Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Summary

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Abstract

Wbudowany druk 3D komórek wewnątrz ziarnistego medium wsparcia stał się w ostatniej dekadzie potężnym podejściem do swobodnej biofabrykacji konstrukcji tkanek miękkich. Jednak formuły granulowanych żeli zostały ograniczone do ograniczonej liczby biomateriałów, które umożliwiają opłacalną produkcję dużych ilości mikrocząstek hydrogelu. Dlatego granulowane żelowe nośniki wspomagające zazwyczaj nie posiadały funkcji adhezji komórkowej i indukcyjnej, które występują w natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).

Aby temu zaradzić, opracowano metodologię generowania samonaprawiającej się wyżarniającej się kompozytów z macierzą cząstek i zewnątrzkomórkowych (SHAPE). Kompozyty SHAPE składają się z fazy ziarnistej (mikrożeli) i fazy ciągłej (lepki roztwór ECM), które razem umożliwiają zarówno programowalny druk wysokiej jakości, jak i regulowane biofunkcjonalne środowisko zewnątrzkomórkowe. Praca ta opisuje, jak opracowana metodologia może być wykorzystana do precyzyjnej biofabrykacji ludzkich konstrukcji neuronowych.

Po pierwsze, mikrocząstki alginatu, które stanowią ziarnisty składnik w kompozytach SHAPE, są wytwarzane i łączone z ciągłym komponentem kolagenowym. Następnie wewnątrz materiału wsparcia drukowane są ludzkie komórki macierzyste nerwowe, a następnie wyżarzane są nośniki. Wydrukowane konstrukty można utrzymywać przez tygodnie, aby umożliwić różnicowanie nadrukowanych komórek w neurony. Jednocześnie faza ciągła kolagenu umożliwia wyrost aksonów i powiązania regionów. Wreszcie, prace te dostarczają informacji o tym, jak wykonywać obrazowanie fluorescencji żywych komórek oraz immunocytochemię w celu scharakteryzowania ludzkich konstrukcji neuronalnych wydrukowanych w 3D.

Introduction

Precyzyjny i programowalny druk 3D konstrukcji hydrożelowych z komórkami, które naśladują tkanki miękkie in vitro , stanowi poważne wyzwanie. Na przykład próby oparte na bezpośrednim wytłaczaniu miękkich hydrożeli są z natury problematyczne, ponieważ słabe właściwości mechaniczne niezbędne do odtworzenia mikrośrodowiska in vivo prowadzą do braku integralności strukturalnej, deformacji wcześniej określonych cech lub całkowitego załamania się struktur wykonanych. Konwencjonalnym obejściem tego problemu jest wydrukowanie rusztowania nośnego z sztywniejszego materiału biokompatybilnego, co pozwala końcowej konstrukcji zachować kształt. Jednak takie podejście znacznie ogranicza możliwości projektowe i wymaga starannego reologicznego dostrojenia sąsiednich tuszów.

Aby przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnego druku 3D opartego warstwa po warstwie, w ostatnich latach wyłonił się druk 3D wbudowany jako potężna alternatywa dla produkcji miękkich materiałów i tkanek 1,2,3,4,5,6. Zamiast wytłaczać atrament w powietrzu na powierzchnię, atrament jest bezpośrednio osadzany przez igłę strzykawki wewnątrz kąpieli nośnej, która w spoczynku jest podobna do ciała stałego, ale odwracalnie płynie wokół ruchomego końcówki igły, umożliwiając precyzyjne osadzanie miękkiego materiału wypełnionego komórkami. Zdeponowany materiał jest utrzymywany na miejscu, gdy podparcie ponownie się zastyga po wbiciu igły. W związku z tym wbudowany druk 3D umożliwia wysokorozdzielcze, swobodne wytwarzanie złożonych struktur z miękkich biomateriałów z rozszerzonymi możliwościami projektowania ^7,8.

Granularne żele były szeroko badane jako materiały do kąpieli wsparcia do drukowania 3D w osadzeniu, ponieważ mogą być opracowane tak, aby wykazywać gładkie, lokalizowane i odwracalne przejścia z ciała stałego do cieczy przy niskich granicach plastyczności ^9,10,11. Chociaż wykazują doskonałe właściwości reologiczne do druku w wysokiej rozdzielczości, żele granularne zostały ograniczone do kilku biomateriałów¹². Brak różnorodności w formułach żeli granularnych, szczególnie widoczny, jeśli weźmie się pod uwagę szeroki zakres biomateriałów dostępnych do formuł hydrożeli masowych, wynika z potrzeby ekonomicznego generowania dużej liczby mikrożeli przy użyciu prostych chemikaliów. Ze względu na ograniczone zasoby biomaterialne podłoża żelowego, dostrojenie mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego zapewnianego przez wsparcie drukarskie stanowi wyzwanie w tej dziedzinie.

