Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykrywanie reakcji przepływu krwi w mózgu (CBF) na różne formy aktywacji neuronów jest kluczowe dla zrozumienia dynamicznej funkcji mózgu i zmian w dostarczaniu substratu do mózgu. W artykule opisano protokół pomiaru odpowiedzi CBF na przezczaszkową stymulację prądem przemiennym (tACS). Krzywe dawka-odpowiedź są szacowane zarówno na podstawie zmiany CBF zachodzącej przy tACS (mA), jak i na podstawie wewnątrzczaszkowego pola elektrycznego (mV/mm). Szacujemy wewnątrzczaszkowe pole elektryczne na podstawie różnych amplitud mierzonych przez szklane mikroelektrody po każdej stronie mózgu. W tym artykule opisujemy konfigurację eksperymentalną, która polega na użyciu obustronnych laserowych sond dopplerowskich (LD) lub laserowego obrazowania plamkowego (LSI) do pomiaru CBF; W rezultacie, ta konfiguracja wymaga znieczulenia w celu umieszczenia elektrody i stabilności. Przedstawiamy korelację między odpowiedzią CBF a prądem w funkcji wieku, wykazując istotnie większą odpowiedź przy wyższych prądach (1,5 mA i 2,0 mA) u młodych zwierząt kontrolnych (12-14 tygodni) w porównaniu ze starszymi zwierzętami (28-32 tygodnie) (różnica p < 0,005). Wykazujemy również znaczącą odpowiedź CBF przy natężeniu pola elektrycznego <5 mV/mm, co jest ważnym czynnikiem dla ewentualnych badań na ludziach. Na te odpowiedzi CBF duży wpływ ma również zastosowanie znieczulenia w porównaniu z przebudzonymi zwierzętami, kontrola oddychania (tj. Oddychanie zaintubowane vs. spontaniczne), czynniki ogólnoustrojowe (tj. CO2 ) oraz miejscowe przewodnictwo w naczyniach krwionośnych, w którym pośredniczą perycyty i komórki śródbłonka. Podobnie, bardziej szczegółowe techniki obrazowania/rejestracji mogą ograniczyć rozmiar pola z całego mózgu do tylko małego obszaru. Opisujemy zastosowanie elektrod pozaczaszkowych do stosowania stymulacji tACS, w tym zarówno domowe, jak i komercyjne projekty elektrod dla gryzoni, jednoczesny pomiar CBF i wewnątrzczaszkowego pola elektrycznego za pomocą dwustronnych szklanych elektrod rejestrujących prąd stały oraz podejścia do obrazowania. Obecnie stosujemy te techniki do implementacji formatu zamkniętej pętli do rozszerzania CBF w zwierzęcych modelach choroby Alzheimera i udaru.
Wprowadzenie
Przezczaszkowa stymulacja elektryczna (tES; w przypadku stymulacji falą sinusoidalną – tACS) jest powszechną, zewnętrzną i nieinwazyjną metodą neuromodulacji mózgu1,2. Wcześniej postawiliśmy hipotezę, że przy określonych dawkach tES (a w szczególności tACS) może zwiększać mózgowy przepływ krwi (CBF) w leżących poniżej obszarach mózgu3. Ponadto może istnieć zależność dawka-odpowiedź między przyłożonym prądem zewnętrznym lub wewnątrzczaszkowym polem elektrycznym a wynikającymi z nich odpowiedziami CBF. Jednak większość klinicznych protokołów stymulacji koncentrowała się na maksymalnym, komfortowym poziomie stymulacji skóry (tj. ~ 2 mA) przez zaplanowane okresy czasu (tj. 30-45 min) jako protokół terapeutyczny4,5. U gryzoni możliwe jest zastosowanie inwazyjnych, pozaczaszkowych elektrod mózgowych przyłożonych bezpośrednio do czaszki w celu zbadania pól elektrycznych w mózgu indukowanych przez tES6. Zatem celem niniejszego podejścia jest określenie wpływu intensywności tACS przy odpowiednich częstotliwościach na zmiany CBF w kontekście zależności dawka-odpowiedź. Ta krzywa dawka-odpowiedź opiera się na krótkoterminowym biomarkerze fizjologicznym – bezpośrednich pomiarach CBF – w relacji do pola elektrycznego narzuconego na mózg3. Wykazaliśmy wcześniej, że przy większych amplitudach, zazwyczaj wykraczających poza zakres pól elektrycznych w mózgu indukowanych klinicznie przez tACS, występuje niemal liniowa korelacja między indukowanym polem elektrycznym a CBF w korze3. Jednak stymulacja słabszym polem (tj. o intensywności 1-5 mV/mm) może być bardziej istotna i wykonalna do zastosowania u ludzi; dlatego zmodyfikowaliśmy nasze techniki, aby wykrywać mniejsze zmiany CBF.
