Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

DOI:

10.3791/65414

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane genomiczne mogą być wykorzystywane do śledzenia transmisji i geograficznego rozprzestrzeniania się chorób zakaźnych. Jednak zdolność sekwencjonowania wymagana do nadzoru genomicznego pozostaje ograniczona w wielu krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), w których wścieklizna przenoszona przez psy i/lub wścieklizna przenoszona przez dzikie zwierzęta, takie jak nietoperze wampiry, stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i gospodarki. Przedstawiamy tutaj szybki i przystępny cenowo przepływ pracy od próbki, sekwencji i interpretacji przy użyciu technologii nanoporów. Pokrótce opisano protokoły pobierania próbek i diagnozowania wścieklizny, a następnie szczegółowo opisano zoptymalizowany przebieg sekwencjonowania całego genomu, w tym projektowanie starterów i optymalizację reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej (PCR), zmodyfikowane, tanie przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, sekwencjonowanie z wywoływaniem bazy na żywo i offline, oznaczanie linii genetycznej i analizę filogenetyczną. Zademonstrowano implementację przepływu pracy i podkreślono kluczowe kroki dla wdrożenia lokalnego, takie jak walidacja rurociągu, optymalizacja starterów, włączenie kontroli ujemnych oraz wykorzystanie publicznie dostępnych danych i narzędzi genomicznych (GLUE, MADDOG) do klasyfikacji i umieszczenia w filogenezie regionalnej i globalnej. Czas realizacji przepływu pracy wynosi 2-3 dni, a koszt waha się od 25 USD za próbkę w przypadku 96 prób do 80 USD za próbkę w przypadku 12 próbek. Dochodzimy do wniosku, że ustanowienie nadzoru genomowego nad wirusem wścieklizny w krajach o niskich i średnich dochodach jest wykonalne i może przyczynić się do postępu w kierunku globalnego celu, jakim jest zerowa liczba zgonów ludzi z powodu wścieklizny za pośrednictwem psów do 2030 r., a także ulepszone monitorowanie rozprzestrzeniania się wścieklizny dzikich zwierząt. Co więcej, platformę można dostosować do innych patogenów, pomagając w budowaniu wszechstronnych zdolności genomicznych, które przyczyniają się do gotowości na wypadek epidemii i pandemii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus wścieklizny (RABV) to lyssawirus z rodziny Rhabdoviridae, który powoduje śmiertelną chorobę neurologiczną u ssaków1. Chociaż wściekliźnie można w 100% zapobiec poprzez szczepienia, pozostaje ona poważnym problemem zdrowia publicznego i gospodarki w krajach endemicznych. Szacuje się, że spośród 60 000 zgonów ludzi z powodu wścieklizny, ponad 95% ma miejsce w Afryce i Azji, gdzie psy są głównym rezerwuarem2. W przeciwieństwie do tego, szczepienia psów doprowadziły do wyeliminowania wścieklizny wywoływanej przez psy w Europie Zachodniej, Ameryce Północnej i dużej części Ameryki Łacińskiej. W tych regionach rezerwuary wścieklizny są teraz ograniczone do dzikich zwierząt, takich jak nietoperze, szopy pracze, i dzikie psowate3. W całej Ameryce Łacińskiej nietoperz wampir jest problematycznym źródłem wścieklizny ze względu na regularne przenoszenie się z nietoperzy zarówno na ludzi, jak i zwierzęta gospodarskie podczas nocnego karmienia krwią4. Szacuje się, że roczny globalny wpływ ekonomiczny wścieklizny wynosi 8,6 miliarda dolarów, przy czym straty w inwentarzu żywym stanowią 6%5.

Dane sekwencji patogenów wirusowych w połączeniu z metadanymi na temat czasu i źródła infekcji mogą dostarczyć solidnych informacji epidemiologicznych6. W przypadku RABV sekwencjonowanie zostało wykorzystane do zbadania pochodzenia ognisk choroby7,8, zidentyfikuj powiązania gospodarza z dzikimi zwierzętami lub psami domowymi8,9,10,11,12, oraz źródła śledzenia przypadków u ludzi13,14. Badania epidemii z wykorzystaniem analizy filogenetycznej wykazały, że wścieklizna pojawiła się w prowincji Bali, która była wcześniej wolna od wścieklizny, w Indonezji, poprzez pojedyncze wprowadzenie z pobliskich endemicznych obszarów Kalimantan lub Sulawesi15. Tymczasem na Filipinach udowodniono, że wybuch epidemii na wyspie Tablas w prowincji Romblon został wprowadzony z głównej wyspy Luzon16. Dane genomiczne wirusów wykorzystano również do lepszego zrozumienia dynamiki przenoszenia patogenów, która jest niezbędna do geograficznego ukierunkowania środków kontroli. Na przykład charakterystyka genomiczna RABV ilustruje geograficzne grupowanie kladów17,18,19, co-circulation of lineages20,21,22, ludzki ruch wirusowy17,23,24, oraz Dynamika metapopulacji25,26.

Monitorowanie chorób to jedna z ważnych funkcji nadzoru genomicznego, która została wzmocniona wraz z globalnym wzrostem zdolności sekwencjonowania w odpowiedzi na pandemię SARS-CoV-2. Nadzór genomiczny umożliwił śledzenie w czasie rzeczywistym wariantów SARS-COV-2 budzących obawy27,28 i powiązane środki zaradcze6. Postępy w dostępnej technologii sekwencjonowania, takie jak technologia nanoporowa, doprowadziły do powstania ulepszonych i bardziej przystępnych cenowo protokołów szybkiego sekwencjonowania zarówno human29,30,31,32 i animal33,34,35 Patogenów. Jednak w wielu krajach endemicznych dla wścieklizny nadal istnieją bariery utrudniające operacjonalizację nadzoru genomowego patogenów, o czym świadczą globalne dysproporcje w zdolności sekwencjonowania SARS-CoV-236. Ograniczenia w infrastrukturze laboratoryjnej, łańcuchach dostaw i wiedzy technicznej sprawiają, że ustanowienie i rutynizacja nadzoru genomicznego jest wyzwaniem. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób zoptymalizowany, szybki i niedrogi przepływ pracy sekwencjonowania całego genomu można wdrożyć do nadzoru RABV w warunkach ograniczonych zasobów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Koordynacyjny ds. Badań Medycznych Narodowego Instytutu Badań Medycznych (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), Ministerstwo Administracji Regionalnej i Samorządu Lokalnego (AB.81/288/01) oraz Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Instytutu Zdrowia Ifakara (IHI/IRB/No:22-2014) w Tanzanii; Instytut Chorób Tropikalnych i Zakaźnych Uniwersytetu w Nairobi (P947/11/2019) oraz Kenijski Instytut Badań Medycznych (KEMRI-SERU; protokół nr 3268) w Kenii; oraz Instytut Badawczy Medycyny Tropikalnej (RITM), Departament Zdrowia (2019-023) na Filipinach. Sekwencjonowanie próbek pochodzących z Nigerii przeprowadzono na archiwalnym materiale diagnostycznym zebranym w ramach krajowego nadzoru.

UWAGA: Sekcja 1-4 to wymagania wstępne. Sekcja 5-16 opisuje przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji dla sekwencjonowania nanoporowego RABV (Rysunek 1). W przypadku kolejnych kroków w protokole, które wymagają wirowania impulsowego, należy odwirować przy 10-15 000 x g przez 5-15 s.

1. Konfiguracja środowiska obliczeniowego do sekwencjonowania i analizy danych

  1. Otwórz stronę internetową Oxford Nanopore Technology (ONT)37 i utwórz konto, aby uzyskać dostęp do zasobów specyficznych dla nanoporów.
    1. Zaloguj się i zainstaluj oprogramowanie do sekwencjonowania i basecallingu ONT38.
  2. Otwórz GitHub39 i utwórz konto.
    1. Przejdź do repozytoriów artic-rabv40 i MADDOG41 i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji.

2. Projektowanie lub aktualizacja schematu podkładu multipleksu

UWAGA: Istniejące schematy RABV są dostępne w repozytorium artic-rabv40. W przypadku ukierunkowania na nowy obszar geograficzny należy opracować nowy schemat lub zmodyfikować istniejący schemat w celu uwzględnienia dodatkowej różnorodności.

