Artykuł metodologiczny

In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

DOI:

10.3791/65373

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bis-3-chloropiperydyny (B-CePs) są użytecznymi sondami chemicznymi do identyfikacji i charakteryzowania struktur G-kwadrupleksu w matrycach DNA in vitro. Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę przeprowadzania reakcji sondowania z B-i rozpuszczania produktów reakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G-quadruplexes (G4s) są biologicznie istotnymi, niekanonicznymi strukturami DNA, które odgrywają ważną rolę w ekspresji genów i chorobach, stanowiąc ważne cele terapeutyczne. Potrzebne są dostępne metody do charakterystyki in vitro DNA w obrębie potencjalnych sekwencji tworzących G-kwadrupleks (PQS). B-to klasa środków alkilujących, które okazały się użytecznymi sondami chemicznymi do badania struktury kwasów nukleinowych wyższego rzędu. W artykule opisano nowy test mapowania chemicznego wykorzystujący specyficzną reaktywność B-z N7 guaniny, a następnie bezpośrednie rozszczepienie nici w alkilowanym Gs.

Mianowicie, aby odróżnić fałdy G4 od rozwiniętych form DNA, używamy B-1 do zbadania aptameru wiążącego trombinę (TBA), 15-merowego DNA zdolnego do przyjęcia układu G4. Reakcja guaniny reagującej na B-z B-1 daje produkty, które można rozwiązać za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości (PAGE) na poziomie pojedynczego nukleotydu poprzez lokalizację poszczególnych adduktów alkilacyjnych i rozszczepienia nici DNA w alkilowanych guaninach. Mapowanie za pomocą B-CePs jest prostym i potężnym narzędziem do charakteryzowania in vitro sekwencji DNA tworzących G-kwadrupleks, umożliwiając precyzyjną lokalizację guaniny biorących udział w tworzeniu G-tetrad.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz typowej podwójnej helisy Watsona-Cricka, kwasy nukleinowe mogą przyjmować różne struktury drugorzędowe, takie jak alternatywna forma G-quadruplex (G4), ze względu na ich bogate w guaninę sekwencje. Struktura G4 opiera się na tworzeniu płaskich tetramerów, zwanych G-tetradami, w których cztery guaniny oddziałują poprzez wiązania wodorowe Hoogsteena. G-tetrady są ułożone w stos i dalej stabilizowane przez jednowartościowe kationy, które są skoordynowane w środku rdzenia guaniny (Rysunek 1)1.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie struktury G-quadruplex. (A) Schematyczne przedstawienie G-tetrady. Układ płaski jest stabilizowany przez parowanie zasad Hoogsteena i przez kation centralny (M+). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sekwencje z czterema lub więcej przebiegami co najmniej dwóch następujących po sobie nukleotydów guaniny są potencjalnymi sekwencjami tworzącymi G-kwadrupleksy (PQS), które mogą się fałdować w strukturach G-kwadrupleksu. PQS znajdują się w wielu różnych kontekstach komórkowych, takich jak telomery, promotory genów, rybosomalne DNA i miejsca rekombinacji, i biorą udział w regulacji wielu procesów biologicznych2. W związku z tym identyfikacja i eksperymentalna walidacja G4 w ludzkim genomie, która jest obecnie przeprowadzana głównie za pomocą narzędzi obliczeniowych, jest kwestią istotną z biologicznego punktu widzenia3. W celu wsparcia przewidywań obliczeniowych lub wykrycia nieprzewidzianych struktur G4, przedstawiono tutaj dostępną metodę opartą na mapowaniu chemicznym w celu identyfikacji formacji G4 w matrycy DNA, umożliwiającą precyzyjną identyfikację guaniny tworzącej strukturę G-tetrad.

Zgłoszony test mapowania chemicznego wykorzystuje różną reaktywność bis-3-chloropiperydyn (B-) z guaninami po powstaniu struktur G4. Ze względu na ich wysoką reaktywność z nukleofilami4,5,6,7,8,9, B-CePs są środkami alkilującymi kwasy nukleinowe, które mają zdolność do bardzo efektywnej reakcji z pozycją N7 nukleotydów guaniny10. Po alkilacji następuje deprydacja i rozszczepienie nici w jedno- i dwuniciowych konstruktach DNA. Wręcz przeciwnie, guaniny biorące udział w tworzeniu G-tetrad w układach G4 są odporne na alkilowanie B-, ponieważ pozycja N7 guaniny jest zaangażowana w wiązania wodorowe Hoogsteena. Ta specyficzna reaktywność B-pozwala nie tylko na wykrycie struktur G4, ale także na identyfikację guaniny tworzących tetradę, ponieważ można je wywnioskować z ich względnej ochrony przed alkilacją w porównaniu z guaninami w jedno- i dwuniciowym DNA.

