Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

DOI:

10.3791/65176

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  , 
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora mózgowa jest najbardziej zewnętrzną strukturą mózgu i jest odpowiedzialna za przetwarzanie danych sensorycznych i motorycznych; jest postrzegana jako siedziba wyższych zdolności poznawczych u ssaków, w szczególności naczelnych. Badanie funkcji genów w mózgach naczelnych jest wyzwaniem ze względów technicznych i etycznych, ale opracowanie technologii organoidów mózgowych umożliwiło badanie rozwoju mózgu w tradycyjnych modelach naczelnych (np. makaków rezusów i marmozet), a także u wcześniej eksperymentalnie niedostępnych gatunków naczelnych (np. małp człekokształtnych), w etycznie uzasadnionym i mniej wymagającym technicznie systemie. Co więcej, organoidy ludzkiego mózgu pozwalają na zaawansowane badanie zaburzeń neurorozwojowych i neurologicznych.

Ponieważ organoidy mózgowe podsumowują wiele procesów rozwoju mózgu, stanowią również potężne narzędzie do identyfikowania różnic i funkcjonalnego porównywania genetycznych uwarunkowań leżących u podstaw rozwoju mózgu różnych gatunków w kontekście ewolucyjnym. Dużą zaletą stosowania organoidów jest możliwość wprowadzania modyfikacji genetycznych, co pozwala na badanie funkcji genów. Jednak wprowadzenie takich modyfikacji jest pracochłonne i kosztowne. W artykule opisano szybkie i ekonomiczne podejście do genetycznej modyfikacji populacji komórek w strukturach przypominających komory organoidów mózgowych naczelnych, podtypu organoidów mózgowych. Metoda ta łączy zmodyfikowany protokół niezawodnego generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących od ludzi, szympansów, makaków rezusów i marmozetów z podejściem opartym na mikroiniekcji i elektroporacji. Stanowi to skuteczne narzędzie do badania procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, które można również zastosować do modelowania chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie (pato)fizjologicznego rozwoju i ewolucji kory mózgowej jest ogromnym zadaniem, które jest utrudnione przez brak odpowiednich systemów modelowych. Wcześniej takie badania ograniczały się do dwuwymiarowych modeli hodowli komórkowych (takich jak pierwotne hodowle progenitorów nerwowych lub neuronalnych) i ewolucyjnie odległych modeli zwierzęcych (takich jak gryzonie)1,2. Chociaż modele te są przydatne do rozwiązywania niektórych pytań, są ograniczone w modelowaniu złożoności, składu typu komórki, architektury komórkowej i wzorców ekspresji genów rozwijającej się ludzkiej kory nowej w stanach zdrowych i chorych. Ograniczenia te prowadzą, na przykład, do słabej przekładalności mysich modeli chorób ludzkich na sytuację ludzką, jak opisano dla niektórych przypadków małogłowia (np. Zhang et al.3). Ostatnio w centrum uwagi znalazły się transgeniczne naczelne inne niż ludzie, które są ewolucyjnie, funkcjonalnie i morfologicznie bliższym modelem rozwoju ludzkiej kory nowej4,5,6,7,8, ponieważ przezwyciężają wiele ograniczeń modeli opartych na hodowlach komórkowych i gryzoniach. Jednak wykorzystanie zwierząt z rzędu naczelnych w badaniach jest nie tylko bardzo kosztowne i czasochłonne, ale także budzi obawy natury etycznej. Niedawno rozwój technologii organoidów mózgowych 9,10 okazał się obiecującą alternatywą, która rozwiązuje wiele ograniczeń poprzednich modeli11,12,13,14,15,16.