Ostatnio opracowano modułowe podejście do generowania wbudowanych podpór do druku 3D, nazwane samonaprawiającymi się wyżansowalnymi macierzami cząstek i komórek komórkowych (SHAPE) kompozytów¹³. Podejście to łączy charakterystyczne właściwości reologiczne żeli ziarnistych z biofunkcjonalną wszechstronnością formuł hydrożeli objętych. Prezentowane wsparcie kompozytowe SHAPE składa się z upakowanych mikrocząstek alginatu (faza ziarnista, ~70% ułamka objętościowa) z powiększoną przestrzenią międzymiąższową wypełnioną lepkim roztworem preżelu ECM na bazie kolagenu (faza ciągła, ~30% ułamka objętościowa). Wykazano również, że wsparcie SHAPE ułatwia wysokorozdzielczą depozycję ludzkich komórek macierzystych nerwowych (hNSC), które po wyżarzeniu kąpieli wsparcia mogą być zróżnicowane w neurony i utrzymywane przez tygodnie, aby osiągnąć funkcjonalną dojrzałość. Wbudowany druk 3D wewnątrz kąpieli wsparcia SHAPE przezwycięża niektóre z głównych ograniczeń związanych z konwencjonalnymi technikami biofabrykacji tkanek nerwowych, zapewniając jednocześnie wszechstronną platformę.

Praca ta opisuje kroki osadzonego druku 3D hNSC wewnątrz wsparcia SHAPE oraz ich późniejszą różnicację w neurony funkcjonalne (Rysunek 1). Po pierwsze, mikrocząstki alginatu powstają poprzez ścinanie podczas żelacji wewnętrznej. Takie podejście umożliwia łatwe generowanie dużych ilości mikrocząstek bez potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu i cytotoksycznych odczynników. Ponadto alginatan jest szeroko dostępnym i ekonomicznym źródłem materiału do tworzenia biokompatybilnych podłoży hydrożelowych dla różnorodnych typów komórek. Wygenerowane mikrocząstki alginatu są łączone z roztworem kolagenowym, tworząc kompozytowy materiał wspierający SHAPE. Następnie hNSC są pobierane i ładowane do strzykawki jako biotusz komórkowy do druku 3D. Biodrukarka 3D jest używana do drukowania hNSC w formie wytłaczania wbudowanego wewnątrz kompozytu SHAPE. Komórki wydrukowane w 3D są zróżnicowane w neurony, tworząc przestrzennie zdefiniowane i funkcjonalne ludzkie konstrukcje neuronowe. Na koniec protokół opisuje, jak można scharakteryzować wygenerowane konstrukty tkankowe za pomocą obrazowania żywych komórek i immunocytochemii. Dodatkowo podano wskazówki dotyczące optymalizacji i rozwiązywania problemów. Warto zauważyć, że zarówno składniki fazy ziarnistej, jak i ciągłej mogły być wymieniane z innymi formułami hydrożelu, aby dostosować różne biofunkcjonalne części, właściwości mechaniczne i mechanizmy sieciowania, zgodnie z wymaganiami innych typów komórek i tkanek poza zastosowaniami neuronowymi.

Protocol

1. Przygotowanie buforów i odczynników

1. Przygotuj podłoże do wzrostu komórek, dodając do DMEM/F12 następujące suplementy z dipeptydem L-alanyl-glutaminy: 30 mM glukozy, 5 μM HEPES, 0,5% w lipidy bogatej w lipidy albuminy surowicy bydła, 40 μM L-alaniny, 40 μM monohydratu L-asparaginy, 40 μM kwasu L-aspartynowego, 40 μM kwasu L-glutaminowego, 40 μM L-proliny, 1% suplementu N2, 1% penicylin-streptomycyny, oraz po 20 ng/L po 20 ng/L naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i fibroblastowego (FGF). Wykonaj te kroki na ławce z laminarnym przepływem powietrza (LAF).
2. Przygotuj 1% roztwór alginianu w/v w wodzie ultraczystej, intensywnie mieszając przez 4 godziny w 60 °C. Przefiltruj rozpuszczony, gorący roztwór alginianu sterylnie za pomocą filtra o wielkości poru 0,45 μm na stole LAF. Przechowuj ją w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Jeśli temperatura roztworu alginatu spadnie poniżej 60 °C, nie będzie możliwe przepuszczenie go przez filtr.
3. Przygotuj roztwór NaHCO₃ o pojemności 37 g/l w wodzie ultraczystej. Reguluj pH roztworu do 9,5 za pomocą NaOH i sterylizuj filtrem na stole LAF. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie materiałów kompozytowych SHAPE

