Artykuł metodologiczny

Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

DOI:

10.3791/65349

⸱

16 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Molecular Cell Biology of Autophagy, The Francis Crick Institute, 2MRC Laboratory of Molecular Biology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje różne metody, które mogą pomóc w badaniu biologii ATG9A, w tym immunofluorescencję, po której następuje analiza obrazu, rozważania dotyczące przejściowej nadekspresji i badanie statusu glikozylacji ATG9A za pomocą western blot.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagia to wysoce zachowana ścieżka, którą komórka wykorzystuje do utrzymania homeostazy, degradacji uszkodzonych organelli, zwalczania atakujących patogenów i przetrwania w stanach patologicznych. Zestaw białek, zwanych białkami ATG, składa się na rdzeń maszynerii autofagii i współpracuje ze sobą w określonej hierarchii. Badania przeprowadzone w ostatnich latach poszerzyły naszą wiedzę na temat szlaku autofagii. Ostatnio zaproponowano, że pęcherzyki ATG9A są sercem autofagii, ponieważ kontrolują szybką syntezę de novo organelli zwanej fagoforem. Badanie ATG9A okazało się trudne, ponieważ ATG9A jest białkiem transbłonowym i jest obecne w różnych przedziałach błonowych. W związku z tym zrozumienie jego handlu jest ważnym elementem zrozumienia autofagii. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe metody, które można wykorzystać do badania ATG9A, a w szczególności jego lokalizacji za pomocą technik immunofluorescencyjnych, które można ocenić i określić ilościowo. Omówiono również pułapki związane z przejściową nadekspresją. Prawidłowa charakterystyka funkcji ATG9A i standaryzacja technik analizy jego transportu są kluczowe dla dalszego scharakteryzowania zdarzeń rządzących inicjacją autofagii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATG9A jest jedynym białkiem transbłonowym głównej maszynerii autofagii i jest transportowane między kompartmentem Golgiego a cytozolowym przedziałem pęcherzykowym ATG9A, przechodząc przez kompartment endosomalny 1. Będąc od dawna enigmatycznym, ATG9A został niedawno opisany jako działający jako scramblaza lipidowa, ponieważ równoważy lipidy w dwuwarstwach błony2,3. Teraz jest jasne, że ATG9A znajduje się na szczycie hierarchii w tworzeniu autofagosomów, a zatem jego badanie jest niezbędne do zrozumienia autofagii4,5. W związku z tym pęcherzyki ATG9A zostały niedawno zaproponowane jako "ziarno" autofagosomu6,7. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że ATG9A tylko przejściowo oddziałuje z tworzącym się autofagosomem na różnych etapach jego dojrzewania i nie integruje się z błoną autofagiczną6,8,9,10,11. W związku z tym potrzebne są dalsze badania, aby całkowicie rozwikłać rolę i potencjalne wielorakie funkcje ATG9A w tworzeniu autofagosomów. Jednak rozbieżność między obecnymi modelami a poprzednimi danymi może zostać rozwiązana tylko poprzez ukierunkowane eksperymenty dotyczące transportu ATG9A przy użyciu zwalidowanych podejść ilościowych i markerów wewnątrzkomórkowych.

Do badania ATG9A używane są różne narzędzia, każde z nich ma zalety i wady, a korzystanie z tych narzędzi komplikuje struktura ATG9A, jego funkcja molekularna i transport komórkowy2,8,12. ATG9A tworzy homotrimer, jest glikozylowany i jest transportowany przez komórkę do przedziałów takich jak Golgi, endosomy i błona plazmatyczna13,14. Biorąc pod uwagę jego złożoną trasę, istnieje kilka wyzwań związanych z interpretacją odczytów, takich jak rozprzestrzenianie się ATG9A z Golgiego po określonych zabiegach lub bodźcach (takich jak głód składników odżywczych i surowicy). ATG9A jest niezwykle dynamiczny pod względem transportu pęcherzykowego; rzeczywiście, pęcherzyki zawierające ATG9A zostały zdefiniowane jako przedział ATG9A w kontekście autofagii wywołanej głodem. Przedział ATG9A, utworzony przez te dynamiczne pęcherzyki, przejściowo oddziałuje z kilkoma organellami wewnątrzkomórkowymi8,15,16,17. Opisane tutaj techniki, w tym immunofluorescencja, obrazowanie na żywo i testy glikozylacji, powinny pomóc w wykryciu i zrozumieniu biologii ATG9A. W szczególności podejścia opisane w tym artykule pomogą odpowiedzieć na pytania dotyczące lokalizacji w określonych przedziałach komórkowych i interakcji z określonymi partnerami białkowymi i/lub przedziałami błonowymi. Ponieważ hydrofobowa konserwowana domena rdzeniowa ATG9A (domena PFAM PF04109) ma unikalną topologię i cykle ATG9A między kilkoma przedziałami błony, naukowcy powinni zdawać sobie sprawę z pewnych pułapek i artefaktów podczas przejściowej nadekspresji ATG9A, w tym między innymi retencji retikulum endoplazmatycznego (ER). Inne możliwe problemy mogą pojawić się z powodu nieprawidłowego fałdowania białka, sztucznej agregacji w normalnych warunkach wzrostu lub niewystarczającego wykrywania przedziału pęcherzykowego z powodu nieoptymalnych protokołów przepuszczalności dla immunofluorescencji.