Organoidy mózgu to trójwymiarowe (3D), wielokomórkowe struktury, które naśladują główne cechy cytoarchitektury i składu typu komórki jednego lub wielu regionów mózgu dla określonego okna czasowego rozwoju11,12,13,14,17. Te struktury 3D są generowane albo z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), albo, jeśli są dostępne dla danego gatunku, z embrionalnych komórek macierzystych (ESC). Ogólnie rzecz biorąc, na podstawie zastosowanej metodologii można wyróżnić dwa typy organoidów mózgowych: niekierowane i zregionalizowane (kierowane) organoidy mózgowe18. Tworząc ten drugi typ organoidów, uwzględnia się małe cząsteczki lub czynniki, które kierują różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych do organoidów określonego regionu mózgu (np. organoidów przodomózgowia)18. Natomiast w organoidach niekierowanych różnicowanie nie jest sterowane przez dodawanie małych cząsteczek, ale raczej opiera się wyłącznie na spontanicznym różnicowaniu iPSC/ESC. Powstałe organoidy mózgowe składają się z typów komórek reprezentujących różne regiony mózgu (np. organoidy mózgowe)18. Organoidy mózgowe łączą w sobie wiele kluczowych cech rozwoju mózgu ze stosunkowo oszczędnym i czasowo generowaniem z dowolnego gatunku zainteresowania, dla którego dostępne są iPSC lub ESC11,12,13,14. To sprawia, że organoidy mózgowe są doskonałym modelem dla wielu rodzajów badań neurobiologicznych, począwszy od pytań ewolucyjnych i rozwojowych, a skończywszy na modelowaniu chorób i testowaniu leków15,16. Jednak odpowiedź na te pytania za pomocą organoidów mózgowych w dużym stopniu zależy od dostępności różnych metod modyfikacji genetycznej.

Jednym z kluczowych aspektów badania (pato)fizjologicznego rozwoju kory nowej i jej ewolucji jest funkcjonalna analiza genów i wariantów genów. Zwykle osiąga się to poprzez (ektopową) ekspresję i/lub knock-down (KD) lub knock-out (KO) tych genów. Takie modyfikacje genetyczne można podzielić na stabilne i przejściowe modyfikacje genetyczne, a także na modyfikacje ograniczone czasowo i przestrzennie lub bez ograniczeń. Stabilna modyfikacja genetyczna jest definiowana przez wprowadzenie zmiany genetycznej do genomu gospodarza, która jest przekazywana wszystkim kolejnym generacjom komórek. W zależności od punktu czasowego modyfikacji genetycznej może wpływać na wszystkie komórki organoidu lub może być ograniczona do określonych populacji komórek. Najczęściej stabilną modyfikację genetyczną uzyskuje się w organoidach mózgowych na poziomie iPSC/ESC poprzez zastosowanie lentiwirusów, systemów transpozonopodobnych i technologii CRISPR/Cas9 (sprawdzonej m.in. przez Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 oraz Teriyapirom et al.20). Ma to tę zaletę, że wszystkie komórki organoidu mózgowego przenoszą modyfikację genetyczną i nie jest ona ograniczona czasowo ani przestrzennie. Jednak generowanie i charakteryzacja tych stabilnych linii iPSC/ESC jest bardzo czasochłonna, często zajmuje kilka miesięcy, zanim pierwsze zmodyfikowane organoidy mózgowe będą mogły być analizowane (przejrzane np. przez Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, lub Teriyapirom et al.20).

Natomiast przejściowa modyfikacja genetyczna jest definiowana przez dostarczenie ładunku genetycznego (np. plazmidu ekspresji genu), który nie integruje się z genomem gospodarza. Chociaż modyfikacja ta może być w zasadzie przekazywana kolejnym pokoleniom komórek, dostarczony ładunek genetyczny będzie stopniowo rozcieńczany przy każdym podziale komórki. Dlatego ten rodzaj modyfikacji genetycznej jest zwykle ograniczony czasowo i przestrzennie. Przejściowa modyfikacja genetyczna może być przeprowadzana w organoidach mózgowych za pomocą wirusów związanych z adenowirusami lub przez elektroporację (recenzowane np. przez Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 oraz Teriyapirom et al.20), przy czym ta ostatnia jest szczegółowo opisana w tym artykule. W przeciwieństwie do stabilnej modyfikacji genetycznej, takie podejście jest bardzo szybkie i opłacalne. Rzeczywiście, elektroporację można przeprowadzić w ciągu kilku minut, a w zależności od docelowej populacji komórek, elektroporowane organoidy są gotowe do analizy w ciągu kilku dni (sprawdzone np. przez Fischer et al.17 i Kyrousi et al.19). Jednak poważne zmiany morfologiczne organoidu mózgu, takie jak różnice w wielkości, nie mogą być wykryte za pomocą tej metody, ponieważ ten rodzaj modyfikacji genetycznej jest ograniczony czasowo i przestrzennie. To ograniczenie może być również zaletą, na przykład w przypadku badania pojedynczych populacji komórek w obrębie organoidu lub wpływu na organoidy mózgowe w określonych punktach rozwojowych (przegląd np. Fischer i wsp.17 oraz Kyrousi i wsp.19).

