Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.
Artykuł metodologiczny
Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroby naczyniowe stanowią podstawę większości chorób sercowo-naczyniowych (CVD), które pozostają główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Pilnie potrzebne są skuteczne interwencje chirurgiczne i farmakologiczne w celu zapobiegania i leczenia chorób naczyniowych. Częściowo brak modeli translacyjnych ogranicza zrozumienie procesów komórkowych i molekularnych związanych z chorobami naczyniowymi. Bioreaktory do hodowli perfuzyjnych ex vivo stanowią idealną platformę do badania dużych naczyń krwionośnych zwierząt (w tym ludzi) w kontrolowanym, dynamicznym środowisku, łącząc łatwość hodowli in vitro i złożoność żywej tkanki. Większość bioreaktorów jest jednak produkowana na zamówienie, a zatem trudna do przyjęcia, co ogranicza odtwarzalność wyników. W tym artykule przedstawiono system wydrukowany w 3D, który można łatwo wyprodukować i zastosować w dowolnym laboratorium biologicznym, a także przedstawiono szczegółowy protokół jego konfiguracji, umożliwiający działanie użytkowników. Ten innowacyjny i powtarzalny system hodowli perfuzyjnej ex vivo umożliwia hodowlę naczyń krwionośnych do 7 dni w warunkach fizjologicznych. Oczekujemy, że przyjęcie standaryzowanego bioreaktora perfuzyjnego przyczyni się do lepszego zrozumienia procesów fizjologicznych i patologicznych zachodzących w dużych naczyniach krwionośnych zwierząt oraz przyspieszy odkrywanie nowych środków terapeutycznych.
Wprowadzenie
Ściana naczyń krwionośnych istnieje w stanie stacjonarnym, co zapewnia zarówno reakcję na bodźce zewnętrzne (np. zmiana ciśnienia, czynniki zwężające naczynia krwionośne), jak i stałą, nieaktywującą powierzchnię zapobiegającą krzepnięciu krwi i infiltracji komórek zapalnych1. W odpowiedzi na bodźce związane ze starzeniem się i stylem życia oraz przy bezpośrednim uszkodzeniu, ściana naczyń aktywuje procesy przebudowy, takie jak restenoza i miażdżyca, które są znanymi czynnikami przyczyniającymi się do powszechnych chorób sercowo-naczyniowych (CVD), takich jak udar niedokrwienny mózgu i zawał mięśnia sercowego2. Chociaż dostępne są podejścia interwencyjne, takie jak przezskórna rewaskularyzacja i stentowanie, w celu zwalczania zaawansowanych objawów choroby naczyniowej, wiadomo, że wywołują one dalsze uszkodzenia naczyń, często prowadząc do nawrotu. Ponadto dostępne są tylko ograniczone rozwiązania zapobiegawcze i wczesnoetapowe. Zrozumienie mechanizmów utrzymujących homeostazę ścian naczyniowych i napędzających ich dysfunkcję jest podstawą opracowywania nowych leków3.
Pomimo ciągłego rozwoju i postępu w biologii molekularnej i inżynierii tkankowej, badania na zwierzętach pozostają kluczowym elementem badań nad biologią naczyniową. Badania in vivo na zwierzętach dostarczyły ogromnego wglądu w mechanizmy homeostazy i patologii naczyń krwionośnych; Procedury te są jednak kosztowne, mają stosunkowo niską przepustowość i stwarzają poważne problemy etyczne. Ponadto małe zwierzęta są słabo reprezentatywne dla ludzkiej fizjologii naczyń krwionośnych, a większe eksperymenty na zwierzętach są znacznie droższe i stwarzają dalsze rozważania etyczne4,5. Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na rozwiązania farmaceutyczne i medyczne dla szybko starzejącej się populacji, wady wykorzystywania zwierząt są spotęgowane, co wpływa na odtwarzalność, wiarygodność i możliwość przenoszenia wyników do opieki nad pacjentem6.
Systemy in vitro oferują uproszczoną platformę do badania podstawowych mechanizmów, ale nie są w stanie podsumować złożoności całej tkanki, interakcji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową oraz sił mechanicznych, które są krytycznymi determinantami w rozwoju chorób naczyniowych7.