Niniejsza praca opisuje protokół analizy wpływu prądów zmiennych sinusoidalnych tES o niskiej natężeniu pola (tj. prąd 0.5-2.0 mA, pole elektryczne 1-5 mV/mm), które są tolerowane przez budzące się gryzonie5. Protokół ten obejmuje zastosowanie nowatorskiego obrazowania speckle laserowego podczas tACS, a także podwójnych wewnątrzczaszkowych elektrod szklanych, w celu określenia zarówno rozprzestrzeniania się aktywnego tACS w mózgu (monitorowanego poprzez CBF), jak i natężenia pola elektrycznego wewnątrz czaszki, co przedstawiono w formie schematu oraz rzeczywistej fotografii eksperymentalnej (Rycina 1). Istnieje wiele możliwych efektów fizjologicznych tES w mózgu, w tym bezpośrednia modulacja neuronalna, plastyczność neuronalna oraz aktywacja astrocytów7,8. Chociaż CBF mierzono przy użyciu tDCS9,10, pomiary te były powolne, pośrednie i niewystarczające do oceny funkcji dawka-odpowiedź w mózgu. Dlatego, stosując odpowiednie biomarkery krótkoterminowe (tj. CBF, pola elektryczne) oraz szybkie sekwencje włączania/wyłączania tACS, możemy obecnie dokładniej oszacować funkcję dawka-odpowiedź. Ponadto możemy zastosować różne techniki pomiaru CBF, w tym zarówno ogniskowe sondy laserowego Dopplera (LD), jak i obrazowanie speckle laserowe (LSI) z zdefiniowanymi obszarami zainteresowania.
Rysunek 1: Schemat i przykład fotograficzny stymulacji przezczaszkowej. (A) Schemat układu stymulacji przezczaszkowej. Schemat przedstawia czaszkę myszy z szwami wieńcowymi i strzałkowymi. Elektrody przezczaszkowe są umieszczone bocznie i symetrycznie na czaszce, a następnie przymocowane za pomocą kleju chirurgicznego i pasty przewodzącej pomiędzy elektrodami a czaszką. Elektrody te są podłączone do kompatybilnego z ludźmi urządzenia do stymulacji prądem stałym, które umożliwia określenie częstotliwości, amplitudy i czasu trwania stymulacji. Do oceny wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych w korze mózgu (tj. w odległości 1 mm od wewnętrznej powierzchni czaszki poprzez małe otwory trepanacyjne) umieszcza się obustronne elektrody szklane (~2 MΩ), które są uszczelnione olejem mineralnym i posiadają uziemienia AgCl w mięśniach szyi (przedstawione jako grubsze przewody w centrum, zatopione w podskórnej tkance szyi). Elektrody szklane są podłączone do wzmacniacza DC, a ich wyjścia są rejestrowane za pomocą cyfryzatora z co najmniej czterema kanałami. Do pomiarów na czaszce umieszczone są również obustronne sondy laser Dopplera. Cała czaszka jest dodatkowo obrazowana za pomocą urządzenia do obrazowania laserowego speckle lub chłodzonej kamery o wysokiej rozdzielczości (co najmniej 1,024 x 1,024 pikseli, głębokość bitowa piksela 12-14 bit) do detekcji wewnętrznego sygnału optycznego. Do obrazowania przepływu krwi zazwyczaj wybiera się częstotliwość izosbestyczną hemoglobiny (tj. 562 nm) do oświetlenia. (B) Zbliżenie z rzeczywistego eksperymentu, pokazujące obustronne sondy laser Dopplera (po lewej), (obustronne) wewnątrzczaszkowe szklane mikroelektrody rejestrujące umieszczone przez otwory trepanacyjne oraz elektrody stymulujące tACS umieszczone bocznie. Skrót: tACS = przezczaszkowa stymulacja prądem zmiennym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
