Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Summary

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Celem pracy jest przedstawienie metody oceny zdolności fagocytozy i klirensu makrofagów pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej pochodzących z monojądrowych stymulowanych Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Makrofagi reprezentują kluczową linię obrony i są odpowiedzialne za zapobieganie wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Fagocytoza konidialna jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych związanych z interakcjami makrofagów-patogenów, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów. Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana w badaniach oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Unikanie fagocytozy i ucieczka fagosomów są mechanizmami zjadliwości grzybów. W tym miejscu przedstawiamy metody, które można zastosować do analizy fagocytozy, klirensu i żywotności T. stromaticum conidia, grzyba, który jest stosowany jako środek kontroli biologicznej i bionawozu i jest zdolny do wywoływania infekcji u ludzi. Protokół składa się z 1) hodowli Trichodermy, 2) przemywania w celu uzyskania konidiów, 3) izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu metody roztworu polisacharozy i różnicowania PBMC w makrofagi, 4) metody fagocytozy in vitro z wykorzystaniem okrągłych szkiełek nakrywkowych i barwienia oraz 5) testu klirensu w celu oceny żywotności konidiów po fagocytozie konidiów. Podsumowując, techniki te można wykorzystać do pomiaru skuteczności usuwania grzybów przez makrofagi.

Introduction

Rodzaj Trichoderma (Zamówienie: Hypocreales, Rodzina: Hypocreaceae) składa się z wszechobecnych, saprofitycznych grzybów, które są pasożytami innych gatunków grzybów i są zdolne do wytwarzania szeregu komercyjnie użytecznych enzymów¹. Te gatunki grzybów są wykorzystywane do produkcji białek heterologicznych², produkcji celulozy³, etanolu, piwa, wina i papieru⁴, w przemyśle tekstylnym⁵, przemyśle spożywczym⁶, oraz w rolnictwie jako środki kontroli biologicznej^7,8. Oprócz przemysłowego zainteresowania tymi gatunkami grzybów, rosnąca liczba infekcji u ludzi nadała niektórym gatunkom Trichoderma status oportunistycznych patogenów⁹.

Trichoderma spp. szybko rośnie w kulturze, z początkowo białymi i bawełnianymi koloniami, które zmieniają kolor na zielonkawo-żółty do ciemnozielonego¹⁰. Są przystosowane do życia w szerokim zakresie warunków pH i temperatury, a gatunki oportunistyczne są w stanie przetrwać w fizjologicznym pH i temperaturach, a tym samym kolonizować różne tkanki ludzkie^11,12,13. Co ważne, wzrost częstości zakażeń Trichoderma spp. może być związany z czynnikami wirulencji, a te nie są dobrze zbadane. Ponadto badania koncentrujące się na zrozumieniu odpowiedzi immunologicznej na oportunistyczne gatunki Trichoderma są nadal rzadkie.

Podczas infekcji, wraz z neutrofilami, makrofagi reprezentują linię obrony odpowiedzialną za fagocytozę, a tym samym zapobiegają wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Wykorzystując receptory rozpoznawania wzorców, takie jak receptory Toll-podobne i receptory lektyny typu C, makrofagi fagocytozują grzyby i przetwarzają je w fagolizosomy, promując w ten sposób wybuch oddechowy, uwalnianie cytokin prozapalnych i niszczenie mikroorganizmów fagocytozowanych¹⁴. Mechanizm fagocytozy może być jednak zakłócony i uniknięty przez różne strategie mikrobiologiczne, takie jak rozmiar i kształt komórek grzyba; obecność kapsułek utrudniających fagocytozę; zmniejszenie liczby receptorów indukujących fagocytozę; przebudowa struktury włókien aktynowych w cytoplazmie; utrudnianie tworzenia pseudopodiów; i ucieczka fagosomu lub fagolizosomu po procesie fagocytozy¹⁴.