Badania ex vivo przeprowadzone na całych tkankach utrzymywanych w sztucznie kontrolowanych środowiskach naśladują złożoność in vivo, umożliwiając jednocześnie stosunkowo wysokoprzepustowe badania8. Biorąc pod uwagę możliwość ścisłej kontroli warunków hodowli i środowiska, modele ex vivo umożliwiają szeroki zakres złożonych badań i stanowią odpowiednią alternatywę w celu ograniczenia stosowania procedur na zwierzętach w biologii naczyniowej. Statyczne hodowle pierścieni naczyniowych dostarczyły interesujących spostrzeżeń, ale nie uwzględniły kluczowego elementu hemodynamicznego9. Rzeczywiście, badanie układu naczyniowego ex vivo stawia szczególne wyzwania związane z wieloma dynamicznymi siłami, które działają na komórki w ścianie naczynia krwionośnego. Bodźce takie jak przepływ światła, turbulencje, naprężenia ścinające, ciśnienie i deformacja ścian znacząco wpływają na patofizjologię tkanek10,11,12.
Bioreaktory perfuzyjne są niezbędne do badania homeostazy naczyń krwionośnych i przebudowy w odpowiedzi na uszkodzenia lub zmiany hemodynamiczne13. Co więcej, kultura perfuzyjna może być stosowana w celu poprawy dojrzewania i trwałości naczyń krwionośnych inżynierii tkankowej (TEBV), zapewniając odpowiednią alternatywę dla przeszczepów naczyniowych14.
Dostępne na rynku bioreaktory perfuzyjne mają ograniczoną elastyczność i zdolność adaptacji oraz są kosztowne. Wiele z istniejących, opracowanych przez nas bioreaktorów jest trudnych do odtworzenia w innych laboratoriach ze względu na ograniczone opisy i niedostępność specjalnie wykonanych komponentów7,8,9,10,11,12. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy niedawno nowy bioreaktor (EasyFlow), który jest ekonomiczny w produkcji, mieści szereg tkanek i umożliwia stosunkowo proste modyfikacje w celu dostosowania do różnych wymagań badawczych13. Wkładka jest drukowana w 3D i pasuje jak w pokrywie standardowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Jego modułowa konstrukcja i produkcja druku 3D sprawiają, że jest dostępny i powtarzalny w różnych laboratoriach, a także łatwo modyfikowalny w celu dostosowania do różnych potrzeb naukowych. Protokół ten opisuje montaż i podstawowe działanie systemu bioreaktora w warunkach perfuzji tętniczej.
Protokół
Niniejszy protokół opisuje montaż i zastosowanie systemu składającego się z dwóch wkładów EasyFlow (bioreaktora): jednego pełniącego rolę komory reakcyjnej (C), zawierającej perfundowaną próbkę tętnicy, oraz drugiego funkcjonującego jako rezerwuar medium (R) (Rysunek 1 oraz Rysunek 2A). Tętnice szyjne pobrano od 4-6-tygodniowych prosiąt płci męskiej i żeńskiej (6-12 kg) z The Pirbright Institute w Wielkiej Brytanii. Procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z ustawą Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) i zostały one zatwierdzone przez Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) w The Pirbright Institute. Zwierzęta przetrzymywano zgodnie z Kodeksem dobrych praktyk dotyczącym zakwaterowania i opieki nad zwierzętami hodowlanymi. Wszystkie procedury zostały wykonane przez posiadaczy licencji osobistych, którzy zostali przeszkoleni i uznani za kompetentnych w ramach licencji projektowej PPL70/8852. Prosięta uśmiercono zgodnie z metodą przewidzianą w harmonogramie ASPA.
1. Produkcja insertu
- Wyprodukuj wkładkę za pomocą druku 3D, korzystając z dostarczonego modelu 3D (Supplementary File 1).
UWAGA: Modelowanie 3D umożliwia łatwe wprowadzanie zmian w projekcie w celu dostosowania go do nowych zastosowań. Do produkcji wkładki można wykorzystać również alternatywne materiały i techniki wytwarzania. Ze względu na złożoną strukturę wewnętrzną odpowiednimi alternatywami są selektywne spiekanie laserowe oraz stereolitografia15. Poliamid 12 (PA12; patrz Table of Materials) jest odpowiednim materiałem ze względu na doskonałe właściwości w zakresie zatrzymywania cieczy oraz odporność na powtarzalne cykle sterylizacji termicznej16. - Wyprodukuj silikonowe uszczelki i podkładki z poliwęglanu metodą cięcia laserowego17, korzystając z projektów dostarczonych w Supplementary File 2.
UWAGA: Cięcie laserowe jest tanią metodą produkcji, którą łatwo zlecić na zewnątrz. Podkładki mogą zostać wykonane ze stali nierdzewnej, co zapewni większą trwałość komponentu przy wielokrotnym użytkowaniu. Wszystkie pozostałe elementy są dostępne w sprzedaży. Pełna lista wymaganych materiałów znajduje się w Table 1. Szczegóły handlowe produktów zawarto w Table of Materials.
