Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65231

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Celem pracy jest przedstawienie metody oceny zdolności fagocytozy i klirensu makrofagów pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej pochodzących z monojądrowych stymulowanych Trichoderma stromaticum conidia.

Streszczenie

Makrofagi reprezentują kluczową linię obrony i są odpowiedzialne za zapobieganie wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Fagocytoza konidialna jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych związanych z interakcjami makrofagów-patogenów, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów. Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana w badaniach oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Unikanie fagocytozy i ucieczka fagosomów są mechanizmami zjadliwości grzybów. W tym miejscu przedstawiamy metody, które można zastosować do analizy fagocytozy, klirensu i żywotności T. stromaticum conidia, grzyba, który jest stosowany jako środek kontroli biologicznej i bionawozu i jest zdolny do wywoływania infekcji u ludzi. Protokół składa się z 1) hodowli Trichodermy, 2) przemywania w celu uzyskania konidiów, 3) izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu metody roztworu polisacharozy i różnicowania PBMC w makrofagi, 4) metody fagocytozy in vitro z wykorzystaniem okrągłych szkiełek nakrywkowych i barwienia oraz 5) testu klirensu w celu oceny żywotności konidiów po fagocytozie konidiów. Podsumowując, techniki te można wykorzystać do pomiaru skuteczności usuwania grzybów przez makrofagi.

Wprowadzenie

Rodzaj Trichoderma (Zamówienie: Hypocreales, Rodzina: Hypocreaceae) składa się z wszechobecnych, saprofitycznych grzybów, które są pasożytami innych gatunków grzybów i są zdolne do wytwarzania szeregu komercyjnie użytecznych enzymów1. Te gatunki grzybów są wykorzystywane do produkcji białek heterologicznych2, produkcji celulozy3, etanolu, piwa, wina i papieru4, w przemyśle tekstylnym5, przemyśle spożywczym6, oraz w rolnictwie jako środki kontroli biologicznej7,8. Oprócz przemysłowego zainteresowania tymi gatunkami grzybów, rosnąca liczba infekcji u ludzi nadała niektórym gatunkom Trichoderma status oportunistycznych patogenów9.

Trichoderma spp. szybko rośnie w kulturze, z początkowo białymi i bawełnianymi koloniami, które zmieniają kolor na zielonkawo-żółty do ciemnozielonego10. Są przystosowane do życia w szerokim zakresie warunków pH i temperatury, a gatunki oportunistyczne są w stanie przetrwać w fizjologicznym pH i temperaturach, a tym samym kolonizować różne tkanki ludzkie11,12,13. Co ważne, wzrost częstości zakażeń Trichoderma spp. może być związany z czynnikami wirulencji, a te nie są dobrze zbadane. Ponadto badania koncentrujące się na zrozumieniu odpowiedzi immunologicznej na oportunistyczne gatunki Trichoderma są nadal rzadkie.

Podczas infekcji, wraz z neutrofilami, makrofagi reprezentują linię obrony odpowiedzialną za fagocytozę, a tym samym zapobiegają wzrostowi i kolonizacji patogenów w różnych tkankach. Wykorzystując receptory rozpoznawania wzorców, takie jak receptory Toll-podobne i receptory lektyny typu C, makrofagi fagocytozują grzyby i przetwarzają je w fagolizosomy, promując w ten sposób wybuch oddechowy, uwalnianie cytokin prozapalnych i niszczenie mikroorganizmów fagocytozowanych14. Mechanizm fagocytozy może być jednak zakłócony i uniknięty przez różne strategie mikrobiologiczne, takie jak rozmiar i kształt komórek grzyba; obecność kapsułek utrudniających fagocytozę; zmniejszenie liczby receptorów indukujących fagocytozę; przebudowa struktury włókien aktynowych w cytoplazmie; utrudnianie tworzenia pseudopodiów; i ucieczka fagosomu lub fagolizosomu po procesie fagocytozy14.

