Artykuł metodologiczny

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65338

⸱

6 października 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Streszczenie

Obrazowanie próbek biologicznych w nanoskali może poprawić zrozumienie patogenezy chorób. W ostatnich latach wykazano, że mikroskopia ekspansywna (ExM) jest skuteczną i tanią alternatywą dla optycznej mikroskopii superrozdzielczej. Zostało to jednak ograniczone przez potrzebę stosowania specyficznych i często niestandardowych środków kotwiczących w celu zachowania różnych klas biomolekuł w żelu oraz przez trudności z rozszerzeniem standardowych formatów próbek klinicznych, takich jak tkanka zatopiona w parafinie utrwalona w formalinie, zwłaszcza jeśli pożądane są większe współczynniki ekspansji lub zachowane epitopy białkowe. W tym miejscu opisujemy Magnify, nową metodę ExM zapewniającą solidną ekspansję do 11-krotności w szerokiej gamie typów tkanek. Wykorzystując metakroleinę jako chemiczną kotwicę między tkanką a żelem, Magnify zatrzymuje wiele biomolekuł, takich jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe, w żelu, umożliwiając w ten sposób obrazowanie tkanek w szerokiej skali nano na konwencjonalnych mikroskopach optycznych. Protokół ten opisuje najlepsze praktyki mające na celu zapewnienie solidnej i wolnej od pęknięć ekspansji tkanek, a także wskazówki dotyczące obchodzenia się i obrazowania wysoce ekspandowanych żeli.

Wprowadzenie

Systemy biologiczne wykazują strukturalną niejednorodność, począwszy od kończyn i organów, a skończywszy na poziomach białek w nanoskali. W związku z tym pełne zrozumienie działania tych systemów wymaga oględzin w tych skalach wielkości. Jednak granica dyfrakcji światła powoduje wyzwania w wizualizacji struktur mniejszych niż ~200-300 nm na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym. Ponadto metody optycznej superrozdzielczości1,2,3, takie jak wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotowoltaicznie (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), choć potężne, stanowią własne wyzwania, ponieważ wymagają drogiego sprzętu i odczynników, a także często mają powolny czas akwizycji i słabą zdolność obrazowania duże objętości w 3D.

Mikroskopia ekspandacyjna4 (ExM) dostarcza alternatywnego sposobu na obejście limitu dyfrakcji światła poprzez kowalencyjne zakotwiczenie biomolekuł w pęczniejącym żelu polimerowym i fizyczne ich rozdzielenie, dzięki czemu stają się one rozdzielalne na konwencjonalnych mikroskopach optycznych. Od czasu pierwotnej publikacji ExM niecałą dekadę temu opracowano wiele wariantów protokołu ExM, a protokoły te umożliwiają bezpośrednie włączenie białek5,6,7, RNA8,9,10, lub lipids11,12,13 do sieci żelowej poprzez zmianę kotwicy chemicznej lub dalsze rozszerzanie próbki (poprawiając w ten sposób efektywną rozdzielczość) w jednym kroku14 lub w wielu iteracyjnych krokach15,16. Do niedawna żaden pojedynczy protokół ExM nie był w stanie utrzymać tych trzech klas biomolekuł za pomocą jednej dostępnej na rynku kotwicy chemicznej, zapewniając jednocześnie mechanicznie wytrzymały żel, który mógł rozszerzyć się ~10-krotnie w jednej rundzie rozprężania.

Tutaj prezentujemy Magnify17, najnowszy dodatek do arsenału ExM, który wykorzystuje metakroreinę jako kotwicę biomolekuł. Metakroleina tworzy wiązania kowalencyjne z tkankami, takimi jak paraformaldehyd, zapewniając zachowanie wielu klas biomolekuł w sieci żelowej bez konieczności stosowania różnych specyficznych lub niestandardowych środków kotwiczących. Ponadto technika ta może rozszerzyć szerokie spektrum tkanek nawet 11-krotnie, w tym notorycznie trudne próbki, takie jak próbki kliniczne zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie. Poprzednie metody namnażania takich mechanicznie sztywnych próbek wymagały ostrego trawienia proteazą, co uniemożliwiało znakowanie przeciwciałami interesujących białek po namnażaniu próbki. W przeciwieństwie do tego, technika ta osiąga ekspansję próbek klinicznych FFPE za pomocą gorącego roztworu denaturującego, zachowując w ten sposób epitopy całych białek w żelu, które mogą być przeznaczone do obrazowania po ekspansji (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Carnegie Mellon University. Próbki tkanek ludzkich uzyskano komercyjnie.