2. Sterylizacja, montaż i przygotowanie urządzenia
- Sterylizować wszystkie komponenty zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1.
- W warunkach przepływu laminarnego złożyć dwa wykonane wkłady (krok 1), jak pokazano na Rysunku 1A.
- Złożyć system perfuzyjny zgodnie z Rysunkiem 2, wykonując poniższe kroki:
- Przymocować dwa połączone zawory trójdrożne do portu R1 zbiornika (port wymiany mediów).
- Połączyć powstałe wyjście z głowicą pompy perystaltycznej za pomocą rurki wyposażonej w zawór jednokierunkowy (rurka z zaworem jednokierunkowym).
- Połączyć głowicę pompy z portem C4 komory reakcyjnej za pomocą przewodów systemowych wyposażonych w zawór jednokierunkowy.
UWAGA: Odgałęzienie to może opcjonalnie zostać wyposażone w czujnik ciśnienia umożliwiający stałe monitorowanie. - Połączyć port C1 komory reakcyjnej z elastyczną rurką, a tę z kanałem oporowym (mała średnica wewnętrzna).
UWAGA: Długość rurki oporowej będzie miała ogromny wpływ na ciśnienie panujące w systemie. Należy to dodatkowo zbadać, aby zapewnić odpowiednie warunki perfuzji. - Przedłużyć kanał oporowy przewodami systemowymi, tworząc kanał powrotny i zamykając pętlę krążenia luminalnego poprzez połączenie ze zbiornikiem w R5 (Rysunek 2C).
- Utworzyć kanał przelewowy, łącząc port C3 komory reakcyjnej z portem R3 zbiornika za pomocą przewodów systemowych.
- Zamocować filtr wentylacyjny przez R2.
- Utworzyć tłumik ciśnienia, łącząc strzykawkę zawierającą powietrze i media z portem C6 komory reakcyjnej.
UWAGA: Prawidłowy stosunek powietrza do mediów będzie zależał od wymaganego tłumienia ciśnienia.
- Wypełnić system medium perfuzyjnym (Dulbecco's modified eagle medium [DMEM] + 10% [v/v] fetal bovine serum [FBS] + 1% [v/v] penicillin-streptomycin + 1% [v/v] amphotericin B + 30% [v/v] dextran; patrz Tabela Materiałów) przez porty wymiany mediów i zbiornik.
UWAGA: Wstępne wypełnienie systemu zmniejsza ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza w układzie i pozwala zidentyfikować potencjalne nieszczelności. Zalecana objętość mediów wynosi około 100-120 mL. Wykorzystana objętość będzie zależeć od objętości martwej przewodów użytych w eksperymencie.
3. Pozyskiwanie i przygotowanie próbek
- Pobrać lewą i prawą wspólną tętnicę szyjną, minimalizując bezpośrednie manipulowanie tkanką tętniczą13.
- Umieścić tkankę w zimnym medium transportowym (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicylina-streptomycyna + 1% [v/v] amfoterycyna B, patrz Tabela materiałów) w celu przeniesienia.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza usunąć nadmiar tkanki łącznej i przyciąć końce tkanki za pomocą ostrza skalpela. Przemyć tkankę dwukrotnie w zimnym medium transportowym.
- Umieścić tkankę w medium transportowym na wytrząsarku orbitalnym na co najmniej 30 min w celu dokładnego przemycia.
- Podłączyć niegałęziący się odcinek tętnicy do systemu bioreaktora, używając dwóch złączek luer z karbem i przymocować go za pomocą wiązania naczyniowego (silikonowe więzadła naczyniowe; Tabela 1).
UWAGA: Wiązanie naczyniowe zapewnia odpowiednie napięcie i retrakcję w celu zabezpieczenia naczynia. Przekrój owalny zapobiega uszkodzeniu tkanki. - Powoli przepuścić medium przez tętnicę, aby sprawdzić jej drożność.
- Po przymocowaniu tętnicy do wykonanego insertu, wypełnić przestrzeń reakcyjną medium perfuzyjnym (krok 2.4). Na koniec powoli wypełnić pętlę krążenia luminalnego medium, aby usunąć z systemu wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza.
- Połączyć przestrzeń reakcyjną z wcześniej zmontowanym systemem perfuzyjnym (sekcja 2), domykając obieg.
UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości za pomocą immunohistochemii przetworzonej tkanki. Pozwala to na zidentyfikowanie ewentualnych uszkodzeń wynikających z nadmiernych manipulacji podczas przygotowania.