Klasycznym podejściem do badania funkcji genów podczas rozwoju i ewolucji mózgu jest elektroporacja in utero. Elektroporacja in utero jest dobrze znaną i użyteczną techniką dostarczania konstruktów ekspresji genów do mózgów gryzoni21,22,23 i frret24,25 mózgów. Po pierwsze, roztwór zawierający konstrukt ekspresyjny będący przedmiotem zainteresowania jest mikrowstrzykiwany przez ścianę macicy do określonej komory mózgu embrionalnego, w zależności od regionu, który ma być docelowy. W drugim etapie stosuje się impulsy elektryczne w celu transfekcji komórek bezpośrednio wyściełających docelową komorę. Podejście to nie ogranicza się tylko do ekspresji ektopowej lub nadekspresji genów, ponieważ może być również stosowane w badaniach KD lub KO poprzez mikroiniekcję krótkiej spinki do włosów (shRNA) lub CRISPR/Cas9 (w postaci plazmidów ekspresyjnych lub rybonukleoprotein [RNP]), odpowiednio26,27. Jednak elektroporacja in utero zarodków myszy, szczurów i fretek ma takie same ograniczenia, jak opisano powyżej dla tych modeli zwierzęcych.

Idealnie, chciałoby się przeprowadzić elektroporację in utero bezpośrednio u naczelnych. Chociaż jest to w zasadzie technicznie możliwe, elektroporacja in utero nie jest przeprowadzana u naczelnych ze względu na obawy etyczne, wysokie koszty utrzymania zwierząt i małe rozmiary miotów. W przypadku niektórych naczelnych, takich jak małpy człekokształtne (w tym ludzie), nie jest to w ogóle możliwe. Jednak to właśnie te naczelne mają największy potencjał do badania rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej człowieka i jej ewolucji. Jednym z rozwiązań tego dylematu jest zastosowanie techniki elektroporacji do organoidów mózgowych naczelnych28.

Ten artykuł przedstawia protokół elektroporacji podtypu organoidów mózgowych naczelnych, organoidów mózgowych naczelnych. Takie podejście pozwala na szybką i ekonomiczną modyfikację genetyczną populacji komórek w obrębie przypominających komory struktur organoidów. W szczególności opisujemy ujednolicony protokół generowania organoidów mózgowych naczelnych z iPSC człowieka (Homo sapiens), szympansa (Pan troglodytes), makaka rezusa (Macaca mulatta) i marmozety zwyczajnej (Callithrix jacchus). Ponadto szczegółowo opisujemy technikę mikroiniekcji i elektroporacji oraz podajemy kryteria "go" i "no-go" dla wykonywania elektroporacji organoidów mózgowych u naczelnych. Podejście to jest skutecznym narzędziem do badania rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej i jej ewolucji w modelu szczególnie zbliżonym do sytuacji człowieka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura iPSC naczelnych

UWAGA: Ze względu na swoją solidność, przedstawiona tutaj metoda może być zastosowana do dowolnej linii iPSC naczelnych. W tym artykule opisujemy produkcję organoidów mózgowych od człowieka (iLonza2.2)29, szympansa (Sandra A)30, makaka rezusa (iRh33.1)29 i marmozety zwyczajnej (cj_160419_5)31 linii iPSC. Warunki hodowli podsumowano w tabeli 1. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. W celu wyhodowania odpowiednich iPSC należy postępować zgodnie z pierwotnie opisanymi warunkami hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, aby pomyślnie wygenerować i elektroporować organoidy mózgowe, należy użyć linii iPSC, które nie były hodowane przez więcej niż 90 pasaży. Dodatkowo, na początku wytwarzania organoidów mózgowych, upewnij się, że iPSC wykazują cechy pluripotencji bez oznak różnicowania.

