Artykuł metodologiczny

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

DOI:

10.3791/65393

⸱

21 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ limfatyczny uczestniczy w regulacji nadzoru immunologicznego, absorpcji lipidów i równowagi płynów tkankowych. Izolacja mysich komórek śródbłonka limfatycznego jest ważnym procesem dla badań limfatycznych, ponieważ umożliwia przeprowadzanie eksperymentów in vitro i biochemicznych na izolowanych komórkach. Co więcej, rozwój technologii Cre-lox umożliwił specyficzny tkankowo niedobór genów, których nie można globalnie ukierunkować, co doprowadziło do precyzyjnego określenia ich roli w badanych tkankach. Analiza roli niektórych genów w fizjologii i patofizjologii układu limfatycznego wymaga zastosowania promotorów specyficznych dla układu limfatycznego, a co za tym idzie, eksperymentalnej weryfikacji poziomów ekspresji docelowych genów.

Metody efektywnej izolacji komórek śródbłonka limfatycznego od myszy typu dzikiego lub transgenicznego umożliwiają wykorzystanie testów ex vivo i in vitro do badania mechanizmów regulujących funkcje limfatyczne i identyfikacji poziomów ekspresji badanych białek. Opracowaliśmy, ustandaryzowaliśmy i prezentujemy protokół skutecznej izolacji mysich komórek śródbłonka limfatycznego skóry (DLEC) poprzez oczyszczanie kulek magnetycznych w oparciu o ekspresję LYVE-1. Przedstawiony protokół ma na celu wyposażenie naukowców w narzędzie do lepszego zrozumienia i wyjaśnienia ważnych czynników wpływających na funkcje komórek śródbłonka limfatycznego, zwłaszcza w obiektach, w których nie jest dostępny sprzęt do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ limfatyczny odgrywa kluczową rolę w fizjologii człowieka. Jest uważany za istotny czynnik homeostatyczny, który ułatwia ważne funkcje, takie jak utrzymanie równowagi płynów tkankowo-plazmowych, nadzór immunologiczny i wchłanianie lipidów1, a także niedawno zidentyfikowane funkcje, takie jak zdolność naprawcza serca2 oraz zdolność regeneracyjna kości i hematopoezy3. Pomimo znaczącej roli układu limfatycznego, kilka aspektów roli układu limfatycznego, a także mechanizmy molekularne rządzące niektórymi parametrami fizjologicznymi i reakcjami pozostają nieuchwytne. Co więcej, ubytki naczyń limfatycznych są czynnikami wyzwalającymi lub pogarszającymi w niektórych stanach patofizjologicznych. Dobrze znanymi przykładami są obrzęki limfatyczne pierwotne i wtórne, w zależności odpowiednio od genetycznego lub niegenetycznego pochodzenia choroby, podczas gdy rola układu limfatycznego we wzroście guza pierwotnego i rozprzestrzenianiu się przerzutów jest kluczowa, ponieważ może on działać jako kanał dla przerzutów i modulator funkcji immunologicznych1.

Opóźnienie w badaniach i wiedzy o limfie w porównaniu z unaczynieniem krwi wynika głównie z późniejszego odkrycia układu limfatycznego w porównaniu z układem naczyniowym krwi i opóźnienia w identyfikacji markerów molekularnych specyficznych dla układu limfatycznego. Sytuacja uległa znacznej poprawie w ostatnich dziesięcioleciach, co doprowadziło do zmiany konwencjonalnego obrazu układu limfatycznego w stanie stacjonarnym i w stanach chorobowych1. Podobnie jak angiogeneza, limfangiogeneza polega na tworzeniu nowych naczyń limfatycznych z wcześniej istniejących i odgrywa kluczową rolę w rozwoju szerokiego spektrum chorób4,5,6. Jednak w przeciwieństwie do angiogenezy, badania limfangiogenezy ograniczały się głównie do modeli in vivo, koncentrujących się na tworzeniu naczyń rozwojowych i defektach strukturalnych w modelach patologicznych. Izolacja komórek śródbłonka limfatycznego jest istotna dla badań in vitro, a to może zapewnić przedstawiony protokół.