Wiele patogenów, w tym Cryptococcus neoformans, wykorzystuje makrofagi jako niszę do przetrwania w organizmie gospodarza, rozprzestrzeniania się i wywoływania infekcji15. Test fagocytozy i klirensu służy do oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom oraz do identyfikacji strategii mikrobiologicznych stosowanych w celu uniknięcia wrodzonego układu odpornościowego15,16,17. Tego typu technika może być również wykorzystana do zbadania zróżnicowanej kinetyki fagocytozy, opóźnionego zakwaszenia fagosomu i wybuchu oksydacyjnego, które skutkują zmniejszonym zabijaniem grzybów18.

Różne metody mogą być używane do oceny fagocytozy, przeżywalności grzybów i unikania procesu dojrzewania fagosomu. Należą do nich mikroskopia fluorescencyjna, która służy do obserwacji fagocytozy, lokalizacji komórkowej i cząsteczek wytwarzanych podczas fagocytozy19; cytometria przepływowa, która dostarcza danych ilościowych na temat fagocytozy i służy do oceny różnych markerów zaangażowanych w ten proces20,21; mikroskopia przyżyciowa, która służy do oceny wychwytywania drobnoustrojów i dojrzewania fagosomów22; fagocytoza za pośrednictwem przeciwciał, która służy do oceny swoistości procesu fagocytozy dla patogenu23; i inni24,25,26,27.

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje powszechną, tanią i bezpośrednią metodę wykorzystującą mikroskop optyczny i test wzrostu płytki do oceny fagocytozy i zabijania konidiów grzybowych. Protokół ten dostarczy czytelnikom instrukcji krok po kroku dotyczących wykonywania testu fagocytozy i klirensu przy użyciu ludzkich makrofagów pochodzących z krwi obwodowej monojądrowej wystawionych na działanie T. stromaticum. PBMC zostały użyte, ponieważ Trichoderma conidia są stosowane jako biokontrola przeciwko fitopatogenom i bionawóz do upraw roślin na całym świecie i spowodowały kilka infekcji u ludzi, zwanych trichodermozą. Poza tym istnieją tylko dwie wcześniejsze prace skupiające się na interakcji między Trichoderma conidia a ludzkim układem odpornościowym, w których badaliśmy neutrofile28 i autofagię w makrofagach29. W artykule tym pokazano najpierw, w jaki sposób można badać fagocytozę konidiów T. stromaticum za pomocą makrofagów pochodzących z PBMC, a następnie jak można ocenić żywotność pochłoniętych konidiów za pomocą prostych technik opartych na mikroskopii. Protokół ten może dodatkowo ułatwić badania nad odpowiedzią immunologiczną związaną z makrofagami lub mechanizmami związanymi z modulacją układu odpornościowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Kwestie etyczne i uczestnicy badania
Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzi opisane w niniejszej pracy zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz brazylijskim prawem federalnym i zatwierdzone przez Komisję Etyczną State University of Santa Cruz (kod identyfikacyjny projektu: 550.382/ 2014).

Krew obwodowa ludzi została pobrana od zdrowych ochotników z miasta Ilhéus w stanie Bahia w Brazylii, którzy nie byli narażeni na działalność zawodową związaną z badanym grzybem. Wykluczono osoby z zgłoszonymi schorzeniami medycznymi lub przyjmujące leki. Wszyscy uczestnicy dobrowolnie zgodzili się na udział w badaniu i podpisali formularz świadomej zgody przed włączeniem do niniejszego badania.

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy należy przygotować następujące odczynniki i roztwory. Informacje dotyczące dostawców odczynników i materiałów znajdują się w Tabeli Materiałów (TOM).

  1. Przygotować zrównoważony sterylny roztwór soli buforowej z fosforanem (PBS) 1x.
    UWAGA: W niniejszym protokole nie zastosowano PBS wolnego od endotoksyn.
  2. Przygotować podłoże agar ziemniaczano-dekstrozowe (PDA) i wlać po 20 mL do każdej szalki Petriego dla hodowli T. stromaticum. Przygotować sześć płytek z PDA dla każdego donora, wykorzystując jedną płytkę dla każdego stanu czasowego: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h. Dodatkowo przygotować trzy płytki dla każdej kontroli: trzy dla kontroli Trichoderma oraz trzy dla kontroli z podłożem R10. W celu optymalnego odzyskania konidiów należy użyć szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm lub 100 mm x 15 mm.
  3. Sterylizować 100% glicerol.
  4. Przygotować podłoże R10 do hodowli komórkowej: podłoże RPMI uzupełnione o 10% płatkowej surowicy bydlęcej oraz 1% antybiotyku (penicylina/streptomycyna).
  5. Sterylizować wodę destylowaną do lizy komórek.
  6. Przygotować wodę o pH 7,0 do procesu barwienia.
    UWAGA: W razie potrzeby skorygować pH za pomocą pH-metru oraz roztworów 0,1 M/L NaOH i 0,1 M/L HCl.
  7. Sterylizować okrągłe szkiełka zakryjące (13 mm) oraz pęsety.