Wiele patogenów, w tym Cryptococcus neoformans, wykorzystuje makrofagi jako niszę do przetrwania w organizmie gospodarza, rozprzestrzeniania się i wywoływania infekcji¹⁵. Test fagocytozy i klirensu służy do oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom oraz do identyfikacji strategii mikrobiologicznych stosowanych w celu uniknięcia wrodzonego układu odpornościowego^15,16,17. Tego typu technika może być również wykorzystana do zbadania zróżnicowanej kinetyki fagocytozy, opóźnionego zakwaszenia fagosomu i wybuchu oksydacyjnego, które skutkują zmniejszonym zabijaniem grzybów¹⁸.

Różne metody mogą być używane do oceny fagocytozy, przeżywalności grzybów i unikania procesu dojrzewania fagosomu. Należą do nich mikroskopia fluorescencyjna, która służy do obserwacji fagocytozy, lokalizacji komórkowej i cząsteczek wytwarzanych podczas fagocytozy¹⁹; cytometria przepływowa, która dostarcza danych ilościowych na temat fagocytozy i służy do oceny różnych markerów zaangażowanych w ten proces^20,21; mikroskopia przyżyciowa, która służy do oceny wychwytywania drobnoustrojów i dojrzewania fagosomów22; fagocytoza za pośrednictwem przeciwciał, która służy do oceny swoistości procesu fagocytozy dla patogenu²³; i inni^24,25,26,27.

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje powszechną, tanią i bezpośrednią metodę wykorzystującą mikroskop optyczny i test wzrostu płytki do oceny fagocytozy i zabijania konidiów grzybowych. Protokół ten dostarczy czytelnikom instrukcji krok po kroku dotyczących wykonywania testu fagocytozy i klirensu przy użyciu ludzkich makrofagów pochodzących z krwi obwodowej monojądrowej wystawionych na działanie T. stromaticum. PBMC zostały użyte, ponieważ Trichoderma conidia są stosowane jako biokontrola przeciwko fitopatogenom i bionawóz do upraw roślin na całym świecie i spowodowały kilka infekcji u ludzi, zwanych trichodermozą. Poza tym istnieją tylko dwie wcześniejsze prace skupiające się na interakcji między Trichoderma conidia a ludzkim układem odpornościowym, w których badaliśmy neutrofile²⁸ i autofagię w makrofagach²⁹. W artykule tym pokazano najpierw, w jaki sposób można badać fagocytozę konidiów T. stromaticum za pomocą makrofagów pochodzących z PBMC, a następnie jak można ocenić żywotność pochłoniętych konidiów za pomocą prostych technik opartych na mikroskopii. Protokół ten może dodatkowo ułatwić badania nad odpowiedzią immunologiczną związaną z makrofagami lub mechanizmami związanymi z modulacją układu odpornościowego.

Protocol

Względy etyczne i tematy ludzkie
Wszystkie eksperymenty na ludziach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i brazylijskim prawem federalnym i zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Stanowego Santa Cruz (kod identyfikacyjny projektu: 550.382/ 2014).

Ludzka krew obwodowa została pobrana od zdrowych ochotników z miasta Ilhéus, Bahia, Brazylia, którzy nie byli narażeni na działania zawodowe związane z badanym grzybem. Osoby ze zgłoszonymi schorzeniami lub przyjmujące leki zostały wykluczone. Wszyscy uczestnicy dobrowolnie zgodzili się na udział w badaniu i podpisali formularz świadomej zgody przed włączeniem ich do tego badania.

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

UWAGA: Zanim przejdziesz dalej, przygotuj następujące odczynniki i roztwory. Zapoznaj się z tabelą materiałów (TOM), aby uzyskać informacje o dostawcy odczynnika i materiału.