Opracowano kilka protokołów izolacji śródbłonka limfatycznego od myszy, które wymagają użycia sortowania komórek aktywowanego fluorescencją7. Zaletą sortownika komórek, o ile jest dostępny, jest wyższy stopień czystości, w przeciwieństwie do izolacji opartej na kulkach, przy czym ta ostatnia zapewnia wyższą wydajność. Protokół wykorzystuje ekspresję receptora hialuronowego śródbłonka limfatycznego 1 (LYVE-1), markera śródbłonka limfatycznego, ważnego dla transportu komórek w naczyniach limfatycznych4,8. Ponieważ ekspresja LYVE-1 jest ograniczona do naczyń włosowatych limfatycznych, a nie do naczyń limfatycznych zbierających, technika ta jest odpowiednia do izolacji komórek śródbłonka limfatycznego specyficznie z naczyń włosowatych limfatycznych, w przeciwieństwie do innych markerów limfatycznych, takich jak podoplanina, które ulegają ekspresji równomiernie we wszystkich komórkach śródbłonka limfatycznego9. Do protokołu wykluczono inne ważne markery limfatyczne, które nie były transbłonowe, takie jak Prox1.

Ponieważ fizjologicznym wynikiem była limfangiogeneza, która zwykle jest inicjowana w naczyniach włosowatych limfatycznych, LYVE-1 został wybrany jako cel ze względu na jego selektywność w tych komórkach i dlatego, że wybrane przeciwciało zapewniało wysoką wydajność. Użyte enzymy to kolagenaza typu II, o której ogólnie wiadomo, że jest bardziej skuteczna w dysocjacji kolagenu niż typ I10, oraz dispase, szersza proteaza, regularnie stosowana do separacji skóry właściwej i naskórka11; Zgłoszono jednak inne enzymy do separacji tkanek12,13 i mogą być stosowane. Celem tego protokołu jest opisanie metody izolacji komórek śródbłonka limfatycznego skóry z naczyń włosowatych limfatycznych dorosłych myszy z wysoką wydajnością przy użyciu magnetycznego oczyszczania kulkowego, szczególnie w miejscach, w których sortowanie komórek aktywowane fluorescencją nie jest łatwo dostępne. Metoda jest odpowiednia do zastosowań, w których czystość komórek śródbłonka limfatycznego może być zagrożona w dalszych zastosowaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Nauk o Zdrowiu Texas Tech University (TTUHSC) dla eksperymentów w TTUHSC oraz przez Administrację Weterynaryjną Prefektury Grecji Zachodniej zgodnie z Dyrektywą 2010/63 dla eksperymentów na Uniwersytecie w Patras. Należy sumiennie przestrzegać przepisów dotyczących utylizacji odpadów podczas utylizacji odpadów zwierzęcych.