Podczas obrazowania endogennego ATG9A, należy zachować ostrożność podczas przygotowywania próbki i akwizycji obrazu, aby zapewnić jakość późniejszej analizy ilościowej i poprawną interpretację danych. Połączenie technik opisanych w tym artykule ze standardowymi podejściami biochemicznymi (takimi jak immunoprecypitacja lub eksperymenty typu pull-down, które nie zostały tutaj opisane) powinno poprawić nasze zrozumienie funkcji ATG9A. Ten eksperymentalny zestaw narzędzi ma na celu pomóc nowym badaczom w poruszaniu się po niektórych testach wymaganych do określenia funkcji ATG9A w ich systemie biologicznym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie odczynniki użyte w tym badaniu są dostępne na rynku, z wyjątkiem konstruktów DNA ATG9A i domowego przeciwciała STO-215 (zobacz Tabelę Materiałów), które są dostępne na życzenie. Opisane tutaj narzędzia analityczne są oparte na oprogramowaniu typu open source (FIJI/ImageJ)18.

1. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymuj HEK293A komórek w kolbie poddanej hodowli tkankowej T150 do 80%-90% konfluencji w DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionym 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) i 4 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 10% CO2,
    UWAGA: Komórki HEK293A są używane w niniejszym badaniu, ponieważ mają silną kanoniczną odpowiedź autofagii na głód aminokwasów, który jest w szczególności wykrywany przez wzrost lipidowanego, związanego z błoną LC31,9,19 i nadają się do obrazowania.
  2. Przejść przez przejście komórek przez zasysanie pożywki z kolby za pomocą pipety serologicznej. Umyj komórki raz 15 ml 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) lub podobnym roztworem przed dodaniem 2 ml roztworu Trypsyna-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) w celu odłączenia komórek. Zbierz oderwane komórki za pomocą 8 ml DMEM i zasiej z powrotem pewną liczbę komórek, tak aby po 2 dniach osiągnięto zbieżność 80%-90% dla opisanych tutaj eksperymentów.

2. Endogenne barwienie ATG9A

  1. Nasiona HEK293A komórek (lub komórek z wyboru) na sterylnych szkiełkach nakrywkowych nr 1,5 umieszczonych na 24-dołkowej płytce tak, aby następnego dnia zlewały się w ~80%. Zazwyczaj daje to 7 x 104 komórek/studzienkę w 500 μl DMEM.
    UWAGA: W przypadku komórek HEK293A lub innych luźno przylegających linii komórkowych szkiełka nakrywkowe należy pokryć poli-D-lizyną w stężeniu 0,1 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Dodać 500 μl poli-D-lizyny (patrz tabela materiałów) na wierzch szkiełek nakrywkowych umieszczonych w studzienkach na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie trzy płukania wodą dejonizowaną i ostatnie płukanie w DMEM. Przystąp do wysiewu komórek po powlekaniu i upewnij się, że są równomiernie rozłożone w naczyniu hodowlanym.
  2. Traktuj komórki zgodnie z określonymi warunkami eksperymentalnymi (tj. głód przez 2 godziny w EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
    UWAGA: Skład EBSS to 1 g/L D-glukozy, 6,8 g/L NaCl, 0,4 g/L KCl, 0,151 g/L CaCl2,2H 2O, 0,2 g/L mM MgSO, 4,7H2O, 0,124 g/L NaH2HPO4,2H 2O i 2,2 g/L NaHCO3 (patrz tabela materiałów) rozpuszczone w wodzie destylowanej.
  3. Odessać pożywkę i ostrożnie zastąpić ją 500 μl 4% roztworu formaldehydu w PBS uzupełnionym 0,1 mM CaCl2 i 0,1 mM MgCl2 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek.
  4. Odessać 4% roztwór formaldehydu z każdej studzienki, zastępując go 500 μl PBS. Powtórz ten krok prania trzy razy. Nie pozwól, aby szkiełka nakrywkowe wyschły lub pozostały bez płynu.
  5. Stłumić wolne grupy aldehydowe przy użyciu 500 μl 50 mM roztworu NH4Cl w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać PBS i zastąpić go 500 μl roztworu digitoniny o stężeniu 50 μg/ml w PBS (roztwór podstawowy 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, patrz Tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek.
  7. Odessać roztwór digitoniny z każdej studzienki i zastąpić go 500 μl PBS. Powtórz ten krok prania trzy razy.
  8. Odessać PBS z każdej studzienki i zastąpić ją 500 μl roztworu blokującego (5% BSA [albumina surowicy bydlęcej] rozcieńczona w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać roztwór blokujący i zastąpić go 500 μl PBS.
  10. Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe z dołka, ostrożnie usuń nadmiar roztworu PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych lub celulozowej bibuły filtracyjnej i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe, stroną z komórkami do dołu, na 50 μl kropli roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (np. chomik ormiański 14F2 rozcieńczony do 0,9 μg/ml w 1% roztworze BSA/PBS, patrz tabela materiałów). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: W celu łatwej obsługi, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu samouszczelniającej się folii termoplastycznej (patrz Tabela materiałów) w innym pojemniku zamiast bezpośrednio na twardej powierzchni.
  11. Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i, po delikatnym odsączeniu nadmiaru roztworu przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą cienkich chusteczek tkankowych, umieścić szkiełka nakrywkowe (komórką do góry) na płytce 24-dołkowej i umyć je trzykrotnie PBS.
  12. Powtórz krok 2.10. Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe z każdej studzienki, ostrożnie odsączając nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych, i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (stroną komórkową do dołu) na 50 μl kropli roztworu przeciwciał wtórnych rozcieńczonego w stosunku 1:1000 w 1% roztworze BSA/PBS (np. Cy3 Goat Anti-Armenian Hamster IgG, który ma minimalną reaktywność krzyżową z bydłem, białka surowicy ludzkiej, myszy, królika i szczura, patrz tabela materiałów). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Opcjonalnie: Oprócz przeciwciała drugorzędowego można użyć markera cytoszkieletu do późniejszej analizy obrazu (tj. Alexa Fluor 647 Phalloidin rozcieńczony w stosunku 1:1,000, patrz Tabela materiałów). Aby ułatwić obsługę, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu folii uszczelniającej w innym pojemniku, a nie bezpośrednio na twardej powierzchni.
  13. Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i po odsączeniu nadmiaru roztworu przeciwciał wtórnych umieścić szkiełka nakrywkowe na płytce 24-dołkowej (komórką do góry) i przemyć je trzykrotnie 500 μl PBS.
  14. Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe, ostrożnie odsączając nadmiar PBS za pomocą cienkich chusteczek higienicznych i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (komórką do dołu) na 50 μl kropli roztworu Hoechsta w stosunku 1:4 000 (Hoechst 33342) w PBS. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 5 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Aby ułatwić obsługę, krople roztworu przeciwciał można umieścić na arkuszu folii uszczelniającej w innym pojemniku zamiast bezpośrednio na twardej powierzchni.
  15. Zebrać szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i po delikatnym odsączeniu nadmiaru roztworu Hoechst za pomocą cienkich chusteczek chusteczkowych, umieścić szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej i przemyć trzykrotnie PBS i raz wodą dejonizowaną (500 μl na pranie).
  16. Ostrożnie spuść nadmiar dejonizowanej wody za pomocą cienkich chusteczek higienicznych i delikatnie połóż każde szkiełko nakrywkowe (komórką do dołu) na kropli 10-20 μl roztworu montażowego (patrz Tabela materiałów) naniesionej na szkiełko mikroskopowe w celu immunofluorescencji, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Zastosowane tutaj podłoże montażowe ma taki sam współczynnik załamania światła jak olejek immersyjny i twardnieje po kilku godzinach w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Można stosować nietwardniejące roztwory montażowe, ale należy zachować ostrożność, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
  17. Usunąć nadmiar roztworu montażowego przez aspirację i pozostawić próbki do wyschnięcia, leżąc płasko w temperaturze pokojowej przez noc w ciemności, w uchwycie na szkiełko lub przykryte folią aluminiową.

