaj gnojowicę pokarmową w dyskretnych kropelkach, aby larwy zawsze miały dostęp do wystarczającej ilości pokarmu i aby woda nie wydawała się mętna. Larwy będą powiększać się z każdym stadium rozwojowym i ostatecznie wejdą w przepoczwarzenie w larwalach.
  2. Gdy poczwarki zaczną się pojawiać, ~ 5-6 dni po wykluciu, oddziel je według płci, aby upewnić się, że dorosłe osobniki są dziewicami, gdy się pojawią (do późniejszego krycia), jak opisano poniżej.
    1. Aby posortować poczwarki według płci, zacznij od zebrania poczwarek za pomocą plastikowych pipet o pojemności 3 ml do małych plastikowych kubków zawierających czystą wodę z kranu. Poczwarki męskie są zwykle mniejsze i mają tendencję do pojawiania się jako pierwsze w porównaniu z samicami. Najpierw posortuj poczwarki według rozmiaru, a następnie potwierdź ten początkowy ekran według morfologii.
    2. Przenieś poczwarkę do szklanego szkiełka mikroskopowego i usuń nadmiar wody chusteczką. To unieruchamia poczwarkę. Pod stereoskopem przy powiększeniu 2x-4x ustaw poczwarkę brzuszną stroną do góry za pomocą pędzla z cienką końcówką.
    3. Przeanalizuj wzrokowo ogon pod kątem różnic w kształcie płata narządów płciowych (na końcu segmentów brzusznych poczwarki za wiosłami; Rysunek 2). Samice mają spiczaste płetwy, które wystają poza płaty narządów płciowych, z grubsza przypominając koronę lub zęby wampira, podczas gdy męskie płaty narządów płciowych są zaokrąglone i nie mają tych spiczastych struktur. Patrz: Carvalho i wsp.24 dla dodatkowych figur.
  3. Umieść poczwarki samców i samic w oddzielnych kubkach na wodę i umieść je w odpowiednim pojemniku, na przykład w kartonach o pojemności 1,9 l (1/2 galona lub 64 uncji) z białą tkaniną organdy o wymiarach 0,2 m x 0,2 m (8 cali x 8 cali), z których każdy zawiera ~ 150 poczwarek.
  4. Na wierzchu klatek należy zapewnić źródło cukru i wody (np. rodzynki i kubek wypełniony wodą pokryty gazą, zabezpieczony dwoma gumkami). Wytnij otwór wielkości długopisu w kartonach i przykryj go gumowym korkiem, aby dodatkowe poczwarki mogły zostać dodane do klatek w miarę ich wyłaniania się.
  5. Po 3-5 dniach od pojawienia się dorosłego osobnika należy znieczulić komary, umieszczając kartony w temperaturze 4 °C na ~2-5 minut. Chociaż komary mogą nadal drgać, są wystarczająco znieczulone, gdy większość z nich spadnie na dno kartonu. Umieść komary na szklanej szalce Petriego na lodzie na ~30 min-1 h.
    UWAGA: Zbyt długie pozostawienie komarów w temperaturze 4 °C może znacząco wpłynąć na ich zdrowie, chociaż nie znaleźliśmy żadnych skutków, jeśli zostaną pozostawione na lodzie do 1 godziny.
  6. Krzyżuj masowo samce WT lub transgeniczne GD1 lub GD29 (napęd genowy oparty na CRISPR/Cas-9) z dziewiczymi samicami WT (kontrolnymi), dodając znieczulone komary w proporcjach pięciu WT lub transgenicznych samców do jednej samicy WT do kartonów na komary, z których każdy zawiera ~150 komarów. Pamiętaj, aby oznaczyć klatki według typu męskiego.
    UWAGA: Ten schemat krzyżowania ma na celu określenie dopasowania do hemizygot GD1 lub GD29 (tj. komarów posiadających jedną kopię transgenu). Aby określić przydatność dla homozygotycznych linii transgenicznych, schemat krzyżowania można dostosować tak, aby transgeniczne samce i samice mogły kojarzyć się w porównaniu z krzyżówkami samców i samic WT.
  7. Po 2-3 dniach nakarmić samice krwią zgodnie ze standardowymi praktykami hodowlanymi25, zapewniając źródło krwi na górze klatki. Usuń źródło cukru 24 godziny przed karmieniem krwią i źródło wody ~ 2-3 godziny przed karmieniem krwią, aby zwiększyć wydajność karmienia.
  8. Po podaniu krwi należy znieczulić komary, umieszczając je w temperaturze 4 °C, jak w kroku 1.5.
  9. Oddziel karmione krwią (w pełni nabrzmiałe) samice od niekarmionych samic, wizualnie sprawdzając ich brzuchy pod kątem obrzęku. Wyrzuć niekarmione, częściowo karmione i samce.
  10. Umieść nabrzmiałe samice z powrotem w odpowiednich klatkach i zapewnij źródło cukru i wody na wierzchu klatek.
  11. Po 2-3 dniach umieść pojedyncze samice w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml wyłożonych bibułą filtracyjną, która została wstępnie opisana ołówkiem (Ryc. 3). Przykryj stożkowe rurki siatką i uszczelnij dwiema gumowymi opaskami.
  12. Gdy samice się obudzą, napełnij wszystkie probówki ~ 5 ml wody z kranu. Umieść mały kawałek rodzynek lub wacika nasączonego cukrem na wierzchu każdej stożkowej rurki. Pozostaw samice na 1-2 dni w owadzie i pozwól im złożyć jaja.
  13. Po 1-2 dniach opróżnij każdą stożkową rurkę i znieczul komary, umieszczając je w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać szybkie przetwarzanie, użyj końcówki plastikowego pipetora o pojemności 3 ml dociśniętego do siatki, aby spuścić wodę z każdej stożkowej rurki. Obróć rurki do góry nogami i umieść je na ręczniku papierowym, aby odsączyć. Umieścić stożkowe probówki o pojemności 50 ml w uchwycie na probówki i umieścić stojak w temperaturze 4 °C.
  14. Zbierz papier jajeczny i policz liczbę jajek na każdym papierze. Policz samice, które nie składają jaj, jako 0 i uwzględnij je w analizie. Oblicz średnią płodność jako całkowitą liczbę jaj zliczonych na każdym papierze podzieloną przez całkowitą liczbę samic poddanych badaniom przesiewowym.
    UWAGA: Cyfrowe zdjęcia poszczególnych bibułek jaj mogą służyć jako wizualny zapis do potwierdzenia liczenia (Rysunek 4).
  15. Osusz bibułki jajkowe i umieść je z powrotem w owadzie. Zaleca się, aby bibułki jajowe schły przez co najmniej 3-5 dni dla optymalnego wylęgu25.