2. Wytwarzanie organoidów mózgowych z iPSC naczelnych

UWAGA: Protokół generowania organoidów mózgowych jest oparty na zmodyfikowanej wersji28,30,32,33 oryginalnego protokołu organoidów mózgowych10,34 z pewnymi modyfikacjami specyficznymi dla gatunku (szczegółowo opisanymi poniżej).

  1. Wysiewanie iPSC w celu wytworzenia ciał zarodkowych (EB)
    1. Gdy iPSC osiągną zbieżność 80%-90%, przemyj je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco i dodaj 500 μl rekombinowanego substytutu trypsyny lub 1 ml mieszaniny proteolitycznej i kolagenolitycznej.
      UWAGA: Zazwyczaj iPSC są hodowane w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm w celu uzyskania około 900 000 komórek, co wystarcza do wytworzenia 96 organoidów mózgowych. Liczbę komórek można dostosować w zależności od liczby potrzebnych organoidów. Należy pamiętać, że nie wszystkie wygenerowane organoidy mózgowe mogą nadawać się do elektroporacji.
    2. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 2 minuty w celu odłączenia komórek.
      UWAGA: W zależności od użytej linii iPSC lub enzymu może być konieczne do dodatkowych 2 minut inkubacji w temperaturze 37 °C. Zaleca się zbadanie naczynia pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki zaczęły się odłączać.
    3. Dodać 1,5 ml podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej iPSC w celu zatrzymania reakcji i pipetować w górę i w dół 7x-10x (nie więcej niż 10x), aby oddzielić komórki od naczynia do hodowli komórkowej i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować komórki pod ciśnieniem 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki hodowlanej iPSC uzupełnionej 50 μM Y27632 lub 50 μM związkiem sprzyjającym przeżyciu.
    6. Użyć 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
    7. Dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 9 000 komórek na 150 μL (60 000 komórek/ml) za pomocą pożywki hodowlanej iPSC uzupełnionej 50 μM Y27632 lub 50 μM związkiem pro-survivalowym.
    8. Aby wytworzyć ciała zarodkowe (EB), należy wysiać 150 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce. Podczas pipetowania delikatnie wstrząsnąć probówką zawierającą zawiesinę komórek, aby zapobiec ich sedymentacji.
    9. Hodować EB w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C (0 dni po wysiewie [dps]). Nie należy naruszać EB w ciągu pierwszych 24 godzin po wysiewie.
      UWAGA: EB wytworzone z iPSC marmozety muszą być hodowane w wilgotnej atmosferze w warunkach niedotlenienia (5% CO2 , 5 % O2 i 90 % N2) w temperaturze 37 °C.
    10. Po ~48 h (2 dps) zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną iPSC bez związku Y27632/pro-survival. Usunąć 100 μl pożywki z dołka i dodać 150 μl podgrzanej (37 °C) świeżej pożywki bez Y27632. Idź rząd po rzędzie.
    11. Wykonywać kolejne zmiany pożywki co drugi dzień; usunąć 150 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 150 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) świeżej pożywki bez Y27632 / związku pro-survivalowego na studzienkę.
      UWAGA: Po 4-5 dps obrzeża EB powinny stać się przezroczyste.
  2. Indukcja neuroektodermy
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, dobrej jakości EB powinny mieć na tym etapie gładkie kontury i półprzezroczyste obramowania. Punkty czasowe indukcji neuronalnej nieznacznie różnią się między gatunkami naczelnych a liniami iPSC. W przypadku użytych tutaj linii komórkowych (patrz sekcja 1 i tabela materiałów), indukcja neuronalna dla EB marmozety zwykle musi być rozpoczęta przy 4 dps, dla makaków rezusów przy 5 dps, a dla EB u ludzi i szympansów przy 4-5 dps (Rysunek 1A), w zależności od stanu EB (patrz wyżej).
    1. Usunąć 150 μl pożywki z każdego dołka w pierwszym rzędzie płytki 96-dołkowej i dodać 150 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki do indukcji neuronalnej (patrz tabela 2) do każdego dołka w tym samym rzędzie.