4. Hodowla perfuzyjna i wymiana pożywki
- Umieść system perfuzyjny w 37 °C inkubator z 5% CO22 a następnie podłączyć go do pompy perystaltycznej (patrz Tabela materiałów)
- Podłącz wszelkie dodatkowe (fakultatywne) systemy akwizycji danych, takie jak czujniki ciśnienia (patrz Tabela materiałów).
- Pozostawić układ do wyrównania potencjałów przez noc, przy niskim przepływie medium wynoszącym ok. 10–15 ml/min.
UWAGA: Wymagane jest przeprowadzenie wstępnych eksperymentów w celu ustalenia ustawień pompy, przepływu pożywki, ciśnienia w systemie oraz optymalnych ustawień tłumików ciśnienia/zacisków, aby zapewnić spełnienie odpowiednich warunków. - Następnego dnia stopniowo zwiększaj przepływ (+1 obr./min co godzinę, co w obecnym systemie odpowiada przyrostowi o ok. 2,5 ml/min co godzinę), aż do osiągnięcia końcowej prędkości przepływu (35 ml/min). Okresowo monitoruj system pod kątem nieszczelności.
UWAGA: Aby obliczyć dokładny przepływ na podstawie prędkości pompy perystaltycznej, użytkownicy muszą najpierw przeprowadzić odpowiednią kalibrację pompy18Korzystając z wzoru (1), natężenie przepływu objętościowego (Q) można obliczyć na podstawie objętości pobranej cieczy (V) w określonym czasie (t). Aby obliczyć szacowaną prędkość przepływu (
) możemy wykorzystać wcześniej obliczoną prędkość przepływu (Q) oraz pole przekroju naczynia (A), opisane w równaniu (2).
(1)
(2) - Co 3 dni wymieniaj 50% pożywki (~50 mL), podłączając strzykawkę wypełnioną świeżą pożywką do portu wymiany pożywki znajdującego się bliżej pompy oraz pustą strzykawkę do portu bliżej zbiornika w celu zebrania zużytej pożywki (Rysunek 2).
UWAGA: Wykorzystanie dwóch zaworów trójdrożnych jako portów wymiany pożywki umożliwia ciągłość perfuzji podczas wymiany medium. - Po zakończeniu eksperymentu pobierz tkankę z komory reakcyjnej, odcinając końce połączone z bioreaktorem za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.
- Zdemontować, wyczyścić i wysterylizować układ w celu dalszego użytkowania.
5. Analiza próbek
- Utrwal pobraną próbkę w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
- Zatop tkankę w medium OCT (optimal cutting temperature; patrz Tabela materiałów)19 i zamroź poprzez zanurzenie w izopentanie schłodzonym w ciekłym azocie.
- Przygotuj krioprzekroje o grubości 3-5 mm za pomocą kriotomu.
- Wykonaj immunohistochemię (hematoksylina i eozyna [H&E]) i/lub immunofluorescencję. Postępuj zgodnie z typowym protokołem immunofluorescencji:
- Blokuj skrawki przez 1 h w temperaturze pokojowej z zastosowaniem 20% [v/v] surowicy koziej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; patrz Tabela materiałów).
- Inkubuj skrawki przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnym przeciwciałem króliczym przeciwko CD31 rozcieńczonym 1:50 w PBS (patrz Tabela materiałów).
- Przepłucz trzy razy w PBS przez 5 min.
- Inkubuj przez 1 h w temperaturze 37 °C z fluorescencyjnie znakowanym wtórnym przeciwciałem kozim przeciwko króliczym rozcieńczonym 1:200 w PBS oraz bezpośrednio sprzężonym z fluoresceincją przeciwciałem przeciwko α-aktynie mięśni gładkich (SMA) rozcieńczonym 1:200 w PBS (patrz Tabela materiałów).
- Przepłucz trzy razy w PBS przez 5 min.
- Barw jądra komórkowe DAPI rozcieńczonym 1:1 000 w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Inkubuj z 0,1% (w/v) Sudan Black (patrz Tabela materiałów) w 70% (v/v) etanolu przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby zredukować autofluorescencję tkanki.
- Przepłucz tkankę obficie wodą dejonizowaną. Zamknij preparaty za pomocą medium montażowego.
- Wykonaj obrazowanie próbek przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.
Wyniki
W niniejszym badaniu opracowano wszechstronny i niedrogi system perfuzyjny (EasyFlow)13. Konstrukcja systemu wykonana w technologii druku 3D ułatwia jego wdrożenie w innych laboratoriach, a tym samym sprzyja powtarzalności badań.