W celu oceny mechanizmów możemy również badać interakcje z innymi procesami fizjologicznymi, które również zmieniają CBF, takimi jak indukowana K+ depolaryzacja rozprzestrzeniająca11. Ponadto, zamiast zaplanowanych sesji w regularnych odstępach czasu, możliwe jest opracowanie systemu w pętli zamkniętej opartego na dodatkowych biomarkerach dla różnych schorzeń, co zostało zaproponowane w leczeniu epilepsji12 (np. kliniczne urządzenia Neuropace). Przykładowo, stymulacja mózgu w pętli zamkniętej w chorobie Parkinsona opiera się zazwyczaj na wewnętrznych, nieprawidłowych lokalnych potencjałach polowych (LFPs) charakterystycznych dla tej choroby przy niedoborze dopaminy (zazwyczaj LFPs w paśmie β)13.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Duke lub przez równoważny lokalny organ regulujący badania z udziałem zwierząt. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, instrumentów i sprzętu użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie instrumentu
- Upewnij się, że wszystkie wymagane przedmioty i instrumenty chirurgiczne są przygotowane (Rysunek 2): roztwór do oczyszczania skóry głowy (gaziki nasączone alkoholem), taśma, pęseta, nożyczki oraz wiertarka do wykonania małych (0.5 mm) otworów trepanacyjnych.
- Przygotuj elektrody powierzchniowe pozaczaszkowe do aplikacji na czaszkę i upewnij się, że zostały oczyszczone z resztek kleju chirurgicznego, jeśli były wcześniej używane.
- Bezpośrednio przed aplikacją na czaszkę zweryfikuj impedancję tych elektrod tACS. W tym celu użyj wbudowanej funkcji pomiarowej stymulatora tACS, umieszczając obie elektrody w kąpieli solnej.
UWAGA: Preferowana impedancja wynosi <5 KΩ na parę elektrod, aby umożliwić przepływ wystarczającego prądu przez czaszkę. Urządzenie stymulujące sprawdza impedancję przed podaniem impulsów prądu stałego i podaje wartość bezpośrednio.
Rycina 2: Fotografia wymaganego instrumentarium, w tym narzędzi do dyssekcji i nożyczek, niezbędnych do przygotowania stymulacji pozaczaszkowej. 1. Mikronożyczki do dyssekcji, 11,5 cm; 2. Pęseta, 11,5 cm, lekko zakrzywiona, z ząbkami; 3. Pęseta Dumont #7, zakrzywiona; 4. Pęseta Dumont #5; 5. Mikroküreta, 13 cm; 6. Patyczki higieniczne; 7. Taśma chirurgiczna; 8. Gaziki nasączone alkoholem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Przygotowanie zwierzęcia do zabiegu
UWAGA: W tych eksperymentach wykorzystano 14 myszy kontrolnych szczepu C57BL/6 w wieku od 12 do 33 tygodni, z czego pięć było samcami, a dziewięć samicami.
- Zanurz zwierzę w znieczuleniu w komorze indukcyjnej przy użyciu izofluranu w 30% O22 przy przepływie ok. 1,5 l/min, z początkowym stężeniem ok. 4% w celu indukcji i stężeniem 1,25%–1,5% w celu utrzymania poziomu znieczulenia przy oddychaniu spontanicznym, wystarczającym do zniesienia odruchu na uciśnięcie ogona.
- Po indukcji przenieś zwierzę do aparatu stereotaktycznego, a następnie unieruchom głowę w stożku nosowym i uchwytach usznych, aby umożliwić późniejsze wprowadzenie elektrod i wykonanie otworu trepanacyjnego (Rycina 1 i Rycina 3).
- Podłącz stożek nosowy ramy stereotaktycznej do waporyzatora poprzez do wlotu i wylotu, aby usunąć wszelkie pozostałości izofluranu za pomocą systemu odprowadzającego (np. filtra z węglem aktywnym lub odsysacza). Należy upewnić się, że z maski nosowej nie występują żadne wycieki powietrza, zarówno w celu utrzymania poziomu znieczulenia izofluranem, jak i zapobiegania przypadkowemu przedostawaniu się gazu do powietrza w pomieszczeniu (Rycina 3).