Protokół mapowania chemicznego jest tutaj opisany przy użyciu B-1 (Rysunek 2A) jako sondy do charakterystyki aptameru wiążącego trombinę (TBA), 15-merowego DNA zdolnego do przyjęcia układu G4 w obecności kationów potasu11,12. Układ G4 TBA (G4-TBA) jest bezpośrednio porównywany z dwiema kontrolami, a mianowicie TBA w postaci jednoniciowej (ssTBA) i TBA wyżarzonym do sekwencji komplementarnej w celu utworzenia konstruktu dwuniciowego (dsTBA) (Tabela 1). Produkty reakcji sondowania są rozpuszczane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości (PAGE) na poziomie pojedynczego nukleotydu poprzez lokalizację poszczególnych adduktów alkilacyjnych i rozszczepienia nici DNA na alkilowanych guaninach. Wizualizacja na żelu jest możliwa dzięki koniugacji oligonukleotydu TBA z fluoroforem na jego końcu 3' (Tabela 1). Protokół ten pokazuje, jak złożyć TBA w różnych konformacjach (G4 i kontrole) oraz jak przeprowadzić reakcje sondowania za pomocą B-, a następnie PAGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kwasu nukleinowego i sondy chemicznej

  1. Kwasy nukleinowe
    UWAGA: Oligonukleotyd o nazwie "TBA" to 15-merowa sekwencja DNA 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' znakowana na końcu 3' przez fluoroforową 5-karboksyfluoresceinę (FAM), aby umożliwić wizualizację na żelu. Nieznakowany oligonukleotyd "cTBA" jest jego komplementarną sekwencją DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA i cTBA stosuje się w celu uzyskania trzech różnych struktur, jak pokazano w tabeli 1.
    1. Końcówki do autoklawu i probówki o pojemności 0,5 ml w celu uzyskania sterylnych materiałów jednorazowego użytku i uniknięcia zanieczyszczenia.
    2. Przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając każdy oligonukleotyd w wodzie ultraczystej do końcowego stężenia 100 μM. Określić dokładne stężenie oligonukleotydów za pomocą spektrofotometru UV-Vis w ultrafiolecie, stosując współczynnik ekstynkcji przy 260 nm podany przez producenta.
      UWAGA: Współczynniki ekstynkcji: 164 300 M-1 cm-1 i 138 600 M-1 cm-1 zastosowano odpowiednio dla TBA i cTBA.
    3. Roztwory podstawowe TBA i cTBA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w tych warunkach przez wiele miesięcy).
  2. Związek B-1
    UWAGA: Związek B-1 jest syntetyzowany zgodnie z wcześniejszymi raportami6.
    1. Przygotować roztwór podstawowy B-1 o stężeniu ~10 mM. Odważyć ~1 mg liofilizowanego związku za pomocą wagi analitycznej umieszczonej w dygestorium i rozpuścić go w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Obliczyć dokładne stężenie związku na podstawie rzeczywistej ilości użytego związku i DMSO (d = 1,1 g/cm3).
      UWAGA: Z związkiem należy obchodzić się w rękawiczkach przez cały czas (zarówno po liofilizacji, jak i po rozpuszczeniu w DMSO)13,14.

Tabela 1: Struktury oligonukleotydowe użyte w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Składanie konstruktów kwasów nukleinowych