2. Pomiar długości skrzydła, powierzchni i rozmiaru środka ciężkości

  1. Zamrozić co najmniej 25 WT lub transgenicznych samic karmionych krwią w tym samym wieku z ukończonego badania płodności, umieszczając klatki na komary w temperaturze -20 °C na około 15 minut
    UWAGA: Nie zamrażaj przez dłuższy czas i nie potrząsaj ani nie upuszczaj pojemnika, ponieważ może to spowodować odpadnięcie skrzydeł od komarów.
  2. Wyciąć lewe skrzydło każdego komara, wycinając połączenie skrzydła i klatki piersiowej, usuwając całe skrzydło, postępując zgodnie z poniższym protokołem.
    1. Jedną ręką trzymaj komara kleszczami, chwytając okolicę klatki piersiowej pod skrzydłami.
    2. Używając drugiej pary kleszczy w drugiej ręce, rozetnij lewe skrzydło każdego komara, wycinając staw skrzydła i klatkę piersiową, delikatnie naciskając, aby ściągnąć skrzydło, usuwając całe skrzydło bez rozrywania żył skrzydła.
  3. Za pomocą kleszczy umieść skrzydło na szklanym szkiełku, leżąc płasko. Za pomocą pipety transferowej dodaj jedną kroplę z 15 ml roztworu podstawowego, składającego się w 70% z etanolu, i jedną kroplę płynu do naczyń na skrzydełko na szkiełku.
  4. Dodaj jedną kroplę 80% glicerolu do szkiełka nakrywkowego i umieść na skrzydełku w roztworze etanolu z mydłem.
  5. Sfotografuj skrzydła zamontowane na prowadnicach za pomocą aparatu z obiektywem 65 mm (7D-65 mm-1x; zoom = 1, 200, 6.3, ISO = 100). Zwróć uwagę na skalę pikseli/mm i upewnij się, że pozostaje ona taka sama dla wszystkich obrazów. Jeśli wiele skrzydeł jest obrazowanych razem, przytnij zdjęcia do pojedynczych skrzydeł i dodaj paski skali do każdego zdjęcia. Zapisuj obrazy w formacie TIFF z kompresją LZW, przy czym każdy obraz jest wyraźnie oznaczony wszystkimi informacjami dotyczącymi poszczególnych skrzydeł.
    UWAGA: Skrzydła mogą być fotografowane przy użyciu innego aparatu i powiększenia lub za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu do innych badań, jeśli ustawienia pozostają takie same, a skala piksel/mm pozostaje taka sama dla każdego sfotografowanego skrzydła w badaniu. Stosunek pikseli do mm zostanie uwzględniony przy określaniu pomiarów.
  6. Pobierz tpsUtil i tpsDig, które są darmowymi programami do morfometrycznego przetwarzania obrazów. Zobacz Rohlf26,27, aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje o oprogramowaniu.
  7. Zdigitalizuj skrzydła za pomocą tpsUtil, aby utworzyć plik TPS ze zdjęciami skrzydeł do następnego kroku digitalizacji.
    1. Aby to zrobić, otwórz tpsUtil i w obszarze operacji wybierz pozycję Zbuduj plik tps z obrazów. Kliknij przycisk wejść, wybierz plik zawierający poszczególne obrazy skrzydeł, a następnie wybierz dowolny obraz, aby wybrać ten folder. Kliknij wyjście i nazwij plik, który zostanie utworzony w formacie .tps. Kliknij Zapisz.