    2. Kontynuować wymianę podłoża zgodnie z powyższym opisem rząd po rzędzie dla całej płytki 96-dołkowej. Wykonuj dalsze zmiany pożywki indukcyjnej neuronów (NIM) co drugi dzień, usuwając 150 μl NIM z każdej studzienki i dodając 150 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) świeżego NIM.
      UWAGA: Od tego momentu EB marmozet powinny być hodowane w takich samych warunkach, jak inne EB naczelnych (wilgotna atmosfera 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C).
  3. Osadzanie w macierzy membrany podstawnej
    UWAGA: Gdy EB rozwiną wyraźny, półprzezroczysty, promieniście zorganizowany nabłonek nerwowy na powierzchni, należy zapewnić wsparcie strukturalne dla rozwoju struktur podobnych do komór. Osiąga się to poprzez osadzenie EB w matrycy błony podstawnej. Ze względu na różnice w tempie rozwoju, EB makaków marmozet i rezusów są gotowe do zagnieżdżenia już przy 7 dps, podczas gdy EB ludzi i szympansów są zwykle osadzone w 8-9 dps. Dla uproszczenia, matryca błony podstawnej odnosi się tylko do Matrigel w tym protokole. Jednak Geltrex może być stosowany jako zamiennik.
    1. W ramach przygotowań do zatapiania, wysterylizuj UV nożyczki, kleszcze, mały stojak na probówki o pojemności 0,2 ml i od trzech do sześciu kwadratów parafilmu potraktowanych 70% (vol/vol) etanolem pod okapem z przepływem laminarnym przez 15 minut. Pozwól matrycy błony podstawnej rozmrozić się na lodzie przez kilka godzin (~ 1,5 ml matrycy błony podstawnej zwykle wystarcza na 96 EB).
      UWAGA: Zawsze utrzymuj matrycę membrany podstawnej na lodzie.
    2. Utwórz siatkę wgłębień 4 x 4 na parafilmie. Umieść siatkę parafilmową na stojaku na probówki o pojemności 0,2 ml tak, aby strona pokryta papierową kopertą była skierowana do góry, i delikatnie dociśnij palec w rękawiczce do każdego otworu stojaka.
    3. Usuń papier i wytnij siatkę wgłębień z kwadratu parafilmu za pomocą nożyczek, aby dostosować jej rozmiar tak, aby pasowała do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm. Umieść wgłębiony parafilm z powrotem na stojaku na probówki o pojemności 0,2 ml, aby zapewnić podstawę do generowania kropelek macierzy błony podstawnej.
    4. Za pomocą pipety z naciętą końcówką pipety o pojemności 200 μl ostrożnie przenieś EB jeden po drugim z dołka naczynia hodowlanego do wgłębień parafilmu.
    5. Po przeniesieniu 16 EB na siatkę weź nową końcówkę do pipety o pojemności 200 μl i usuń pozostałą pożywkę z wgłębień.
    6. Odpipetować jedną kroplę (~15 μl) matrycy błony podstawnej na każde wgłębienie zawierające jeden EB.
    7. Weź końcówkę do pipety o pojemności 10 μl i szybko przesuń EB do środka każdej kropli, nie naruszając granic kropli.
    8. Umieścić wgłębiony parafilm z kroplami macierzy błony podstawnej w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm i inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację matrycy.
    9. Aby odłączyć EB osadzone w matrycy od parafilmu, dodaj 5 ml pożywki różnicującej (DM) bez witaminy A (patrz Tabela 2) do naczynia i obróć parafilm do góry nogami za pomocą kleszczy tak, aby strona z EB była skierowana w stronę dna naczynia.
    10. Ostrożnie potrząśnij naczyniem, aby krople macierzy błony podstawnej zawierające EB oderwały się od parafilmu. Jeśli niektóre z nich są nadal przymocowane, weź krawędź kwadratu parafilmu za pomocą kleszczy i szybko zwiń go kilka razy w kierunku środka naczynia.
    11. Hoduj organoidy mózgowe na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 55 obr./min w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C. Utrzymuj je w DM bez witaminy A ze zmianami pożywki co drugi dzień. Aby indukować produkcję neuronów, przełącz się na DM z witaminą A (kwas retinowy, RZS) po 13 dps dla organoidów mózgowych makaków marmozet i rezus lub 14-15 dps dla organoidów mózgowych ludzi i szympansów (Figura 1A). Od tego momentu zmieniaj podłoże co 3-4 dni.
      UWAGA: Aby wspomóc przeżycie neuronów, cukrzyca z witaminą A może być uzupełniona o 20 μg/ml ludzkiej neurotrofiny 3 (NT3), 20 μg/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1 μl / ml macierzy błony podstawnej od 40 dps.

3. Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych

UWAGA: Z technicznego punktu widzenia, elektroporacja organoidów mózgowych może być przeprowadzona, gdy tylko struktury podobne do komór są na tyle wyraźne, że można je namierzyć za pomocą mikroiniekcji. Optymalne okno czasowe elektroporacji zależy od kwestii biologicznej i populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład, jeśli głównym celem są wierzchołkowe komórki progenitorowe (AP), to organoidy mózgowe o natężeniu około 30 dps są już odpowiednie. Jeśli głównym celem są podstawni progenitorzy (BP) lub neurony, należy użyć starszych organoidów mózgowych o wielkości większej niż 50 dps (patrz na przykład Fischer et al.28).

  1. Przygotowanie zestawu do elektroporacji
    UWAGA: Na wydajność elektroporacji duży wpływ ma rozmiar i stężenie elektroporowanego plazmidu (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji dyskusji).
    1. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki do elektroporacji dla grupy kontrolnej i genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI), na przykład 10 μl mieszanki do elektroporacji dla każdej kontroli i GOI, aby naelektryzować około 30 organoidów mózgowych na stan.
      UWAGA: Skład mieszanin do elektroporacji, patrz Tabela 3.
    2. Wstępnie podgrzaną (niesterylną) zmodyfikowaną mieszanką Eagle i składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) i DM firmy Dulbecco z witaminą A do 37 °C. Przygotuj małą szpatułkę oraz cienkie i normalne nożyczki i spryskaj narzędzia 70% (obj./obj.) etanolem.
      UWAGA: Poniższe kroki można wykonać w sterylnych lub niesterylnych warunkach, ponieważ cukrzyca zawiera antybiotyki (patrz Tabela 2). Z naszego doświadczenia wynika, że brak sterylności nigdy nie spowodował żadnego zanieczyszczenia.
    3. Przygotować szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i podłączyć komorę elektrody na szalkę Petriego do elektroporatora.
      UWAGA: Komory elektrod na szalki Petriego są dostępne na rynku. Można je jednak łatwo wyprodukować w sposób ekonomiczny (patrz plik uzupełniający 1).
    4. Za pomocą końcówek do mikroładowarek napełnij igły do mikroiniekcji 8 μl każdej mieszanki do elektroporacji. Przed pierwszym użyciem odetnij końcówki igieł cienkimi nożyczkami, aby uzyskać stabilny przepływ. Należy jednak usunąć tylko niewielką część końcówki, ponieważ i szeroka końcówka może poważnie uszkodzić organoidy.
      UWAGA: Igły do mikroiniekcji są dostępne w handlu jako wstępnie wyciągnięte igły do mikroiniekcji lub można je wyciągnąć w laboratorium, jeśli dostępny jest ściągacz do igieł. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta ściągacza do igieł, aby wygenerować igły do mikroiniekcji z długim stożkiem i średnicą końcówki 10 μm.
  2. Mikroiniekcja i elektroporacja
    1. Pod mikroskopem wybierz pięć organoidów mózgowych z gładkimi obwódkami i wyraźnie widocznymi strukturami przypominającymi komory. Przenieść je do 35-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej wstępnie podgrzany (37 °C) DMEM/F12 za pomocą przeciętej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl.
      UWAGA: Wybierz organoidy mózgowe z wyraźnymi i dostępnymi strukturami przypominającymi komory (patrz Ryc. 1B).
    2. Aby wstrzyknąć strukturę przypominającą komorę, ostrożnie włóż igłę przez jej ściankę i napełnij ją mieszanką do elektroporacji, aż do widocznego napełnienia. Nie wywieraj nadmiernego nacisku na struktury przypominające komory, aby uniknąć ich pęknięcia. Postępuj w ten sposób z sześcioma do ośmiu strukturami przypominającymi komory każdego organoidu mózgowego.
      UWAGA: Jeśli igła zostanie zatkana podczas procesu mikroiniekcji, końcówkę należy lekko przyciąć.
    3. Przenieść jeden mikroiniekowany organoid mózgowy do komory elektrody na szalkę Petriego z niewielką ilością DMEM/F12. Ułóż organoid w taki sposób, aby powierzchnie mikroiniekcyjkowanych struktur przypominających komory były skierowane w stronę elektrody podłączonej do bieguna dodatniego elektroporatora.
      UWAGA: Orientacja struktur w ten sposób zapewnia, że komórki są transfekowane po stronie struktury podobnej do komory, która nie jest dotknięta przez sąsiednią strukturę.
    4. Elektroportuj organoidy mózgowe jeden po drugim, stosując następujące ustawienia: 5 impulsów 80 V, czas trwania impulsu 50 ms i odstęp 1 s. Przenieść elektroporowane organoidy do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm wypełnionego wstępnie podgrzanym (37 °C) DMEM/F12.