1. Przygotować zbilansowany, sterylny, buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej 1x (PBS).
   UWAGA: W tym protokole nie zastosowano PBS wolnego od endotoksyn.
2. Przygotować podłoże z agardem dekstrozowym ziemniaczanym (PDA) i wlać 20 ml do każdej szalki Petriego dla kultury T. stromaticum. Przygotuj sześć płytek z PDA dla każdego dawcy i użyj jednej płytki dla każdego stanu: 3 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin i 120 godzin. Dodatkowo należy użyć trzech płytek do każdej kontroli: trzech dla kontroli Trichoderma i trzech dla kontroli R10. Używaj szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm lub 100 mm x 15 mm w celu optymalnego odzyskiwania konidiów.
3. Sterylizuj 100% glicerol.
4. Przygotuj pożywkę R10 do hodowli komórkowej: pożywka RPMI uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% antybiotykiem (penicylina/streptomycyna).
5. Sterylizuj wodę destylowaną do lizy komórek.
6. Przygotuj wodę o pH 7,0 do procesu barwienia.
   UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj pH za pomocą pH-metru i roztworów 0,1 M/L NaOH i 0,1 M/L HCl.
7. Wysterylizuj okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (13 mm) i pęsetę.

2. Hodowla i przetwarzanie Trichoderma stromaticum

1. Przygotowanie materiału matecznego (M1) T. stromaticum:
   UWAGA: Stado mateczne (M1) jest wymagane w celu zapewnienia, że wszystkie doświadczenia są przeprowadzane z kultury tego samego świeżego pokolenia (F1).
   1. Hodować inokulum T. stromaticum na szalkach Petriego z PDA w temperaturze 28 °C w ciemności przez 7-10 dni, aż zaobserwuje się konidia i kultura zmieni kolor na zielony.
   2. Umyj kulturę T. stromaticum. Dodaj 3-5 ml PBS do powierzchni hodowli za pomocą pipety. Zebrać PBS z płytki i ponownie dozować go do kultury, aby stopniowo usuwać konidia za pomocą pipety. Powtarzaj ten proces tak często, jak to konieczne, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnozielony.
      UWAGA: Alternatywnie sugeruje się delikatne mycie kultury poprzez dodanie 3-5 ml PBS do płytki, a następnie wykonywanie ruchów okrężnych, aż zawiesina zmieni kolor na zielony, aby odzyskać konidia. Przy wielokrotnym pipetowaniu można zebrać więcej konidiów.
   3. Przenieść odzyskaną zawiesinę z płytki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Powtórz kroki 2.1.2-2.1.3 tyle razy, ile to konieczne, aby uzyskać więcej konidiów.
   4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1,160 x g przez 5 minut w temperaturze 12 °C i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS. Powtórzyć ten krok (2.1.4) trzy razy, aby uzyskać zawiesinę wolną od strzępek.
      UWAGA: Aby prawidłowo zawiesić osad, po odwirowaniu zaleca się krótkie wirowanie.
   5. Zawiesić końcowe osady w 2-3 ml PBS i policzyć konidia w komorze Neubauera, stosując rozcieńczenie 1:100 lub 1:1 000,
      UWAGA: W optymalnych warunkach można odzyskać z hodowli końcowe stężenie 2 x 10⁸ konidii/ml. Ocena żywotności konidiów przy użyciu metody wykluczenia błękitu trypanowego jest fakultatywna.
   6. Porcję zawiesiny rozdzielić do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml, dodając 0,5 ml zawiesiny konidiów (z kroku 2.1.5) do każdej probówki. Następnie dodaj 0,5 ml sterylnego 100% glicerolu, aby uzyskać zapasy M1. Krótko przemieszać, zidentyfikować probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
2. Hodowla T. stromaticum i pozyskiwanie konidiów do eksperymentu
   1. Płytka 10 μl zawiesiny M1 (przygotowanej w kroku 2.1) w PDA w temperaturze 28 °C w ciemności przez 7-10 dni, aż do zaobserwowania konidiów i zmiany koloru kultury na zielony w celu uzyskania świeżej generacji F1.
      UWAGA: Aby zapewnić świeżą hodowlę T. stromaticum do eksperymentu, należy ocenić czas potrzebny do wzrostu grzyba i czas potrzebny do różnicowania makrofagów.
   2. Zbierz konidia, powtarzając kroki 2.1.2-2.1.4.
   3. Zawiesić ostatnią osadkę w 2-3 ml PBS. Ocenić żywotność konidiów przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego lub policzyć konidia, jak wspomniano w kroku 2.1.5.

3. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

UWAGA: PBMC są otrzymywane metodą bariery gęstości przy użyciu roztworu polisacharozy o gęstości 1,077 g/mL³⁰.

1. Podwielokrotność 15 ml roztworu polisacharozy do jednej probówki o pojemności 50 ml na każdą próbkę dawcy, która zostanie pobrana.
2. Zbierz 20 ml krwi od każdego dawcy za pomocą trzech do czterech probówek EDTA. Zrekrutuj co najmniej czterech dawców na eksperyment. Nie gromadź krwi dawców; Zamiast tego należy użyć każdej próbki osobno jako kontrpróby biologicznej. Dla każdego dawcy przenieś krew do jednej probówki o pojemności 50 ml i dodaj PBS, aby uzyskać końcową objętość 35 ml.
3. Przenieść zawiesinę krwi (krok 3.2) powoli wzdłuż ścianki probówki zawierającej roztwór polisacharozy (krok 3.1) do utworzenia dwufazowej zawiesiny.
   UWAGA: Aby zapobiec mieszaniu się krwi z roztworem polisacharozy, dodawaj krew powoli. Do izolacji PBMC zaleca się użycie co najmniej 7 ml krwi od każdego dawcy
.
4. Natychmiast odwirować probówkę zawierającą dwufazową zawiesinę o stężeniu 1 600 x g przez 30 minut w temperaturze 24 °C. Zaprogramować wirowanie PBMC: użyć przyspieszenia 1 i opóźnienia 0, aby uniknąć nagłego zatrzymania wirowania.
5. Obserwuj tworzenie się białego pierścienia zawierającego PBMC po odwirowaniu. Czerwone krwinki i granulocyty znajdują się w dolnej warstwie, następna warstwa zawiera roztwór polisacharozy, a PBMC znajdują się w białym pierścieniu między roztworem polisacharozy a osoczem (górna warstwa). Zebrać biały pierścień, delikatnie zasysając go pipetą lub sterylną pipetą Pasteura, aby nie przechwycić czerwonych krwinek, osocza lub roztworu polisacharozy, i przenieść do jednej probówki o pojemności 15 ml.
6. Dodać PBS do 15 ml probówki zawierającej PBMC, aby uzyskać końcową objętość 10 ml. Homogenizować zawiesinę i odwirowywać probówkę o sile 1 600 x g przez 30 minut w temperaturze 24 °C.
7. Przemyć komórki trzykrotnie w temperaturze 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze 24 °C za pomocą 10 ml PBS. Następnie ponownie zawiesić ostatnią osadkę w 2 ml pożywki R10.
8. Ocenić żywotność komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego i policzyć komórki w komorze Neubauera.

4. Kinetyka fagocytozy

UWAGA: Ludzkie makrofagi monojądrowe krwi obwodowej są traktowane T. stromaticum conidia przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:10 lub tylko pożywce R10 jako kontrola. Wielokrotność infekcji (MOI) reprezentuje stosunek czynników zakaźnych dodanych do celów infekcji i jest przedstawiona jako liczby bezwzględne: MOI = agents:targets³¹. Tutaj używamy 1 T. stromaticum conidia (agent) na 10 makrofagów (celów). Następnie komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez różne okresy czasu (3 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin i 120 godzin). Następnie okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe służy do wizualizacji przylegających makrofagów biorących udział w procesie fagocytozy pod mikroskopem. Dostarczony jest eksperymentalny rysunek projektowy (Rysunek 1).

UWAGA: Sugeruje się stosowanie płytek 24-dołkowych.