    2. Następnie w obszarze Akcje kliknij pozycję Ustawienia. Zaznacz opcję Uwzględnij wszystko, kliknij przycisk Utwórz i zamknij wyskakujące okienko. W obszarze Operacja wybierz teraz opcję Losowo sortuj próbki. Kliknij przycisk Wprowadź i wybierz plik .tps, który został właśnie utworzony. Kliknij pozycję wyjście, zmień nazwę pliku .tps, aby wskazać, że jest to wersja pliku z losowo wybranymi próbkami, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Następnie kliknij przycisk Utwórz. Zamknij program tpsUtil.
      UWAGA: Aby zmniejszyć błąd pomiaru, zdjęcia skrzydeł mogą być powielane i wykorzystywane dwukrotnie w celu uzyskania repliki technicznej.
  8. Użyj oprogramowania tpsDig, aby zidentyfikować dwuwymiarowe współrzędne kartezjańskie dla punktów orientacyjnych. W obszarze Dane wejściowe wybierz plik .tps utworzony w kroku 2.7. Ustaw skalę na skalę określoną w kroku 2.5; W obszarze Opcje wybierz pozycję Narzędzia obrazów, a następnie kliknij przycisk Zmierz.
  9. Dodaj punkty orientacyjne do obrazu, klikając niebieską ikonę celownika reprezentującą digitalizację punktów orientacyjnych, a następnie kliknij połączenia skrzydeł wskazane w Rysunek 5, w kolejności od punktu orientacyjnego 1 do punktu orientacyjnego 14.
    UWAGA: Te punkty orientacyjne zostały wybrane, ponieważ były wcześniej używane do digitalizacji i analizy punktów orientacyjnych skrzydeł 19, są łatwe do zlokalizowania na połączeniach żył skrzydeł w wielu próbkach i zapewniają wystarczającą liczbę punktów orientacyjnych skrzydeł, aby uchwycić rozmiar i kształt skrzydła.
  10. Podczas oznaczania punktów orientacyjnych oznacz wszelkie brakujące lub zasłonięte punkty orientacyjne (z powodu złożenia lub uszkodzenia skrzydeł) jako brakujące w tpsDig, klikając ikonę M, aby wykluczyć je z analizy i zachować prawidłową kolejność punktów orientacyjnych. Kliknij czerwoną strzałkę skierowaną w prawo, aby powtórzyć digitalizację punktów orientacyjnych dla następnych obrazów, aż wszystkie obrazy w pliku zostaną ukończone. Zapisz i zamknij plik.
    UWAGA: Punkty orientacyjne muszą być dodawane do obrazu skrzydła w odpowiedniej kolejności dla każdego obrazu, aby obliczenia długości, powierzchni i rozmiaru skrzydła były poprawne.
  11. Oblicz długość i powierzchnię skrzydła za pomocą skryptu R dostarczonego w pliku uzupełniającym 1, modyfikując lokalizację pliku .tps i skalę obrazu zgodnie z eksperymentem.
  12. Oblicz rozmiar środka ciężkości skrzydła, miarę rozmiaru statystycznie niezależną od kształtu, zdefiniowaną jako pierwiastek kwadratowy z sumy kwadratów odległości każdego z punktów orientacyjnych od punktu środkowego skrzydła28,29.
  13. Użyj uogólnionego wyrównania prokrustu, aby usunąć zmienność niezwiązaną z kształtem i wykreślić średnie współrzędne punktu orientacyjnego, używając skrzydeł, które mają nienaruszone wszystkie punkty orientacyjne. Zarówno w przypadku rozmiaru środka ciężkości skrzydła, jak i wyznaczenia średniego punktu orientacyjnego, należy użyć skryptu R dostarczonego w pliku uzupełniającym 2, modyfikując lokalizację pliku .tps i skalę obrazu zgodnie z eksperymentem.