1. Generowanie mikrocząstek alginatowych
   1. Przygotuj roztwór CaCO₃ o stężeniu 2 mg/mL w ultraczystej wodzie w sterylnej zlewce. Wymieszaj 1:1 z roztworem alginanu i mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego.
   2. Dodaj kwas octowy w proporcji 1:500 i pozostawij mieszanie przez noc przy 650 obr./min.
      UWAGA: Roztwór alginatu zacznie się żelować natychmiast. Upewnij się, że używasz magnesu mieszającego o długości takiej samej jak średnica szkła, aby zapewnić optymalne, jednorodne mieszanie żelu formującego. Następnego dnia roztwór powstały podczas mieszania podczas żelacji będzie wyglądał na lepki (Rysunek 2A).
   3. Mechanicznie rozdrobnić roztwór żelowanego alginianu na mikrocząstki, ujednolicając go przy 15 000 obr./min przez 10 minut za pomocą homogenizatora umieszczonego na stole LAF (Rysunek 2B).
   4. Mikrocząstki wiruj w temperaturze 18 500 × g przez 20 minut (rysunek 2C) w temperaturze pokojowej.
   5. Ostrożnie wyrzuć supernatant wewnątrz stołu LAF, ponownie zawiesić cząstki w DMEM zawierającym 2 mM NaOH i 1% P/S oraz inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 2D).
      UWAGA: Kolor zawieszenia powinien wrócić do czerwonego. Jeśli zawieszenie pozostaje żółte, dodaj NaOH kropelo i mieszaj, aż stanie się czerwone (Rysunek 2E).
   6. Homogenizuj cząstki z prędkością 15 000 obr./min przez 3 minuty i wiruj w 18 500 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Obserwuj granulkę (rysunek 2F) i ostrożnie usuń supernatant.
      UWAGA: Granulki z gęsto upakowanymi mikrocząstkami alginatu można przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia. Jeśli roztwór alginianu nie został wysterylizowany filtrem, mikrocząstki powinny zostać zużyte w ciągu tygodnia.
2. Formuła kompozytowa SHAPE
   1. Dzień przed drukiem ponownie zawiesij mikrocząsteczkowy granulat alginatu w dwukrotnie większej objętości medium wzrostu zawierającego 4% HEPES (1 M zapasu) i 4% roztworu NaHCO₃ na stole LAF i inkubuj go przez noc w temperaturze pokojowej.
   2. Wirówka zawiesiny mikrożelowej w stężeniu 18 500 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant.
   3. Zneutralizuj kolagen do mieszania z mikrocząstkami alginatu na stole LAF. Rozcieńcz roztwór zapasów kolagenu, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/mL, a następnie zneutralizuj go, dodając 4% HEPES i 4% NaHCO₃. Na przykład, dla 3 mL kompozytu SHAPE wymieszaj 2 mL mikrocząstek alginianu z 1 mL zneutralizowanego kolagenu (0,12 mL HEPES, 0,12 mL NaHCO₃, 0,16 mL podłoża wzrostu i 0,6 mL kolagenu).
      UWAGA: Wszystkie materiały mieszane z kolagenem muszą być obsługiwane na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji kolagenu. Gdy tylko kolagen zostanie zneutralizowany, polimeryzacja zaczyna się powoli.
   4. Generuj kompozyt SHAPE, mieszając mikrogranulat alginatu z rozcieńczonym i zneutralizowanym kolagenem w proporcji 2:1. Dokładnie wymieszaj żel, pipetując powoli na lodzie na ławce LAF.
      UWAGA: Nie wiruj, ponieważ wprowadzi to pęcherzyki do materiału nośnego.
   5. Na stole LAF przenieś wygenerowany materiał kompozytowy na schłodzoną płytkę mikrodołową lub dowolny odpowiedni pojemnik drukarski i użyj w ciągu 30 minut (rysunek 3E, F).

3. hodowla hNSC i przygotowanie biotuszu

1. Hodować komórki w kolbie T75 pokrytej ekstraktem z błony podstawnej w podłożu wzrostowym. Po rozmrożeniu przepuszczaj komórki co najmniej dwa razy, zanim wykorzystasz je do eksperymentu z drukiem 3D.
2. Przed drukiem należy enzymatycznie rozdzielić komórki za pomocą roztworu 0,025% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C, zneutralizować trypsynę medium wzrostu i wirować zawiesinę komórkową w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu zasysaj supernatant i ponownie zawiesij pellet w 2-3 mL podłoża wzrostu.
3. Wykonaj liczenie komórek, odwiądź komórki w 400 × g i ponownie zawiesij pellet w ośrodku wzrostu z dodatkiem 0,1% gumy ksantanowej (aby zapobiec sedymentacji) przy końcowym stężeniu 9 × 10^{6 komórek} /mL.
4. Użyj 21 g igły tępego metalu, aby załadować 100 μL ściśle upakowanych mikrocząstek alginatu do strzykawki (Rysunek 3A).
   UWAGA: Tworzenie korka z mikrocząstek alginatu służy dwóm celom: pomaga utrzymać stabilność wyciągania podczas druku oraz umożliwia całkowite wytłaczanie załadowanego tuszu komórkowego (bez martwej objętości).
5. Używając tej samej igły, załaduj przygotowaną zawiesinę komórkową do strzykawki (rysunek 3B).
   UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków powietrza podczas ładowania strzykawki. Pęcherzyki powietrza powodują niestabilności podczas drukowania.
6. Zamień igłę ładowającą na tępą metalową igłę o masie 27 G, która będzie używana do druku (rysunek 3C).