3. Akwizycja obrazu

  1. Włącz mikroskop konfokalny. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Sp. z materiałami), aby rozpocząć konfigurację akwizycji obrazu.
  2. Na karcie Function (Funkcja) wybierz obiektyw Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27, aby przechwycić obrazy do analizy.
  3. W zakładce Funkcja akwizycji włącz odpowiednie lasery w strefie Laser Panelu Sterowania (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 i HeNe633).
  4. W obszarze Imaging Setup (Ustawienia obrazowania) w Panelu sterowania utwórz cztery ścieżki, z których każda odpowiada jednemu kanałowi, aby przeprowadzić sekwencyjną akwizycję.
  5. Ustaw odpowiednią rozdzielczość obrazów w oknie Tryb akwizycji. Ustaw rozdzielczość na 1 024 x 1 024 (rozmiar klatki) i wybierz głębię bitową 16 bitów.
  6. Dla każdego kanału dostosuj moc i wzmocnienie lasera, aby uzyskać dobry sygnał bez nasyconych pikseli, które utrudniałyby analizę intensywności obrazu. Za pomocą przycisku Live (Na żywo) ustaw poziom wyjściowy lasera i Gain (Master).
    UWAGA: Użycie opcji wskaźnika zasięgu jest zalecane do wykrywania nasyconych pikseli. Utrzymuj moc lasera w zakresie od 1% do 10%, a wzmocnienie (Master) poniżej 850, aby uniknąć szumów tła.
  7. W strefie Kanały w Panelu sterowania ustaw ten sam otwór otworkowy dla każdego kanału, biorąc pod uwagę 1 jednostkę Airy (AU) dla kanału o najwyższej długości fali.
  8. Zdobądź 10 losowych pól zawierających podobną liczbę komórek (20-30 komórek na pole). Akwizycja 100-200 komórek na warunek zapewni dobrą moc do późniejszej analizy obrazu.