2. Trichoderma stromaticum hodowla i przetwarzanie

  1. Przygotowanie roztworu matki (M1) z T. stromaticum:
    UWAGA: Wymagane jest przygotowanie kultury matczynej (M1), aby zapewnić, że wszystkie eksperymenty zostaną przeprowadzone na kulturze z tego samego świeżego pokolenia (F1).
    1. Hodowla T. stromaticum inakulum w szalkach Petriego z PDA w temperaturze 28 °C w ciemności przez 7–10 dni, aż do zaobserwowania konidiów i zazielenienia się kultury.
    2. Przemyć hodowlę T. stromaticumZa pomocą pipety dodaj 3–5 ml buforu PBS na powierzchnię hodowli. Zbierz PBS z płytki i ponownie nanieś go na hodowlę, aby stopniowo usuwać konidia za pomocą pipety. Powtarzaj ten proces tyle razy, ile będzie to konieczne, aż zawiesina stanie się ciemnozielona.
      UWAGA: Alternatywnie, w celu odzyskania konidiów, sugeruje się delikatne przemycie kultury poprzez dodanie do płytki 3-5 ml PBS, a następnie wykonywanie ruchów okrężnych aż do momentu, gdy zawiesina zmieni kolor na zielony. Powtarzanie pipetowania pozwala na zebranie większej ilości konidiów.
    3. Przenieś odzyskaną zawiesinę z płytki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety. Powtórz kroki 2.1.2-2.1.3 tyle razy, ile będzie to konieczne, aby uzyskać więcej konidiów.
    4. Odwirować zawiesinę przy 1160 x g przez 5 min w temperaturze 12 °Cnastępnie osad resuspender w 5 ml PBS. Powtórzyć ten krok (2.1.4) trzykrotnie, aby uzyskać zawiesinę wolną od strzępek.
      UWAGA: Aby prawidłowo resuspendować osad, po wirowaniu zaleca się krótkie wymieszanie w wstrząsarzu wortexowym.
    5. Resuspenduj końcowy osad w 2–3 ml PBS, a następnie policz konidia w komorze Neubauera, stosując rozcieńczenie 1:100 lub 1:1000.
      UWAGA: W optymalnych warunkach końcowe stężenie wynosi 2 x 108 konidiów/ml można odzyskać z hodowli. Ocena żywotności konidiów metodą wykluczania błękitu trypanu jest opcjonalna.
    6. Rozdziel zawiesinę do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml, dodając do każdej probówki 0,5 ml zawiesiny konidiów (z kroku 2.1.5). Następnie dodaj 0,5 ml sterylnego, 100% glicerolu, aby otrzymać zapasy M1. Krótko wymieszaj na wortexie, opisz probówki i przechowuj w temperaturze −20 °C lub −80 °C.
  2. Hodowla T. stromaticum oraz pozyskiwanie konidiów do eksperymentu
    1. Szalka 10 µL zawiesiny M1 (przygotowanej w kroku 2.1) w PDA przy 28 °C w ciemności przez 7–10 dni, aż do czasu zaobserwowania konidiów i zmiany koloru kultury na zielony, w celu uzyskania świeżej generacji F1.
      UWAGA: Aby zapewnić świeżość *T. stromaticum* hodowla do eksperymentu, ocena czasu wymaganego do wzrostu grzyba oraz czasu wymaganego do różnicowania makrofagów.
    2. Zebrać konidia, powtarzając kroki 2.1.2–2.1.4.
    3. Resuspender końcowy osad w 2–3 ml PBS. Ocenić żywotność konidiów za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu lub policzyć konidia zgodnie z opisem w punkcie 2.1.5.

3. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)

UWAGA: PBMC uzyskuje się metodą bariery gęstości z wykorzystaniem roztworu polisacharozy o gęstości 1,077 g/mL30.

  1. Odmiar 15 mL roztworu polisacharozy do jednej probówki o pojemności 50 mL dla każdej próbki pobranej od dawcy.
  2. Pobierz 20 mL krwi od każdego dawcy, używając trzech lub czterech probówek z EDTA. Do każdego eksperymentu zakwalifikuj minimum czterech dawców. Nie łącz krwi od dawców; zamiast tego użyj każdej próbki osobno jako replikatu biologicznego. W przypadku każdego dawcy przenieś krew do jednej probówki 50 mL i dodaj PBS, aby uzyskać objętość końcową 35 mL.
  3. Powoli przenieś zawiesinę krwi (krok 3.2) wzdłuż ścianki probówki zawierającej roztwór polisacharozy (krok 3.1), aby utworzyć zawiesinę dwufazową.
    UWAGA: Aby zapobiec zmieszaniu krwi z roztworem polisacharozy, dodawaj krew powoli. Do izolacji PBMC zaleca się użycie minimum 7 mL krwi od każdego dawcy.
  4. Natychmiast odwiruj probówkę z zawiesiną dwufazową przy 1 600 x g przez 30 min w temperaturze 24 °C. Zaprogramuj wirowanie PBMC: ustaw przyspieszenie 1 i hamowanie 0, aby uniknąć gwałtownego zatrzymania wirowania.
  5. Po wirowaniu zaobserwuj powstanie białego pierścienia zawierającego PBMC. Erytrocyty i granulocyty znajdują się w warstwie dolnej, następna warstwa zawiera roztwór polisacharozy, a PBMC znajdują się w białym pierścieniu pomiędzy roztworem polisacharozy a osoczem (warstwa górna). Zbierz biały pierścień, delikatnie aspirując go za pomocą pipety lub sterylnej pipety Pasteura, tak aby nie pobrać erytrocytów, osocza ani roztworu polisacharozy, i przenieś do probówki 15 mL.
  6. Dodaj PBS do probówki 15 mL zawierającej PBMC, aby uzyskać objętość końcową 10 mL. Zhomogenizuj zawiesinę i odwiruj probówkę przy 1 600 x g przez 30 min w temperaturze 24 °C.
  7. Przemyj komórki trzykrotnie przy 1 600 x g przez 5 min w temperaturze 24 °C przy użyciu 10 mL PBS. Następnie resuspenduj końcowy osad w 2 mL pożywki R10.
  8. Oceń żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i policz komórki w komorze Neubauera.

4. Kinetyka fagocytozy

UWAGA: Makrofagi pochodzące z monocytów krwi obwodowej człowieka są traktowane konidiami T. stromaticum przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:10 lub wyłącznie medium R10 jako kontrolą. Wielokrotność infekcji (MOI) reprezentuje stosunek dodanych czynników zakaźnych do celów infekcji i jest przedstawiana jako liczby bezwzględne: MOI = czynniki:cele31. W tym przypadku stosujemy 1 konidie T. stromaticum (czynnik) na 10 makrofagów (cele). Następnie komórki są inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez różne okresy czasu (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h). Następnie do wizualizacji przylegających makrofagów uczestniczących w procesie fagocytozy pod mikroskopem wykorzystuje się okrągłe szkiełko nakrywkę. Schemat doświadczenia przedstawiono na rysunku (Rysunek 1).

UWAGA: Sugeruje się użycie płytek 24-dołkowych.