- Sprawdzić położenie myszy w aparacie stereotaksycznym, w tym pozycję stożka nosowego, aby umożliwić oddychanie spontaniczne bez intubacji, a także zapewnić odpowiednie wybudzanie z narkozy i odprowadzanie gazów anestetycznych w celu ochrony personelu badawczego (Rycina 3).
- Umieść na zwierzęciu sondy do pomiaru tętna, saturacji tlenem we krwi (pulse OX), ciśnienia tętniczego oraz temperatury; upewnij się, że minimalna saturacja tlenem wynosi 90%, a tętno jest >450/min (dolna granica alarmu jest wyświetlana jako 380 impulsów/min). Należy rejestrować te parametry w regularnych odstępach czasu lub w sposób ciągły w trakcie procedury, w zależności od systemu rejestrującego (Rycina 3).
- Przed rozpoczęciem procedury należy sprawdzić stopień sedacji zwierzęcia, na przykład za pomocą uciśnięcia palca w celu sprawdzenia odruchów. Brak odruchu świadczy o optymalnym poziomie sedacji, o ile zwierzę utrzymuje spontaniczny oddech i odpowiednie wysycenie krwi tlenem. W przypadku wystąpienia odruchu należy zwiększyć podaż izofluranu, aby pogłębić znieczulenie, a następnie ponownie sprawdzić odruchy. Należy stale obserwować i monitorować częstość oddechów zwierzęcia i odpowiednio dostosowywać podaż izofluranu.
- Zgolić włosy z owłosienia skóry głowy lub usunąć je za pomocą kremu do depilacji (pozostałości kremu należy usunąć, przecierając skórę gazikiem nasączonym alkoholem).
- Należy nałożyć maść do oczu, a następnie w sposób aseptyczny oczyścić skórę głowy, przemywając ją trzykrotnie jodyną i alkoholem przed wycięciem zmiany za pomocą nożyczek.
Rysunek 3: Zdjęcie zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym z odsłoniętą czaszką i umieszczonymi jedynie elektrodami stymulatora tACS (przed wykonaniem otworów trepanacyjnych). Zwróć uwagę na urządzenie do pomiaru ciśnienia krwi wokół ogona oraz pulsoksymetr na łapie, z odczytem widocznym po lewej stronie. Wokół maski nosowej znajdują się rurki odsysające izofluran. Skrót: tACS = przezczaszkowa stymulacja prądem zmiennym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Procedura chirurgiczna: Aplikacja elektrod stymulujących i wykonanie otworów trepanacyjnych
- W przypadku badania terminalnego usunąć skórę głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i odsłonić czaszkę w odległości ok. 3 mm ku tyłowi od szwu jagodowego oraz ok. 3 mm przed bregma, aby odsłonić część tylnego szwu czołowego. Wyciąć skórę w okolicy ciemieniowej, aby odsłonić początkową część mięśnia skroniowego po obu stronach (Rycina 3).
- Usunąć wszelkie pozostałe podskórne tkanki łącznościowe, aby czaszka była czysta i sucha przed aplikacją elektrod stymulujących.
- Nanieść żel lub pastę przewodzącą na stronę elektrod, która będzie w kontakcie z czaszką, a następnie przymocować elektrody za pomocą chirurgicznego superkleju, nakładając go punktowo wokół krawędzi.
UWAGA: Należy dopilnować, aby żel przewodzący nie zmieszał się z chirurgicznym superklejem, co zapewni lepszą przyczepność do powierzchni czaszki. Zewnętrzną powierzchnię elektrod można również odizolować (od skóry głowy, jeśli jest ona zamknięta podczas operacji z przeżyciem zwierzęcia) za pomocą chirurgicznego superkleju. - Użyć komercyjnych elektrod płaskich lub wykonać elektrody we własnym zakresie, stosując izolowany drut o średnicy 100 µm (przylutowany do płytki) oraz elastyczną, izolowaną (z jednej strony) miedzianą płytkę o wymiarach 1 mm x 3 mm, dociętą do rozmiaru czaszki.