4. Wbudowany druk 3D

1. Zaprojektuj strukturę do druku za pomocą wskazanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Upewnij się, że początkowa wysokość wydrukowanej konstrukcji jest dostosowana do głębokości kompozytowej podpory SHAPE. Sugestie projektowe można znaleźć na Rysunku 4A (spiralne i drewniane wzory).
2. Wygeneruj kod G, klikając na Generuj.
3. Włóż szklaną strzykawkę wypełnioną komórkami do głowicy wytłaczania objętościowej na bioprinterze opartym na wytłaczaniu (Rysunek 3D).
4. Zmierz długość igły szklanej strzykawki wypełnionej komórkami, klikając na Pomiar długości igły.
5. Połóż płytkę lub pojemnik mikrodołek załadowany kompozytem SHAPE na drukarce.
   UWAGA: Utrzymuj płytkę lub pojemnik w temperaturze 4 °C aż do wydruku, aby zapobiec przedwczesnemu sieciowaniu podpór.
6. Zmierz wysokość powierzchni pustej studni w tej samej mikrodołce lub pojemniku, do którego załadowany jest żel SHAPE, klikając na SHM (pomiar wysokości powierzchni).
   UWAGA: Alternatywnie, można określić wysokość powierzchni ręcznie, mierząc wysokość dołka igłą.
7. Ustaw szybkość wyciągania na 3,6 μL/min, a prędkość podawania na 0,3 mm/s.
   UWAGA: Przed drukowaniem upewnij się, że testujesz wyciąganie. Sedymentacja komórek może powodować zatykanie dyszy i można jej uniknąć, wstępnie wytłaczając niewielką objętość przed faktycznym osadzonym drukiem lub dodając objętość retrakcyjną do strzykawki objętościowej. W niektórych przypadkach prędkość podawania powinna być utrzymywana poniżej 0,5 mm/s podczas wprowadzania igły do lub wychodzenia z żelu SHAPE, aby uniknąć przeciągania tuszu.
8. Załaduj kod G do interfejsu drukarki.
   UWAGA: Za każdym razem, gdy wprowadzane są zmiany w zaprojektowanej strukturze, należy generować nowy G-Code.
9. Rozpocznij procedurę drukowania, klikając na Uruchom (Rysunek 3G).
10. Bezpośrednio po wydruku umieść żel SHAPE w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut w celu wyżarzania.
11. Delikatnie dodaj podłoże do wzrostu na wyżarzonym żelowym podłożu SHAPE.
12. Następnego dnia zastąpić podłoże wzrostowe podłożem różnicującym o sformułowaniu następująco: DMEM/F12 dipeptydem L-alanyl-L-glutaminy o stężeniu 30 mM glukozy, 5 μM HEPES, 0,5% ogólno-bogatej w lipidy w surowicy bydłej albuminie w surowicy, 40 μM L-alaniny, 40 μM monohydratu L-asparaginy, 40 μM kwasu L-aspartynowego, 40 μM L-proliny, 1% suplement N2, 1% penicylina-streptomycyna, 100 μM dibutyrylowo-cykliczna adenozynomonofosforan (dibutyryl-cAMP) oraz 2 ng/mL czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF).
    UWAGA: Upewnij się, że nie uszkodzi hydrożelu podczas wymiany podłoża. Przechyl płytkę i delikatnie wyjmij starą podłożną płytę. Nakładaj świeże medium kropelo do ściany dołku zawierającego żel, a nie bezpośrednio na żelu. Nie używaj aspiratora do usuwania medium.
13. Odświeżaj podłoże różnicujące co 2 dni aż do osiągnięcia punktu końcowego eksperymentalnego.

5. Obrazowanie fluorescencji z użyciem żywych komórek

1. Usuń nadmiar medium z żelu.
2. Dodaj równą objętość 20 μM kalceiny AM (rozcieńczonej w medium różnicującym z roztworu zapasowego) do objętości żelu wspierającego.
3. Inkubuj przez 40 minut w temperaturze 37 °C.
4. Usuń roztwór kalceiny AM i dodaj odpowiednią ilość świeżego medium różnicowego.
5. Przenieś płytkę do mikroskopu do obrazowania.