3. Ocena płodności komórek jajowych

  1. Wykluj pojedyncze jaja F1 z bibułek zebranych od pojedynczych samic (zebranych w kroku 1) do przezroczystych pojemników delikatesowych z polipropylenu zawierających ~ 100 ml świeżo wysterylizowanej wody dejonizowanej. Dodaj dwie lub trzy krople zmielonej gnojowicy z pokarmu dla ryb do karmienia ad libitum. Wyłóż górne części pojemników siatką lub organdą i zabezpiecz gumką.
  2. Po 2-3 dniach od wyklucia wyjmij bibułki jajowe z wody i pozostaw je do wyschnięcia na noc, umieszczając je w nowym pojemniku przykrytym pokrywką lub siatką i pozostawiając je w owadzie.
  3. Ponownie wykluć bibułki jajowe w tych samych pojemnikach, w których zostały pierwotnie wyklute, umieszczając je z powrotem w pojemniku na wodę.
    UWAGA: Suszenie i ponowne wylęganie bibułek jajowych znacznie poprawia wydajność wylęgu. Może to nie być konieczne w przypadku innych gatunków komarów.
  4. Po 3-5 dniach od początkowego wyklucia należy przeprowadzić oględziny larw (od 2. do 4. stadium) pod kątem markera transgenicznego (jeśli dotyczy; Rysunek 6). Zbadaj kilka larw pod mikroskopem fluorescencyjnym w tym samym czasie, umieszczając je na kawałku bibuły filtracyjnej umieszczonej na organdzie lub siatce wyłożonej ręcznikami papierowymi. Ręczniki papierowe pochłaniają nadmiar wody, dzięki czemu bibuła filtracyjna może być używana do przesiewania i manipulowania unieruchomionymi larwami.
  5. Zapisz liczbę dodatnich lub ujemnych larw transgenicznych. Wyrzuć ujemne larwy.
  6. Oczyść wodę larwalną, aby zapewnić optymalny czas rozwoju. Aby to zrobić, odpipetuj larwy do małego kubka, wylej brudną wodę i zastąp ją świeżą wodą z kranu Dodaj dodatnie larwy i upewnij się, że dostępna jest wystarczająca ilość zmielonej gnojowicy dla ryb.
  7. Oblicz płodność jako liczbę larw transgenicznych lub kontrolnych podzieloną przez całkowitą liczbę jaj.