1. Przygotowanie podstawowych odczynników i roztworów

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z listą użytych odczynników.

  1. Przygotować żelujące roztwory podstawowe. Zostaną one połączone bezpośrednio przed etapem żelowania.
    1. Przygotować roztwór podstawowy monomeru (4 g/100 ml kwasu N,N-dimetyloakrylamidu [DMAA], 50 g/100 ml akrylanu sodu [SA], 66,7 g/100 ml akryloamidu [AA], 0,10 g/100 ml N,N′-metylenobisakryloamidu [Bis], 33 g/100 ml chlorku sodu [NaCl], 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem; PBS) przy użyciu składników wymienionych w tabeli 1. Rozpuścić lub rozcieńczyć wszystkie roztwory podstawowe w wodzie. Roztwór podstawowy monomeru może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 miesiące.
    2. Przygotować oddzielnie w wodzie następujące roztwory podstawowe: 0,5% (m/w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), który hamuje żelowanie podczas dyfuzji monomeru do tkanek, oraz 10% (w/w) tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), która przyspiesza wytwarzanie rodników zainicjowane przez nadsiarczan amonu (APS) i jest przygotowywana w stężeniu 10% (m/w).
      UWAGA: Roztwory podstawowe można rozprowadzić w podwielokrotnościach o objętości 1-2 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy; jednak APS wykonuje się bezpośrednio przed przygotowaniem roztworu żelującego.
  2. Przygotować bufor homogenizacyjny (1% w/v S.D.S., 8 M mocznika, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, w temperaturze pokojowej [RT]) przez zmieszanie 1 g SDS, 48,048 g mocznika, 5 ml EDTA (0,5 M, pH 8), 20 ml 10 x PBS, 25 ml Tris (2 M) i 0,75 g glicyny. Dodaj wodę do całkowitej objętości 100 ml. Rozwiązanie można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb i można je przechowywać w R.T.

2. Przygotowanie tkanek do zarchiwizowanych i świeżo przygotowanych preparatów tkanek klinicznych

UWAGA: Etapy wstępnego przetwarzania tkanek różnią się w zależności od sposobu przygotowania próbek.

  1. W przypadku próbek klinicznych z zatopioną parafiną utrwaloną w formaldehydzie (FFPE) należy postępować zgodnie z poniższymi czynnościami.
    1. Umieścić próbki w sekwencyjnej serii roztworów (można użyć szklanego szkiełka do barwienia lub stożkowej probówki o pojemności 50 ml): ksylen, 95% etanol, 70% etanol i 50% etanol, a następnie podwójnie dejonizowana woda. Używaj każdego roztworu dwa razy przez co najmniej 3 minuty za każdym razem. Za pomocą kleszczy umieść szkiełko w pojemniku i dodaj 15 ml odpowiedniego roztworu (tyle, aby przykryć próbkę). Umieść zaślepioną stożkową rurkę poziomo na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  2. W przypadku próbek barwionych i montowanych na szkiełkach stałych należy postępować zgodnie z poniższymi czynnościami.
    1. Umieść szkiełko na krótko w ksylenie i ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą odpowiedniego narzędzia, takiego jak żyletka. Jeśli szkiełko nakrywkowe nadal jest zablokowane, przywróć szkiełka z ksylenu do temperatury pokojowej, aż szkiełko nakrywkowe się poluzuje.
    2. Następnie przetworzyć próbki jako próbki FFPE (krok 2.1.1).
      UWAGA: W przypadku szkiełek barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) barwienie hematoksyliną i eozyną jest tracone podczas procesu rozprężania.
  3. W przypadku nieutrwalonych szkiełek tkankowych zamrożonych w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), należy utrwalić tkanki w acetonie w temperaturze -20 °C na 10 minut, a następnie umyć próbki 1 x roztworem PBS trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.
  4. W przypadku wcześniej utrwalonych zamrożonych klinicznych szkiełek tkankowych, stopić OCT, inkubując szkiełka przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 1x roztworem PBS trzy razy przez 5 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie tkanek do mózgu myszy utrwalonego paraformaldehydem