6. Immunocytochemia

1. Usuń nadmiar medium z żelu.
2. Używając małej łopatki, przełóż żel do większego pojemnika zawierającego DPBS.
3. Za każdym razem myj trzy razy przez 20 minut za pomocą DPBS, a następnie przełóż płytę do okapu spalinowego.
4. Usuń DPBS, dodaj wystarczającą ilość 4% roztworu formaldehydu, aby pokryć żel, i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Myj trzy razy DPBS przez 20 minut za każdym razem.
6. Przygotuj roztwór blokujący składający się z 5% surowicy osła, 0,25% detergentu i 0,02% azyku sodu w DPBS.
   UWAGA: Przygotuj trzy razy więcej objętości potrzebnej do pokrycia żelu; Później zostanie wykorzystana jako podstawa dla rozwiązań przeciwciał pierwotnych i wtórnych.
7. Po umyciu DPBS dodaj roztwór blokujący do żelu i inkubuj przez 6 godzin w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Delikatnie kołysz płytę.
8. Przygotuj pierwotny roztwór przeciwciał, rozcieńczając przeciwciało TUBB3 w roztworze blokującym w proporcji 1:1 000.
9. Usuń roztwór blokujący z żelu, dodaj pierwotny roztwór przeciwciał i inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Delikatnie kołysz płytę.
10. Myj trzy razy DPBS przez 20 minut za każdym razem.
11. Przygotuj roztwór przeciwciał wtórnych, rozcieńczając 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1 000) oraz przeciwciało wtórne (1:200) w roztworze blokującym.
12. Po umyciu DPBS inkubuj żel w roztworze przeciwciał wtórnych przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Delikatnie kołysz płytę.
13. Myj trzy razy DPBS przez 20 minut za każdym razem i przechowuj w temperaturze 4 °C aż do wykonania obrazowania.
14. Przed obrazowaniem przenieś zabarwiony żel szpatułką do naczynia lub płytki z cienkim dnem obrazującym.

Results

Przygotowanie mikrożelu alginanowego poprzez ścinanie podczas żelacji wewnętrznej, a następnie fragmentację mechaniczną, daje mikrożele alginanowe o rozmiarze polidysperseyjnym i kształtach przypominających płatki, jak widać na rysunku 2G. Rozmiar tych nieregularnych cząstek waha się od mniej niż 1 μm do około 40 μm średnicy. Gdy są ściśle upakowane, mikrocząstki tworzą przezroczysty materiał objętościowy, który jest tylko nieco bardziej nieprzezroczysty niż odpowiadające mu medium hodowlane komórki (Rysunek 2F). Przezroczystość materiału nośnego jest ważnym aspektem platformy, ponieważ umożliwia wizualizację wydrukowanych struktur podczas okresu hodowli, a także umożliwia wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalną konstruktów oznaczanych zarówno barwnikami z komórek żywych, jak i immunocytochemią . Po namoczeniu w buforowanym pożywce komórkowym, powstały żel o pH powinien mieć czerwony kolor, co wskazuje na warunki fizjologiczne (rysunek 2F). Ważne jest, aby zneutralizować pH mikrocząstek alginatu z dwóch powodów. Kwaśne mikrocząstki mogą bezpośrednio szkodzić komórkom. Ponadto kwaśne środowisko uniemożliwi skuteczne wyżarzanie kompozytowego podparcia SHAPE, ponieważ zakłóca polimeryzację kolagenu.

Drukowanie atramentu hNSC przy użyciu opisanych powyżej parametrów daje filament komórek o średnicy ~200 μm (rysunek 4A). Zaprogramowana geometria jest zachowywana zarówno podczas drukowania w jednej płaszczyźnie, jak i podczas drukowania struktur na sobie. W przypadku druku wielowarstwowego struktury drukowane pozostają nienaruszone, z minimalną odległością warstwa po warstwie wynoszącą 200 μm¹³. Żywotność komórek nie powinna być znacząco zakłócona podczas przygotowania i ekstruzji tuszu. Wydrukowane nici są bogate w żywe komórki o okrągłej morfologii (Rysunek 4B, po lewej). Szczeliny w wydrukowanych włóknach mogą pojawić się dzień po wydruku, nawet jeśli wykonana konstrukcja nie wykazuje żadnych odkształceń bezpośrednio po druku. Najprawdopodobniej jest to efekt niejednorodnego mieszania podpór. Ponieważ komórki nie oddziałują z mikrocząstkami alginatu, migrują one z obszarów bogatych w alginany w kierunku obszarów bogatych w kolagen i komórki, powodując tym samym przerwy w wydrukowanych niciach. Ponadto wsparcie SHAPE powinno być wolne od pęcherzyków, ponieważ kieszenie powietrzne mogą zakłócać jakość druku.