4. Określenie proporcji płci u poczwarek

  1. Do 14 dni po wykluciu należy kontynuować zbieranie i rejestrowanie liczby poczwarek płci męskiej i żeńskiej (zgodnie z opisem w kroku 1.2.3). Samice lub samce mogą być łączone, w zależności od płci, w małych kubkach umieszczonych w pojemnikach o pojemności 1,9 l.
  2. Aby określić stosunek płci, dodaj liczbę samic F1 lub liczbę samców F1 zebranych na osi czasu badania na pojedynczą dorosłą samicę komara. Podziel tę liczbę przez całkowitą liczbę poczwarek zebranych dla tej samej linii komarów wygenerowanej z jednej samicy.

5. Określanie żywotności larw

  1. Aby określić żywotność larw, należy dodać całkowitą liczbę poczwarek zebranych na osi czasu badania na pojedynczą dorosłą samicę komara.
  2. Podziel tę liczbę przez całkowitą liczbę larw zliczonych na pojedynczą dorosłą samicę komara dla tej samej linii policzonej w kroku 3.

6. Określenie czasu rozwoju larw do poczwarki

  1. Aby określić rozwój larw do poczwarki, śledź liczbę larw i liczbę poczwarek w linii dziennie.
  2. Oblicz rozwój od larwy do poczwarki jako średni czas do rozwoju poczwarki po wykluciu.

7. Określenie udziału mężczyzn

  1. Używając samców w tym samym wieku, znieczul dorosłe dziewicze transgeniczne samce komarów na lodzie, a także dorosłe dziewicze samce i samice komarów kontrolnych.
  2. Skrzyżuj transgenicznych lub kontrolnych dorosłych mężczyzn z kontrolnymi dorosłymi kobietami, dodając 50 transgenicznych lub 50 kontrolnych samców (dopasowanych wiekowo) ze 100 kontrolnymi samicami do kartonów o pojemności 64 uncji, tak aby było w sumie 50 samców ze 100 samicami (dwie kontrolne samice: jedna kontrolna lub transgeniczna samica). Pamiętaj, aby oznaczyć, który karton zawiera transgeniczne samce, a który zawiera samce kontrolne.
  3. Pozwól kryciu nastąpić przez 2-3 dni. Po tym czasie zaoferuj komarom posiłek z krwi, postępując zgodnie ze standardowymi praktykami hodowlanymi.
  4. Trzy dni po karmieniu krwią oddziel pojedyncze, w pełni nabrzmiałe samice do stożkowych probówek o pojemności 50 ml wyłożonych wstępnie oznakowaną białą bibułą filtracyjną, jak opisano w kroku 1 (test płodności). Odrzuć niekarmione samice lub zaoferuj im kolejny posiłek z krwi następnego dnia. Napełnij wszystkie probówki ~5 ml wody z kranu. Umieść mały kawałek rodzynek na siatce umieszczonej na każdej stożkowej rurce.
  5. Pozostaw samice na 1-2 dni w owadzie i pozwól im złożyć jaja. Sprawdź wzrokowo bibułki jajowe przez 4-5 dni po mączce z krwi w przypadku jaj. Daj samicom dodatkowy dzień na złożenie jaj, aby zwiększyć tempo składania jaj.
  6. Aby zebrać bibułki jajowe, spuść wodę i znieczul samice, umieszczając stożkowe rurki w temperaturze 4 °C, jak opisano wcześniej. Odrzuć samice komarów, umieszczając je w 70% etanolu.
  7. Pozostaw papiery w tubkach w owadzie, aby wyschły. Użyj kleszczy, aby usunąć papiery i umieść je w polipropylenowych przezroczystych pojemnikach delikatesowych zawierających ~ 100 ml świeżo wysterylizowanej wody dejonizowanej do wylęgu. Dodaj 2-3 krople zmielonej gnojowicy z pokarmu dla ryb do karmienia ad libitum. Wyłóż górne części pojemników siatką lub organdą, zabezpieczoną gumką.
  8. Po 2-3 dniach od wyklucia wyjmij bibułki jajowe z wody i pozostaw je do wyschnięcia na noc, umieszczając je w nowym pojemniku przykrytym pokrywką lub siatką i umieszczając je z powrotem w owadzie.
  9. Ponownie wykluć bibułki jajowe w tych samych pojemnikach, umieszczając je z powrotem w pojemniku na wodę.
  10. Po 3-5 dniach od początkowego wyklucia należy przeprowadzić oględziny larw (od 2. do 4. stadium) pod kątem markera transgenicznego (jeśli dotyczy). Oblicz udział samców jako liczbę transgenicznych larw F2 podzieloną przez całkowitą liczbę larw na linię komarów.