  1. Postępuj zgodnie z tym protokołem dla sekcji mózgu myszy o grubości 30-50 μm.
    UWAGA: Sukces można osiągnąć przy większych sekcjach, ale dyfuzja i homogenizacja roztworu monomeru może wymagać dłuższego czasu.
  2. Jeśli skrawki nie są obecnie przechowywane w 1 roztworze PBS (na przykład w 30% roztworze glicerolu i 30% roztworze glikolu etylenowego w 1 PBS), myj trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej w 1 x PBS w płytce 6 do 24 dołków.
  3. Zaopatrzyć się w szkiełko mikroskopowe bez powłoki. Jeśli jedna strona szkiełka jest pokryta, użyj mokrego pędzla, aby sprawdzić, czy strona nie jest powlekana (często etykieta strony powlekanej będzie wykonana ze zmielonego szkła i stanie się mniej nieprzezroczysta, gdy będzie mokra).
  4. Użyj pędzla, aby zwilżyć niepowlekany szkiełko. Usuń tkankę mózgową myszy z płytki dołka za pomocą pędzla i ostrożnie umieść ją na szkiełku, wykonując ruch toczny, aby upewnić się, że tkanka jest płaska. Pozwól, aby nadmiar PBS pozostał na tkance, dopóki wszystkie sekcje nie zostaną zamontowane.
    UWAGA: Podczas gdy pojedyncze szkiełko może być używane do wielu odcinków tkanek, gdy więcej odcinków tkanek jest żelowanych jednocześnie (nawet na oddzielnych szkiełkach), należy zachować większą ostrożność, aby nie wyschły całkowicie.
  5. Za pomocą laboratoryjnej ściereczki papierowej usuń większość nadmiaru PBS ze szkiełka. Pozostaw mały pierścień płynu wokół każdej części tkanki, ale resztę szkiełka pozostaw w większości suchą. Ten pozostały płyn pokryje tkankę podczas przygotowywania roztworu monomeru żelu.

4. Żelowanie

UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla wszystkich typów tkanek przygotowanych do użycia tą techniką.

  1. Zastosuj przekładki po obu stronach sekcji tkanki (Rysunek 2A), aby zapobiec uciskowi tkanki. W tym celu należy wykonać przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego za pomocą pisaka z diamentową końcówką, a następnie przymocować je do szkiełka za pomocą niewielkiej ilości wody lub 1x PBS lub przymocować za pomocą niewielkiej ilości super kleju. Następnie delikatnie umieść przekładki po obu stronach tkanki.
  2. Przygotuj końcowy roztwór żelujący. Ogólnie rzecz biorąc, ~ 200 μL jest wystarczające na wycinek tkanki, ale objętość nie powinna przekraczać 800 μL na szkiełko. Każde więcej roztworu żelującego spowoduje rozlanie się.
    UWAGA: Metakroleina służy do zakotwiczania biomolekuł w żelu. Nie jest jednak wymagany oddzielny etap zakotwiczania, a metakroleina może być dodawana bezpośrednio do końcowego roztworu żelującego.
    1. Na każdą sekcję należy połączyć w kolejności: 200 μl roztworu monomeru, 0,5 μl 0,5% roztworu podstawowego 4HT (rozcieńczenie 1:400), 0,2-0,5 μl metakuleiny (rozcieńczenie 1:400-1:1000 w zależności od rodzaju tkanki; zazwyczaj należy stosować rozcieńczenie 1:1000 dla próbek utrwalonych paraformaldehydem [PFA] i 1:400 dla próbek klinicznych FFPE), 2 μl 10% roztworu podstawowego TEMED (rozcieńczenie 1:100), i 5 μl 10% roztworu podstawowego APS (rozcieńczenie 1:40).
      UWAGA: Gotowy końcowy roztwór żelujący należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu, roztwór APS należy dodać na końcu.
  3. Usunąć nadmiar roztworu z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko na szalce Petriego. Dodać cały świeżo przygotowany, zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję do tkanki.
  4. Ostrożnie umieść drugi szkiełko bez powłoki na roztworze tkanki i żelu. Należy unikać pęcherzyków powietrza (Rysunek 2B).
    UWAGA: Jeśli pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione na chusteczce, szklaną pokrywę można ostrożnie podnieść i odłożyć z powrotem. Dodatkowo każdy roztwór monomeru, który się wyleje, może zostać odcięty po polimeryzacji i nie spowoduje żadnych problemów dla tkanki.
  5. Upewnij się, że polimeryzacja została zakończona. Polimeryzację tę można przeprowadzić na dwa sposoby, z których każdy daje podobne wyniki. Najpierw inkubować próbki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku (takim jak zamknięta szalka Petriego z wilgotnym ręcznikiem papierowym) przez noc. Alternatywnie, w celu szybszej polimeryzacji, próbki należy inkubować w wilgotnej atmosferze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.