Udana różnicacja hNSC powinna dać struktury bogate w neurony 30 dni po wydruku, z komórkami wykazującymi morfologię neuronów z małymi ciałami komórkowymi i długimi, cienkimi wyrostkami (Rysunek 4B, po prawej). Ponadto, jeśli wydrukowane są gęste wzory, takie jak prostokątna warstwa komórek, nie powinno być widocznych szczelin ani agregatów powstających podczas różnicowania, lecz powinna pozostać nienaruszona ciągła warstwa komórek (rysunek 4C). W tym protokole opisana jest procedura immunocytochemii fluorescencyjnej próbek wydrukowanych w 3D. Barwienie dla TUBB3, cytoplazmatycznego markera neuronalnego, umożliwia bezpośrednią wizualizację generowanych sieci neuronalnych. Mikroskopia fluorescencyjna różnicowanych odbitków powinna ujawnić struktury bogate w TUBB3 i zachowane geometricznie (Rysunek 4D, po lewej). Podczas procesu różnicowania komórki nie migrują poza wydrukowane nici, co można zaobserwować podczas barwienia jąder komórkowych DAPI (rysunek 4D, środek). W rezultacie ciała neuronalne są obserwowane w granicach wydrukowanej geometrii, z projekcjami aksonalnymi emanującymi setki mikrometrów do podpór SHAPE otaczającego konstrukcję. Eksploracja aksonalna otaczającej objętości wskazuje, że wsparcie SHAPE dostarcza biofunkcjonalnych wskazówek umożliwiających aksonalne wyznaczanie ścieżek. Dojrzałe markery neuronalne lub markery specyficzne dla podtypu mogłyby być wykorzystywane w immunocytochemii do dalszego charakteryzowania generowanych populacji neuronów. Ponadto wydrukowany konstrukcja neuronalna może być scharakteryzowana za pomocą RT-qPCR lub elektrofizjologii¹³. Oba podejścia wymagałyby jednak usunięcia kolagenu za pomocą kolagenazy, ponieważ warstwa hydrożelu blokuje zarówno ekstrakcję RNA, jak i fizyczny dostęp do komórek za pomocą mikropipety.

Rysunek 1: Koncepcyjna ilustracja podejścia SHAPE z osadzonym drukiem. Roztwór kolagenu miesza się z mikrocząstkami alginatu, tworząc kompozyt SHAPE; kompozyt SHAPE jest używany jako materiał pomocniczy do wbudowanego druku 3D hNSC, które są zróżnicowane w neurony wewnątrz wyżarzonego podłoża. Biofunkcjonalne właściwości kompozytu SHAPE pozwalają neuronom rozszerzać projekcje i wypełniać pustą część podpory swoimi aksonalnymi projekcjami. Figurka ta została zmodyfikowana na podstawie Kajtez i ^in.13. Skróty: SHAPE = samonaprawiająca, wyżarniająca się macierz cząstkowa-zewnątrzkomórkowa; hNSC = ludzkie komórki macierzyste nerwowe. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Przygotowanie mikrocząstek alginatu. (A) Roztwór alginatu po żelacji przez noc. (B) Mikrocząstki alginatu powstające w wyniku homogenizacji. (C) Granulki cząstek po wirówce. (D) Pellet został ponownie zawieszony w DMEM (E) przed zmianą pH i po jej zmianie. (F) Mikrocząstki po inkubacji w medium przez noc i wirówce. (G) Obraz w jasnym polu wytwarzanych mikrocząstek alginatu. Pasek skali = 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 3: Przygotowanie do procesu druku 3D. (A) Do strzykawki ładuje się korek zawiesiny (~100 μL), a następnie (B) nakłada się biotusz komórkowy (tutaj uzupełniony kolorowymi kulkami dla celów wizualizacji). (C) Stożkowa plastikowa końcówka (21 G) używana do załadunku atramentem zostaje zastąpiona tępą metalową końcówką igły o masie 27 G. (D) Strzykawka jest wkładana do głowicy drukującej 3D. (E,F) Kompozyt SHAPE jest podłączany do studni o 48-dołowej płytce. Rurka z kompozytem SHAPE jest przechowywana na lodzie, gdy nie jest obsługiwana. (G) Końcówka igły drukarskiej jest wstawiana do podpory SHAPE, a rozpoczyna się drukowanie ścieżki wyznaczonej przez projekt komputera (tutaj przedstawiono drukowanie spirali). Skrót: SHAPE = samonaprawiająca, wyżansowana matryca cząsteczkowa z zewnątrzkomórkową. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Konstrukcje neuronalne wydrukowane 3D wewnątrz kompozytowego podłoża SHAPE. (A) Obrazy jasnego pola wydrukowanych hNSC wewnątrz hydrożelu wsparcia. Prezentowane są konstrukcje spiralne (po lewej) i stosu drewna (po prawej). (B) Obrazowanie żywymi komórkami wydrukowanej 3D konstrukcji dzień po wydruku (po lewej) i po różnicowaniu neuronów (po prawej). (C) Konstrukcja kwadratowa wydrukowana w 3D wyjęta z studni do hodowli za pomocą łopatki wykazuje integralność strukturalną. (D) Fluorescencyjne obrazy konfokalne tego samego kwadratowego konstruktu immunoznakowanego pod kątem markera neuronalnego (TUBB3) oraz z przeciwbarwionymi jądrami (DAPI), potwierdzające skuteczną różnicację hNSC w konstrukcjach wydrukowanych 3D. Pręty skalowe = 500 μm (A, po prawej); 100 μm (B,D). Panele C i D na tym rysunku zostały zmodyfikowane na podstawie Kajteza i ^in.13. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