1. Izolacja skóry właściwej myszy

  1. Dzień 1
    UWAGA: W dniu 1; Przygotuj następujące materiały i sprzęt: komorę anestezjologiczną, maszynkę do strzyżenia włosów zwierzęcych, izofluran, drobne kleszcze, filtry strzykawkowe 0,2 μm.
    1. Przygotuj 2 mg/ml roztwór dispazy w DMEM z 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i przefiltruj go.
      UWAGA: Użycie nośnika lub PBS może zostać zastąpione przez HBSS, ponieważ zostało ono z powodzeniem użyte w innych raportowanych protokołach12. 1x roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy można zastąpić dodatkiem penicyliny (100 j.m./ml), streptomycyny (100 μg/ml) i amfoterycyny (2,5 μg/ml).
    2. Znieczulić mysz, umieszczając ją w komorze anestezjologicznej z podawaniem izofluranu (0,5-2% izofluranu, przepływ: 1 l/min). Gdy mysz przestanie się poruszać, przenieś ją z klatki i kontynuuj znieczulenie, dostosowując stożek nosowy z podobnym przepływem izofluranu. Uszczypnij zwierzę u nogi, aby potwierdzić wystarczający poziom znieczulenia i stale monitoruj mysz, aby upewnić się, że głębokie znieczulenie jest zachowane (brak ruchliwości). Przytnij około 9cm2 futra grzbietowego i brzusznego (odpowiednio grzbiet myszy i brzuch) wzdłuż linii środkowej, używając maszynki do strzyżenia włosów. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu i wróć do klatki.
      UWAGA: Zamiast tego można użyć kremu do depilacji (depilacji). Upewnij się, że sierść została całkowicie usunięta w obszarach skóry, które mają być odizolowane, zachowując integralność skóry. Spróbuj przyciąć jak najbardziej rozległy obszar skóry. Aby upewnić się, że potencjalny stan zapalny spowodowany depilacją zostanie rozwiązany, następnego dnia należy przeprowadzić izolację komórek. Aby zwiększyć liczbę izolowanych komórek, należy zebrać od 2 do 4 myszy na grupę.
  2. Dzień 2
    UWAGA: Przygotuj następujące materiały i sprzęt: komora eutanazyjna, szafka bezpieczeństwa biologicznego, inkubator CO2, etanol, drobne nożyczki, cienkie kleszcze, kleszcze, płytka do hodowli tkankowej 100 mm, Dyspaza, DMEM, 1x roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy.
    1. Poddaj mysz eutanazji przez podanie CO2 i umieść ją w pozycji leżącej, odsłaniając przycięty obszar. Rozpyl 70% etanol jako środek dezynfekujący.
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach (w komorze bezpieczeństwa biologicznego).
    2. Umieścić sterylną płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm na lodzie.
    3. Wykonaj 0,5 cala powierzchowne nacięcie na brzuchu i przetnij wzdłużnie wzdłuż linii środkowej do szyi i dolnej części brzucha. Wykonuj boczne cięcia, aby móc otworzyć klapę skóry.
      UWAGA: Rozmiar nacięcia i izolowany obszar skóry zależą od rozmiaru myszy.
    4. Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel skórę od otaczających tkanek. Zrób to, okrążając cały tułów myszy, przecinając skórę bocznie wokół szyi i dolnej części brzucha.
    5. Ostrożnie umieść skórę na 100-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej, stroną ze skóry właściwej skierowaną w dół, utrzymując skórę tak rozciągniętą, jak to możliwe. Przykryj talerze i trzymaj je na lodzie. Zakończ izolację wszystkich myszy z grupy.
    6. Po pobraniu skóry od wszystkich myszy inkubuj płytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby spłaszczyć eksplantat.
    7. Dodać 6 ml roztworu Dispase do płytki, upewniając się, że skóra jest całkowicie zanurzona i inkubować przez noc z łagodnym mieszaniem w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zamiast Dispase można również przeprowadzić trawienie trypsyny12, a następnie leczenie liberazą zamiast kolagenazy typu II (poniżej).

2. Izolacja komórek ze skóry właściwej

  1. Dzień 3
    UWAGA: Przygotuj następujące materiały i sprzęt: wirówkę, inkubator CO2 , szafkę bezpieczeństwa biologicznego, nożyczki, DMEM, 1x roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, kolagenazę typu II, PBS, probówkę stożkową 50 ml, płytki do hodowli tkankowych 100 mm i 60 mm, roztwór DNAse I, sitka do komórek kolagenu typu I, sitka komórkowe 70 μm i 40 μm, filtry strzykawkowe 0,2 μm, podłoże LEC.
    1. Przygotuj 500 ml 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) i sterylizuj w autoklawie przez 20 minut przy 15 psi lub sterylizuj filtrem. Alternatywnie użyj dostępnego w handlu sterylnego PBS.
    2. Przygotuj 10 ml roztworu kolagenazy typu II o sile 2 mg / ml w DMEM z 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i przefiltruj go.
      UWAGA: Kolejne kroki należy wykonać pod sterylnym kapturem, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia próbki.
    3. Użyj pipety, aby usunąć płyn z naczynia.
    4. Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę właściwą (spód skóry) od naskórka (góra) i usunąć widoczną tkankę tłuszczową. Przenieś skórę właściwą na czystą płytkę do hodowli tkankowej.
    5. Dodaj 1 ml DMEM z 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym do czystej płytki do hodowli tkankowej i przechyl ją tak, aby płyn gromadził się po jednej stronie płytki.
    6. Zmiel skórę właściwą na1-2 mm 2 kawałki i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Ten etap najlepiej wykonać w ciągu 4-5 minut, ponieważ oczekuje się, że dłuższe przetwarzanie nie zapewni wyższej wydajności ani przeżycia komórek.
    7. Dodać 10 ml roztworu kolagenazy typu II.
    8. Dodać 50 μl (25 jednostek/ml roztworu) roztworu DNAzy I (zmniejsza zlepianie się komórek) i trawić roztwór skóry właściwej przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z ciągłym mieszaniem (użyć inkubatora obrotowego/wstrząsającego przy 30-50 obr./min).
      UWAGA: Sprawdzaj okresowo, czy większość skóry właściwej została strawiona. Jeśli nie, zwiększ czas trawienia (maksymalnie 1 dodatkowa godzina) i prędkość mieszania, jeśli to możliwe.
    9. Pokryj 60 mm płytki do hodowli tkankowych 2 ml 10 μg/ml kolagenu typu I w 0,02 M kwasie octowym przez >20 min w temperaturze 37 °C. Przemyć 2x sterylnym PBS.
    10. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm i odwirować przy 250 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    11. Zawiesić w 10 ml DMEM z 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
    12. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek o wielkości 40 μm i odwirować przy 250 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    13. Zawiesić w 1 ml kompletnego podłoża LEC (Endothelial Cell Growth Base Medium z suplementem).
    14. Umieść komórki na pokrytej kolagenem płytce do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm w kompletnym pożywce LEC. To będzie dzień 0 hodowli komórkowej.
    15. Wymieniaj pożywkę co 2 dni, myjąc ogniwa dwukrotnie 1x PBS i dodając świeże podłoża LEC.
    16. Powtarzaj krok 2.1.15, aż komórki będą zlewać się w 80-90%.
      UWAGA: Jeśli oczyszczanie zostanie przeprowadzone, zanim komórki zlewają się w 80-90%, zostanie wyizolowanych mniej komórek śródbłonka limfatycznego. Proces ten trwa około 7 do 10 dni.