5. Trawienie próbki i rozszerzanie tkanek

UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla wszystkich typów tkanek.

  1. Zakładając okulary ochronne, wsuń żyletkę między dwa szklane szkiełka komory żelowania, aby je rozdzielić.
    UWAGA: Szkiełka powinny się bardzo łatwo rozdzielać. Jeśli różne części żelu są przyklejone do obu szkiełek, można użyć pędzla, aby poprowadzić żel do jednego lub drugiego. Jeśli żel stał się szczególnie suchy podczas polimeryzacji, 1x PBS można nałożyć na zewnątrz komory żelowej, ale nie należy całkowicie zanurzać żelu, ponieważ spowoduje to jego rozszerzanie się przed homogenizacją tkanki, co spowoduje pękanie.
  2. Przytnij ślepy żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość. Asymetryczne cięcie żelu pozwala na śledzenie orientacji żelu po homogenizacji, ponieważ próbka będzie całkowicie przezroczysta.
  3. Delikatnie podnieś żel zawierający tkankę ze szkiełka za pomocą żyletki i delikatnie przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą pędzla.
  4. Napełnić probówkę do góry buforem homogenizacyjnym (Tabela 2) podgrzanym do temperatury 80 °C.
  5. Inkubować próbkę, wytrząsając w temperaturze 80 °C przez 8 godzin (w przypadku mózgu myszy z utrwalonym PFA) lub 60 godzin (większość próbek klinicznych FFPE; patrz tabela 3).
    UWAGA: Czas homogenizacji zależy od rodzaju tkanki i metody utrwalania. Wiele z tych warunków zostało już zweryfikowanych, ale w przypadku innych może być konieczna optymalizacja.
  6. Wlać zawartość probówki wirówkowej do pojedynczego dołka 6-dołkowej plastikowej płytki do hodowli komórek.
  7. Usunąć bufor denaturacyjny za pomocą pipety transferowej.
  8. W celu całkowitego usunięcia pozostałej karty charakterystyki z hydrożelu, przemyć próbkę w 1% roztworze niejonowego środka powierzchniowo czynnego (C12E10) w następujący sposób: co najmniej trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej; przez 60 minut w temperaturze 60 °C; a następnie kolejne trzy płukania przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.
  9. Przechowywać próbkę w 1x PBS + 0,02% azydeku sodu w temperaturze 4 °C do czasu konieczności przeprowadzenia barwienia po rozprężaniu i obrazowania.
    UWAGA: W tym momencie próbka powinna być ~3-4,5-krotnie większa w każdym wymiarze, w zależności od rodzaju tkanki.