8. Określanie długowieczności komarów

  1. Przenieś 50 samców i 50 samic komarów WT lub transgenicznych komarów w tym samym wieku, niekarmionych krwią, do odpowiedniego pomieszczenia. Użyj kartonów o pojemności 64 uncji, z górnym otworem wyłożonym wężem majtkowym, skręconym i zawiązanym, aby uzyskać łatwy dostęp i manipulację komarami w miarę postępu eksperymentu (Rysunek 7).
    UWAGA: Zaleca się zrobienie tego w trzech egzemplarzach do celów statystycznych.
  2. Zapewnij źródło cukru i wody. Używano tu rodzynek i wypełnionego wodą kubka wyłożonego gazą, zabezpieczonego dwoma gumkami.
  3. Śledź liczbę martwych samców i samic komarów każdego dnia. Oblicz długowieczność jako średnią liczbę dni, które minęły, zanim komary umrą w klatkach, pomijając komary, które umierają z przyczyn nieinformacyjnych (przyczyn niezwiązanych z długością życia komarów, takich jak zgniecenie lub utonięcie w cukrze) i pomijając komary, które są nadal żywe pod koniec badania.
    UWAGA: Przeżycie definiuje się jako prawdopodobieństwo przeżycia do czasu t lub funkcji S(t) = Pr(T>t). Mediana przeżycia to czas, w którym prawdopodobieństwo przeżycia wynosi 0,5, czyli T_0,5 = S-1 x 0,5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z powyższym protokołem oceniono kondycję dwóch linii komarów: (1) linii z knock-outem białka śliniankowego Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) za pomocą CRISPR/Cas9 oraz (2) linii Ae. aegypti wykazujących autonomiczne napędy genowe oparte na CRISPR/Cas99. W pierwszym przypadku homozygotyczna linia z knock-outem D7L1 została stworzona poprzez wykorzystanie szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) do wywołania przerwania sekwencji po mikroiniekcji embrionów sgRNA specyfic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania sprawności Ae. aegypti są często przeprowadzane w laboratorium w celu oceny kosztów dopasowania związanych z ładunkiem transgenicznym (np. elementami napędu genowego) lub nokautami genów, jak omówiono w tym manuskrypcie; jednak badania te mogą być wykonywane w różnych celach - każdy, który ma na celu ocenę zdrowia grupy Ae. aegypti, takich jak zakażony Wolbachią 30,31, odporny na insektycydy32,33...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Billowi Reidowi i Alexandrowi Franzowi z University of Missouri za ich wsparcie przy tworzeniu tego protokołu. Autorzy chcieliby również podziękować dr Benjaminowi Krajacichowi z NIH/NIAID za wsparcie w analizie R. Badanie to zostało sfinansowane przez NIH, grant numer R01 AI130085 (KEO) oraz NIH/NIAID Division of Intramural Research Program AI001246 (EC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 uncja półprzezroczyste plastikowe kubki na sufletyWebstaurantStore301100PC
2 uncje przezroczyste kubki sufletkowe z polistyrenuWebstaurantStore760P200N
3 ml plastikowe pipety Cornin357524
Probówki stożkowe 50 mlDowolna marka
64 uncje biały kubek na żywność z podwójnie powlekanego polietylenuWebstaurantStore999SOUP64WBdo osłony komarów
Soczewka 65 mm CanonMP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro PhotoCanon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; do fotografowania skrzydeł lub papieru jajowego, chociaż inne aparaty są prawdopodobnie wystarczające
Aedes aegypti  komaryBEIwiele szczepów jako jaja są dostępne
Podajniki sztucznych membranhttps://lillieglassblowers.com/Podajnik membranowy Meduim, wykonany na zamówienie, 33 mmChemglass również oferuje, ale rozmiary są dla nas niewłaściwe. Nasze mają około 3 cm?
ATPMP BiomedicalICN15026605Dowolna dobrej jakości ATP, 10mM filtr sterylne porcje w -20
Autoklawdo sterylizacji wody do wylęgu
aparatu Canon EOS 7D Kanon3814B004do fotografowania skrzydeł lub bibułek jajowych, chociaż inne aparaty są prawdopodobnie wystarczające
zdefibrynowaną krwią owczą Serum Kolorado Co.60 ml, co 2 tygodniehttps://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Podwójny oświetlacz mikroskopu na gęsiej szyiDolan Jenner Fiber-Lite 180181-1 System
Kleszczyki do etanolu
Dumont5SF
Gauzeomnisorb ii4-calowe gąbki włókninowe
szklane szkiełkomikroskopoweFisher Scientific12-544-2
Szklane szalki Petriego, 100 & razy; 15 mmVWR75845-546do znieczulania/manipulowania komarami na lodzie
Jelita świńWszelkie delikatesy, które kupujemy luzem, dzielimy, myjemy i przechowujemy w małych porcjach ~4X12" po -20 w 50 ml stożkowe