3. Powłoka z kulki magnetycznej przeciwciałem LYVE-1

UWAGA: Dzień przed etapem oczyszczania, przygotuj następujące materiały i sprzęt: Lodówka 4 °C, Rotor, separator magnetyczny, PBS, kulki magnetyczne anty-królikowe IgG, probówki do mikrowirówek, filtry strzykawkowe 0,2 μm, roztwór do powlekania kulkami magnetycznymi, przeciwciało LYVE-1.

  1. Przygotuj roztwór do powlekania kulkami magnetycznymi: 20 ml PBS z 0,1% BSA i 2 mM EDTA i przefiltruj go-wysterylizuj. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie zaleca się przechowywania dłuższego niż kilka dni; Przed użyciem sprawdź, czy nie ma osadów lub zanieczyszczeń.
  2. Odpipetować 500 μl kulek magnetycznych anty-króliczych IgG do probówki mikrowirówkowej i dodać 1 ml lodowatego roztworu do powlekania kulkami magnetycznymi.
  3. Użyj separatora magnetycznego do umycia koralików.
  4. Powtórz pranie 2x z 1 ml lodowatego roztworu do powlekania kulkami magnetycznymi.
  5. Zawiesić kulki w 500 μl roztworu do powlekania kulkami magnetycznymi i zrobić porcje 150 μl w probówkach do mikrowirówek.
  6. Dodać 15 μg przeciwciała LYVE-1 do każdej probówki (15 μl z 1 mg/ml stężenia podstawowego przeciwciała).
  7. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z ciągłym mieszaniem.

4. Oczyszczanie komórek śródbłonka limfatycznego

UWAGA: Przygotuj następujące materiały i sprzęt: inkubator CO2, wytrząsarka, timer, parafilm, DMEM, 1x Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, BSA, PBS, Roztwór do powlekania kulkami magnetycznymi, trypsyna-EDTA, płytki do hodowli tkankowej 100 mm lub 60 mm, filtry strzykawkowe 0,2 μm, Kolagen typu I, Kwas octowy, podłoże LEC.