4. Analiza obrazu dyspersji ATG9A

  1. Pobierz oprogramowanie FIJI z Internetu (patrz Spis materiałów). Otwórz obraz za pomocą FIJI, klikając Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
  2. Kliknij Analizuj > Ustaw pomiary, a następnie wybierz Średnią wartość szarości w oknie pomiarów do analizy intensywności.
  3. Kliknij Obraz > Kolor > Podziel kanały i podziel kanały na trzy obrazy (marker Golgiego, cytoszkielet, sygnał ATG9A).
  4. Przejdź do opcji Obraz > Dostosuj próg > i zdefiniuj próg w kanale odpowiadający znacznikowi Golgiego.
  5. Kliknij Edytuj > Zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie i utwórz zaznaczenie z obrazu binarnego.
  6. Przejdź do opcji Edytuj > zaznaczenie > Dodaj do Menedżera > Zmień nazwę (Golgi), zapisz zaznaczenie w menedżerze ROI i zmień jego nazwę na Golgi.
  7. Kliknij Obraz > Dostosuj próg > i zdefiniuj próg w kanale odpowiadający markerowi cytoszkieletu, aby zdefiniować kontur komórki.
  8. Przejdź do opcji Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie i utwórz zaznaczenie z obrazu binarnego.
  9. Kliknij Edytuj > zaznaczenie > Dodaj do Menedżera > Zmień nazwę (Suma), zapisz wybór w menedżerze ROI i zmień jego nazwę na Suma.
  10. Wybierz obraz odpowiadający barwieniu ATG9A.
  11. W Analizuj > mierz zastosuj ROI Golgi, klikając go, i zmierz intensywność obszaru Golgiego.
  12. Kliknij Analizuj > mierz, zastosuj całkowity zwrot z inwestycji, klikając na niego, i zmierz intensywność całkowitego regionu.
  13. Powtórz procedurę na wszystkich obrazach, zapisz wyniki jako pliki .csv i przetwórz dane przy użyciu następującej formuły:
    Szybkość dyspersji ATG9A = intensywność Golgiego/Całkowita intensywność

5. Obrazowanie żywych komórek konstruktów ATG9A

  1. Wysiewaj HEK293A komórki (lub komórki z wyboru) w 2 ml pożywki do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm, aby następnego dnia osiągnęły ~65%-70% konfluencji; zwykle daje to 1 x 106-2 x 106 komórek.
  2. Następnego dnia należy przygotować mieszaniny lipofetamina:DNA (lub odpowiedni alternatywny odczynnik do transfekcji DNA, patrz Tabela Materiałów) w następujący sposób:
    1. W zależności od wydajności ekspresji konstruktu, rozcieńczyć 0,5-2 μg plazmidowego DNA w 100 μl odpowiedniego podłoża bez surowicy i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę iw dół. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Konstrukt plazmidowego DNA jest specyficzny dla eksperymentu. Badacze mogą klonować samodzielnie lub uzyskać od autorów na żądanie.
    2. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 w stosunku 3:1 Lipofectamina:DNA w 100 μl odpowiedniej pożywki wolnej od surowicy i delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół. Inkubuj tę mieszankę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wymieszać oba roztwory razem, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj mieszaninę Lipofectamina:DNA do każdej płytki do hodowli komórkowej zawierającej 4 ml pożywki wzrostowej i delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 10% CO2 .
  4. Zastąp pożywkę świeżą pożywką 4 godziny po transfekcji i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przy 10% CO2 przez noc.
  5. Następnego dnia trypsynizuj, policz i ponownie zasiaj komórki na szalkach hodowlanych odpowiednich do mikroskopii żywych komórek (szalki hodowlane ze szkiełkiem nakrywkowym nr 1,5, patrz Tabela Materiałów). Umieść 0,4 x 10 6-0,7 x 106 komórek na szalkach, aby osiągnąć ~60%-75% konfluencji na szkiełku nakrywkowym w momencie obrazowania.
    UWAGA: Powlekanie poli-D-lizyną, jak wyjaśniono w kroku 2.1, jest zalecane dla komórek HEK293A.
  6. Następnego dnia (48 godzin po transfekcji) zobrazuj komórki.