Podejście SHAPE do materiałów kompozytowych zapewnia wszechstronną drogę do formułowania wyżarzalnych i biofunkcjonalnych kąpieli wsparcia do osadzonego druku 3D tuszów komórkowych. Chociaż protokół ten stanowi przykład druku 3D konstrukcji neuronalnych, zestaw narzędzi SHAPE można łatwo dostosować do biofabrykacji z innymi źródłami komórek, aby precyzyjnie inżynierować różne typy docelowych tkanek. Podejście drukarskie pozwoliłoby również na precyzyjne wzorowanie wielu typów komórek w celu badania ich interakcji lub inżynierii tkanek z określonym układem przestrzennym przedziałów komórkowych (np. neuronów i komórek glejowych). W przeciwieństwie do tradycyjnych żeli ziarnistych, kompozyt SHAPE zawiera rozszerzoną przestrzeń międzymiąższową (~30% ułamka objętościowa dla formuły przedstawionej w tym protokole). Komponent ziarnisty pełni rolę modyfikatora reologicznego, który nadaje kompozytowi korzystne właściwości materiałowe do drukowania w wysokiej rozdzielczości w osadzeniu. Otwiera to drogę do racjonalnego projektowania mikrośrodowiska komórkowego poprzez zmianę formułowania składnika ciągłego, zachowując ten sam składnik ziarnisty. Na przykład do kąpieli wsparcia można wprowadzić inne funkcjonalne cząsteczki ECM (np. kwas hialuronowy, lamininy, fibronektyna) lub można wykorzystać inne mechanizmy sieci (np. enzymatyczne, oparte na świetle)¹³. Ponadto alginian w składniku ziarnistym można zastąpić mikrocząstkami pochodzącymi z różnych materiałów hydrożelowych (np. żelatyna⁸, glikol polietylenowy^14,15, agaroza¹⁶) lub produkować w różnych rozmiarach i kształtach, zgodnie z potrzebami różnych zastosowań inżynierii tkankowej lub modelowania chorób. Stosunek fazy granularnej do ciągłej można dostosować do potrzeb poszczególnych projektów druku 3D, ale zwiększenie fazy ciągłej powyżej 30% może obniżyć jakość i rozdzielczość druku.

Podczas etapów produkcji mikrożelu kluczowe jest, aby mieszanie roztworu alginianu po dodaniu kwasu octowego było skuteczne w całej objętości roztworu żelowego. Jeśli prędkość mieszania jest zbyt niska lub mieszadła magnetyczna zbyt mała, mieszanie może nie dotrzeć do górnych warstw roztworu, które zamieniają się w dużą objętość zesieciowanego hydrożelu objętościowego, podczas gdy dolne warstwy zostaną ścinane. Homogenizacja nierównomiernie ścinanego hydrożelu alginianowego skutkuje powstawaniem mikrocząstek alginatu, które są nieoptymalne do zastosowań w druku 3D. Ponadto mikrocząstki alginatu muszą być dokładnie wymieszane z roztworem kolagenowym, ponieważ niejednorodna mieszanina spowoduje powstanie plam materiału nośnego bez kolagenu; Te poprawki nie byłyby wyżarzane, a więc brakowałoby im funkcji interaktywnych z komórkami. Mogą też występować łaty bez mikrocząstek alginatu, przez co nie będą wspierać druku. Niejednorodnie mieszane wsparcie drukarskie nie byłoby w stanie obsłużyć druku wysokiej wierności i byłoby strukturalnie ograniczone, ponieważ nie byłoby wyżarzane przez cały swój pojem. Należy również unikać pęcherzyków, nie dlatego, że mogą być szkodliwe dla komórek, ale dlatego, że kieszenie powietrzne mogą powodować deformacje podczas druku i utrudniać obrazowanie konstrukcji. Dwa powszechne źródła pęcherzyków to wirowanie (mikrobąbelki w zimnym podłożu, które rozszerzają się podczas wyżarzania podpór w temperaturze 37 °C) oraz intensywne pipetowanie.