  1. Należy wybrać zestaw referencyjny genomu, który będzie reprezentował różnorodność w badanym obszarze; zazwyczaj jest to zestaw publicznie dostępnych sekwencji (np. z NCBI GenBank) lub wstępnych danych wewnętrznych. Wykonaj krok 2.1.1, aby użyć RABV-GLUE42, zasobu danych sekwencji RAPV, do filtrowania i pobierania sekwencji NCBI i powiązanych metadanych.
    UWAGA: Wybierz sekwencje referencyjne z kompletnymi genomami (tj. bez przerw i zamaskowanych zasad). Zaleca się wybranie do 10 sekwencji jako zestawu referencyjnego do projektowania podkładu. Jeśli dostępne dane sekwencyjne są niekompletne lub niereprezentatywne dla badanego obszaru, należy zapoznać się z advice43,44,45 w pliku uzupełniającym 1.
    1. Przejdź do strony NCBI RABV Sequences by Clade z menu rozwijanego Dane sekwencji w RABV-GLUE. Kliknij łącze Wirus wścieklizny (RABV), aby uzyskać dostęp do wszystkich dostępnych danych lub wybrać konkretny klad zainteresowania. Użyj opcji filtrowania, aby dodać filtry, które spełniają żądane kryteria (np. kraj pochodzenia, długość sekwencji). Pobieranie sekwencji i metadanych.
  2. Wygeneruj schemat startera dla multipleksowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez Primal Scheme46. Schemat 400 pz z nakładaniem się 50 pz jest zalecany do sekwencjonowania próbek o niskiej jakości. Pobierz i zapisz wszystkie dane wyjściowe (nie edytuj nazw plików ani starterów).
    UWAGA: Schemat zostanie zindeksowany do pierwszej sekwencji w pasku wejściowym, zwanym dalej "odniesieniem do indeksu" (Rysunek 2). Zobacz Plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z opcjami optymalizacji wydajności podkładu.

3. Konfiguracja potoków bioinformatycznych RAMPART i ARTIC

  1. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 2, aby skonfigurować strukturę katalogów do zarządzania plikami wejściowymi/wyjściowymi dla RAMPART i potoku bioinformatycznego ARTIC.

4. Bezpieczeństwo biologiczne i konfiguracja laboratorium

  1. Z próbkami potencjalnie dodatnimi w kierunku wścieklizny należy obchodzić się w warunkach 2 lub 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL).
  2. Upewnij się, że personel laboratoryjny ukończył przedekspozycyjne szczepienie przeciwko wściekliźnie i przeszedł monitorowanie odporności zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)3.
  3. Upewnij się, że w laboratorium obowiązują specjalne standardowe procedury operacyjne i oceny ryzyka, zgodne z krajowymi lub międzynarodowymi wytycznymi.
  4. Wymagana konfiguracja laboratorium: Zminimalizuj zanieczyszczenie, zachowując fizyczną separację między obszarami przed i po PCR. W laboratoriach o ograniczonej przestrzeni lub w warunkach laboratoryjnych w terenie należy używać przenośnych komór rękawicowych lub prowizorycznych stanowisk laboratoryjnych, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  5. W niniejszym protokole należy zapewnić wyznaczenie oddzielnych obszarów dla:
    1. Ekstrakcja próbki: Skonfiguruj szafkę/schowek BSL2/3 do obsługi materiału biologicznego i przeprowadzenia inaktywacji i ekstrakcji RNA.
    2. Obszar szablonu: Skonfiguruj szafkę/schowek BSL1 w celu dodania matrycy (RNA/cDNA) do wstępnie przygotowanej mieszanki wzorcowej reakcji.
    3. Obszar mieszania głównego: Ustaw wyznaczony obszar czysty (szafka BSL1/schowek na rękawiczki) do przygotowania głównych mieszanek odczynników. W tym obszarze nie powinno być żadnego szablonu.
    4. Obszar po PCR: Stwórz osobny obszar do pracy nad amplikonami i przygotowaniem biblioteki sekwencjonowania.
      UWAGA: Wszystkie obszary należy oczyścić powierzchnią środkiem odkażającym i wysterylizować ultrafioletem (UV) przed i po użyciu.

5. Pobieranie próbek w terenie i diagnoza

UWAGA: Próbki muszą być pobierane przez przeszkolony i zaszczepiony personel, noszący środki ochrony osobistej i przestrzegający wspomnianych standardowych procedur47,48,49.

  1. Pobrać próbkę przez otwór wielki (tj. drogę potyliczną), jak szczegółowo opisano w Mauti et al.50.
  2. Diagnozuj wściekliznę w terenie za pomocą szybkich testów diagnostycznych i potwierdź w laboratorium, stosując zalecane procedury47, takie jak bezpośredni test fluorescencyjny przeciwciał (DFA), bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT)51,52, lub odwrotna transkrypcja w czasie rzeczywistym (RT)-PCR53.
  3. Do ekstrakcji RNA należy użyć potwierdzonych dodatnich próbek mózgu lub przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez 2-3 miesiące lub -80 °C przez dłuższy czas. Zachowaj RNA do przechowywania i transportu przy użyciu odpowiedniej pożywki stabilizującej DNA/RNA.

6. Przygotowanie próbki i ekstrakcja RNA (3 h)

UWAGA: Użyj zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA opartego na kolumnie wirowej, odpowiedniego dla typu próbki.

  1. Przygotuj dwie probówki z kulkami ceramicznymi, wypełniając probówkę PCR o pojemności 2 ml probówką o pojemności około 200 μl wypełnioną kulkami ceramicznymi o średnicy 1,4 mm i oznacz probówkę.
  2. Dodaj zalecaną objętość buforu do lizy znajdującą się w zestawie do ekstrakcji RNA do oznakowanej probówki PCR.
  3. Za pomocą drewnianego aplikatora pobrać około 3-milimetrową kostkę z próbki mózgu, w której potwierdzono zakażenie wścieklizną, i umieścić w oznakowanej probówce z identyfikatorem próbki i 100 μl wody wolnej od nukleaz do probówki z napisem kontrola negatywna.
    UWAGA: Użyj homogenizacji opartej na kulkach w zamkniętej probówce, aby ograniczyć ekspozycję próbki. Jeśli nie jest to możliwe, użyj innych odpowiednich mechanicznych urządzeń zakłócających (np. na bazie wirnika) lub ręcznego mikrotłuczka. Mogą one być jednak mniej skuteczne niż uderzanie kulkami w twardą powierzchnię w celu rozerwania tkanki (próbki tkanek mogą stwardnieć w niektórych nośnikach pamięci).
  4. Rozbij tkankę mózgową ręcznie za pomocą drewnianego aplikatora w sztyfcie, a następnie wiruj z maksymalną prędkością, aż do uzyskania całkowitej homogenizacji tkanki.
  5. Odwirować lizat zgodnie z instrukcjami producenta i za pomocą pipety przenieść supernatant do nowej, oznakowanej probówki do mikrowirówki. Tego supernatantu należy używać wyłącznie w kolejnych krokach.
  6. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi kolumny wirowej zestawu do ekstrakcji RNA, aby uzyskać oczyszczony RNA.
  7. Uwzględnij tutaj ujemną kontrolę ekstrakcji (NEC) i przejdź aż do etapu sekwencjonowania.

7. przygotowanie cDNA (20 min)

  1. W obszarze mieszaniny wzorcowej przygotować mieszaninę wzorcową do syntezy pierwszej nici cDNA zgodnie z liczbą próbek i prób kontrolnych, które mają być przetworzone (z nadmiarem 10% objętości w celu zapewnienia odpowiedniego odczynnika; Tabela 1). Na tym etapie należy uwzględnić kontrolę bez szablonu (NTC).
  2. Oznaczyć 0,2 ml probówek z paskiem PCR i podać 5 μl mieszanki wzorcowej do probówek.
  3. Zabierz przygotowane probówki do obszaru szablonu. Dodaj 5 μl RNA do każdej znakowanej probówki, w tym NEC. Dodać 5 μl wody wolnej od nukleaz (NFW) do NTC.
  4. Inkubować w termocyklerze zgodnie z warunkami wymienionymi w tabeli 1.
    UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca, jeśli to konieczne, ale preferowane jest przejście do PCR.

8. Przygotowanie podkładu (1 h)

UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko w przypadku tworzenia nowych zapasów z pojedynczych starterów, po czym można użyć wstępnie przygotowanych roztworów podstawowych.

  1. Przygotować pulę starterów składającą się z 100 μM zapasu w obszarze mieszanki wzorcowej.
  2. Zawiesić liofilizowane startery w 1x buforze tris-EDTA (TE) lub NFW w stężeniu 100 μM każdy. Dokładnie odwiruj i odwiruj w dół.
    UWAGA: W poniższych krokach poszczególne startery są rozdzielane na dwie pule starterów - nieparzyste (nazwane Pool A) i parzyste (nazwane Pool B) - aby uniknąć interakcji między starterami flankującymi nakładanie się amplikonów. Te pule starterów generują nakładające się na siebie amplikony 400 pz obejmujące genom docelowy.
  3. Ułóż wszystkie podkłady o numerach nieparzystych w stojaku na tuby. Wygeneruj zapas startera, dodając 5 μl z każdej startera do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej "nazwa schematu startera - Pool A (100 μM)".
  4. Powtórz ten proces dla wszystkich starterów o numerach parzystych i oznacz jako "nazwa schematu podkładu - Pula B (100 μM)".
  5. Rozcieńczyć każdą pulę starterów w stosunku 1:10 w wodzie molekularnej, aby wytworzyć 10 μM zapasów starterów.
    UWAGA: Wykonać wiele porcji 10 μM rozcieńczeń startera i zamrozić je w przypadku degradacji lub zanieczyszczenia.