1. Leczenie makrofagów pochodzenia ludzkiego za pomocą T. stromaticum conidia
   1. Dodaj sterylne okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (13 mm) do każdego dołka za pomocą sterylnej pęsety.
   2. Dostosuj objętość zawiesiny komórek otrzymanej w krokach 3.7-3.8 do płytki 8 x 10 5 komórek na studzienkę do końcowej objętości 1 ml z pożywką R10. Użyj odwróconego mikroskopu, aby ocenić morfologię komórki.
      UWAGA: Komórki muszą być zawieszone w pożywce i mieć zaokrągloną morfologię.
   3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przez 7 dni i zastępować pożywkę świeżą pożywką R10 co 2 dni w celu różnicowania monocytów na makrofagi³². Obserwuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Makrofagi będą prezentować wrzecionowatą morfologię, o spłaszczonych i wydłużonych kształtach; Można również zaobserwować zwiększony stosunek cytoplazmatyczny i obecność pseudopodiów. Szukaj przylegających makrofagów pochodzenia jednojądrowego.
      UWAGA: Bardzo mały odsetek niezróżnicowanych monocytów może pozostać zawieszony w pożywce.
   4. Usunąć pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety i umyć komórki 1 ml PBS w celu usunięcia zanieczyszczeń i nieprzylegających komórek.
   5. Użyć zawiesiny przygotowanej w kroku 2.2 w celu przygotowania nowej zawiesiny T. stromaticum conidia o końcowym stężeniu 8 x 10⁴ konidia/ml w pożywce R10.
   6. Dodać 1 ml zawiesiny konidiów przygotowanej w kroku 4.1.5 do każdej studzienki zabiegowej (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h), aby uzyskać MOI 1:10. Do kontroli dodaj tylko 1 ml pożywki R10 do studzienki.
   7. Badać makrofagi przez 3 godziny za pomocą konidiów T. stromaticum w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .} Po 3 godzinach usuń pożywkę i umyj komórki, aby usunąć niefagocytozowane konidia.
   8. Dodać 1 ml pożywki R10 do każdego dołka i inkubować płytkę przez różne czasy (3 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin i 120 godzin) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ .
2. Koloryzacja i analiza
   1. Po zakończeniu odpowiedniej inkubacji (krok 4.1.8) usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać do niej 1 ml PBS.
   2. Usuń okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe z dołków za pomocą sterylnej pęsety i igły do barwienia za pomocą zestawu do barwienia.
      UWAGA: Alternatywnie barwienie można wykonać za pomocą May Grünwald-Giemsa stain³³.
   3. Do każdego z okrągłych szkiełek nakrywkowych dodaj utrwalacz plam (5 s), Dye 1 (5 s), Dye 2 (2 s) i bufor wodny o pH 7,0 (5 s), które są składnikami zestawu do barwienia. Poczekaj, aż wyschną i przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą środka montażowego.
   4. Określ ilościowo wynik: Policz w sumie 100 makrofagów (Mø) dla każdego warunku czasowego. Za pomocą mikroskopu optycznego policz liczbę makrofagów z fagocytozowanymi konidiami za pomocą obiektywu 100x i olejku immersyjnego (równanie [1]).
      (1)
   5. Uzyskaj liczbę fagocytozowanych konidiów na makrofagi: Skoreluj konidia obecne w 100 makrofagach podzielone przez liczbę makrofagów z co najmniej jednym fagocytozowanym konidołem (równanie [2])³⁴.
      (2)
      UWAGA: Do oceny i liczenia konidiów można użyć oprogramowania ImageJ³⁵.
   6. Sfotografuj fagocytozę z każdej próbki i warunki czasowe, używając obiektywów 40x i 100x, aby przedstawić wyniki.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie testu fagocytozy i żywotności konidialnej przy użyciu ludzkich makrofagów pochodzących z krwi obwodowej monojądrowej. (1-10) Test fagocytozy: T. stromaticum musi być hodowany w PDA, a konidia są odzyskiwane przez mycie płytki PBS. PBMC należy wyizolować metodą bariery gęstości przy użyciu opisanego protokołu, hodować na 24-dołkowych płytkach ze sterylnymi okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi przez 7 dni w celu różnicowania do makrofagów, a następnie poddać działaniu MOI 1:10 w różnych odstępach czasu. Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe są usuwane i barwione za pomocą zestawu do barwienia, a wyniki są analizowane za pomocą mikroskopii świetlnej. (1-8,11-13) Test żywotności konidiów: Po izolacji PBMC hoduje się na 24-dołkowych płytkach bez okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych przez 7 dni w celu różnicowania w makrofagi, a następnie traktuje MOI 1:10 przez różne przedziały czasu. Komórki muszą być poddane lizie przez inkubację z wodą destylowaną; zawiesina jest następnie odwirowywana, a następnie ponownie zawieszony osad jest platerowany w PDA w celu analizy kinetyki wzrostu Trichoderma. Figura ta została zaprojektowana przy użyciu bazy danych obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Test żywotności konidialnej po fagocytozie