      UWAGA: Ustawienia elektroporacji mogą zależeć od dostępnego elektroporatora o fali prostokątnej. Ustawienia te są zoptymalizowane pod kątem referencyjnego systemu elektroporacji. Zwiększenie napięcia może prowadzić do przemieszczenia ogniw.
    5. Postępuj w ten sam sposób z następnymi pięcioma organoidami mózgowymi, używając drugiej mieszanki elektroporacyjnej (na przykład GOI).
      UWAGA: Powtarzaj kroki 3.2.1-3.2.5, aż do osiągnięcia żądanej liczby elektroporowanych organoidów mózgowych.
    6. Jeśli mikroiniekcja i elektroporacja zostały przeprowadzone w warunkach niesterylnych, należy przenieść elektroporowane organoidy do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm pod kapturem z przepływem laminarnym, przenosząc jak najmniej DMEM/F12 do nowej płytki do hodowli komórkowej.
  3. Dalsza hodowla i utrwalanie organoidów mózgowych
    1. Wyhodować elektroporowane organoidy w DM z witaminą A na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 55 obr./min w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia po elektroporacji sprawdź organoidy mózgowe pod kątem udanej elektroporacji pod konwencjonalnym odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: W zależności od długości dalszej hodowli po elektroporacji, wpływa to na różne populacje komórek w organoidzie mózgowym (patrz również sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników).
    3. Kontynuuj dalsze aplikacje po hodowli elektroporowanych organoidów mózgowych przez czas odpowiedni dla interesującego pytania biologicznego.
      UWAGA: Elektroporowane organoidy mózgowe mogą być przetwarzane do różnych dalszych zastosowań (np. utrwalanie do barwienia immunofluorescencyjnego lub zamrażanie zatrzaskowe w celu izolacji RNA i qRT-PCR). W tym miejscu opisujemy utrwalanie elektroporowanych organoidów mózgowych.
    4. Przenieść elektroporowane organoidy do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą przeciętej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i usunąć nadmiar pożywki.
    5. Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu (PFA) do DPBS (pH 7,5) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: PFA jest klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy dla ludzi i może powodować nieodwracalne szkody dla zdrowia. Zdecydowanie zaleca się stosowanie dodatkowych środków ostrożności, w tym rękawic nitrylowych i gogli
      6. .
    6. Odessać PFA, dodać 5 ml DPBS, lekko wstrząsnąć i odessać DPBS. Powtórz to 2x. Przechowywać organoidy w DPBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany, ponieważ organoidy mózgowe utrwalone przez PFA mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Elektroporowane organoidy utrwalone PFA mogą być analizowane przez kriosekcję i barwienie immunofluorescencyjne10,28 lub przez barwienie i czyszczenie całego montażu35,36. Przykładowe obrazy znajdują się w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników (szczegółowe informacje na temat przeciwciał znajdują się w Tabeli 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na efektywne generowanie organoidów mózgowych z linii iPSC człowieka, szympansa, makaka rezusa i marmozety pospolitej przy minimalnych zmianach czasowych wymaganych między gatunkami (Rysunek 1A). Organoidy te mogą być elektroporowane w zakresie od 20 dps do 50 dps, w zależności od dostępności struktur podobnych do komór i obfitości populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak przed elektroporacją ważne jest, aby ustalić, czy organoidy mózgowe są wystarc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj procedury stanowią ujednolicony protokół generowania organoidów mózgowych od różnych gatunków naczelnych z ukierunkowanym podejściem do elektroporacji. Pozwala to na ektopową ekspresję GOI w systemie modelowym, który naśladuje (w tym ludzki) (pato)fizjologiczny rozwój kory nowej naczelnych. Ten ujednolicony protokół generowania organoidów mózgowych naczelnych wykorzystuje te same materiały (np. pożywki) i kroki protokołu dla wszystkich czterech przedstawionych gatunków naczelnych. Różnice rozwojowe między t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przepraszamy wszystkich badaczy, których prace nie mogły być cytowane z powodu ograniczeń miejsca. Dziękujemy Ulrichowi Bleleyerowi ze służb technicznych DPZ i Hartmutowi Wolfowi z warsztatu MPI-CBG za budowę komór elektrod na płytce Petriego; Stoyan Petkov i Rüdiger Behr za dostarczenie ludzkich (iLonza2.2), makaków rezusów (iRh33.1) i marmozet (cj_160419_5); Sabrina Heide do kriosekcji i barwienia immunofluorescencyjnego; oraz Neringa Liutikaite i César Mateo Bastidas Betancourt za krytyczną lekturę rękopisu. Prace w laboratorium W.B.H. były wspierane przez grant ERA-NET NEURON (MicroKin). Prace w laboratorium M.H. zostały wsparte grantem ERBN dla startowców (101039421).