6. Badanie stanu glikozylacji ATG9A

  1. Wysiewaj HEK293A komórki (lub komórki z wyboru) w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, aby osiągnęły ~ 80% konfluencji następnego dnia, jeśli planujesz zbadać endogenny ATG9A, który zwykle daje 1,5 x 10 6-2,5 x 106 komórek w 10 ml. Alternatywnie, zasiej komórki, aby osiągnęły ~ 65% -70% konfluencji podczas transfekcji konstruktów ATG9A, co zwykle daje 1 x 10 6-1,5 x 106 komórek w 10 ml.
  2. Następnego dnia należy potraktować komórki cykloheksamidem o stężeniu 100 μg/ml (CHX, patrz tabela materiałów) lub podłożem. Inkubować przez 24 godziny (lub do pożądanego punktu czasowego).
  3. Usunąć komórki z inkubatora, odessać pożywkę i umieścić na lodzie. Zastąp go 5 ml lodowatego 1x PBS. Fizycznie odłączyć komórki od naczynia za pomocą skrobaka do komórek i odpipetować roztwór komórek PBS do probówki o stożkowym dnie o pojemności 15 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ~100 μl (w zależności od wielkości osadu komórkowego) lodowatego buforu do lizy TNTE (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) uzupełnionym tabletkami koktajlowymi inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów) i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    1. Inkubować lizat na lodzie przez 15 minut. Następnie odwirować lizat o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki.
  5. Określ ilościowo stężenie białka w lizacie za pomocą metody Bradforda20 i spektrofotometru, który może mierzyć przy długości fali 595 nm.
  6. Znormalizuj ilość białka i połącz 16 μl lizatu (zawierającego łącznie nie więcej niż 100 μg białka) z 5x buforem PNGase F (peptyd: N-glikozydaza F) zgodnie z instrukcjami producenta przed dodaniem 1 μl enzymu PNGazy F (patrz tabela materiałów). Inkubować zgodnie z instrukcją producenta PNGazy F.
  7. Dodać objętość 3x buforu próbki Laemmli, aby uzyskać stężenie 1x, i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut przed załadowaniem do elektroforezy przy użyciu żelu Tris-acetat, aby zmaksymalizować separację białek. Przenieść białka z żelu do odpowiedniej błony (tj. PVDF [polifluorku winylidenu]) przy użyciu standardowych protokołów western blot21 (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Gotowanie próbek w temperaturze 95 °C spowoduje agregację ATG9A, zmniejszając w ten sposób wykrywalność ATG9A.
  8. Wykonaj western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał dla ATG9A (przeciwciało STO-215, produkowane we własnym zakresie1) (patrz tabela materiałów). Pozostaw nieprzeciętą część membrany o większej masie cząsteczkowej, aby uwidocznić gatunki o wyższej masie cząsteczkowej ATG9A.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATG9A to białko transbłonowe związane z kilkoma wewnątrzkomórkowymi przedziałami błony8,17,22,23,24. W warunkach podstawowych ATG9A jest głównie zlokalizowany w sieci trans-Golgiego (TGN), na co wskazuje immunofluorescencja endogennego białka i nakładanie się z GM130, markerem cis-Golgiego (Figura 1A), a także w małych pęcherzykach, które częściowo pokrywają się z endocytarnym przedziałem recyklingu (ERC)23. Lokalizację ATG9A w Golgi można wykryć przy użyciu różnych protokołów immunofluorescencyjnych. Jednak frakcja pęcherzykowa ATG9A, a także zmiana jej lokalizacji, w szczególności wzrost puli pęcherzykowej, w odpowiedzi na określone bodźce, takie jak głód składników odżywczych i surowicy, może być dość zmienna pod względem intensywności i trudna do wizualizacji przy użyciu konwencjonalnych metod obrazowania. Stosunek między ATG9A zlokalizowanym w Golgi a ATG9A zlokalizowanym we frakcji pęcherzykowej nazywa się szybkością dyspersji ATG9A. Aby wykryć zmiany w szybkości dyspersji ATG9A, na przykład po leczeniu EBSS, które jest używane do zubożenia zarówno surowicy, jak i aminokwasów, marker Golgiego, taki jak GM130 lub TGN46, i marker cytoszkieletu, taki jak falloidyna, który barwi kontur komórki25, są przydatne do łatwego ilościowego określenia dyspersji ATG9A (Rysunek 1B). Co ważne, analiza średniego współczynnika fluorescencji może być interpretowana jedynie jako miara porównawcza między warunkami, a nie jako stała szybkość dyspersji. Stosunek między przedziałami jest w dużym stopniu zależny od czynników biologicznych i niebiologicznych, takich jak użyta linia komórkowa, jakość barwienia lub zastosowane metody progowania (Rysunek 1B). Z tego powodu badacz musi skonfigurować potok, który jest w stanie wykryć wzbogacenie ATG9A Golgiego w określonych warunkach eksperymentalnych, a następnie rozszerzyć analizę z tymi samymi parametrami na wszystkie obrazy w zestawie, który ma być analizowany. Reprezentatywne obrazy binarne i obszary wybrane do analizy średniej fluorescencji ATG9A są pokazane jako przewodnik w Rysunek 1B.

ATG9A posiada kilka domen transbłonowych otoczonych przez dwie stosunkowo elastyczne i nieustrukturyzowane domeny N- i C-końcowe, z których sekwencja C-końcowa obejmuje prawie połowę białka12. Co ważne, na wzorzec lokalizacji nadekspresji ATG9A może mieć wpływ to, który koniec białka jest oznaczony ( Rysunek 2A). W szczególności, przy użyciu przejściowych systemów ekspresji i znakowaniu ATG9A bezpośrednio na jego N-końcu za pomocą znacznika fluorescencyjnego (np. eGFP, mRFP lub pochodne), jego lokalizacja Golgiego może być częściowo zagrożona, z mniejszym wzbogaceniem obserwowanym w warunkach podstawowych (tj. Karmionych), podczas gdy pęcherzyki ATG9A są nadal łatwo widoczne (Rysunek 2A). Znakowanie ATG9A na jego C-końcu wydaje się nieznacznie indukować większe klastry GFP, które mogą być agregowane. Wreszcie, monomeryczna wersja mRFP-ATG9A wykazuje również podobne fluorescencyjne skupiska pęcherzyków i niewielkie barwienie Golgiego w komórkach z nadekspresją (Figura 2A).

1,14. Ta modyfikacja przez glikozylację może być wykryta przez western blot po pojawieniu się podwójnego pasma14. Zgodnie z lokalizacją wewnątrzkomórkową, większość endogennych ATG9A zawiera złożone glikany połączone z N, a zatem dominuje pasmo o wyższej masie cząsteczkowej, z widocznym również słabym pasmem o niższej masie cząsteczkowej (Figura 2B). Obecność podwójnego pasma jest najłatwiej zauważalna przy użyciu żeli Tris-acetate w celu poprawy rozdzielczości białek o wyższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2B, kontrola, t = 0). Kiedy endogenne białko jest poddawane zabiegowi PNGazy F (peptyd: N-glikozydaza F), który usuwa większość złożonych glikanów połączonych z N, białko działa jako pojedyncze pasmo (Rysunek 2B, PNGaza F, t = 0). W związku z tym status glikozylacji sprzężony z N ATG9A może być używany jako wskaźnik zastępczy do monitorowania wyjścia ATG9A z ER do Golgiego, co znajduje odzwierciedlenie we względnym stosunku między dwoma pasmami.