Kompozytowy materiał SHAPE w tej pracy nie został sformułowany jako materiał ofiarny do usunięcia po druku, lecz jako długoterminowe biofunkcjonalne wsparcie zarówno dla różnicowania komórek macierzystych, jak i wzrostu neuronów oraz funkcjonalnej dojrzewania. W porównaniu do żeli granularnych, które nie są wyżarzane po druku, stabilność strukturalna i przezroczystość wyżarzonego materiału kompozytowego SHAPE zapewniają ochronne środowisko dla delikatnych cech neuronalnych podczas procesu utrwalania i immunoznakowania, dzięki czemu materiał ten ułatwia charakteryzację morfologiczną poprzez wizualizację antygenów. Raporty fluorescencji mogłyby być również wykorzystywane do śledzenia zmian morfologii komórkowej w czasie oraz monitorowania proliferacji i migracji komórkowej w obrębie wyżarzonego podzespołu druku. Ponadto podejścia do obrazowania wapnia mogłyby być wykorzystywane do dostarczania informacji o spontanicznej aktywności komórkowej (np. wyładowaniu potencjałów czynnościowych w neuronach lub nawet synchronicznej aktywności sieci neuronalnej). Jednak chemiczna stymulacja inżynieryjnych konstrukcji komórkowych (np. stymulacja neuronów za pomocą KCl) może być trudna ze względu na warstwę hydrożelu otaczającą komórki, która spowalnia dyfuzję i uniemożliwia natychmiastową modulację mikrośrodowiska komórkowego. Stymulacja optogenetyczna stanowi lepszą opcję kontroli aktywności komórkowej, ponieważ hydrożele SHAPE nie blokują optycznego dostępu do komórek.

Kulki wrażliwe na tlen mogły być włączane do biotuszu lub materiału pomocniczego (poprzez bezpośredni druk lub dyspersję podczas przygotowania kompozytu), co umożliwiało na żywo mapowanie poziomów napięcia tlenu wewnątrz i wokół wydrukowanych konstrukcji o wysokiej czułości¹³. To nieinwazyjne podejście do 3D mapowania tlenu, oparte na pomiarach życia fosforescencji, umożliwia inżynierię konstrukcji tkankowych o lepszej tleności, a prawdopodobnie także o lepszym zaopatrzeniu w składniki odżywcze. Słabe natlenienie może prowadzić do powstawania martwiczych obszarów w wydrukowanych konstrukcjach, zakłócać różnicowanie komórek macierzystych oraz wpływać na metabolizm neuronalny. Mapowanie tlenu dostarcza odczytu, na podstawie którego projekt druku 3D może być modyfikowany, aby umożliwić jednolite natlenienie w całej konstrukcji, precyzyjne dostrojenie poziomów tlenu do warunków fizjologicznych lub generowanie gradientów tlenu.

Kanały inżynieryjne mogły być również włączone do wyżarzalnego podłoża drukarskiego poprzez drukowanie atramentu ofiarnego, takiego jak żelatyna, który twardnie wewnątrz zimnej kąpieli wsparcia, ale można go łatwo opróżnić w temperaturze 37°C ^4,13. Kanały byłyby potrzebne do dostarczania składników odżywczych i tlenu do struktur tkankowych o wysokiej gęstości komórek lub wymiarach przekraczających możliwości podejścia do manipulacji napięciem tlenu opartego na projektach. Dodatkowo, kanały przypominające naczynia mogą być wykorzystywane do tworzenia gradientów małych cząsteczek, które kształtują tożsamość komórkową, modulują aktywność komórkową lub kierują chemotaksją.

Podsumowując, wbudowany druk 3D wewnątrz kompozytu SHAPE oferuje modułową platformę materiałową, która jest łatwo adaptowalna i ma wszechstronny potencjał do funkcjonalnego modelowania tkanek wrażliwych mechanicznie. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo wyjaśnia niezbędne kroki i podstawowe zasady potrzebne do wygenerowania materiału pomocniczego i drukowania tuszu komórkowego z wysoką wiernością. Podejście to wykorzystuje przystępne cenowo materiały i dostępny sprzęt, jednocześnie dając przestrzeń do personalizacji podejścia do potrzeb i zastosowań poszczególnych badaczy.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL strzykawki gazoszczelnej 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11001	Kozy anty-Myszy
Tępa igła, sterikanowa (21 G)	Braun	9180109
Tępa igła (27 G)	Cellink	NZ5270505001
Oprogramowanie BioCAD	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Węglan wapnia	Sigma-Aldrich	C5929
Sól sodowa dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Kolagen I (5 mg/mL)	R& D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Serum osła	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R& D Systems	236-EG
FGF	R& D Systems	3718-FB
Roztwór formaldehydu 4%, buforowany, pH 6,9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R& D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
Bufor HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
Monohydrat L-Asparaginy	Sigma-Aldrich	A4284
Kwas L-asparaginowy	Sigma-Aldrich	A9256
Kwas L-glutaminowy	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Mieszadło magnetyczne RET podstawowe	IKA	3622000
Dodatek N-2	ThermoFisher	17502048
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFisher	15140122
Narzędzie rozpraszające S25N-10G	IKA	4447100
Alginian sodu (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Azyd sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881
Cyfrowy homogenizator T18 ULTRA-TURAX	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Roztwór trypsyny/EDTA	ThermoFisher	R001100
Przeciwciało TUBB3	BioLegend	801213	Mysz
Guma ksantanowa	Sigma-Aldrich	G1253