- Nanieść pastę z lidokainą na mięsień skroniowy i skórę głowy po obu stronach, nie naruszając elektrod, aby zredukować aktywację mięśni i nerwów obwodowych.
- Po umieszczeniu pozaczaszkowych elektrod stymulujących w odległości 4 mm bocznie od każdej strony czaszki (między bregma a lambda), wywiercić dwa otwory trepanacyjne o średnicy 0,5 mm dla elektrod szklanych, w odległości 2 mm od linii środkowej po każdej stronie, w odstępie 4 mm od siebie, prostopadle do szwu strzałkowego (Rycina 1). Wypełnić otwory trepanacyjne sterylnym olejem mineralnym, aby zapobiec przedostawaniu się prądu z elektrod pozaczaszkowych do wnętrza czaszki.
- Jeśli w danym eksperymencie planowane jest wywołanie depresji rozprzestrzeniającej (tj. depresji rozprzestrzeniającej indukowanej potasem [K+-SD]), wywiercić po prawej stronie czaszki trzeci otwór trepanacyjny o średnicy 0,5 mm, ok. 1,5 mm rostralnie od szwu wieńcowego i ok. 1 mm bocznie od tylnego szwu czołowego. Wypełnić ten otwór solą fizjologiczną w celu późniejszej aplikacji 1 M KCl dla indukcji K+-SD.
- Przetestować impedancję pozaczaszkowych elektrod stymulujących zarówno przed wykonaniem otworów trepanacyjnych (porównując z tymi samymi elektrodami umieszczonymi w kąpieli z soli fizjologicznej), jak i po wykonaniu otworów, aby zweryfikować, że otwory trepanacyjne nie zakłócają przepływu prądu do mózgu (tj. upewnić się, że rezystancja nie uległa zmianie).
UWAGA: Pomiar impedancji jest dostarczany bezpośrednio przez urządzenie stymulujące. Zazwyczaj stwierdzono, że całkowita impedancja systemu (tj. od elektrod pozaczaszkowych przez ścieżkę czaszka/mózg, zazwyczaj ok. 3 KΩ) pozostaje względnie stała niezależnie od otworów trepanacyjnych i szklanych mikroelektrod, co wskazuje na minimalny wyciek prądu bezpośrednio do mózgu przez otwory trepanacyjne. - Elektrody do przewlekłej stymulacji przezczaszkowej umieścić w podobny sposób. W tym przypadku należy odizolować zewnętrzną powierzchnię elektrod, zamknąć skórę głowy, a następnie wyprowadzić izolowane przewody poprzez skórę lub skierować je do zamocowanej na czaszce stałej głowicy.
4. Procedura fizjologiczna
- Rozpocznij od aspektów fizjologicznych eksperymentu, gdy zwierzę zostanie w pełni przygotowane do nieprzeżyciowego badania fizjologicznego. Utrzymuj poziom znieczulenia wystarczający dla zachowania spontanicznego oddychania oraz odpowiednich wartości saturacji tlenem, częstości oddechów i tętna.
- Zmierz CBF wynikający ze stymulacji poza czaszkowej, stosując jedną z dwóch poniższych metod.
- Umieść mysz pod urządzeniem do obrazowania laserowego rozproszenia (laser speckle imaging), z zastosowaniem lub bez zastosowania wewnątrzczaszkowych elektrod rejestrujących, aby zmierzyć wewnątrzczaszkowe pole elektryczne podczas epizodów stymulacji (Rycina 3).
- Przenieś zwierzę do preparacji fizjologicznej w celu umieszczenia obustronnych sond laserowych Dopplera oraz elektrod wewnątrzczaszkowych, aby zmierzyć wewnątrzczaszkowe pole elektryczne podczas epizodów stymulacji (Rycina 1).
5. Umieszczenie obustronnych elektrod laserowych Dopplera i szklanych
- Przenieś zwierzę na stolik mikroskopu w celu aplikacji obustronnych sond laserowych Dopplera. Umieść sondy na górnej powierzchni czaszki pomiędzy obustronnymi otworami trepanacyjnymi a szwem czołowym (Rysunek 1).