9. Multipleksowy PCR (5 h)

  1. Przygotuj dwie główne mieszanki PCR, po jednej dla każdej puli starterów w obszarze mieszanki głównej.
    1. Użyj końcowego stężenia 0,015 μM na podkład. Obliczyć wymaganą objętość puli startera dla reakcji PCR (tabela 2) przy użyciu następującego wzoru:
      Objętość puli starterów = liczba starterów x objętość reakcji x 0,015/stężenie (μM) podkładu
  2. Podamy po 10 μl mieszanki głównej z puli A i mieszanki głównej z puli B do oznakowanych probówek paskowych do PCR w obszarze szablonu. Do każdej próbki dodać 2,5 μl cDNA (z kroku 3) do każdej z odpowiednich znakowanych reakcji grupy A i B startera. Nadmiar cDNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
  3. Wymieszać delikatnie przesuwając i wirując pulsacyjnie.
  4. Próbki należy inkubować w warunkach wymienionych w tabeli 2 na maszynie do PCR.
    UWAGA: Program nie zawiera określonego kroku przedłużania ze względu na długi czas wyżarzania wynoszący 5 minut (wymagany ze względu na dużą liczbę starterów) oraz krótką długość amplikonów (400 pz), która jest wystarczająca do przedłużenia.

10. Oczyszczanie metodą PCR i kwantyfikacja (3,5 h)

  1. Od tego momentu wszystkie prace należy wykonywać w obszarze po PCR.
  2. Podwielokrotne kulki do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI) umieścić w probówkach mikrowirówek z głównej butelki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Podgrzać kulkę SPRI do temperatury pokojowej (RT; ~20 °C) i dokładnie przetrząsnąć, aż kulki zostaną całkowicie zawieszone w roztworze.
  4. W probówkach o pojemności 1,5 ml połącz produkty PCR z puli A ze starterem z puli B dla każdej próbki. W razie potrzeby dodaj wodę, aby doprowadzić objętość do 25 μl.
  5. Dodać 25 μl kulek SPRI do każdej próbki (stosunek 1:1 kulki do próbki). Mieszać, pipetując w górę i w dół lub delikatnie stukając w probówkę.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, od czasu do czasu odwracając lub przesuwając probówki.
  7. Umieść na stojaku magnetycznym, aż koraliki i roztwór całkowicie się rozdzielą. Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć granulki kulki.
  8. Umyć dwukrotnie 80% etanolem (podgrzanym do RT).
    1. Dodaj 200 μl etanolu do granulki. Odczekaj 30 sekund, aby upewnić się, że koraliki są prawidłowo umyte.
    2. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, starając się nie dotykać granulki kulki.
    3. Powtórz kroki 10.8.1-10.8.2, aby umyć osad po raz drugi.
  9. Usuń wszelkie ślady etanolu za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Suszyć na powietrzu, aż śladowe ilości etanolu odparują (w przypadku małych kulek dzieje się to szybko, ~30 s); Kiedy tak się stanie, granulka powinna zmienić kolor z błyszczącego na matowy. Uważaj, aby nie przesuszyć (jeśli granulka pęka, jest zbyt sucha), ponieważ wpłynie to na odzyskanie DNA.
  10. Zawiesić kulki w 15 μl NFW i inkubować w RT (poza stojakiem magnetycznym) przez 10 minut.
  11. Wróć do stojaka magnetycznego i przenieś supernatant (oczyszczony produkt) do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  12. Przygotować rozcieńczenie 1:10 każdej próbki w oddzielnej probówce (2 μl produktu + 18 μl NFW).
    UWAGA: Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Na raz otwarta jest tylko jedna rurka amplikonowa. Najpierw wlej 18 μl wody do probówek (w obszarze czystej mieszanki głównej).
  13. Zmierz stężenie DNA w każdej rozcieńczonej próbce za pomocą bardzo czułego i specyficznego fluorometru, zgodnie z opisem w protocols.io54,55.

11. Normalizacja (30 min)

  1. Użyj szablonu normalizacji (plik uzupełniający 3) i stężenia DNA (ng/μl) każdej próbki, aby obliczyć objętość rozcieńczonej (lub czystej) próbki wymaganą dla 200 fmol każdej próbki o całkowitej objętości 5 μl.
  2. Oznacz nowe probówki PCR i dodaj obliczone objętości NFW i próbki, aby uzyskać znormalizowane DNA.
  3. Obliczoną objętość należy stosować dla próbek nierozcieńczonych (czystych), jeżeli do uzyskania 200 fmol.
    wymagane jest ponad 5 μl rozcieńczonej próbki. UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: W tym momencie oczyszczony produkt PCR można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia lub w razie potrzeby umieścić w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania.

12. Przygotowanie końcowe i kody kreskowe (1,5 h)

UWAGA: Następne kroki zakładają użycie specyficznych odczynników z zestawów do sekwencjonowania kodów kreskowych i ligacji specyficznych dla nanoporów (szczegóły w Tabeli Materiałów). Protokół można przenosić między różnymi wersjami chemii, ale użytkownicy powinni zadbać o to, aby używać kompatybilnych zestawów, zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Naprawa końcowa i dA-tailing
    1. Ustawić reakcję końcowego przygotowania dla każdej próbki wymienionej w tabeli 3. Przygotować mieszankę wzorcową w zależności od liczby próbek (plus 10% nadmiaru). Podczas pipetowania należy zachować ostrożność, ponieważ odczynniki są lepkie.
    2. Dodać 5 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki ze znormalizowanym DNA (5 μl). Całkowita mieszanina reakcyjna powinna wynosić 10 μl. Za każdym razem zmieniaj końcówki i otwieraj tylko jedną probówkę na raz.
    3. Inkubować w termocyklerze w warunkach wymienionych w tabeli 3.
  2. Kody kreskowe
    1. Podać kody kreskowe z zestawu do kodów kreskowych do probówek paskowych do PCR przy 1,25 μl/probówkę i zapisać kod kreskowy przypisany do każdej próbki.
    2. Dodać 0,75 μl próbki z gotowym końcem do przypisanej jej podwielokrotności kodu kreskowego.
    3. Przygotować główną mieszankę do podwiązywania w zależności od liczby próbek (plus 10% nadmiaru) (tabela 4).
    4. Dodać 8 μl głównej mieszanki do ligacji do próbki przygotowanej na końcu + kody kreskowe, uzyskując całkowitą reakcję 10 μl.
    5. Inkubować w termocyklerze, stosując warunki wymienione w tabeli 4.
  3. Oczyszczanie kulek SPRI i kwantyfikacja DNA
    1. Rozmrozić bufor krótkich fragmentów (SFB) w temperaturze pokojowej, wymieszać przez wirowanie, odwirować impulsowo i umieścić na lodzie.
    2. Zebrać wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w probówce mikrowirówkowej lobind o pojemności 1,5 ml. Aby objętość oczyszczania nie była zbyt duża do użycia, należy zebrać 12-24 próbki (10 μl/próbkę), do 48 próbek (5 μl/próbkę) lub do 96 próbek (2,5 μl/próbkę) z każdej natywnej reakcji kodowania kreskowego.
    3. Dodaj 0,4x objętość koralików SPRI do puli z kodami kreskowymi. Delikatnie wymieszać (przesuwając lub pipetując) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Umieść próbki na magnesie, aż kulki się zagnieżdżą, a supernatant będzie całkowicie klarowny (~2 min). Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
    5. Przemyć dwukrotnie 250 μl SFB.
      1. Wyjmij probówkę z magnesu i całkowicie zawieś granulat w 250 μl SFB. Inkubować przez 30 sekund, odwirować pulsacyjnie i powrócić do magnesu.
      2. Usunąć supernatant i wyrzucić.
    6. Powtórz krok 12.3.5, aby wykonać drugie pranie SFB.
    7. Odwirować impulsowo i usunąć wszelkie pozostałości SFB.
    8. Dodaj 200 μl 80% (RT) etanolu, aby wykąpać granulki. Usuń i wyrzuć etanol, uważając, aby nie naruszyć granulki kulki. Suszyć na powietrzu przez 30 s lub do momentu, gdy pellet straci połysk.
    9. Zawiesić w 22 μl NFW w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    10. Umieść na magnesie, pozostaw na ~2 min, a następnie ostrożnie usuń roztwór i przenieś do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    11. Użyć 1 μl, aby uzyskać stężenie DNA, jak opisano wcześniej (krok 10.13).
      UWAGA: Opcjonalny punkt pauzy: W tym momencie biblioteka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień lub -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania, ale lepiej jest kontynuować podwiązanie i sekwencjonowanie adaptera.