UWAGA: Podano eksperymentalny rysunek projektowy (Rysunek 1).

UWAGA: Używaj płytek 24-dołkowych.

1. Rzuć wyzwanie makrofagom pochodzącemu od człowieka za pomocą T. stromaticum conidia.
   1. Powtórz kroki 4.1.2-4.1.8 w celu różnicowania monocytów i potraktuj makrofagi T. stromaticum conidia.
      UWAGA: Nie używaj okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych w studzienkach. Stosować te same przedziały czasowe, które są używane do oznaczania kinetyki fagocytozy, aby fagocytoza mogła być skorelowana z żywotnością konidiów.
   2. Ocenić wpływ pożywki R10 na wzrost T. stromaticum, stosując studzienki z zawiesiną przygotowaną w kroku 4.1.5 (podłoże R10 + konidia) jako kontrolę.
2. Test żywotności konidialnej
   1. Usuń pożywkę po każdym okresie inkubacji (3 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny, 96 godzin i 120 godzin) i dwukrotnie przemyj komórki PBS w celu usunięcia konidiów, które nie zostały fagocytozytozowane.
      UWAGA: Kontroli zawierającej pożywkę R10 + konidia nie należy myć.
   2. Dodać 0,5 ml sterylnej wody destylowanej do każdego dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut. Po tym czasie obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem, aby upewnić się, że komórki zostały poddane lizie.
   3. Zebrać zawiesinę i przenieść ją do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawiesinę za pomocą mini wirówki o sile 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Ostrożnie odrzucić supernatant, zawiesić osad w 10 μl sterylnej wody destylowanej i zaszczepić 10 μl zawiesiny na płytce zawierającej PDA w temperaturze 28 °C w ciemności.
   5. Przygotować kontrolę dodatnią dla wzrostu T. stromaticum: Użyć zawiesiny T. stromaticum conidia (etap 2.2) do przygotowania nowej zawiesiny o końcowym stężeniu 8 x 10⁶ konidiów/ml. Płytka 10 μl tej zawiesiny w PDA w temperaturze 28 °C w ciemności.
      UWAGA: 10 μl tej zawiesiny będzie zawierało taką samą liczbę konidiów (8 x 10⁴), które zostały użyte do zakażenia makrofagów krwi pochodzenia jednojądrowego. Różnica między tą kontrolą dodatnią a kontrolą wspomnianą w kroku 5.1.2 polega na tym, że kontrola wspomniana powyżej w kroku 5.1.2 jest wykorzystywana do oceny możliwego wpływu pożywki R10 na wzrost Trichoderma w czasie fagocytozy. Ta kontrola pozytywna w kroku 5.2.5 z wykorzystaniem zawiesiny T. stromaticum conidia zebranej w PBS stanowi kontrolę wzrostu Trichoderma bez wpływu pożywki R10 w celu odzwierciedlenia naturalnego wzrostu grzyba. Za pomocą tej kontroli można ocenić, czy podłoże R10 wpływa na wzrost Trichodermy.
   6. Codziennie obserwuj kinetykę wzrostu T. stromaticum w PDA i fotografuj kulturę.
   7. Analiza: Do oceny wyników można wykorzystać dwa punkty: 1) czas (w dniach) wymagany do zajęcia przez hodowlę całej płytki hodowlanej oraz 2) czas (w dniach) do pojawienia się charakterystycznej zielonej pigmentacji konidiów T. stromaticum w kulturze.