6. Profilowanie biomolekuł po ekspansji

  1. Barwienie przeciwciałami
    UWAGA: Jest to zgodne z typowym protokołem barwienia immunofluorescencyjnego (IF)/immunohistochemicznego (IHC). Ilości użytych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zależą od stężeń sugerowanych przez producenta lub od optymalizacji dla konkretnego eksperymentu. Poszczególne mogą być zastępowane według uznania użytkownika.
    1. Z próbką w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, przemyć rozszerzone próbki trzy razy przez 10 minut za każdym razem w 1x PBS przy RT, przenosząc ciecz za pomocą pipety.
    2. Wykonać opcjonalny etap blokowania (na przykład 3% albuminy surowicy bydlęcej/0,1% Triton-X100 w 1x PBS) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze barwiącym (na przykład 0,1% Triton-X100 1x PBS lub 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparyny) przez noc w temperaturze 37 °C. W zależności od wielkości próbki, 0,5-2 ml powinno odpowiednio pokryć żel.
    4. Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w wybranym buforze barwiącym.
    6. Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  2. Barwienie białek pan-estrowych NHS
    1. Umieść próbkę na płytce 6-dołkowej, wlej 1-2 ml glikolu polietylenowego (PEG 200) na próbkę (tyle, aby całkowicie ją pokryć).
      UWAGA: Tkanka powinna się skurczyć i powrócić do pierwotnego rozmiaru sprzed ekspansji (lub zbliżonego do niego).
    2. Barwienie estrem NHS sprzężonym z fluoroforem rozcieńczonym do 13,3-80 μg / ml przez 3 godziny w R.T. w 1-2 ml buforu barwiącego (na przykład 1x PBS, 2x SSC lub 100 mM roztworu wodorowęglanu sodu).
    3. Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  3. Barwienie lipidami
    UWAGA: Barwienie lipidów po ekspansji nie jest skuteczne w próbkach klinicznych FFPE, ponieważ lipidy są tracone podczas procesu utrwalania.
    1. Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
    2. Zastosuj konwencjonalny barwnik lipofilowy (DiO, DiI lub DiD) rozcieńczony 200-krotnie w 2 ml 0,1% TritonX-100/1x PBS przez 72-96 godzin w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj co najmniej trzy razy za pomocą 1x PBS
  4. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
    1. Umieścić homogenizowane próbki żelu w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do temperatury 60 °C na 30 minut.
    2. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny dla FISH: Połącz 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 10% (v/v) siarczan dekstranu, 20% (v/v) węglan etylenu i 0,1% (v/v) Tween20.
    3. Próbki żelu inkubować z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym 10 pM (na oligonukleotykatu) sond FISH przeciwko genowi docelowemu (co najmniej 20 sond na 10 kb) w temperaturze 45 °C przez noc.
    4. Umyć rygorystycznym buforem do płukania (2x S.S.C. i 0,1% Tween20) dwa razy przez 15 minut za każdym razem w temperaturze 45 °C.
    5. Przemyć buforem do płukania jeszcze dwa razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze 37 °C.
    6. Na koniec umyć 1x PBS co najmniej trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.
    7. Próbki są gotowe do obrazowania lub przechowywania w 1x PBS + 0,02% azydku sodu w temperaturze 4 °C.
  5. Pełna ekspansja tkanek i obrazowanie fluorescencyjne
    UWAGA: Współczynnik ekspansji osiągalny za pomocą Magnify różni się w zależności od typu tkanki i metody ekspansji (pełne podsumowanie można znaleźć w Tabeli 3). Jednak ogólnie rzecz biorąc, próbka Magnify rozszerzy się 3-4,5-krotnie w 1x PBS, 5-7-krotnie w PBS rozcieńczonym do 1:50 w ddH2O i 8-11-krotnie w ddH2O. Optymalny współczynnik rozszerzalności obrazowania zależy od potrzeb każdego eksperymentu. Współczynnik rozszerzalności jest wysoce przestrajalny, dzięki czemu pojedyncza próbka może być wielokrotnie rozszerzana i zmniejszana w celu obrazowania w różnych skalach.
    1. Przenieść próbki rozprężone 4-krotnie w PBS na 6-dołkową płytkę obrazową ze szklanym dnem za pomocą pędzla. Przenieś dowolną rozszerzoną próbkę dalej, krojąc ją na mniejsze kawałki lub delikatnie umieszczając na dużej płytce obrazowej ze szklanym dnem z cienkim kawałkiem elastycznego tworzywa sztucznego.
    2. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania. Usunięcie nadmiaru płynu wokół żelu za pomocą papierowej ściereczki laboratoryjnej może zapobiec ruchowi żelu podczas obrazowania. Żele można również unieruchomić, nakładając 0,1% poli-L-lizyny na powierzchnię szkła przed obrazowaniem.
      UWAGA: Zastosowanie poli-L-lizyny spowoduje, że żel będzie całkowicie unieruchomiony w kontakcie. Z tego powodu należy zachować ostrożność, aby żel nakładać na szkło bez składania lub rozciągania. Ponadto nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia żelu na szkle pokrytym poli-L-lizyną, ponieważ może to utrudnić usunięcie, a żelu nie należy obkurczać w PBS, gdy jest on nadal przymocowany do szkła za pomocą poli-L-lizyny, ponieważ może to spowodować uszkodzenie żelu lub tkanki.