13. Sekwencjonowanie (maksymalnie 48 godzin)

  1. Przygotuj komputer (patrz również sekcje 1-4 wymagań wstępnych).
    1. Sprawdź, czy jest wystarczająco dużo miejsca do przechowywania nowych danych (min. 150 GB), dane ze starych przebiegów są archiwizowane/przenoszone na serwer przed usunięciem i zainstalowana jest najnowsza wersja MinKNOW.
  2. Wyjmij przechowywaną komorę przepływową z lodówki i pozwól jej dotrzeć do RT.
  3. Podwiązanie adaptera (1 h)
    1. Odwirować pulsacyjnie adapter, wymieszać i podlać ligazą, a następnie umieścić na lodzie.
    2. Bufor elucji do rozmrażania (EB), SFB i bufor ligacyjny w temperaturze pokojowej. Wymieszać przez wirowanie, wirować pulsacyjnie i umieścić na lodzie.
    3. Przygotować główną mieszankę do podwiązywania adapterów (Tabela 5), łącząc odczynniki w określonej kolejności w probówce o niskim poziomie wiązania.
      UWAGA: W zależności od dostępności w laboratorium, można zastosować alternatywy dla odczynników do podwiązywania węzłów (tabela 5). Patrz Plik uzupełniający 3 i Spis materiałów, aby uzyskać listę alternatyw. Użyj obliczeń w arkuszu pliku uzupełniającego 3, aby uzyskać objętość biblioteki DNA równą 200 fmol. Jeżeli obliczono mniej niż 20 μl, dodać NFW, aby uzyskać do 20 μl.
    4. Wymieszać przez delikatne trzebanie i wirowanie pulsacyjne. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
      UWAGA: Podczas inkubacji należy rozpocząć przygotowanie komory przepływowej (sekcja 13.5).
  4. Oczyść za pomocą kulek SPRI (nie używaj etanolu, jak we wcześniejszych porządkach).
    1. Dodaj 0,4x objętość kulek SPRI (RT) do próbek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie przesuwać z przerwami, aby ułatwić mieszanie.
    2. Umieść na magnesie, aż kulki i roztwór całkowicie się rozdzielą (~5 min). Usunąć i wyrzucić supernatant; Uważaj, aby nie naruszyć granulki kulki.
    3. Przemyć dwukrotnie 125 μl SFB.
    4. Zawiesić całkowicie osad ze 125 μl SFB, mieszając go pipetą. Pozostaw do inkubacji na 30 sekund.
    5. Wirówka pulsacyjna do zbierania cieczy u podstawy probówki i umieszczania na magnesie. Usunąć supernatant i wyrzucić.
    6. Powtórz kroki 13.4.4-13.4.5, aby umyć osad po raz drugi.
    7. Odwirować impulsowo i usunąć nadmiar SFB.
    8. Zawiesić w 15 μl EB i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Wróć do magnesu na ~2 minuty, a następnie ostrożnie przenieś roztwór do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    10. Określ ilościowo 1 μl eluowanej biblioteki, jak opisano wcześniej w kroku 10.13
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przejdź bezpośrednio do sekwencjonowania MinION; jednak ostateczna biblioteka może być przechowywana w EB w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  5. Uruchom kontrolę jakości celi przepływowej.
    1. Podłącz urządzenie sekwencjonujące do laptopa i otwórz oprogramowanie do sekwencjonowania.
    2. Wybierz typ komórki przepływu, a następnie kliknij przycisk Sprawdź komórkę przepływu i rozpocznij test.
    3. Po zakończeniu zostanie wyświetlona całkowita liczba aktywnych (tj. żywotnych) porów. Nowa komórka przepływowa powinna mieć >800 aktywnych porów; Jeśli tak się nie stanie, skontaktuj się z producentem w celu wymiany.
  6. Zalewanie i ładowanie komory przepływowej (20 min)
    1. Rozmrozić następujące odczynniki w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić na lodzie bufor sekwencyjny, pętę do spłukiwania, bufor do płukania i kulki ładujące.
    2. Odwirować bufor sekwencyjny i przepłukać bufor, odwirować impulsowo i umieścić na lodzie.
    3. Odwirować pulsacyjnie pęto spłukujące i wymieszać przez pipetowanie, a następnie umieścić na lodzie.
    4. Przygotować mieszankę zalewającą do komór przepływowych, dodając 30 μl linki do spłukiwania bezpośrednio do rurki bufora do płukania z zestawu do zalewania komory przepływowej i wymieszać przez pipetowanie.
    5. Wymieszaj kulki ładujące, pipetując bezpośrednio przed użyciem, ponieważ szybko osiadają.
    6. W świeżej probówce przygotować końcowe rozcieńczenie biblioteki do sekwencjonowania, jak wspomniano w tabeli 5.
      UWAGA: Użyj obliczeń w arkuszu pliku uzupełniającego 3, aby uzyskać objętość biblioteki DNA równą 50 fmol. Jeżeli obliczono mniej niż 12 μl, dodać EB, aby uzyskać 12 μl.
    7. Odchyl pokrywę urządzenia sekwencjonującego i przesuń pokrywę portu zalewowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, tak aby port zalewowy był widoczny (Rysunek 3)
    8. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza, ustawiając pipetę P1000 na 200 μl, włóż końcówkę do portu zalewania i obracaj pokrętłem, aż zobaczysz niewielką objętość wchodzącą do końcówki pipety (maksymalny obrót do 230 μl).
    9. Załadować 800 μl mieszanki gruntującej do komory przepływowej do komory przepływowej przez port zasysający, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.
    10. Pozostaw na 5 minut.
    11. Delikatnie podnieś pokrywę portu próbki i załaduj 200 μl mieszanki zalewającej do komory przepływowej przez port zasysania za pomocą pipety P1000.
    12. Przed załadowaniem należy pipetować mieszanie w górę i w dół, upewniając się, że kulki załadowcze w mieszance wzorcowej są ponownie zawieszone przed załadowaniem.
    13. Załadować 75 μl mieszanki bibliotecznej do celi przepływowej przez port próbki w sposób kroplowy. Upewnij się, że każda kroplówka wpływa do portu przed dodaniem następnej.
    14. Delikatnie załóż pokrywę portu próbki, upewniając się, że korek wchodzi do portu próbki.
    15. Zamknij port zalewowy i załóż pokrywę urządzenia sekwencjonującego.
  7. Sekwencjonowanie (maksymalnie 48 godzin)
    1. Podłącz urządzenie sekwencjonujące do laptopa i otwórz oprogramowanie do sekwencjonowania.
    2. Kliknij przycisk Start, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij sekwencjonowanie.
    3. Kliknij pozycję Nowy eksperyment i postępuj zgodnie z przepływem pracy graficznego interfejsu użytkownika (GUI) oprogramowania do sekwencjonowania, aby skonfigurować parametry przebiegu.
    4. Wpisz nazwę eksperymentu i identyfikator próbki (np. rabv_run1), a następnie wybierz z menu rozwijanego Typ komórki przepływu.
    5. Kontynuuj wybór zestawu i wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania ligacji oraz używany natywny zestaw do kodowania kreskowego.
    6. Przejdź do sekcji Opcje uruchamiania. Zachowaj wartości domyślne, chyba że pożądane jest, aby przebieg zatrzymał się automatycznie po określonej liczbie godzin (przebiegi można zatrzymać ręcznie w dowolnym momencie).
    7. Przejdź do rozmowy bazowej. Wybierz, czy chcesz włączyć lub wyłączyć połączenia bazowe, w zależności od zasobów obliczeniowych (patrz konfiguracja komputera). Wybierz opcję Edytuj opcje w obszarze kodów kreskowych i upewnij się, że opcja Kod kreskowy na obu końcach jest włączona. Zapisz i przejdź do sekcji wyjściowej.
    8. Zaakceptuj ustawienia domyślne i przejdź do końcowego przeglądu, sprawdź ustawienia i zapisz szczegóły w arkuszu roboczym (plik uzupełniający 3). Kliknij przycisk Start.
      UWAGA: Jeśli cela przepływowa jest ponownie używana, wyreguluj napięcie początkowe (w sekcji zaawansowanej opcji uruchamiania), jak wskazano na schemacie w pliku uzupełniającym 3.
    9. Zapisz początkowe aktywne kanały - jeśli jest to znacznie niższe niż kontrola jakości (QC), uruchom ponownie oprogramowanie do sekwencjonowania. Jeśli nadal jest niższy, uruchom ponownie komputer.
    10. Zapisz początkowe kanały w pasmie w porównaniu z pojedynczymi porami, aby uzyskać przybliżone zajętość porów. Liczba ta będzie się zmieniać, więc podaj przybliżenie.
    11. Monitoruj przebieg w miarę jego postępu.

14. Połączenia bazowe na żywo i offline

UWAGA: Te instrukcje zakładają, że istniejąca wcześniej struktura katalogów dostarczona w repozytorium artic-rabv i że przestrzegane są wymagania wstępne sekcji 1 i 3 protokołu.