  1. Traktowanie makrofagów pochodzenia ludzkiego konidiami T. stromaticum
    1. Do każdego dołka za pomocą sterylnej pęsety wprowadź sterylną okrągłą szkiełko podstawowe (13 mm).
    2. Dostosuj objętość zawiesiny komórkowej uzyskanej w krokach 3.7-3.8, aby wysiać 8 x 105 komórek na dołek do końcowej objętości 1 mL w pożywce R10. Użyj mikroskopu odwróconego, aby ocenić morfologię komórek.
      UWAGA: Komórki muszą być zawieszone w pożywce i mieć obły kształt.
    3. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 7 dni, wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę R10 co 2 dni w celu dyferencjacji monocytów w makrofagi32. Obserwuj morfologię komórek za pomocą mikroskopu odwróconego. Makrofagi będą wykazywać morfologię wrzecionowatą, z płaskimi i rozciągniętymi kształtami; można również zaobserwować zwiększony stosunek cytoplazmy oraz obecność pseudopodiów. Poszukuj adherentnych makrofagów pochodzenia mononuklearnego.
      UWAGA: Bardzo niewielka proporcja nieróżnicujących się monocytów może pozostać w zawiesinie w pożywce.
    4. Usuń pożywkę z każdego dołka za pomocą pipety i przemyj komórki 1 mL PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i komórki nieadherentne.
    5. Używając zawiesiny przygotowanej w kroku 2.2, przygotuj nową zawiesinę konidii T. stromaticum o końcowym stężeniu 8 x 104 konidii/mL w pożywce R10.
    6. Do każdego dołka traktowanego (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) dodaj 1 mL zawiesiny konidii przygotowanej w kroku 4.1.5, aby uzyskać MOI 1:10. Do kontrolek dodaj jedynie 1 mL pożywki R10.
    7. Poddaj makrofagi działaniu konidii T. stromaticum przez 3 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Po 3 h usuń pożywkę i przemyj komórki, aby usunąć niepofagocytowane konidia.
    8. Do każdego dołka dodaj 1 mL pożywki R10 i inkubuj płytkę przez różne odstępy czasu (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  2. Barwienie i analiza
    1. Po zakończeniu odpowiedniej inkubacji (krok 4.1.8) usuń pożywkę z każdego dołka i dodaj do niego 1 mL PBS.
    2. Wyjmij okrągłe szkiełka podstawowe z dołków za pomocą sterylnej pęsety i igły w celu zabarwienia przy użyciu zestawu do barwienia.
      UWAGA: Alternatywnie barwienie można przeprowadzić metodą May-Grünwald-Giemsa33.
    3. Do każdego z okrągłych szkiełek podstawowych dodaj fiksator do barwienia (5 s), barwnik 1 (5 s), barwnik 2 (2 s) oraz wodę buforową o pH 7,0 (5 s), które są składnikami zestawu do barwienia. Odczekaj do wyschnięcia i przymocuj szkiełka podstawowe do szkiełka przedmiotowego za pomocą medium montażowego.
    4. Ilościowo określ wynik: Policz łącznie 100 makrofagów (Mø) dla każdego punktu czasowego. Używając mikroskopu optycznego i obiektywu 100x z olejem imersyjnym, policz liczbę makrofagów z pofagocytowanymi konidiami (równanie [1]).
      Wzór fagocytozy pokazujący procent konidii pochłoniętych przez makrofagi w badaniu mikrobiologicznym. (1)
    5. Oblicz liczbę pofagocytowanych konidii na makrofag: Wyznacz korelację liczby konidii obecnych w 100 makrofagach podzieloną przez liczbę makrofagów z co najmniej jedną pofagocytowaną konidią (równanie [2])34.
      Schemat wzoru pojemności fagocytycznej; analiza stosunku pofagocytowanych konidii do MΦ z konidiami. (2)
      ​UWAGA: Do oceny i liczenia konidii można użyć oprogramowania ImageJ35.
    6. Wykonaj zdjęcia fagocytozy z każdej próbki i punktu czasowego, używając obiektywów 40x i 100x, aby przedstawić wyniki.