  1. Przygotowanie
    1. Przygotować roztwór buforowy BPE (kwas bifosforanowo-etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6 mM Na2HPO4, 1 mM Na2EDTA, pH 7,4) i roztwór 500 mM KCl w wodzie ultraczystej. Przefiltruj roztwory przez filtry o wielkości porów 0,22 μm.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, używaj świeżo przygotowanych roztworów. Bufor BPE może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 15 dni.
  2. Składanie próbek G4-TBA, ssTBA i dsTBA metodą ponownego składania na gorąco
    UWAGA: Kationy potasu są niezbędne do fałdowania struktury G4 (G4-TBA). Nie dodawać kationów potasu do roztworu składającego kontrolnych ssTBA i dsTBA.
    1. Przygotować 40 μL 4 μM roztworu G4-TBA w 1x BPE i 100 mM KCl. Denaturować roztwór oligonukleotydu G4-TBA poprzez podgrzanie probówki do 95 °C przez 5 minut i powoli schłodzić ją do temperatury pokojowej (RT), aby umożliwić TBA złożenie się w G-kwadrupleksy.
    2. Przygotować 40 μL 4 μM roztworu ssTBA w 1x BPE. Wykonaj procedurę ponownego składania na gorąco, jak wspomniano w kroku 2.2.1, aby złożyć TBA w postaci jednoniciowej.
    3. Przygotować 40 μl 4 μM roztworu dsTBA, mieszając równomolowe ilości TBA i cTBA w 1x BPE. Wykonaj procedurę ponownego fałdowania na gorąco, jak wspomniano powyżej (krok 2.2.1), aby TBA wyżarzał się do swojej komplementarnej sekwencji cTBA i tworzył dwuniciową formę TBA.
      UWAGA: Ostateczna objętość każdego roztworu do składania opiera się na liczbie próbek do reakcji sondowania, biorąc pod uwagę, że na każdą próbkę potrzeba 5 μl roztworu o stężeniu 4 μM. Przygotuj niewielką nadmierną objętość każdego roztworu, aby uniknąć błędów w pipetowaniu.

3. Reakcje sondowania

UWAGA: Reakcje sondowania muszą być przeprowadzone natychmiast po procedurze ponownego składania na gorąco.

  1. Gdy roztwory do składania G4-TBA, ssTBA i dsTBA ostygną do RT, należy przeprowadzić wirowanie z krótkim wirowaniem (7 000 × g przez 5-8 s w temperaturze pokojowej) i rozpocząć reakcje sondowania.
  2. Przygotuj 21 pustych probówek autoklawowanych o pojemności 0,5 ml. Uporządkuj je w trzech zestawach po siedem probówek każdy w stojaku na próbki laboratoryjne, jak podano w tabeli 2.
    UWAGA: Każdy zestaw kolumn odpowiada trzem różnym warunkom składania TBA: G4-TBA, ssTBA i dsTBA. Każdy rząd odpowiada trzem różnym czasom inkubacji. Każda komórka w kolumnie odpowiada końcowemu stężeniu sondy B-1 (tabela 2). Upewnij się, że rurki są wyraźnie oznaczone.
  3. Dodaj 3 μl ultraczystej wody do każdej probówki.
  4. Dodać 5 μl złożonego G4-TBA do każdej probówki z pierwszego zestawu (krok 3.2). Dodać 5 μl złożonego ssTBA do każdej probówki z drugiego zestawu. Dodać 5 μl złożonego dsTBA do każdej probówki z trzeciego zestawu.
  5. Rozcieńczyć roztwór podstawowy B-1 do 250 μM i 25 μM w wodzie ultraczystej.
    UWAGA: Rozcieńczenia sondy chemicznej B-1 muszą być świeżo przygotowane i natychmiast poddane reakcji z substratem DNA, aby uniknąć konkurencyjnych reakcji z wodą.
  6. Dodać do próbek 2 μl odpowiedniego rozcieńczenia B-1 (25 μM i 250 μM). Zastąp związek ultraczystą wodą w trzech próbkach kontrolnych (C) w celu analizy różnie pofałdowanych TBA pod nieobecność związku. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C.
  7. Po 1 godzinach, 4 godzinach i 15 godzinach inkubacji należy przerwać reakcję, umieszczając probówki w temperaturze -20 °C do następnego etapu.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka dni.
  8. Wysuszyć próbki w wirówce próżniowej.
    UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed przystąpieniem do analizy PAGE.

Tabela 2: Próbki do reakcji sondowania (struktury, stężenia sondy i czas inkubacji). Każdy zestaw kolumn odpowiada trzem różnym warunkom składania TBA (G4-TBA, ssTBA i dsTBA). Każdy rząd odpowiada trzem różnym czasom inkubacji (1, 4, 15 godzin). Każda komórka w kolumnie odpowiada końcowemu stężeniu sondy B-1 (5 lub 50 μM). Kontrola (C) dla każdego zestawu odpowiada próbce różnie pofałdowanych TBA inkubowanych przez dłuższy czas (15 godzin) przy braku związku. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. STRONA w wysokiej rozdzielczości