Gdy transfekcja mRFP-ATG9A konstrukuje się przejściowo, nadekspresja białka początkowo gromadzi się w ER, potencjalnie dlatego, że maszyneria transportowa nie jest w stanie złożyć i przetransportować całego ATG9A, a dominuje pasmo o niższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C, kontrola t = 0). Warto zauważyć, że po 24 godzinach od ekspresji mRFP-ATG9A występuje w przybliżeniu równy rozkład między górnym i dolnym pasmem, co sugeruje, że pula mRFP-ATG9A przesuwa się do puli Golgiego (Rysunek 2C, kontrola, t = 24). Jeśli komórki są traktowane cykloheksymidem (CHX), który blokuje syntezę białek de novo26, można wyjaśnić fałdowanie i wyjście ATG9A z ER. Ponieważ endogenne białko jest pofałdowane, glikozylowane i rezyduje w Golgi, leczenie CHX nie zmienia znacząco stosunku pasm o niższej i wyższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2B, kontrola). Jednak wykorzystując przejściową ekspresję mRFP-ATG9A, leczenie CHX sprzyja akumulacji pasma o wyższej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C, kontrola, CHX t = 24). Pasmo mRFP-ATG9A o wyższej masie cząsteczkowej zapada się w dolne pasmo po leczeniu PNGazą F (Figura 2C, PNGaza F, t = 24). Dane te pokazują, że białko endogenne szybko nabywa dojrzałe glikany, co znajduje odzwierciedlenie w dominacji pasma o wyższej masie cząsteczkowej, a pościg CHX nie wpływa na stosunek podwójnych prążków (Figura 2B). W przypadku przejściowo nadekspresji mRFP-ATG9A, traktowanie CHX indukuje akumulację górnego pasma, co wskazuje, że bardziej dojrzałe glikany są nabywane, gdy pula ER fałduje się i wychodzi z ER do Golgiego (Figura 2C).

Dodanie łącznika między sekwencją ATG9A a znacznikami fluorescencyjnymi może być pomocne w promowaniu bardziej fizjologicznej lokalizacji i transportu białka. Fuzja sekwencji 3x-FLAG (24 aminokwasy) między N-końcowym fluoroforem a ATG9A pomaga nadekspresji białka zachowywać się podobnie do endogennego białka (Ryc. 3). Rzeczywiście, nadekspresja mCherry-3xFLAG-ATG9A kolokalizuje się z markerem Golgiego GM130 w warunkach karmienia (Figura 3A). Co ważne, ta lokalizacja i przedział pęcherzykowy ATG9A są zachowane w czasie, co pozwala na czasoprzestrzenne badanie transportu ATG9A (Ryc. 3B).

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza obrazu endogennej lokalizacji ATG9A. (A) Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny endogennego ATG9A (czerwony), GM130 jako markera Golgiego (zielony) i falloidyny do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego (cyjan). Podziałka = 10 μm. (B) Przebieg analizy obrazu w celu określenia frakcji endogennego ATG9A, która lokalizuje się w obszarze Golgiego. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza fluorescencyjnie znakowanych konstruktów ATG9A przez lokalizację i glikozylację. (A) eGFP N-końcowy ATG9A jest mniej zlokalizowany w Golgi i głównie znajduje się w pęcherzykach. eGFP C-terminalnie oznaczony ATG9A wykazuje agregacje w komórce (niektóre przykłady są oznaczone białymi grotami strzałek; eGFP-ATG9A i ATG9A-eGFP są zaznaczone na zielono). ATG9A oznaczony mRFP N-terminalnie jest mniej zlokalizowany w Golgi i znajduje się głównie w pęcherzykach. N oznacza przybliżoną lokalizację jądra komórkowego, a mRFP-ATG9A jest zaznaczony na czerwono. Pasek skali = 5 μm. (B) Endogenny ATG9A pojawia się jako dwa pasma podczas analizy za pomocą western blot (groty strzałek): górny pas (złożone glikany połączone N) i dolny pasek (brak dojrzałych glikanów związanych z N). Leczenie cykloheksamidem (CHX) nie wpływa na stosunek między górnym i dolnym pasmem. Leczenie PNGazą F powoduje zanik górnego pasma. (C) Po przejściowym transfekcji ATG9A oznaczonego mRFP w komórkach HEK293A, na western blot (grotach strzałek) widoczne są dwa wyraźne pasma. Leczenie PNGazą F powoduje zanik górnego pasma. Leczenie CHX po transfekcji prowadzi do zwiększonej glikozylacji, ponieważ pula transfekowanego ATG9A jest transportowana z ER do Golgiego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza lokalizacji mCherry-3xFLAG-ATG9A za pomocą immunofluorescencji i obrazowania na żywo. (A) Eksperymenty immunofluorescencyjne komórek HEK293A przejściowo z nadekspresją mCherry-3xFLAG-ATG9A i wybarwionymi markerem Golgiego GM130. Podziałka = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A jest w kolorze czerwonym, a znacznik Golgi GM130 jest w kolorze zielonym. (B) Montaż z eksperymentów obrazowania na żywo w HEK293A komórkach przejściowo z nadekspresją mCherry-3xFLAG-ATG9A. N oznacza przybliżone położenie jądra. Ramy czasowe = 1 kl./s. Podziałka = 10 μm. mCherry-3xFLAG-ATG9A jest w kolorze czerwonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ilustruje różne narzędzia, które można wykorzystać do zbadania lokalizacji ATG9A. Po pierwsze, badanie to opisuje, w jaki sposób ATG9A można uwidocznić za pomocą immunofluorescencji i jak można to określić ilościowo. Po drugie, porównano strategie, które można wykorzystać do oznaczania ATG9A markerem fluorescencyjnym w celu wizualizacji w stałych lub żywych komórkach. Wreszcie, ta praca opisuje, jak badać i wykorzystywać stan glikozylacji ATG9A do określenia, czy ATG9A opuścił ostry dyżur i przedostał się przez Golgiego.