- Wypełnij dociągane szklane mikroelektrody (~0,1 µM, impedancja 2-6 MΩ) 0,2 M NaCl i wprowadź je za pomocą mikromanipulatora do dwóch otworów trepanacyjnych umieszczonych bocznie względem szwu strzałkowego3,14 (Rysunek 1).
UWAGA: Otwory trepanacyjne te znajdują się pomiędzy dwiema symetrycznymi elektrodami do stymulacji pozaczaszkowej (Rysunek 1). - Po wprowadzeniu do mózgu upewnij się, że szklane mikroelektrody znajdują się na głębokości ~1 mm w korze mózgowej. Wykonaj profile głębokości na różnych symetrycznych poziomach. Ponownie wypełnij otwory trepanacyjne sterylnym olejem mineralnym, aby odizolować tę drogę przepływu prądu.
6. Procedura stymulacji i pomiar natężenia prądu w transkranialnej stymulacji prądem zmiennym (tACS) lub transkranialnej stymulacji prądem stałym (tDCS)
- Rejestruj dane w trybie ciągłym z podwójnych sond laserowych Dopplera umieszczonych na czaszce oraz z dwóch wyjść wewnątrzczaszkowych mikroelektrod (rejestrowanych za pomocą wzmacniacza DC z przedwzmacniaczami głowicowymi), wykorzystując system digitalizacji i oprogramowanie z co najmniej czterema kanałami (przy częstotliwości próbkowania 1 KHz). Po zarejestrowaniu wszystkich wartości przez wystarczająco stabilny czas bazowy (tj. >10 min), przetestuj stymulację pozaczaszkową.
UWAGA: Rycina 4 przedstawia przykład czterech kanałów, gdzie dwie elektrody rejestrujące wewnątrzczaszkowe znajdują się w kanałach górnych, a odpowiedź CBF w kanałach dolnych. - Stosuj krótkie okresy włączania/wyłączania stymulacji przy różnych amplitudach (tj. 20-30 s, 0.5-2.0 mA, w zakresie tolerancji), aby uzyskać wyraźną linię bazową przed i po stymulacji (Rycina 4). Stymulację aplikuj między dwie czaszkowe elektrody tACS po obu stronach (Rycina 1), używając komercyjnego, kompatybilnego z ludźmi urządzenia stymulującego, które dostarcza stały prąd.
- Uważnie obserwuj mysz pod kątem drgawek mięśniowych lub innych reakcji na tACS, takich jak zmiana tętna lub oddychania, aby określić górną granicę tolerancji (zazwyczaj ~2 mA).
- Kontynuuj monitorowanie impedancji między elektrodami podczas epok stymulacji, aby upewnić się, że pozostaje ona stała.
- Dodaj niewielką ilość (2-3 µL) 1 M KCl do przedniego otworu trepanacyjnego14, aby wywołać spontaniczne zdarzenia K+-SD. Generują one dużą odpowiedź CBF oraz interakcje między odpowiedzią CBF indukowaną przez K+-SD a ogólną odpowiedzią CBF. Oszacuj odpowiedź CBF na tACS, stosując stymulację tACS zarówno przed, jak i po wystąpieniu SD.
- Na koniec eksperymentu przeprowadź eutanazję poprzez przedawkowanie izofluranu (5%), a następnie dokonaj dekapitacji po ustaniu oddechów i bicia serca.