6. Analiza statystyczna

1. Użyj testu Kruskala-Wallisa, aby określić statystycznie istotne różnice między 8 grupami/terapiami. Uznajmy, że p < 0,05 jest statystycznie istotne. Wszystkie dane są prezentowane jako średnie ± odchylenia standardowego (SD). Na rysunkach # oznacza istotność statystyczną na poziomie p < 0,05.

Results

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Wykorzystaliśmy fagocytozę konidiów T. stromaticum do oceny żywotności konidiów po fagocytozie, ponieważ unikanie fagocytozy i ucieczka fagosomy są mechanizmami zjadliwości grzybów. Naukowcy powinni wykonywać te techniki jako jedne z pierwszych testów podczas badania gatunku o znaczeniu klinicznym.

Discussion

W przypadku kilku patogenów grzybiczych, w tym Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans i innych, fagocytoza konidialna lub drożdżakowa jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych w interakcjach makrofag-patogen, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów 14,39,40. Fagocytoza jest kluczowym procesem w interakcji Tric...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki wirówkowe 15 ml	Corning	CLS431470	Probówki wirówkowe 15 mL, polipropylen, stożkowe dno z pokrywką, indywidualnie sterylna
24-dołkowa płaska płytka do hodowli komórkowych	Kasvi	K12-024	Wykonana z polistyrenu z oznaczeniem alfanumerycznym; Płytka do hodowli komórkowej jest wolna od DNaz, RNaz i pirogenów oraz substancji cytotoksycznych; Sterylizowane promieniowaniem gamma;
Inkubator CO2 do hodowli komórkowych	Sanyo	303082	Inkubator CO2 służy do tworzenia i kontrolowania warunków podobnych do warunków życia ludzkiego, umożliwiając w ten sposób wzrost i proliferację różnych typów komórek in vitro.
Wirówka Mikroprobówka (typ eppendorf) 1,5 ml	Capp	5101500	Wykonana z polipropylenu, z nakrętką przymocowaną do probówki do otwierania i zamykania jedną ręką. Ma polerowane wnętrze zapobiegające adhezji białek i zapewniające widoczność próbki, ponieważ jest wolne od DNazy, RNazy i pirogenów
Szkiełko nakrywkowe okrągłe 15 mm	Olen	K5-0015	Szkiełka nakrywkowe okrągłe są stosowane w technikach mikroskopowych w hodowlach komórkowych. Wykonany z super przezroczystego półprzezroczystego szkła; o grubości 0,13 mm
Klasa II Typ B2 (Total Exhaust) Szafy bezpieczeństwa biologicznego	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinet (AB2) zapewniają ochronę produktu, operatora i środowiska oraz nadają się do pracy ze śladowymi ilościami toksycznych chemikaliów i środków przypisanych do poziomów bezpieczeństwa biologicznego I, II lub III. W szafie klasy II typu B2 całe powietrze nawiewane i nawiewane jest po filtracji HEPA/ULPA odprowadzane do środowiska zewnętrznego bez recyrkulacji po powierzchni roboczej.
Dekstroza Agar ziemniaczany pożywka	Merck	145	Agar ziemniaczany dekstrozowy jest stosowany w hodowli i oznaczaniu liczby drożdży i grzybów
Probówka próżniowa do pobierania krwi EDTA	FirstLab	FL5-1109L	EDTA jest zalecanym antykoagulantem do rutynowych zabiegów hematologicznych, ponieważ jest to najlepszy antykoagulant do zachowania morfologii komórek.
Entellan	Merck	1.07961	Środek utrwalający; Entellan to bezwodne medium montażowe do stałego montażu do mikroskopii.