Jeśli chodzi o charakterystykę endogennej lokalizacji ATG9A za pomocą immunofluorescencji, należy zachować ostrożność przy metodach utrwalania i przepuszczalności zastosowanych w doświadczeniu. Zgodnie z opisanymi tutaj standardowymi procedurami, wiązanie paraformaldehydu w połączeniu z przepuszczalnością digitoniny jest dobrym warunkiem do wizualizacji zarówno pęcherzyków ATG9A związanych z Golgim, jak i ATG9A-dodatnich7. Wraz z utrwalaniem i przenikaniem krytyczny jest również czas inkubacji z pierwotnym roztworem przeciwciała. Zaobserwowaliśmy, ale nie udokumentowaliśmy, że wyższe stężenia pierwotnego roztworu przeciwciała i dłuższe czasy inkubacji mogą prowadzić do błędnie reprezentatywnego wzrostu barwienia ATG9A metodą Golgiego, co ostatecznie utrudnia wykrywanie redystrybucji ATG9A do innych przedziałów błonowych. Dodatkowo, ponieważ ATG9A jest obecny w wielu przedziałach wewnątrzkomórkowych 1,13,17,22,23,24,27,28, ważne jest, aby użyć określonych markerów błonowych wraz z ATG9A, aby określić, gdzie znajduje się ATG9A. W przeszłości stosowano kilka podejść do ilościowego określania lokalizacji ATG9A, w tym współczynnik korelacji Pearsona dla kolokalizacji29. Jednak częściowe nakładanie się ATG9A z Golgim i wyraźnym przedziałem pęcherzykowym prowadzi do dużej liczby wartości odstających pikseli, co może zniekształcić interpretację współczynnika korelacji. Z tego powodu preferowane jest bardziej uproszczone podejście oparte na stosunku średniej fluorescencji w dwóch analizowanych przedziałach, a podejście to jest mniej wrażliwe na zmienność między komórkami. Więcej informacji na temat analizy obrazu za pomocą mikroskopii można znaleźć w rozdziale30 tej książki.

Podczas badania statusu glikozylacji ATG9A ważny jest dobór żeli do prowadzenia western blot. W przypadku tego protokołu preferowane są żele Tris-acetate o stężeniu 3%-8%, ponieważ oferują one najwyższą rozdzielczość dla większych białek, ale można również stosować alternatywne kompozycje żeli lub biegowe, które zapewniają dobrą separację białek o dużej masie cząsteczkowej. Eksperymentator może zapewnić maksymalną separację białek poprzez wydłużenie czasu elektroforezy.

Przygotowując próbki do wizualizacji ATG9A na Western Blot, należy zachować ostrożność, aby nie zagotować próbek po dodaniu buforu Laemmli; gotowanie w temperaturze 95 °C indukuje tworzenie się agregatów ATG9A, a następnie ATG9A nie migruje efektywnie do żelu1. Zaleca się podgrzewanie próbek w temperaturze 65 °C przez 5 minut27.

Wysokie poziomy transfekcji zwykle prowadzą do większej akumulacji ATG9A w ER, podczas gdy umiarkowane poziomy ekspresji pomagają w fizjologicznej lokalizacji białka. Anegdotycznie czas inkubacji wynoszący 72 godziny zamiast 48 godzin często pomaga zmniejszyć artefakty lokalizacyjne ER. Warto zauważyć, że mRFP-ATG9A może dokładnie informować o transporcie ATG9A i funkcjonować, jeśli poziomy są kontrolowane przez poziomy ekspresji lub przy użyciu stabilnych linii komórkowych 8,9,22,27.

Niepowodzenie populacji nadmiernie eksprymowanej ATG9A w uzyskaniu dojrzałych glikanów sprzężonych z N może być wykorzystane jako odczyt dla zaburzonego transportu ATG9A. Podczas mutacji lub usuwania niektórych regionów ATG9A istnieje ryzyko zwiększonej retencji ER, co może prowadzić do niepowodzenia w uzyskaniu dojrzałych glikanów sprzężonych z N, a tym samym do szybszej migracji pasma ATG9A na western blot. Badacze pracujący z okrojonymi konstruktami ATG9A powinni sprawdzić retencję ER, stany glikozylacji i lokalizację Golgiego.

Do obrazowania ATG9A na żywych komórkach mikroskop Airyscan, oparty na szybkiej funkcji Airyscan, zapewnia optymalną rozdzielczość zwykle około 120 nm. Aby zapewnić dokładność lokalizacji, liczba klatek na sekundę wynosząca około 1-2 klatki na sekundę (fps) w trybie superrozdzielczości jest optymalna w zależności od liczby wyświetlanych kanałów. Podobne mikroskopy konfokalne, które mogą obrazować z dużą prędkością, mogą być również używane do obrazowania pęcherzyków ATG9A; Należy jednak zauważyć, że szybkość obrazowania może bezpośrednio wpływać na wykrywanie zdarzeń, a tym samym wpływać na interpretację danych.