  1. Przygotowanie denaturującego roztworu poliakrylamidu
    UWAGA: Przygotuj wcześniej 500 ml 20% denaturującego roztworu żelu poliakrylamidowego. Do każdego eksperymentu zostanie użyte około 80 ml tego roztworu. Użyj butelki ze szkła oranżowego lub przykryj szklaną butelkę folią aluminiową do przechowywania roztworu w RT.
    UWAGA: Poliakryloamid jest neurotoksyczny. Podczas wszystkich etapów przygotowania i nalewania żelu należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Wyrzuć spolimeryzowany akryloamid do odpowiedniego pudełka na zanieczyszczone materiały.
    1. Odważyć 210 g mocznika w zlewce o pojemności 1 l. Dodać 250 ml 40% roztworu akrylamidu/bisakryloamidu (19/1) i 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM boranu, 20 mM EDTA, pH 8).
    2. Umieścić zlewkę na płytce mieszającej i wymieszać roztwór za pomocą mieszadła. Podczas mieszania przykryj zlewkę folią aluminiową, aby zapobiec rozpryskiwaniu i zanieczyszczeniu.
    3. Mieszać roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści, a roztwór będzie klarowny.
      UWAGA: Ten krok może potrwać wiele godzin. Aby przyspieszyć rozpuszczenie mocznika, dodaj niewielką porcję wody, nie przekraczając pożądanej objętości końcowej.
    4. Wyjmij pręt mieszający. Wlej roztwór do cylindra i dodaj wodę do dokładnej końcowej objętości 500 ml.
  2. Ustawianie aparatury żelowej
    1. Oczyść dwie płytki (jedną z karbem i jedną bez karbu) 70% etanolem, pozwól im wyschnąć, a następnie potraktuj płytki roztworem dimetylodichlorosilanu.
      UWAGA: Silanizację można pominąć, chociaż pomaga ona w uwalnianiu żelu z jednej z płytek po rozebraniu kanapki z żelem.
      UWAGA: Z roztworem silanizacyjnym należy obchodzić się w rękawiczkach i przeprowadzać obróbkę płytki tym roztworem w dygestorium.
    2. Umieść przekładki 0,4 mm wzdłuż długich krawędzi dłuższej płyty, umieść krótką płytkę na drugiej i wyrównaj dwie płytki na dole.
    3. Umieść wiele warstw taśmy papierowej wzdłuż wszystkich krawędzi z wyjątkiem góry.
    4. Aby uniknąć wycieków podczas odlewania, dodaj dodatkową warstwę taśmy na spód żelu.
    5. Przypnij boki szklanej kanapki czystymi zaciskami zgodnie z instrukcjami dostawcy (różni dostawcy używają nieco innego urządzenia, zacisków warstwowych i uszczelek).
  3. Nalewanie żelu
    UWAGA: Wlać żel do temperatury RT (25 °C), ponieważ polimeryzacja poliakrylamidu jest wrażliwa na temperaturę.
    1. Bezpośrednio przed użyciem wlać do zlewki 80 ml wcześniej przygotowanego roztworu poliakryloamidu denaturującego (krok 4.1), 450 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS) o stężeniu 10% m/V oraz 45 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
    2. Wymieszać roztwór i szybko wlać go między szklane płytki za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Wprowadź grzebień z żądaną liczbą dołków między szklane płytki, unikając pęcherzyków. W razie potrzeby dodaj roztwór żelu, aby całkowicie wypełnić kanapkę. Umieść cztery zaciski na grzebieniu, aby docisnąć i umożliwić równomierne rozprowadzenie dołków.
    3. Pozwól żelowi polimeryzować przez co najmniej 45 minut.
  4. Uruchamianie żelu
    1. Po polimeryzacji usuń wszystkie zaciski i warstwy taśmy papierowej. Powoli wyjmij grzebień i dokładnie spłucz studzienki wodą destylowaną.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami konkretnego dostawcy, aby prawidłowo umieścić kanapkę z żelem w pionowym aparacie do elektroforezy żelowej.
    3. Przygotować bufor do pracy TBE (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM boran, 2 mM EDTA, pH 8) w wodzie dejonizowanej i napełnić buforem zarówno górny, jak i dolny zbiornik.
    4. Rozgrzej płytki, wykonując wstępny przebieg elektroforezy żelowej przez co najmniej 30 minut przy mocy 50 W.
    5. Przygotować denaturujący bufor ładujący żel (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% formamidu, 50% glicerolu, 0,05% błękitu bromofenolowego) w ultraczystej wodzie.
      UWAGA: GLB pomaga śledzić przemieszczanie się próbek oligonukleotydów do systemu żelowego i umożliwia załadowanie próbek do studzienek żelu. Obecność środka denaturującego formamidu pozwala na rozdzielenie gatunków DNA w zależności od wielkości, nawet w niedenaturującym PAGE.
    6. Ponownie zawiesić wysuszone próbki (próbki z etapu 3.8) w 5 μl DGLB.
    7. Przed załadowaniem próbek należy oczyścić studzienki za pomocą małej strzykawki i buforu TBE w górnej komorze buforowej w celu usunięcia mocznika z dołków.
      UWAGA: Powtórz ten krok kilka razy, aby dokładnie wyczyścić studzienki, unikając w ten sposób pasm trudnych do interpretacji.
    8. Załaduj próbki do czystych studzienek i zanotuj kolejność ładowania.
    9. Uruchom elektroforezę żelu przez 2 godziny przy mocy 50 W lub przynajmniej do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy spłynie w 2/3 w dół żelu.
  5. Obrazowanie żelu
    1. Po elektroforezie wyłącz zasilanie, wyjmij szklaną kanapkę i wyczyść szklanki.
    2. Wykryj fluorescencję prążków oligonukleotydowych znakowanych FAM, skanując za pomocą obrazownika żelowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywny wynik przeprowadzonego testu mapowania chemicznego, zgodnie z opisem w protokole z B-1 na oligonukleotydzie TBA złożonym w trzy różne struktury. Układ G-kwadrupleksowy TBA (G4-TBA) uzyskano przez fałdowanie oligonukleotydu w BPE i w obecności kationu K+, podczas gdy jednoniciowa forma tej samej sekwencji TBA (ssTBA) była fałdowana przy braku potasu. Konstrukt dwuniciowy (dsTBA) przygotowano przez wyżarzanie TBA do jego komplementarnej sekwencji w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G-kwadrupleksy to drugorzędowe struktury kwasów nukleinowych, które zazwyczaj fałdują się w sekwencjach DNA bogatych w guaninę i są ważnymi celami badawczymi ze względu na ich związek z kontrolą genetyczną i chorobami. Mapowanie chemiczne za pomocą B-CePs jest użytecznym protokołem do charakterystyki DNA G4s, który może być wykorzystany do identyfikacji zasad guaninowych zaangażowanych w tworzenie G-tetrad w fizjologicznych warunkach solnych.