Surowica bydlęca	płodu Gibco	A2720801	Surowica bydlęca płodu (FBS) jest  Uniwersalny suplement wzrostu pożywek do hodowli komórkowych i tkankowych. FBS to naturalny koktajl większości czynników wymaganych do przyłączania, wzrostu i proliferacji komórek, skuteczny w przypadku większości typów komórek ludzkich i zwierzęcych (w tym owadów).
Flaticon			baza obrazów
Glicerol	Merck	24900988	Środek krioprotekcyjny glicerol służy do zamrażania komórek i zarodników
Histopaque-1077			roztwór polisacharozy
Obraz J			Oprogramowanie do analizy obrazu
Szkiełka mikroskopowe	Precision	7105	Szkiełko do mikroskopii 26 x 76 mm Matowe docierane Grubość 1,0 do 1,2 mm. Wykonane ze specjalnego szkła optycznego i zapakowane w przekładkę z jedwabnego papieru o wysokiej jakości przezroczystości wolnej od niedoskonałości
Mini wirówka	Prism	C1801	Mini wirówka Prism została zaprojektowana tak, aby była niezwykle kompaktowa i zajmowała wyjątkowo mało miejsca. Zawiera 2 wymienne wirniki z szybkozłączką, które obracają się z prędkością do 6000 obr./min. Elektroniczny hamulec zapewnia szybkie zwalnianie, a samootwierająca się pokrywa umożliwia łatwy dostęp do próbki, skracając czas obsługi.
Komora Neubauera	Kasvi	K5-0011	Komora licząca Neubauera służy do liczenia komórek lub innych zawieszonych cząstek.
Szybkość panoptyczna	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c to zestaw do szybkiego barwienia w hematologii
Roztwór penicyliny/streptomycyny - 10 000U	LGC- Biotechnologia	BR3011001	antybiotyk stosuje się w celu uniknięcia możliwego zanieczyszczenia przez manipulację zewnętrzną w stosunku do przepływu laminarnego.
szalka Petriego 90 x 15 mm Gładki	Cralplast	18248	Jednorazowa szalka Petriego; Wykonane z wysoce przezroczystego polistyrenu (PS); płaskie dno; Gładki; Rozmiar: 90 x 15 mm.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS to roztwór soli fizjologicznej na bazie wody o prostym składzie. Jest izotoniczny i nietoksyczny dla większości komórek. Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i został opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu przy jednoczesnym utrzymaniu równowagi wodnej żywych komórek.
Pipeta Pasteur 3 ml Sterylna	Accumax	AP-3-B-S	STERYLNA ACCUMAX PASTEUR 3 ML o pojemności 3 ml, wykonana z przezroczystego polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) i indywidualnie sterylna
wirówka z chłodzeniem	Thermo Scientific	TS-HM16R	Wirówka z chłodzeniem Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R to wirówka z chłodzeniem z przyjaznym dla użytkownika panelem sterowania, który ułatwia wstępne ustawienie prędkości, wartości RCF, czas trwania,  temperatury i profilu pracy. Megafuge 16R może osiągnąć maksymalne prędkości  15 200 obr./min i maksymalny RCF 25 830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, z L-glutaminą i 25 mM HEPES, bez wodorowęglanu sodu, proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych
Mikropipety jednokanałowe	Eppendorf	Z683809	Mikropipety jednokanałowe służą do dokładnego przenoszenia i pomiaru bardzo małych ilości cieczy.
Końcówka do mikropipetora	Corning	4894	pojemność 10 &mikro; L oraz 1,000 &mikro; L Autoklawowalny
trójokularowy mikroskop odwrócony	LABOMED	VU-7125500	Pozwala obserwować komórki wewnątrz probówek i butelek, bez konieczności ich otwierania, unikając w ten sposób problemów z zanieczyszczeniem.