Schemat procesu hodowli Trichoderma; ustawienie różnicowania PBMC; analiza mikroskopowa.
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie testu fagocytozy i żywotności konidiów z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z monocyto-limfocytów krwi obwodnej człowieka. (1-10) Test fagocytozy: T. stromaticum należy hodować na PDA, a konidia odzyskać poprzez przemycie płytki PBS. PBMCs należy wyizolować metodą gradientu gęstości zgodnie z opisanym protokołem, hodować w płytkach 24-dołkowych z jałowymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi przez 7 dni w celu różnicowania w makrofagi, a następnie poddać działaniu z MOI 1:10 w różnych odstępach czasu. Okrągłe szkiełka nakrywkowe należy usunąć i zbarwić za pomocą zestawu do barwienia, a następnie przeanalizować wyniki za pomocą mikroskopii świetlnej. (1-8,11-13) Test żywotności konidiów: Po izolacji PBMCs hoduje się w płytkach 24-dołkowych bez okrągłych szkiełek nakrywkowych przez 7 dni w celu różnicowania w makrofagi, a następnie poddaje działaniu z MOI 1:10 przez różne odstępy czasu. Komórki należy zlizować poprzez inkubację z wodą destylowaną; zawiesinę następnie wirować, a resuspensionowanego osadu wysiać na PDA w celu analizy kinetyki wzrostu Trichoderma. Rycina ta została zaprojektowana przy użyciu bazy obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Analiza żywotności konidiów po fagocytozie

UWAGA: Dołączono schemat projektu eksperymentalnego (Rycina 1).

UWAGA: Należy używać płytek 24-dołkowych.

  1. Poddaj makrofagi pochodzenia ludzkiego działaniu *T. stromaticum* konidia
    1. Powtórzyć kroki 4.1.2–4.1.8 w celu zróżnicowania monocytów, a następnie poddać makrofagi działaniu T. stromaticum konidia.
      UWAGA: W dołkach nie należy stosować okrągłych szkiełek nakrywkowych. Należy zastosować takie same odstępy czasowe, jakich użyto do badania kinetyki fagocytozy, aby możliwe było skorelowanie fagocytozy z żywotnością konidiów.
    2. Oceń wpływ pożywki R10 na T. stromaticum wzrost, wykorzystując studzienki z zawiesiną przygotowaną w kroku 4.1.5 (pożywka R10 + konidia) jako kontrolę.
  2. Test żywotności konidiów
    1. Po każdym okresie inkubacji (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 120 h) należy usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS, aby usunąć konidia, które nie zostały pochłonięte w procesie fagocytozy.
      UWAGA: Próbki kontrolne zawierające podłoże R10 i konidia nie powinny być płukane.
    2. Do każdego dołka należy dodać 0,5 ml sterylnej wody destylowanej, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 30 min. Po tym czasie należy ocenić morfologię komórek pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że doszło do lizy komórek.
    3. Zebrać zawiesinę i przenieść ją do probówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawiesinę w miniwirówce z prędkością 6 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie odlej supernatant, a pellet resuspender w 10 µL sterylnej wody destylowanej, a następnie zaszczepić 10 µL zawiesiny na płytkę zawierającą agar PDA przy 28 °C w ciemności.
    5. Przygotuj kontrolę pozytywną dla T. stromaticum wzrost: Należy użyć zawiesiny T. stromaticum konidia (krok 2.2), aby przygotować nową zawiesinę o stężeniu końcowym 8 x 106 konidia/ml. Wysiew na płytki. 10 µL tej zawiesiny w PDA w 28 °C w ciemności.
      UWAGA: 10 µL tej zawiesiny będzie zawierać tę samą liczbę konidiów (8 x 104), której użyto do zainfekowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej. Różnica między tą kontrolą pozytywną a kontrolą wspomnianą w kroku 5.1.2 polega na tym, że kontrola opisana powyżej w kroku 5.1.2 służy do oceny potencjalnego wpływu pożywki R10 na Trichoderma wzrost podczas procesu fagocytozy. Ta kontrola pozytywna w kroku 5.2.5 z wykorzystaniem zawiesiny z T. stromaticum konidia zebrane w PBS stanowią kontrolę dla Trichoderma wzrost bez wpływu pożywki R10, aby odzwierciedlić naturalny sposób wzrostu grzyba. Dzięki zastosowaniu tej kontroli możliwe jest ocenienie, czy pożywka R10 wpływa na Trichoderma wzrost
    6. Obserwuj kinetykę wzrostu T. stromaticum codziennie na podłoże PDA i fotografować kulturę.
    7. Analiza: Do oceny wyników można wykorzystać dwa parametry: 1) czas (w dniach) potrzebny na zajęcie przez kulturę całej płytki hodowlanej oraz 2) czas (w dniach) do pojawienia się charakterystycznej zielonej pigmentacji T. stromaticum konidia w hodowli.