  1. W lokalnym systemie plików utwórz nowy katalog o nazwie analysis, w którym będą przechowywane wszystkie dane wyjściowe analizy. Aby uporządkować dalej: utwórz podkatalog z nazwą projektu, a w nim nowy katalog dla przebiegu, używając przykładowego identyfikatora dostarczonego do MinKNOW jako run_name. Zrób to w jednym poleceniu w następujący sposób:
    mkdir -p
    analiza/project_name/run_name
    Następnie przejdź do jego lokalizacji:
    cd
    ścieżka/analiza/project_name/run_name
  2. Połączenia bazowe na żywo
    UWAGA: Aby wykonywać wywołania bazowe nanoporowe w czasie rzeczywistym, laptopy wymagają procesora graficznego (GPU) zgodnego z NVIDIA CUDA. Upewnij się, że instrukcje dotyczące konfiguracji basecallingu GPU zostały wykonane przy użyciu protokołu guppy56.
    1. Podczas konfiguracji uruchamiania włącz połączenia bazowe na żywo.
    2. Użyj RAMPART do monitorowania zasięgu sekwencjonowania w czasie rzeczywistym, zgodnie z poniższą instrukcją.
    3. W terminalu komputera aktywuj środowisko artic-rabv conda:
      Conda Activate Artic-Rabv
    4. Utwórz nowy katalog dla danych wyjściowych rampart w katalogu run_name i przejdź do niego:
      cd /ścieżka/analiza/project_name/run_name
      mkdir rampart_output
      płyta CD rampart_output
    5. Utwórz plik barcodes.csv, aby sparować kody kreskowe i nazwy próbek. Powinien mieć jeden wiersz na kod kreskowy i określać tylko kody kreskowe, które są obecne w bibliotece, z nagłówkami "kod kreskowy" i "próbka". Postępuj zgodnie z przykładem w katalogu artic-rabv:
      analiza/example_project/example_run/rampart_output/barcodes.csv
    6. Uruchom RAMPART, podając odpowiedni folder protokołu i ścieżkę do folderu fastq_pass w danych wyjściowych MinKNOW dla run:
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath
    7. Otwórz okno przeglądarki i przejdź do localhost:3000 w polu URL. Poczekaj, aż wystarczająca ilość danych zostanie wywołana bazą, zanim wyniki pojawią się na ekranie.
  3. Wywoływanie bazy w trybie offline (wykonywane po uruchomieniu)
    1. Jeśli nie ustawiono livecallingu basecallingowego, wyjściem z MinKNOW będą surowe dane sygnału (pliki fast5). Nie będzie można korzystać z RAMPART podczas biegu. Przekonwertuj pliki fast5 na dane o nazwie basecalled (pliki fastq) po uruchomieniu za pomocą guppy (zobacz instalację w kroku wymagań wstępnych 1.1.1.). Uruchom RAMPART post-hoc na danych o nazwie base.
    2. Uruchom gupika basecaller:
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /ścieżka/do/odczytów/fast5_* -s /ścieżka/analiza/project_name/run_name -x auto -r
      -c jest plikiem konfiguracyjnym określającym model basecalling, -i jest ścieżką wejściową, -s jest ścieżką zapisu, -x określa wywołanie podstawowe przez urządzenie GPU (wyklucza, jeśli używana jest komputerowa wersja guppy), a -r określa rekurencyjne przeszukiwanie plików wejściowych.
      UWAGA: Plik konfiguracyjny (.cfg) można zmienić na basecaller o wysokiej dokładności, zastępując _fast przez _hac, chociaż zajmie to znacznie więcej czasu.

15. Mycie komórek przepływowych

  1. Komórki przepływowe można umyć i ponownie wykorzystać do sekwencjonowania nowych bibliotek, jeśli pory są nadal żywotne. Zobacz instrukcje dotyczące mycia w protokole mycia komór przepływowych ONT57.

16. Analiza i interpretacja

  1. Generowanie sekwencji konsensusu za pomocą potoku bioinformatycznego ARTIC
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w repozytorium artic-rabv GitHub40 w folderze rabv_protocols, aby wygenerować sekwencje konsensusu z plików raw fast5 lub basecalled fastq.
      UWAGA: Zapoznaj się z artykułem Artic pipeline - Core pipeline58, aby uzyskać więcej wskazówek.
  2. Opcjonalnie: Przeanalizuj średnią głębokość odczytu na amplikon.
    1. Dostosuj skrypty dostępne w repozytorium artic-rabv, odwołując się do Pliku Uzupełniającego 1. Krótko mówiąc, szczegółowe statystyki są generowane za pomocą SAMtools59 i pokrycia na nukleotyd wykreślony w R.
  3. Analiza filogenetyczna z wykorzystaniem GLUE
    1. Z RABV_GLUE42 wybierz zakładkę Analiza > Genotypowanie i interpretacja > Dodaj pliki, wybierając plik fasta z sekwencjami konsensusu.
    2. Kliknij Prześlij i poczekaj. Po zakończeniu analiz będzie można kliknąć przycisk Pokaż analizę, pokazujący przypisania kladów i subkladów, pokrycie na gen, odchylenia od sekwencji referencyjnych i najbliższego krewnego.
    3. Odpowiednie sekwencje kontekstowe można również zidentyfikować w sekcji Dane sekwencji > Sekwencje NCBI według kladu.
    4. Wybierz zidentyfikowany klad lub kliknij Wirus wścieklizny (RABV), aby zobaczyć wszystkie dostępne sekwencje.
    5. Filtruj pod kątem odpowiednich sekwencji (np. kraju pochodzenia).
    6. Pobierz te sekwencje i odpowiadające im metadane do analizy i porównania.
  4. Przypisywanie pochodzenia za pomocą MADDOG41
    1. Pobierz repozytorium MADDOG z GitHub, aby upewnić się, że pracujesz z najnowszą wersją.
    2. Utwórz folder przypisania w lokalnym repozytorium MADDOG (wcześniej utworzonym w sekcji Wymagania wstępne) o nazwie nazwa uruchomienia.
    3. Wewnątrz folderu dodaj plik fasta zawierający sekwencje konsensusu.
    4. Dodaj plik metadanych do folderu.
      UWAGA: Ten plik musi być plikiem csv z 4 kolumnami o nazwach "ID", "kraj", "rok" i "przypisanie", zawierającymi szczegółowe identyfikatory sekwencji, kraj pobierania próbek i rok pobrania próbki, podczas gdy kolumna "przypisanie " powinna być pusta.
    5. W interfejsie wiersza poleceń aktywuj środowisko conda: conda activate MADDOG.
    6. W interfejsie wiersza poleceń przejdź do folderu repozytorium MADDOG.
    7. Na początku należy podjąć się przypisania linii w sekwencjach, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych potencjalnych nieprawidłowości i określić, czy właściwe byłoby przeprowadzenie dłuższego kroku oznaczania linii. W tym celu wpisz to w wierszu poleceń: sh assignment.sh.
    8. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby wskazać, że repozytorium zostało pobrane i pracujesz z najnowszą wersją MADDOG.
    9. Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu w folderze repozytorium MADDOG, który zawiera plik fasta.
    10. Po zakończeniu przypisywania pochodzenia sprawdź plik wyjściowy w folderze. Jeśli dane wyjściowe są zgodne z oczekiwaniami i istnieje wiele sekwencji przypisanych do tego samego pochodzenia, uruchom oznaczenie pochodzenia.
    11. Jeśli uruchomione jest oznaczenie pochodzenia, usuń właśnie utworzony plik wyjściowy przypisania.
    12. W terminalu, w folderze repozytorium MADDOG, uruchom polecenie sh designation.sh.
    13. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby wskazać, że repozytorium zostało pobrane i pracujesz z najnowszą wersją MADDOG.
    14. Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu w folderze repozytorium MADDOG zawierającym plik fasta i metadane. W ten sposób uzyskuje się informacje o pochodzeniu każdej sekwencji, filogenezę nowych i odpowiednich poprzednich sekwencji (od 16.3.6), hierarchiczne informacje o liniach oraz szczegóły dotyczące potencjalnie pojawiających się linii i obszarów niedostatecznego próbkowania.
      UWAGA: Pełne informacje na temat protokołu, użycia i danych wyjściowych można znaleźć w Campbell et al.60.
    15. Po zakończeniu wstępnej analizy, jeśli pojawi się monit o przetestowanie również pojawiających się i niedostatecznie próbkowanych linii, wprowadź Y, jeśli jest to wymagane. W przeciwnym razie wprowadź wartość N.
    16. Jeśli pojawi się monit o potwierdzenie nowo znalezionych linii, wprowadź Y i postępuj zgodnie z instrukcjami w wynikowym pliku NEXT_STEPS.eml. W przeciwnym razie wprowadź wartość N.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w tym protokole przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji dla RABV został z powodzeniem wykorzystany w różnych warunkach laboratoryjnych w krajach endemicznych, takich jak Tanzania, Kenia, Nigeria i Filipiny (Rysunek 4). Protokół zastosowano na różnych typach próbek i warunkach (Tabela 6): świeżej i mrożonej tkance mózgowej, ekstraktach cDNA i RNA z tkanki mózgowej transportowanej w łańcuchu chłodniczym przez dłuższy czas oraz kartach FTA z rozmazami tkanki mózgowej.