  1. Przygotuj 50 ml DMEM z 1x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i 0,1% BSA i przefiltruj go i wysterylizuj.
  2. Pokryj 60 mm płytki do hodowli tkankowych 10 μg/ml kolagenu typu I w 0,02 M kwasie octowym przez >20 min w temperaturze 37 °C. Przemyć 2x sterylnym PBS.
  3. Umyj wstępnie powlekane kulki 1 ml roztworu do powlekania kulek magnetycznych za pomocą separatora magnetycznego.
  4. Zawiesić kulki w 150 μl DMEM z 0,1% BSA.
    UWAGA: Koraliki można teraz przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  5. Umyj komórki 2x PBS.
  6. Dodać 3 ml DMEM z 0,1% BSA (dla płytki do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm) i 50 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami do komórek.
    UWAGA: Jeśli komórki dwóch lub więcej myszy są połączone, użyj płytki do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i dodaj 6 ml DMEM z 0,1% BSA.
  7. Uszczelnij naczynie parafilmem.
  8. Umieść naczynie na wytrząsarce mieszającej z prędkością 10 obr./min w temperaturze mokrej i inkubuj dokładnie przez 10 minut.
    UWAGA: Dłuższa inkubacja spowoduje niespecyficzne wiązanie. Aby upewnić się, że koraliki wchodzą w interakcję z całą powierzchnią płyty, ręcznie obracaj płytkę co kilka minut, gdy nadal się trzęsie.
  9. Wyrzuć pożywkę i przemyj komórki raz PBS. Szybko sprawdź komórki, aby zweryfikować obecność kolonii LEC na płytce.
  10. Trypsynizacja komórek: użyć 1 ml trypsyny-EDTA i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Sprawdź komórki pod kątem pomyślnego odłączenia komórek.
  11. Zneutralizować roztwór za pomocą 2 ml kompletnej pożywki LEC i przenieść roztwór do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml.
  12. Za pomocą separatora magnetycznego umyj komórki 4 x 3 ml DMEM z 0,1% BSA w celu usunięcia niezwiązanych komórek.
  13. Ponownie zawiesić pozostałe komórki związane z kulkami w kompletnych pożywkach LEC i płytkach na wcześniej pokrytych kolagenem płytkach do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm.
  14. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i zmieniać pożywkę co drugi dzień po każdym przemyciu dwoma PBS.
  15. Hoduj komórki, aż osiągną zbieg (zwykle trwa to od 7 do 10 dni).
  16. W tym momencie sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem zbieżności i przystąp do przygotowania komórek do cytometrii przepływowej. Jeśli zostanie zidentyfikowany wysoki procent F4/80+, powtórz etap oczyszczania z LYVE-1 (Krok 4: Oczyszczanie komórek śródbłonka limfatycznego) ponownie lub najlepiej z innym markerem limfatycznym (tj. podoplaniną14).
    UWAGA: Wykazano wysoką ekspresję białka, do którego dąży przeciwciało, w populacji komórek oczyszczonych kulkami magnetycznymi15,16. Jednak w przypadku LYVE-1 ważne jest przeprowadzenie kontroli cytometrii przepływowej w celu identyfikacji odsetka innych komórek LYVE-1+, głównie makrofagów. LYVE-1 ulega ekspresji tylko w podzbiorach makrofagów, które są związane z nowotworami i ranami, podczas gdy w zdrowej skórze ekspresja LYVE-1 jest bardziej ograniczona do komórek śródbłonka limfatycznego17. W związku z tym badanie przesiewowe F4/80 nie jest obowiązkowe, ale raczej zależy od kontekstu eksperymentalnego. Myszy użyte do demonstracji nie miały guzów ani ran, a jedynie potencjalny stan zapalny spowodowany depilacją, ale uwzględniliśmy barwienie F4 / 80 jako punkt odniesienia dla procentu makrofagów LYVE-1 +.

5. Cytometria przepływowa

UWAGA: Przygotuj następujące materiały i sprzęt: wirówka, inkubator CO2, timer, hemocytometr, roztwór EDTA, 1x Antybiotyk-Roztwór Przeciwgrzybiczy, BSA, PBS, trypsyna-EDTA, probówki polipropylenowe, filtry strzykawkowe 0,2 μm, 70% etanol, przeciwciało sprzężone z FITC F4/80