6. Analiza statystyczna

  1. Zastosuj test Kruskala-Wallisa, aby określić statystycznie istotne różnice pomiędzy 8 grupami/wariantami traktowania. Przyjmij wartość p < 0,05 za statystycznie istotną. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± odchylenie standardowe (SD). Na rysunkach symbol # oznacza istotność statystyczną przy p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika obejmująca fagocytozę konidiów grzybów przez makrofagi jest powszechnie stosowana w badaniach oceniających modulację odpowiedzi immunologicznych przeciwko grzybom. Wykorzystaliśmy fagocytozę konidiów T. stromaticum do oceny żywotności konidiów po fagocytozie, ponieważ unikanie fagocytozy i ucieczka z fagosomów są mechanizmami wirulencji grzybów. Badacze powinni wykonywać te techniki jako jedne z pierwszych testów podczas badania gatunków o znaczeniu klinicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku kilku patogenów grzybiczych, w tym Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans i innych, fagocytoza konidialna lub drożdżakowa jest kluczowym procesem, który pozwala na badanie zdarzeń cytoplazmatycznych i molekularnych w interakcjach makrofag-patogen, a także na określenie czasu śmierci zinternalizowanych konidiów 14,39,40. Fagocytoza jest kluczowym procesem w interakcji Tric...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez następujące brazylijskie instytucje finansowe: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) z grantami RED0011/2012 i RED008/2014. U.R.S., J.O.C. i M.E.S.M. uznają stypendium przyznane odpowiednio przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) i FAPESB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 15 mlCorningCLS431470Probówki wirówkowe 15 mL, polipropylen, stożkowe dno z pokrywką, indywidualnie sterylna
24-dołkowa płaska płytka do hodowli komórkowychKasviK12-024Wykonana z polistyrenu z oznaczeniem alfanumerycznym; Płytka do hodowli komórkowej jest wolna od DNaz, RNaz i pirogenów oraz substancji cytotoksycznych; Sterylizowane promieniowaniem gamma;
Inkubator CO2 do hodowli komórkowychSanyo303082Inkubator CO2 służy do tworzenia i kontrolowania warunków podobnych do warunków życia ludzkiego, umożliwiając w ten sposób wzrost i proliferację różnych typów komórek in vitro.
Wirówka Mikroprobówka (typ eppendorf) 1,5 mlCapp5101500Wykonana z polipropylenu, z nakrętką przymocowaną do probówki do otwierania i zamykania jedną ręką. Ma polerowane wnętrze zapobiegające adhezji białek i zapewniające widoczność próbki, ponieważ jest wolne od DNazy, RNazy i pirogenów
Szkiełko nakrywkowe okrągłe 15 mmOlenK5-0015Szkiełka nakrywkowe okrągłe są stosowane w technikach mikroskopowych w hodowlach komórkowych. Wykonany z super przezroczystego półprzezroczystego szkła; o grubości 0,13 mm
Klasa II Typ B2 (Total Exhaust) Szafy bezpieczeństwa biologicznegoEsco Lifesciences group2010274Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinet (AB2) zapewniają ochronę produktu, operatora i środowiska oraz nadają się do pracy ze śladowymi ilościami toksycznych chemikaliów i środków przypisanych do poziomów bezpieczeństwa biologicznego I, II lub III. W szafie klasy II typu B2 całe powietrze nawiewane i nawiewane jest po filtracji HEPA/ULPA odprowadzane do środowiska zewnętrznego bez recyrkulacji po powierzchni roboczej.
Dekstroza Agar ziemniaczany pożywkaMerck145Agar ziemniaczany dekstrozowy jest stosowany w hodowli i oznaczaniu liczby drożdży i grzybów
Probówka próżniowa do pobierania krwi EDTAFirstLabFL5-1109LEDTA jest zalecanym antykoagulantem do rutynowych zabiegów hematologicznych, ponieważ jest to najlepszy antykoagulant do zachowania morfologii komórek.
EntellanMerck1.07961 Środek utrwalający; Entellan to bezwodne medium montażowe do stałego montażu do mikroskopii.