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20 &mikro; L MicroloaderEppendorf5242956003
2-MerkaptoetanolMerck8.05740.0005
35 mm naczynia do hodowli komórkowychSarstedt83.3900
60 mm naczynia do hodowli komórkowychCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Mikroskop odwróconej fluorescencji Axio Observer.Z1Zeisszastępowany przez porównywalne mikroskopy fluorescencyjne
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Suplement z witaminą A (kwas retinowy, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 Suplement bez witaminy A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 System elektroporacji fal prostokątnychBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
Linia pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowana przez szympansy Sandra Adoi: 10.7554/elife.18683 
Linia pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez marmozety pospolite cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco14190-094pH 7,0− 7.3; podgrzać do temperatury pokojowej przed użyciem
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
Suplement GlutaMAX (100x)Gibco35050-061suplement zastępczy glutaminy
Heparyna (1 mg / ml zapasu)Sigma-AldrichH3149
Ludzka indukowana pluripotencjalna linia komórek macierzystych iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Ludzka neurotrofina-3 (NT-3)PeproTech450-03
InsulinaSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Stereoskop Leica MS5 (podstawa światła przechodzącego MDG 17)Leica10473849wymienny na porównywalne mikroskopy stereoskopowe
MatrigelCorning354277/354234matryca błony podstawnej; alternatywnie można zastosować Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302)
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x)Suplement Sigma-AldrichM7145
N-2 (100x)Gibco17502-048
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldehyd Merck818715radzić sobie z przyczynowością spowodowaną rakotwórczością
Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/ml)PanBiotechP06-07100
Komora elektrody na szalkę Petriegowłasnej produkcji (patrz plik uzupełniający 1)również dostępne na rynku
Pipety ze szkła wstępnie ciągniętegoWPI TIP10LTpipety ze szkła borokrzemianowego z długim stożkiem, 10 i mikro; m średnica końcówki
Związek Pro-SurvivalMerckMillipore529659
Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego/mysiego/szczuraCzynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF)PeproTechAF-450-02
Linia pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowana przez makaka rezusa iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro AccutaseGibcoA1110501mieszanina enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych
TrypLEGibco12604-013rekombinowany substytut trypsyny; przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej
Ultra-Low Attachment 96-dołkowe płytkiCostar7007
Y27632Technologie komórek macierzystych72305

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612(2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30(2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558(2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347(2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24(2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728(2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349(2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683(2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422(2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884(2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129(2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozw j m zgu naczelnychtechnika mikrowstrzykiwaniametoda elektroporacjiindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystestruktury przypominaj ce komorykom rki progenitorowe koryzaburzenia neurorozwojoweewolucyjne badania m zgu

Powiązane artykuły