Sonda chemiczna użyta w tym protokole to B-1 (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Wydział Nauk Farmaceutycznych i Farmakologicznych Uniwersytetu w Padwie (PRIDJ-BIRD2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu 40%ZastosowanieA3658R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma AldrichA7460
Waga analitycznaMettler Toledo
Autoklawpbi międzynarodowy
Kwas borowySigma AldrichB0252
Błękit bromofenolowy Błękit brylantowy RSigma AldrichB0149
wodorofosforan sodu dwunastowodnyFluka71649
DMSOSigma Aldrich276855
Oligonukleotydy DNAZintegrowane technologie DNAsynteza niestandardowych sekwencji
EDTA disodowySigma AldrichE5134
FormamidFluka40248H351-360D-373
Obrazownik żelowyGE HealtcareSTORM B40
GlicerolSigma AldrichG5516
Mikroprobówki 0,5 mlSarstedt72.704
Chlorek potasuSigma AldrichP9541
Aparatura do sekwencjonowaniaBiometraModel S2
Roztwór silanizacyjny IFluka85126H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Fosforan sodu jednozasadowyCarlo Erba480086
Koncentrator SpeedvacThermo ScientificSavant DNA 120
TEMEDFluka87689R11-21/22-23-34
Tris-HClMERCK1.08387.2500
MocznikSigma Aldrich51456
Spektrofotometr UV-VisThermo ScientificNanodrop 1000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
  3. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
  4. Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
  5. Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
  6. Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
  7. Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
  8. Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874(2021).
  9. Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582(2022).
  10. Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
  11. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
  12. Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
  13. Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
  14. Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
  15. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  16. Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

G tetradyalkilacja DNAelektroforeza w elu poliakrylamidowymaptamer wi cy trombinjednoniciowe DNArozszczepianie nici DNAsondy kwas w nukleinowych

Powiązane artykuły