Połączenia bazowe na żywo za pomocą RAMPART (Rysunek 5) pokazuje generowanie odczytów w czasie zbliżonym do rzeczywistego oraz procentowe pokrycie na próbkę. Jest to szczególnie przydatne przy podejmowaniu decyzji, kiedy zatrzymać przebieg i zapisać komórkę przepływową do ponownego użycia. Zaobserwowano różnice w czasie pracy, przy czym niektóre kończyły się w ciągu 2 godzin, podczas gdy inne mogły potrzebować więcej niż 12 godzin, aby osiągnąć odpowiednią głębokość pokrycia (x100). Możemy również zobaczyć obszary o słabym wzmocnieniu; na przykład Rysunek 6 pokazuje migawkę jednego przebiegu sekwencjonowania, w którym profile pokrycia pokazują niektóre amplikony o bardzo niskim wzmocnieniu, wskazując na potencjalnie problematyczne startery. Dzięki dokładniejszemu zbadaniu tych słabo wzmacniających się regionów, byliśmy w stanie zidentyfikować niedopasowania starterów, co umożliwi nam przeprojektowanie i ulepszenie poszczególnych starterów. Niektóre schematy podkładów wykazały więcej niezgodności niż inne. Jest to widoczne w programie "Podstawa Afryki Wschodniej" w porównaniu z Filipinami, zgodnie z docelową różnorodnością, ponieważ program "Afryka Wschodnia" ma na celu uchwycenie znacznie szerszej różnorodności.

RABV-GLUE42, zasób ogólnego przeznaczenia do zarządzania danymi genomu RAPV, oraz MADDOG60, system klasyfikacji i nomenklatury rodów, zostały użyte do kompilacji i interpretacji wynikowych sekwencji RAPV. Tabela 7 przedstawia główne i mniejsze klady krążące w każdym kraju przypisane za pomocą RABV-GLUE. Pokazana jest również klasyfikacja lokalnych linii rodowych w wyższej rozdzielczości po przypisaniu MADDOG.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji dla RABV. Przedstawiono podsumowane etapy dla (A) przygotowania próbki, (B) PCR i przygotowania biblioteki oraz (C) sekwencjonowania i bioinformatyki aż do analizy i interpretacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat schematu podkładu. Pozycje wyżarzania wzdłuż "genomu odniesienia indeksu" (ciemnofioletowy) dla par starterów do przodu i do tyłu (półstrzałki), które są przypisane do dwóch oddzielnych pul: A (czerwony) i B (zielony). Pary starterów generują nakładające się na siebie amplikony o długości 400 pz (niebieskie), które są numerowane sekwencyjnie wzdłuż genomu referencyjnego indeksu w formacie "scheme_name_X_DIRECTION", gdzie "X" jest liczbą odnoszącą się do amplikonu wygenerowanego przez starter, a "KIERUNEK" to "LEWO" lub "PRAWO", opisując odpowiednio do przodu lub do tyłu. Nieparzyste lub parzyste wartości "X" określają pulę (odpowiednio A lub B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Komórka przepływowa nanoporowa48. Niebieskie etykiety ilustrują różne części komory przepływowej, w tym pokrywę portu zalewowego, która zakrywa port zasysający, w którym dodawany jest roztwór zasysający, pokrywę portu próbki SpotON zakrywającą port próbki, w którym próbka jest dodawana kroplami, porty odpływowe 1 i 2 oraz identyfikator komory przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mapa pokazująca miejsce, w którym przeprowadzono sekwencjonowanie RABV przy użyciu zoptymalizowanego przepływu pracy w 2021 i 2022 roku. Rozmiar i kolor bąbelków odpowiadają liczbie sekwencji na lokalizację, gdzie mniejszy i ciemniejszy to mniej, a większy i jaśniejszy to więcej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zrzut ekranu wizualizacji RAMPART w przeglądarce internetowej. Nazwy kodów kreskowych są zastępowane nazwami próbek zgodnie z konfiguracją bioinformatyczną. Trzy górne panele pokazują wykresy podsumowujące dla całego cyklu: głębokość pokrycia zmapowanych odczytów dla każdego kodu kreskowego na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu (lewy górny róg, pokolorowany kodem kreskowym), zsumowane zmapowane odczyty ze wszystkich kodów kreskowych w czasie (górny środek) oraz zmapowane odczyty dla kodu kreskowego (prawy górny róg, pokolorowany kodem kreskowym). Dolne panele pokazują rzędy wykresów dla każdego kodu kreskowego. Od lewej do prawej: głębokość pokrycia zmapowanych odczytów na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu (po lewej), rozkład długości zmapowanych odczytów (w środku) oraz proporcja pozycji nukleotydów w genomie referencyjnym indeksu, które uzyskały 10-krotne, 100-krotne i 1000-krotne pokrycie zmapowanych odczytów w czasie (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przykładowy odczyt pokrycia genomu próbki wirusa wścieklizny z Filipin zsekwencjonowanej przy użyciu protokołu.Pokazano pokrycie odczytu w każdej pozycji nukleotydu w genomie, wraz z pozycją nakładających się amplikonów (1-41) użytych do wygenerowania biblioteki. Skoki głębokości pokrycia odpowiadają obszarom nakładania się amplikonów. Amplikony o małej głębokości pokrycia odpowiadają obszarom nakładania się amplikonów. Amplikony o małej głębokości pokrycia są podświetlone na czerwono, wskazując problematyczne obszary, które mogą wymagać optymalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Warunki miksowania głównego i termocyklera do przygotowania cDNA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Warunki miksu głównego i termocyklera dla multipleksowego PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Warunki mieszanki głównej i termocyklera dla reakcji przygotowania końcowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Warunki miksu głównego i termocyklera dla kodów kreskowych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Mieszanka główna ligacji adaptera i końcowe rozcieńczenie biblioteki do sekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Liczba wygenerowanych sekwencji całego genomu wirusa wścieklizny oraz rodzaj próbek użytych w różnych krajach przy użyciu przepływu pracy od próbki do sekwencji do interpretacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Przypisania głównych i drugorzędnych kladów z RABV-GLUE oraz przypisania linii z MADDOG dla sekwencji generowanych przy użyciu przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Projektowanie i optymalizacja schematu podkładu oraz analiza głębokości odczytu amplikonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Konfiguracja obliczeniowa Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Arkusz protokołu RABV WGS Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępny przepływ pracy sekwencjonowania całego genomu oparty na nanoporach został opracowany przez Brunkera i wsp.61, wykorzystując zasoby sieci ARTIC46. W tym miejscu przedstawiamy zaktualizowany przepływ pracy, z pełnymi krokami od próbki, przez sekwencję, po interpretację. Przepływ pracy szczegółowo opisuje przygotowanie próbek tkanki mózgowej do sekwencjonowania całego genomu, przedstawia proces bioinformatyczny do przetwarzania odczytów i generowania sekwencji konsensusu oraz podkreśla dwa narzędzia specyficzne dla wścieklizny, które automatyzują przypisywanie linii i określają kontekst filogenetyczny. Zaktualizowany przepływ pracy zawiera również kompleksowe instrukcje dotyczące konfigurowania odpowiednich obliczeniowych i laboratoryjnych obszarów roboczych z uwzględnieniem implementacji w różnych kontekstach (w tym w ustawieniach o niskich zasobach). Wykazaliśmy udane wdrożenie przepływu pracy zarówno w środowisku akademickim, jak i instytutu badawczym w czterech endemicznych LMIC, które nie mają lub mają ograniczone możliwości nadzoru genomowego. Przepływ pracy okazał się odporny na zastosowanie w różnych ustawieniach i zrozumiały dla użytkowników o różnej wiedzy specjalistycznej.

Ten przepływ pracy dla sekwencjonowania RABV jest najbardziej wszechstronnym publicznie dostępnym protokołem (obejmującym etapy od próbki, sekwencji do interpretacji) i specjalnie dostosowanym w celu obniżenia kosztów zarówno uruchomienia, jak i eksploatacji. Czas i koszty wymagane do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania za pomocą technologii nanoporowej są znacznie zmniejszone w porównaniu z innymi platformami, takimi jak Illumina61, a ciągły rozwój technologii poprawia jakość i dokładność sekwencji, aby była porównywalna z Illumina62.

Ten protokół został zaprojektowany tak, aby był odporny w różnych kontekstach o niskich zasobach. Odwołując się do wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów i modyfikacji dostarczonych wraz z podstawowym protokołem, użytkownicy mogą dostosować przepływ pracy do swoich potrzeb. Dodanie przyjaznych dla użytkownika narzędzi bioinformatycznych do przepływu pracy stanowi istotny postęp w stosunku do oryginalnego protokołu, zapewniając szybkie i ustandaryzowane metody, które mogą być stosowane przez użytkowników z minimalnym wcześniejszym doświadczeniem bioinformatycznym do interpretacji danych sekwencji w lokalnych kontekstach. Zdolność do tego celu in situ jest często ograniczona ze względu na konieczność posiadania określonych umiejętności programistycznych i filogenetycznych, które wymagają intensywnych i długoterminowych inwestycji w szkolenie w umiejętności. Chociaż ten zestaw umiejętności jest ważny dla dokładnej interpretacji danych sekwencyjnych, podstawowe i dostępne narzędzia interpretacyjne są równie pożądane, aby zdolić lokalnych "mistrzów sekwencjonowania", których podstawowa wiedza specjalistyczna może być oparta na mokrym laboratorium, umożliwiając im interpretację i przejęcie odpowiedzialności za swoje dane.