Podsumowując, przedstawione protokoły opisują sposoby ilościowego oznaczania i charakteryzowania lokalizacji ATG9A za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii żywych komórek i jej statusu glikozylacji. Protokoły te mogą pomóc naukowcom pracującym z ATG9A i pomóc uniknąć niektórych pułapek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.A.T. zasiada w naukowej radzie doradczej Casma Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Rocco D'Antuono za korektę manuskryptu, a także wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Molecular Cell Biology of Autophagy (MCBA) za dyskusje, które doprowadziły do udoskonalenia tych protokołów. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, były wspierane przez Instytut Francisa Cricka, który otrzymuje swoje główne fundusze od Cancer Research UK (CC2134), Brytyjska Rada ds. Badań Medycznych (CC2134). Badania te zostały sfinansowane w całości lub w części przez Wellcome Trust (CC2134). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24 płytki wielodołkowe Falcon353047Do hodowli tkankowych
35 mm Naczynie | Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 14 mm | NiepowlekaneMATTEKP35G-1.5-14-CNaczynie do hodowli komórkowych do mikroskopii żywych komórek
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad1610747
60 mm naczynie do hodowli tkankowych Thermofisher Scientific10099170Do hodowli
tkankowych Alexa Fluor 647 PhalloidinThermofisher ScientificA22287Przeciwciało anty-ATG9A barwienia aktynowego
domowej robotySTO-215Króliczy peptyd anty N-końcowy ATG9A
anty-króliczy IgG, związany z peroksydazą Invitrogen10794347/NA934-1mlPrzeciwciało drugorzędowe dla króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-RFP STO-215
EvrogenAB233dla przeciwciała monoklonalnego Western Blot
ATG9A (14F2 8B1), InvitrogenInvitrogen15232826Przeciwciało immunofluorescencji
ATG9A-eGFPdomowej robotyKonstrukt, który wyraża oznaczony ATG9A
Bemis ParafilmTermokurczliwafolia 
Bio-Rad Protein Assay Koncentrat odczynnikabarwnikowego Bio-Rad5000006Do oznaczania stężenia białka
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Merck10735086001Do blokowania niespecyficznego znakowania
CaCl2.2H2O/Dla PBS i EBSS
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697498001Suplement w buforze do lizy zapobiegający degradacji białek
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Chomik IgGJackson ImmunoResearch127-165-099Przeciwciało drugorzędowe dla przeciwciała i14F2 8B1 dla mmunofluorescencji
CykloheksamidSigma Aldrich66-81-9Aby zatrzymać translację białek
D-Glukoza/Dla EBSS
Digitonina Merck300410Do komórek przepuszczalnych
DMEMMerckD6546-6x500mlDo hodowli tkankowej
eGFP-ATG9Adomowykonstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A
Płodowa surowica bydlęcaGibco10270-106Suplement do DMEM do hodowli komórkowych
FIJI (ImageJ)/https:/fiji.sc/Oprogramowanie do analizy obrazów typu open source
Hoechst Thermofisher ScientificH3570Barwiący jądro
KCl/Dla EBSS
L-glutamina Sigma67513Do hodowli tkankowych
Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019do transfekcji komórek
Mikroskop LSM880 Airyscan Zeiss/Mikroskopia konfokalna
MgCl2/Dla PBS
MgSO4.7H2O/Dla EBSS
Mowiol rozwiązanie montażoweMillipore475904do stałego montażu szkiełek nakrywkowych
NaCl/Dla EBSS
NaH2PO4.2H2O/Dla EBSS
NaHCO3/Dla EBSS
NuPAGE 3 do 8%, Tris-Acetate, 1,5 mm, Mini żele białkoweThermofisher ScientificEA0378BOXdo Western Blotting
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechNP0002do Western Blotting
Opti-MEM I Zredukowana surowica MediumThermofisher Scientific31985062Do transfekcji komórkowej
paraformaldehydu Agar ScientificR1026Do utrwalania komórek
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A domowykonstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)/Do hodowli tkankowej
PNGaseFNEB  P0710SDo usuwania glikanów związanych z N
Bromowodorek poli-D-lizyny mol wt 70 000-150 000MerckP0899Do powlekania szkiełek nakrywkowych
Szybki enzym PNGazy FNEBP07105Aby usunąć glikany sprzężone z N
RFP-ATG9Adomowykonstrukt, który wyraża oznaczone ATG9A
Triton X-100Thermofisher Scientific13454259Detergent do komórek liza
Roztwór trypsyny-EDTA SigmaT4049Do hodowli tkankowych
Bibuła filtracyjna WhatmanWHA1001325Merck do Western Blot i IF
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Do Western Blotting
Zen Black editionZeiss/Używany do obsługi LSM 880
termoplastyczna Thermofisher Scientific 11747487

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
  2. Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
  3. Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
  4. Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
  5. Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
  6. Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
  7. Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085(2020).
  8. Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
  9. Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
  10. Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420(2016).
  11. Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
  12. Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837(2020).
  13. Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837(2018).
  14. Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
  15. Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
  16. Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
  17. Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
  20. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269(2020).
  21. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
  22. Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
  23. Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
  24. Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
  25. DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
  26. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  27. Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
  28. Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
  29. Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization - Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847(2018).
  30. D'Antuono, R. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. Nechyporuk-Zloy, V. , Springer. Cham, Switzerland. 77-104 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ATG9A TraffickingAutophagy PathwayImmunofluorescence ImagingVesicle TraffickingConfocal MicroscopyProtein TaggingPhagophore FormationLive Cell ImagingGolgi Localization

Powiązane artykuły