wiadro na lód
KimwipeFisher Scientific06-666A
Leica GZ4 StereoZoomdo badań przesiewowych komarów transgenicznych (jeśli dotyczy)
Pędzelsyntetyczny AIT rozmiar 10-0do manipulowania larwami/poczwarkami (Amazonka)
Wąż majtkowyWalmartL'eggs Codziennie  Damskie Nylon Plus Podkolanówki z przezroczystym palcem, 16 par (plus pasuje do kartonu)
OłówkiDowolna marka
Plastikowe pojemniki do przechowywania kartonów 2&stopnieWalmartSterilite 58 Qt Pudełko do przechowywania Przezroczysta podstawa Biała pokrywka Zestaw 8
plastikowych pojemników do hodowli larwWalmartSterilite 28 Qt. Pudełko do przechowywania Plastikowe, Biały, Zestaw 10
Plastikowe pojemniki do wylęgu larwWalmartSterilite 6 Qt. Pudełko do przechowywania Plastikowe, Białe
przezroczyste pojemniki delikatesowe z polipropylenu Sklep internetowy  127DM12BULK12 uncji lub 16 uncji w razie potrzeby dla większych (127RD16BULK)
GumkiOffice Max #100736/#909606 /#377741512", #64 i #10
Gumowy korekVWR217-0515do ochrony przed komarami
Źródło cukru, takie jak kostki cukru lub rodzynki
Tetramin płatki Tetramin16106
tpsDigStony Brook MorphometricsDarmowe oprogramowanie do morfometrycznego przetwarzania obrazów dystrybuowane online dostępne pod adresem https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtilStony Brook MorphometricsBezpłatne oprogramowanie do morfometrycznego przetwarzania obrazów dystrybuowane online dostępne pod adresem https://www.sbmorphometrics.org/
Biała tkanina z organzy 8" i razy; 8"FabricWholesale.com 4491676Joann Casa Collection Tkanina z organzy od Casa Collection 
Bibuła filtracyjna jakościowa Whitman Grade 1 Whitman1001-824do bibułek jajecznych. Biały kolor ułatwia dostrzeżenie czarnych jaj.
Mikroskop

Bibliografia

  1. Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
  2. Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
  3. Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
  4. Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
  5. Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
  6. Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
  7. Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
  8. Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
  9. Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
  10. Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
  11. Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
  12. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
  13. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  14. Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
  15. Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
  16. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
  17. Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
  18. Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
  19. Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
  20. Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
  21. Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
  24. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
  25. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
  26. Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
  27. Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
  28. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
  29. Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
  30. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  31. Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
  32. Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
  33. Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
  34. Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
  35. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  36. David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
  37. Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
  38. Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
  39. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
  40. Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
  41. Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
  42. Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
  43. Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komary transgenicznecechy historii życianapęd genowymorfometria skrzydełpomiar płodnościżywotność larwanaliza stosunku płcidługość życia osobników dorosłych
Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.