Ponieważ protokół jest stosowany od wielu lat w kilku krajach, możemy teraz udzielić wskazówek, jak zoptymalizować schematy multipleksów w celu poprawy zasięgu i radzenia sobie ze skumulowaną różnorodnością. Podjęto również wysiłki, aby pomóc użytkownikom w poprawie opłacalności lub ułatwić zamawianie zamówień w danym regionie, co zazwyczaj stanowi wyzwanie dla trwałości podejść molekularnych63. Na przykład w Afryce (Tanzania, Kenia i Nigeria) zdecydowaliśmy się na główną mieszankę ligazy / TA na etapie ligacji adaptera, która była łatwiej dostępna u lokalnych dostawców i stanowiła tańszą alternatywę dla innych odczynników do ligacji.

Z doświadczenia wynika, że istnieje kilka sposobów na obniżenie kosztu w przeliczeniu na próbkę i na serię. Zmniejszenie liczby próbek w serii (np. z 24 do 12 próbek) może wydłużyć żywotność komórek przepływowych w wielu cyklach, podczas gdy zwiększenie liczby próbek w serii maksymalizuje czas i odczynniki. W naszych rękach byliśmy w stanie umyć i ponownie wykorzystać komory przepływowe w co trzecim cyklu sekwencjonowania, co umożliwiło sekwencjonowanie dodatkowych 55 próbek. Mycie komory przepływowej natychmiast po użyciu lub, jeśli nie jest to możliwe, usuwanie płynu odpadowego z kanału odpływowego po każdym uruchomieniu, wydawało się zachowywać liczbę porów dostępnych dla drugiego cyklu. Biorąc pod uwagę początkową liczbę porów dostępnych w komorze przepływowej, jeden cykl może być również zoptymalizowany w celu zaplanowania, ile próbek ma być uruchamianych w danej komorze przepływowej.

Chociaż przepływ pracy ma być tak wszechstronny, jak to tylko możliwe, z dodaniem szczegółowych wskazówek i oznaczonych zasobów, procedura jest nadal złożona i może być zniechęcająca dla nowego użytkownika. Użytkownik jest zachęcany do skorzystania z osobistego szkolenia i wsparcia, najlepiej lokalnie lub alternatywnie za pośrednictwem współpracowników zewnętrznych. Na przykład na Filipinach w ramach projektu dotyczącego budowania zdolności w ramach regionalnych laboratoriów w zakresie nadzoru genomicznego nad SARS-CoV-2 za pomocą ONT rozwinięto podstawowe kompetencje diagnostów opieki zdrowotnej, które można łatwo przenieść do sekwencjonowania RAPV. Ważne kroki, takie jak czyszczenie koralików SPRI, mogą być trudne do opanowania bez praktycznego szkolenia, a nieskuteczne czyszczenie może uszkodzić komórkę przepływową i zagrozić przebiegowi. Zanieczyszczenie próbki jest zawsze poważnym problemem, gdy amplikony są przetwarzane w laboratorium i mogą być trudne do wyeliminowania. W szczególności zanieczyszczenie krzyżowe między próbkami jest niezwykle trudne do wykrycia podczas bioinformatyki po uruchomieniu. Dobre techniki i praktyki laboratoryjne, takie jak utrzymywanie czystych powierzchni roboczych, oddzielanie obszarów przed i po PCR oraz stosowanie kontroli ujemnych, są niezbędne do zapewnienia kontroli jakości. Szybkie tempo rozwoju sekwencjonowania nanoporowego jest zarówno zaletą, jak i wadą rutynowego nadzoru genomowego RAPV. Ciągłe ulepszenia dokładności, dostępności i repertuaru protokołów nanoporów poszerzają się i poprawiają zakres ich zastosowania. Jednak te same zmiany sprawiają, że utrzymanie standardowych procedur operacyjnych i rurociągów bioinformatycznych jest wyzwaniem. W tym protokole udostępniamy dokument wspomagający przejście ze starszych na obecne zestawy do przygotowania biblioteki nanoporowej (Tabela Materiałów).

Częstą przeszkodą na drodze do sekwencjonowania w krajach o niskich i średnich dochodach jest dostępność, w tym nie tylko koszty, ale także możliwość terminowego pozyskiwania materiałów eksploatacyjnych (w szczególności odczynników do sekwencjonowania, które są stosunkowo nowe dla zespołów zaopatrzeniowych i dostawców) oraz zasobów obliczeniowych, a także po prostu dostęp do stabilnego zasilania i Internetu. Wykorzystanie przenośnej technologii sekwencjonowania nanoporowego jako podstawy tego przepływu pracy pomaga w wielu z tych problemów z dostępnością, a my zademonstrowaliśmy użycie naszego protokołu w różnych ustawieniach, przeprowadzając pełny protokół i analizę w kraju. Trzeba przyznać, że terminowe zaopatrzenie w sprzęt i sekwencjonowanie materiałów eksploatacyjnych pozostaje wyzwaniem, a w wielu przypadkach byliśmy zmuszeni do przewożenia lub wysyłania odczynników z Wielkiej Brytanii. Jednak w niektórych obszarach byliśmy w stanie całkowicie polegać na lokalnych trasach dostaw odczynników, korzystając z inwestycji w sekwencjonowanie SARS-CoV-2 (np. Filipiny), które usprawniły procesy zaopatrzenia i zaczęły normalizować stosowanie genomiki patogenów.

Potrzeba stabilnego połączenia internetowego jest zminimalizowana przez jednorazowe instalacje; na przykład repozytoria GitHub, pobieranie oprogramowania i sekwencjonowanie nanoporowe wymagają jedynie dostępu do Internetu do rozpoczęcia działania (nie w całości) lub mogą być wykonywane całkowicie offline za zgodą firmy. Jeśli dane komórkowe są dostępne, telefon może być używany jako hotspot do laptopa, aby rozpocząć sekwencjonowanie, przed rozłączeniem na czas trwania. Podczas rutynowego przetwarzania próbek wymagania dotyczące przechowywania danych mogą szybko wzrosnąć, a najlepiej byłoby, gdyby dane były przechowywane na serwerze. W przeciwnym razie dyski twarde z dyskami półprzewodnikowymi (SSD) są stosunkowo tanie w zaopatrzeniu.

Chociaż zdajemy sobie sprawę, że nadal istnieją bariery utrudniające nadzór genomiczny w krajach o niskich i średnich dochodach, rosnące inwestycje w budowanie dostępności i wiedzy specjalistycznej w zakresie genomiki (np. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 sugerują, że sytuacja ta ulegnie poprawie. Nadzór genomiczny ma kluczowe znaczenie dla gotowości na wypadek pandemii6 , a zdolności można ustanowić poprzez rutynizację nadzoru genomicznego nad endemicznymi patogenami, takimi jak RABV. Globalne dysproporcje w zdolnościach sekwencjonowania, które uwypukliły się podczas pandemii SARS-CoV-2, powinny być motorem zmian katalitycznych mających na celu rozwiązanie tych nierówności strukturalnych.