    3. Po zobrazowaniu obkurczyć próbki w 1x PBS z co najmniej trzema płukaniami przez 10 minut za każdym razem, ponieważ nie zaleca się długotrwałego przechowywania próbek w ddH2O ze względu na degradację sygnału fluorescencji. W szczególności w pełni ekspandowane próbki barwione barwnikami lipofilowymi powinny być obrazowane jak najbliżej czasu ekspansji, aby zapobiec dysocjacji barwnika w wodzie.
    4. Próbki należy przechowywać w 1x PBS + 0,02% azydek sodu w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli protokół został pomyślnie zakończony (Rysunek 1), próbka będzie przejrzysta i płaska po denaturacji termicznej; wszelkie fałdy lub zmarszczki wskazują na niepełną homogenizację. Pomyślnie rozszerzona próbka będzie 3-4,5 razy większa niż przed ekspansją w 1x PBS i 8-11 razy większa, gdy zostanie w pełni rozprężona w ddH2O. Rysunek 3 pokazuje przykładowe obrazy przed i po ekspansji próbki ludzkiej nerki FFPE o grubości 5 μm przetworzonej przy użyciu tego pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy protokół Magnify17, wariant ExM, który może zatrzymać wiele biomolekuł za pomocą jednej kotwicy chemicznej i rozszerzyć wymagające próbki kliniczne FFPE nawet 11-krotnie dzięki denaturacji cieplnej. Kluczowe zmiany w tym protokole, które odróżniają go od innych protokołów ExM, obejmują zastosowanie przeformułowanego żelu, który pozostaje wytrzymały mechanicznie nawet po pełnym rozprężeniu, a także zastosowanie metakrolineiny jako kotwicy biomolekuły. Najbardziej krytyczne kroki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Y.Z., A.K., Z.C. i B.R.G. wynalazły kilka wynalazków związanych z Magnify i ExM.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Carnegie Mellon University i D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. i X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 oraz Fundacji Kauffmana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Inhibitor
6-dołkowa szklana płytka denna (#1,5 szkła nakrywkowego)CellvisP06-1.5H-N
AkrylamidSigma AldrichA8887Żel Monomer Składnik
Nadsiarczan amonu (APS) Sigma AldrichA3678Inicjator
DAPI (1 mg / ml)Thermo Scientific62248
Eter monododecylowy glikolu dekaetylenowego (C12E10)Sigma AldrichP9769Niejonowy środek powierzchniowo czynny
Nóż diamentowy nr 88 CMNarzędzia ogólne31116
EtanolPharmco111000200
EtanolPharmco
Kwas etylenodiaminotetraoctowy
(EDTA) 0,5 M		VWRBDH7830-1Kleszczyki
GlicynaSigma AldrichG8898Składnik buforu homogenizacyjnego
HeparynaSigma AldrichH3393
MetakryneinaSigma Aldrich133035Środek kotwiący
Mikro osłona Szkło #1 (24x60mm)VWR48393 106
Mikro osłona szklana #1.5 (24x60mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)		Sigma AldrichT9281Akcelerator
N,N′-Metylenobisakryloamid (Bis)Sigma AldrichM7279Składnik monomeru żelowego
N,N-dimetyloakryloamid (DMAA)Sigma Aldrich274135Żelowy składnik monomeru
Nunclon 4-dołkowe x 5 ml MultiDish Naczynie do hodowli komórkowych ThermoFisher167063
6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych NunclonThermo Fisher140675
Nunc™ 15mL  StożkowyThermo Fisher339651
Nunc™ 50mL  Stożkowypędzel
pH-metr
buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwórFischer ScientificBP399-1
Glikol polietylenowy  200Sigma AldrichP-3015
Klasa biologii molekularnej)Thermo ScientificEO0491
ŻyletkaFischer Scientifc12640
Probówki do mikrowirówek Safelock 1,5 mlThermo Fisher3457
Probówki do mikrowirówek Safelock 2,0 mlThermo Fisher3459
Akrylan sodu (SA)AK ScientificR624Składnik
Azydek soduSigma AldrichS2002
Chlorek soduSigma AldrichS6191
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySigma AldrichC8532-1KG
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL3771Bufor homogenizacyjny Składnik
Tris BaseFischer ScientificBP152-1Bufor homogenizacyjny Składnik
Triton X-100Sigma AldrichT8787
MocznikSigma AldrichU5378Bufor homogenizacyjny Składnik
ksylenySigma Aldrich214736
20x SSCThermo ScientificAM9763
Tween20Sigma AldrichP1379
poli-L-lizyna Sigma AldrichP8920
111000200 do homogenizacyjnych do wytrząsarki orbitalnej Thermo Fisher 339653 Sól fizjologiczna Proteinaza K (monomeru żelowego

Bibliografia

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  9. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).
  10. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).
  11. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
  12. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
  13. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  14. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  15. Chang, J. -B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  16. Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
  17. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
  18. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  19. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie w skali nanometoda Magnifyekspansja tkankikotwica z metakroleinzachowanie epitop w bia kowychbarwienie lipid wsondy FISHmikroskopia konfokalnatkanka zatopiona w parafinie

Powiązane artykuły