.
  1. Przygotować PBS zawierający 0,1% BSA i wysterylizować go metodą filtracyjną.
  2. Przygotować 1 mM roztwór EDTA w PBS.
  3. Trypsynizować komórki: inkubować komórki z 1 ml 1 mM roztworu EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Inkubacja z roztworem EDTA jest łagodniejszą metodą odrywania komórek, która lepiej zachowuje białka transbłonowe i jest preferowana, ale wymaga dłuższych okresów inkubacji. Alternatywnie, roztwór trypsyny-EDTA może być używany do 1-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C, ale może to wpływać na powinowactwo przeciwciał do zastosowań cytometrii przepływowej.
  4. Zneutralizować roztwór za pomocą 2 ml kompletnej pożywki LEC i przenieść roztwór do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml.
  5. Odwirować próbki o masie 250 × g przez 5 minut.
  6. Umyć PBS.
  7. Powtórz wirowanie i płukanie PBS.
  8. Ponownie zawiesić komórki w PBS zawierające 0,1% BSA i policzyć je za pomocą hemocytometru lub metody alternatywnej. Porcja ~1 × 106 komórek do probówek polipropylenowych o końcowej objętości 100 μl. Począwszy od tego etapu, wszystkie kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Komórki można utrwalić przed barwieniem lub zabarwić za życia. Utrwalenie może być nieoptymalne dla cytometrii przepływowej, ponieważ niektóre przeciwciała mogą nie wykrywać antygenów po utrwaleniu; Dlatego zalecamy przeprowadzenie cytometrii przepływowej natychmiast po poprzednim kroku i pominięcie etapu fiksacji. Jeśli nie jest to możliwe, fiksacja przed eksperymentem z cytometrią przepływową pozwoli na opóźnienie etapu cytometrii przepływowej. Jeżeli ma być przeprowadzone utrwalenie, należy wcześniej ocenić działanie przeciwciał w kontekście utrwalonych komórek.
  9. Wykonaj utrwalanie (krok opcjonalny; jeśli komórki nie mają być utrwalone, przystąp do barwienia immunologicznego): ponownie zawieś komórki w lodowatym 70% etanolu i delikatnie mieszaj przez 10 minut na lodzie.
    UWAGA: Utrwalanie etanolu może przenikać przez komórki i prowadzić do uwolnienia GFP; Jednak utrwalanie na bazie paraformaldehydu może niszczyć barwniki używane w cytometrii przepływowej i najlepiej tego unikać.
  10. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Płukać komórki 2x przez odwirowanie w ilości 250 × g przez 5 minut w 1x PBS.
  12. Przejdź do następnego kroku lub ponownie zawieś komórki w 0,5-1 ml 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C.

6. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Z komórkami należy obchodzić się delikatnie i unikać nadmiernego pipetowania, jeśli to możliwe, aby zachować integralność błony komórkowej i zminimalizować śmierć komórki, upewniając się, że komórki nie tworzą grudek. Z wyizolowanych komórek śródbłonka przygotuj następujące grupy: komórki niebarwione i komórki barwione innym markerem komórek śródbłonka (tj. VEGFR3, podoplaniną), F4/80 i oba. Włączenie dostępnych w handlu komórek śródbłonka limfatycznego myszy i makrofagów, jeśli są dostępne, jako kontrole pozytywne. W celach demonstracyjnych i ze względu na endogenną fluorescencję tdTomato (PE+) zastosowaliśmy barwienie F4/80 sprzężone z FITC.