Ten przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji dla RABV, w tym dostępne narzędzia bioinformatyczne, może zostać wykorzystany do kierowania środkami kontroli ukierunkowanymi na cel, jakim jest zerowa liczba zgonów ludzi z powodu wścieklizny za pośrednictwem psów, do 2030 r., a ostatecznie do eliminacji wariantów RAPV. W połączeniu z odpowiednimi metadanymi, dane genomiczne wygenerowane za pomocą tego protokołu ułatwiają szybką charakterystykę RABV podczas dochodzeń w sprawie epidemii oraz w identyfikacji krążących linii w kraju lub regionie 60,61,65. Ilustrujemy nasz pipeline głównie na przykładach wścieklizny wywoływanej przez psy; Jednak przepływ pracy ma bezpośrednie zastosowanie do wścieklizny dzikich zwierząt. Ta przenośność i niski koszt minimalizują wyzwania związane z łatwym dostępem do rutynowego sekwencjonowania, nie tylko w przypadku wścieklizny, ale także innych patogenów 46,66,67, w celu poprawy zarządzania i kontroli choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton funding od Medical Research Council [MR/R025649/1] i Filipińskiego Departamentu Nauki i Technologii (DOST), UK Research and Innovation Global effort on COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], oraz Fundusz Rozwoju Partnerstwa Międzynarodowego, stypendium DOST British Council-Filipiny (CB), stypendium Narodowego Instytutu Badań nad Zdrowiem [17/63/82] GemVi (GJ) oraz stypendia Uniwersytetu w Glasgow z MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] i Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Jesteśmy wdzięczni kolegom i współpracownikom, którzy wspierali tę pracę: Danielowi Streickerowi, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Darii Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy'emu Lushasi, Charlesowi Kayukiemu, Jude Karlo Bolivarowi, Jeromirowi Bondocowi, Estevenowi Balbinowi, Ronnelowi Tongohanowi, Agatha Ukande, Davisowi Kuchace, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana i Annie Czuprynie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa marki
Software
Oprogramowanie do sekwencjonowania
(MinKnow)		Oxford Nanopore Technologieshttps://community.nanoporetech.com/downloads
zestaw narzędzi bioinformatycznych
(Guppy)		Oxford Nanopore Technologieshttps://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
Equipment
Thermal cycler
(miniPCR™ mini16 thermal cycler)		CambioMP-QP-1016-01
Homogenizator
(Homogenizator dotykowy Precellys Evolution)		Bertin InstrumentsEQ02520-300
Cold Racks (0,2-0,5 mL)
(PCR Mini-cooler z przezroczystą pokrywą)		MARKA 781260
Pipettor
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL)Gilson SKU: FA10030
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL)Gilson Kod produktu: FA10024
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL)Gilson SKU: FA10020
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL)Gilson SKU: FA10025
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL)Gilson SKU: FA10021
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL)Gilson SKU: FA10026
Fluorometr
(Qubit  4 Fluorometr) 		Thermofisher scientific/Fisher scientificQ33238
Laptop 
(Dowolna marka z ~2 GB miejsca na dysku, minimum 512 GB przestrzeni dyskowej, instalator msi [GPU])Mikrowirówka

(Wirówka z chłodzeniem)		Thermofisher scientific/Fisher scientific75004081
Mieszalnik wirowy
(Podstawowy mieszalnik wirowy) 		Thermofisher scientific/Fisher scientific88882011
Stojak magnetyczny
(DynaMag -2 Magnet)		Thermofisher scientific/Fisher scientific12321D
Urządzenie do sekwencjonowania
(MinION)		Oxford Nanopore TechnologiesMinION Mk1B
RNA Ekstrakcja  Zestaw do ekstrakcji
RNA
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		Qiagen74106
 
(RNA później)  InvitrogenAM7020
(DNA/RNA Shield)Zymo ResearchR1100-50
PCR
Woda wolna od nukleaz
(Woda wolna od nukleaz [not  Poddany działaniu DEPC])		Thermofisher scientific/Fisher scientificAM9937
Master mix do syntezy pierwszej nici cDNA
(LunaScript RT SuperMix Kit)		New England BiolabsE3010S
Mistrzowska mieszanka amplifikacji DNA
(Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])		New England BiolabsM0494L
Primer (schemat)
(Custom DNA oligos)		Invitrogen
SPRI Bead Clean-up
Beads
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		CambioAL-AC1003-50
Etanol, czysty absolut, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen]Merck818760
Short Fragment buffer
(SFB expansion pack)		Oxford Nanopore TechnologiesEXP-SFB001
Oznaczanie ilościowe DNA
zestaw do kwantyfikacji DNA
(Zestaw do oznaczania kubitów® dsDNA HS)		Thermofisher scientific/Fisher scientificQ32854
probówki do oznaczania ilościowego DNA
(Qubit ™ Probówki testowe)		Thermofisher scientific/Fisher scientificQ32856
End Prep and barcoding
(Qubit ™ Probówki testowe)
End Prep master mix
(NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)		New England BiolabsE7546L
Zestaw
*Chemia 9  Oxford Nanopore Technologies*Chemia 9 
(Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12)EXP-NBD104 
(Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 13-24)  EXP-NBD114 
(Native Barcoding Expansion 96)EXP-NBD196
*Chemistry 14Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 14
(niezgodny)  (niezgodny) 
(Natywny zestaw kodów kreskowych 24 V14)SQK-NBD114.24
(Natywny zestaw kodów kreskowych 96 V14)SQK-NBD114.96
Ligacja mastermix
(Blunt/TA Ligase Master Mix)		New England BiolabsM0367S
Adapter Ligation
Adapter podwiązywania mastera mix
(NEBNext  Moduł szybkiego podwiązywania)New England BiolabsE6056S   
(Moduł podwiązania NEBNext Ultra II)  New England BiolabsE7595S
(Blunt/TA Ligase Master Mix)New England BiolabsM0367S
Adapter mix
*Chemia 9  Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 9
EXP-AMII001
(Adapter Mix II [AMII])
*Chemistry 14Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 14
EXP-NBA114
(Adapter natywny [NA])
Sekwencjonowanie 
Zestaw do gruntowania Flowcell
*Chemia 9  Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 9
EXP-FLP002
(Flush Buffer [FB])
(Flush Tether [FT])
*Chemistry 14Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 14
EXP-FLP004
(Flow Cell Flush [FCF])
(Flow Cell Tether [FCT])
Zestaw do sekwencjonowania ligacji 
*Chemia 9  Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 9
SQK-LSK109
Adapter Mix
(Adapter Mix [AMX])
Bufor ligacyjny
(Bufor ligacyjny [LNB])
Short Fragment Buffer
(Short Fragment buffer [SFB])
Bufor sekwencjonujący
(Bufor sekwencjonujący [SQB])
Bufor elucyjny
(Bufor elucyjny [EB])
Ładowanie koralików
(Ładowanie koralików [LB])
Sekwencjonowanie uwięzi
(Sekwencjonowanie uwięzi [SQT])
*Chemistry 14Oxford Nanopore Technologies*Chemistry 14
SQK-LSK114
Adapter Mix
(Adapter do ligacji [LA])
Bufor ligacyjny
(Bufor ligacyjny [LNB])
Bufor krótkich fragmentów
(Bufor krótkich fragmentów [SFB])
Bufor sekwencjonowania
(Bufor sekwencjonowania [SB])
Bufor elucyjny
(Bufor elucyjny [EB])
Ładowanie koralików
(Ładowanie koralików [LIB])
Sekwencjonowanie Tether
(Flow Cell Tether [FCT])
Rozwiązanie biblioteczne
(Rozwiązanie biblioteczne [LIS])
Bufor do płukania
(Płukanie komory przepływowej [FCF])
Komórka przepływowa 
*Chemia 9  Oxford Nanopore Technologies*Chemia 9
FLO-MIN106D
(Komórka przepływowa  [R9.4.1])
*Chemia 14Oxford Nanopore Technologies*Chemia 14
FLO-MIN114
(Komórka przepływowa  [R10.4.1])Mycie
Flow Cell 
Zestaw do mycia komór przepływowych
(Zestaw do mycia komór przepływowych)		Oxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004
Materiały eksploatacyjne 
Odkażanie powierzchni 
(DNA Away Surface Deminant, butelka do wyciskania [Molecular Bio])Thermofisher scientific/Fisher scientific7010PK
em>(RNase Away Surface Deminant, butelka [Molecular Bio])Thermofisher scientific/Fisher scientific7002PK
Pasek z 8 probówkami do PCR 0,2 ml, indywidualna nakrętka
(8-tubowy pasek do PCR 0,2 ml, z indywidualnie dołączonymi płaskimi nakrętkami, sterylny, DNAse/RNAse, bez pirogenów, naturalny [Greiner])		Greiner608281
probówka do PCR 0,2 ml
(probówka do PCR 0,2 ml, naturalna [wypukła nakrętka] pakowana w 500s, niesterylna [Greiner])		Greiner671201
1000 i mikro; L Końcówki filtrów (500)
(ułożone 1000 i mikro; L Końcówki filtrów [500])		Thermofisher scientific/Fisher scientific11977724
100µ L Końcówki filtracyjne (1000)Thermofisher scientific/Fisher scientific11947724
10µ L Końcówki filtrów (1000)
(ułożone 100 i mikro; L Końcówki filtrów [1000])		Thermofisher scientific/Fisher scientific11907724
Rurki wzmocnione  rurki (2ml)  z nakrętkami i o-ringami
(Fisherbrand™   Probówki zbiorcze)		Thermofisher scientific/Fisher scientific15545809
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)
(1,5 ml probówki Eppendorf [500])		Probówki Eppendorf1229888
DNA LoBind  (1,5 ml)
(probówki DNA LoBind)		Thermofisher scientific/Fisher scientific10051232
Etykiety Cryobabies Rękawiczki
(S/M/L)
Ręcznik papierowy
Odczynniki stabilizujące RNA SPRI kodów kreskowych<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002(2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709(2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739(2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144(2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52(2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166(2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525(2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749(2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164(2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231(2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632(2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004(2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24(2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830(2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003(2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403(2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619(2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388(2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008(2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416(2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709(2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023(2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3(2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272(2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39(2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nadz r genomicznyoptymalizacja starter wmultiplex PCRprzypisanie liniianaliza filogenetycznagenomy wirusowebase calling

Powiązane artykuły