Rycina 4: Dane przedstawiające cztery kanały surowych danych w odpowiedzi na tACS o niskim natężeniu. Dane są ułożone w taki sposób, że dwa górne rzędy stanowią wewnątrzczaszkowe, bezpośrednie zapisy elektryczne DC (oznaczone jako Input 1 [IN0] i input 2 [IN1]), a dwa dolne rzędy stanowią obustronne zapisy laserowskiej dopplerometrii przepływu krwi mózgowej. Należy zauważyć, że odpowiedzi są asymetryczne między prawymi (górnymi) a lewymi (dolnymi) śladami elektrycznymi i przepływu krwi mózgowej. (A) Mała odpowiedź (wzrost przepływu krwi o 16%) w odpowiedzi na bodziec 1,2 mV/mm przez 20 s (0,75 mA). (B>) Większa odpowiedź (wzrost przepływu krwi o 21%) w odpowiedzi na bodziec 1,4 mV/mm (1,0 mA). Skrót: tACS = przezczaszkowa stymulacja prądem zmiennym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
7. Obliczenie pola elektrycznego
- Zmierz różnicę w sygnale z dwóch elektrod wewnątrzczaszkowych, wykorzystując różnicę w półfali (jednym cyklu) dwóch zarejestrowanych fal sinusoidalnych (dwie górne ścieżki na Rysunku 4). Podziel tę różnicę (mV) przez odległość między dwiema elektrodami (mm, tutaj ~4 mm, lecz mierzona bezpośrednio w każdym przypadku), aby obliczyć natężenie pola (mV/mm)3,6.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 4, Rysunku 5 oraz Rysunku 6. Rysunek 4 pokazuje przykład czterech kanałów, gdzie w górnych kanałach znajdują się dwie elektrody do rejestracji wewnątrzczaszkowej, a w dolnych kanałach odpowiedzi CBF. tACS jest symetryczny względem czaszki, jednak zazwyczaj odpowiedź pola wewnątrzczaszkowego jest lekko asymetryczna dla przyłożonych prądów AC, przy czym jedn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten koncentruje się na znieczulonym pomiarze odpowiedzi CBF in vivo jako biomarkera w celu oszacowania odpowiedzi mózgu na tES14. Długoterminowe biomarkery odpowiedzi tES obejmują efekty leczenia histologicznego, takie jak zapobieganie lub zmiany w tworzeniu blaszek amyloidowych (tj. ze stymulacją gamma przy 40 Hz w kilku modelach AD)16,17,18,19, ale krótkoterminowe biomarkery są również pomocne w oszacowaniu natychmiastowych efektów fizjologicznych i obli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez następujące granty (dla D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 i VA I21 BX003023.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wkładki alkoholowe | HenryShein | 112-6131 | |
| Olej mineralny dla dzieci | Johnson & Strzykawka Johnson | ||
| BD 1 ml | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Elektrody o płaskiej powierzchni | Myszy | ||
| C57BI | z kolonii NIH | ||
| Miedziane elektrody czaszki | Przygotowanie | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Kleszcze Dumont #5 | FST | #5 | |
| Kleszcze Dumont #7 zakrzywione | Dumont | RS-5047 | |
| Maść do oczu | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Ściągacz | do mikropipet płonący/brązowyInstrument Sutter Co. | Model P-87 | |
| Kleszcze 11,5 cm lekka krzywizna ząbkowane | Roboz | RS-8254 | |
| Igła intramedic 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | Przygotowanie | ||
| Laserowe sondy dopplerowskie | Moor Instruments | Laserowe sondy dopplerowskie | |
| Laserowe urządzenie do obrazowania plamek | RWD | RFLSI-ZW | |
| Mikro łyżeczka 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Nożyczki do mikropreparacji, 11,5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Fiksacja znieczulenia myszy | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| Monitorowanie PhysioSuite | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Sól fizjologiczna 0,9% roztwór NaCl | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Oprogramowanie | Axon Instruments Clampex | ||
| Klej chirurgiczny | Covetrus | 31477 | |
| Taśma chirurgiczna | 3M Transpore | T9784 |
Bibliografia
- Bestmann, S., Walsh, V. Transcranial electrical stimulation. Current Biology. 27 (23), R1258-R1262 (2017).
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).
- Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse. Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).
- Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery. Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).
- Voroslakos, M., et al. Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans. Nature Communications. 9 (1), 483(2018).
- Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human. Neuroimage. 194, 136-148 (2019).
- Tavakoli, A. V., Yun, K. Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214(2017).
- Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).
- Han, C. H., et al. Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study. Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).
- Ayata, C., Lauritzen, M. Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature. Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
- Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation. Frontiers in Neuroscience. 11, 564(2017).
- Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls. Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).
- Colton, C. A., et al. mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).
- Castano-Prat, P., et al. Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia. Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).
- Etter, G., et al. Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 10 (1), 5322(2019).
- Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
- Martorell, A. J., et al. Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition. Cell. 177 (2), 256-271 (2019).
- Dawson, J., et al. Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial. Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).
- Hacker, M. L., et al. Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes. Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).
- Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
- Haneef, Z., et al. Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology. Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