  1. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS 0,1% BSA zgodnie z zalecanym lub zoptymalizowanym rozcieńczeniem. Dodać 0,5 μg (1 μl roztworu przeciwciała) przeciwciała sprzężonego z F4/80 FITC do 100 μl zawiesiny komórkowej.
  2. Zawiesić komórki po dodaniu rozcieńczonego przeciwciała sprzężonego z fluorem. Wymieszaj, przesuwając rurkę polipropylenową, aby upewnić się, że nie ma grudek, a wszystkie komórki są odpowiednio pokryte.
  3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (komórki stałe) lub 30 minut na lodzie (żywe komórki) w ciemności.
  4. Umyć komórki 2x, odwirowując je w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (dla żywych komórek) lub w temperaturze pokojowej (dla komórek stałych), używając PBS z 0,1% BSA w ciemności.
  5. Dla przeciwciał niesprzężonych fluorescencyjnie
    1. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorochromem w buforze inkubacyjnym. W przypadku przeciwciał Alexa Flour należy użyć rozcieńczenia 1:500.
    2. Dodać przeciwciało drugorzędowe do 100 μl roztworu zawiesiny komórkowej.
    3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (komórki stałe) lub na lodzie (żywe komórki).
    4. Przemyć dwukrotnie przez odwirowanie w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (dla żywych komórek) lub w temperaturze pokojowej (dla komórek stałych) w buforze inkubacyjnym.
  6. Zawieś komórki w 0,5 ml 1x PBS i przeanalizuj je za pomocą cytometru przepływowego.
  7. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami strategii bramkowania, aby zidentyfikować populację makrofagów w komórkach eksprymujących LYVE-1:
    1. Rozważ rozpraszanie do przodu i na boki, aby odróżnić populację komórkową.
    2. Rozważ rozproszenie do przodu dla rozmiaru, obszaru i wysokości komórki, aby odróżnić pojedyncze komórki (singlety).
    3. Weź pod uwagę ekspresję F4 / 80 (FITC) i ekspresję RFP (PE) w celu identyfikacji makrofagów (F4 / 80 +) w izolowanych komórkach mysich z ekspresją tdTomato (PE) (ze względu na obecność fluorescencyjnego reportera tdTomato u określonych myszy, opisanych poniżej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda została opracowana w celu identyfikacji ekspresji białka małej GTPazy, RhoA, której gen kodujący został zablokowany w obu allelach i usunięty pod wpływem indukowanego tamoksyfenem promotora specyficznego dla śródbłonka limfatycznego Prox1-CreERT2 18. Wyizolowane LEC mogą być hodowane przez maksymalnie cztery pokolenia, po czym stają się stare. Zostały zamrożone, rozmrożone i skutecznie stymulowane angiopoetyną-2. Ze względu na ograniczoną liczbę pasaży komórkowych nie pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ limfatyczny jest ważnym regulatorem homeostatycznej funkcji organizmu, a najważniejszymi funkcjami są utrzymanie płynnego osocza, usuwanie produktów ubocznych metabolizmu komórkowego i toksycznych cząsteczek, wchłanianie lipidów i transport komórek odpornościowych 1,19. Identyfikacja odpowiednich markerów spowodowała gwałtowny napływ nowych danych w dziedzinie limfy, ujawniając nowe funkcje naczyń limfatycznych, takie jak ich rola w naprawie i zdolności reg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences grant (dla C.M.M.), oraz przez College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up funding, National Institutes of Health (NIH) za pośrednictwem National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] oraz Podprogram Konkurencyjności Badawczej (RCS) Rady Regentów Luizjany za pośrednictwem Funduszu Wsparcia Rady Regentów (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (do GM). Powszechnie używany sprzęt TTUHSC został uzyskany dzięki grantom Instytutu Badań nad Rakiem w Teksasie (CPRIT) w RP190524 i RP200572. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, podejmowaniu decyzji o napisaniu lub przygotowaniu manuskryptu. Abstrakt graficzny na rysunku 1A został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m Filtry strzykawkoweFisher Scientific09-719C
100 mm Naczynia do kultur tkankowychFisher ScientificFB012924
60 mm Naczynia do hodowli tkankowychFisher ScientificFB012921
Maszynka do strzyżenia włosów dla zwierzątWahl
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy 100xFisher Scientific15240-062
kleszczeFine Science Tools11992-20
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4919
Sitko komórkowe 40 μ mFisher Scientific542040
Sitko do komórek 70 μ mFisher Scientific542070
Inkubator
Kolagen I, Wysokie stężenie Rogowanie ogona szczura354249rozcieńczone w 0,02 M Kwas octowy w H2O
Kolagenaza typu IILife Technologies17101-015
Technologie Trwałości Spazy17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
Roztwór DNAzy I (2,500 U/ml)Thermo Scientific90083
Magnetyczny koncentrator cząstek Dynal MPC-LInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Podłoże bazowe do wzrostu komórek śródbłonka i Suplement (podłoże LEC)R& D SystemsCCM027
Komora eutanazyjnaEuthanex Corporation
Drobne kleszczeNarzędzia do nauki11255-20
Drobne nożyczki-ostrenarzędzia naukowe14060-10
FITC anty-mysie przeciwciało F4/80Biolegend123107
Koza Anty-królicze IgG Koraliki magnetyczneNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anestezjologiczna komora indukcyjnaEuthanex Corporation
MagnaBind Kozioł Anty-królicze kulki IgGThermo Scientific21356
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Królik Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
obrotowo-wstrząsowy
Okrągłe dno Rurki polipropylenoweCorning352063
Filtry strzykawkowe w 0,2 i mu; m PoryFisher Scientific09-719C
Trypsyna-EDTAFisher Scientific25-300-120
CO2Inkubator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319(2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464(2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725(2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063(2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497(2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

limfatyczne kom rki r db onkaizolacja z sk ry mysiejoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychekspresja LYVE1sk rne naczynia limfatycznetrawienie kolagenazp ytka do hodowli kom rkowejmyszy transgenicznefiltracja przez sito kom rkowetrypsynizacja

Powiązane artykuły