Surowica bydlęcapłodu GibcoA2720801Surowica bydlęca płodu (FBS) jest  Uniwersalny suplement wzrostu pożywek do hodowli komórkowych i tkankowych. FBS to naturalny koktajl większości czynników wymaganych do przyłączania, wzrostu i proliferacji komórek, skuteczny w przypadku większości typów komórek ludzkich i zwierzęcych (w tym owadów).
Flaticon  baza obrazów
GlicerolMerck24900988Środek krioprotekcyjny glicerol służy do zamrażania komórek i zarodników
Histopaque-1077roztwór polisacharozy
Obraz J  Oprogramowanie do analizy obrazu
Szkiełka mikroskopowePrecision7105Szkiełko do mikroskopii 26 x 76 mm Matowe docierane Grubość 1,0 do 1,2 mm. Wykonane ze specjalnego szkła optycznego i zapakowane w przekładkę z jedwabnego papieru o wysokiej jakości przezroczystości wolnej od niedoskonałości
Mini wirówkaPrismC1801Mini wirówka Prism została zaprojektowana tak, aby była niezwykle kompaktowa i zajmowała wyjątkowo mało miejsca. Zawiera 2 wymienne wirniki z szybkozłączką, które obracają się z prędkością do 6000 obr./min. Elektroniczny hamulec zapewnia szybkie zwalnianie, a samootwierająca się pokrywa umożliwia łatwy dostęp do próbki, skracając czas obsługi.
Komora NeubaueraKasviK5-0011Komora licząca Neubauera służy do liczenia komórek lub innych zawieszonych cząstek.
Szybkość panoptyczna Laborclin620529Laborclin's  panoptic fast c to zestaw do szybkiego barwienia w hematologii
Roztwór penicyliny/streptomycyny - 10 000ULGC- Biotechnologia BR3011001antybiotyk stosuje się w celu uniknięcia możliwego zanieczyszczenia przez manipulację zewnętrzną w stosunku do przepływu laminarnego.
szalka Petriego 90 x 15 mm GładkiCralplast18248Jednorazowa szalka Petriego; Wykonane z wysoce przezroczystego polistyrenu (PS); płaskie dno; Gładki; Rozmiar: 90 x 15 mm.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)thermo fisher Scientific10010001PBS to roztwór soli fizjologicznej na bazie wody o prostym składzie. Jest izotoniczny i nietoksyczny dla większości komórek. Zawiera chlorek sodu i bufor fosforanowy i został opracowany w celu zapobiegania szokowi osmotycznemu przy jednoczesnym utrzymaniu równowagi wodnej żywych komórek.
Pipeta Pasteur 3 ml SterylnaAccumaxAP-3-B-SSTERYLNA ACCUMAX PASTEUR 3 ML o pojemności 3 ml, wykonana z przezroczystego polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) i indywidualnie sterylna
wirówka z chłodzeniemThermo ScientificTS-HM16RWirówka z chłodzeniem Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R to wirówka z chłodzeniem z przyjaznym dla użytkownika panelem sterowania, który ułatwia wstępne ustawienie prędkości, wartości RCF, czas trwania,  temperatury i profilu pracy. Megafuge 16R może osiągnąć maksymalne prędkości  15 200 obr./min i maksymalny RCF 25 830 x g.
RPMI-1640 MediumMerckMFCD00217820HEPES Modification, z L-glutaminą i 25 mM HEPES, bez wodorowęglanu sodu, proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych
Mikropipety jednokanałoweEppendorfZ683809Mikropipety jednokanałowe służą do dokładnego przenoszenia i pomiaru bardzo małych ilości cieczy.
Końcówka do mikropipetoraCorning4894pojemność 10 &mikro; L oraz 1,000 &mikro; L Autoklawowalny
trójokularowy mikroskop odwróconyLABOMEDVU-7125500Pozwala obserwować komórki wewnątrz probówek i butelek, bez konieczności ich otwierania, unikając w ten sposób problemów z zanieczyszczeniem.
pipeta

Bibliografia

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406(2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681(2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008(2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145(2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223(2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082(2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252(2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722(2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Żywotność konidiówfagocytoza makrofagóweliminacja grzybówfagocytoza in vitroizolacja konidiówludzkie makrofagitest fagocytozypatogeneza grzybicza
Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.