Wykonany wkład perfuzyjny umieszczony jest w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL, co tworzy izolowane środowisko. Wykorzystując dwa wkłady perfuzyjne, można stworzyć pętlę perfuzyjną składającą się z rezerwuaru i komory reakcyjnej, w której inkubowana jest próbka biologiczna. Następnie system perfuzyjny zostaje podłączony do pompy perystaltycznej i opcjonalnych systemów akwizycji, takich jak czujniki ciśnienia i urządzenia ultradźwiękowe, w celu monitorowania warunków hodowli (Rysunek 2).
Próbki tętnicy szyjnej świni zostały pobrane i przetworzone przed poddaniem ich 7-dniowej hodowli w układzie perfuzyjnym. Aby zapewnić jakość tkanki przed hodowlą, przeprowadzono wstępne eksperymenty, w których próbki utrwalano w momencie pobrania, po przygotowaniu tkanki oraz po perfuzji. Do oceny zachowania integralności tkanki wykorzystano barwienie fluorescencyjne markerów śródbłonka (CD31) i mięśni gładkich (αSMA). Przykłady tkanek dobrze zachowanych oraz uszkodzonych przedstawiono w Rysunku 3 w celu porównania. Obrazy te wskazują na znaczenie delikatnego obchodzenia się z tkanką podczas pobierania, ponieważ nieprawidłowe przetwarzanie (nadmierne rozciąganie, zmiażdżenie itp.) może doprowadzić do utraty śródbłonka przed rozpoczęciem hodowli. Wyniki wykazują również istotność stopniowego wprowadzania perfuzji, aby uniknąć uszkodzeń światła naczynia.
Barwienie H&E wykonano wraz z barwieniem immunofluorescencyjnym (IF), aby wykazać utrzymanie morfologii i ogólnego rozkładu komórek w ścianie naczynia po 7 dniach hodowli (Rycina 4). Zastosowanie fizjologicznych warunków hodowli w urządzeniu zapewnia utrzymanie pokrycia śródbłonkiem światła naczynia, prawidłowe ustawienie komórek mięśni gładkich w błonie środkowej oraz zachowanie vasa vasorum w błonie zewnętrznej.
Kompaktowa i modułowa konstrukcja systemu bioreaktora umożliwia również szeroki zakres konfiguracji systemu. Mniejsza konfiguracja składa się z pojedynczego bioreaktora i jest idealna do badań farmakologicznych oraz badań o niskiej objętości (perfuzja z recyrkulacją20, objętość całkowita 50-70 mL). Aby wydłużyć czas hodowli i zmniejszyć liczbę wymian pożywki, bardziej odpowiedni jest system cyrkulacji z pojedynczym zbiornikiem, taki jak opisany w niniejszym protokole, lub system ciągłego zasilania, ponieważ posiadają one w obiegu większą objętość pożywki. Można utworzyć konfigurację z podwójną cyrkulacją21, aby badać warunki eksperymentalne, w których lokalizacja bodźców jest krytyczna. Obecne urządzenie można również połączyć z bardziej zaawansowanymi systemami sterowania, aby umożliwić precyzyjną kontrolę sprzężenia zwrotnego parametrów takich jak pH i tlen rozpuszczony (Rysunek 5).
Rysunek 1: Schematy montażowe układu EasyFlow. (A) Renderingi 3D ułatwiające montaż wkładu perfuzyjnego. (B) Szczegółowe schematy ułatwiające montaż miejsc połączeń. (C) Widok przekroju poprzecznego przestrzeni reakcyjnej uwydatnia kluczowe elementy wkładu EasyFlow oraz sposób połączenia tkanki z wkładem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schematyczny przedstawienie zestawu systemu perfuzyjnego. (A) Zmontowany system perfuzyjny zawierający wszystkie istotne komponenty, z zaznaczeniem ich względnego położenia w środowisku renderowanym w 3D. Nie wszystkie komponenty są przedstawione w tej samej skali. (B) Przedstawiono również poszczególne widoki izometryczne komponentów. (C) Pokazano widok z góry zmontowanego systemu perfuzyjnego, aby ułatwić montaż i połączenie poszczególnych elementów. Porty zostały oznaczone i ponumerowane przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby ułatwić nawigację po różnych miejscach połączeń w systemie perfuzyjnym. Zasadę tę zastosowano do zbiornika (R) oraz komory reakcyjnej (C). Różnym kanałom łączącym obie komory przypisano również nazwy w celu odniesienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3Konserwacja tkanki podczas przetwarzania. (AObrazy konfokalne przedstawiają prawidłową strukturę tętnicy w momencie pobrania, (B) po oczyszczeniu i przetworzeniu, oraz (C) po hodowli perfuzyjnej, wykazując zachowanie dobrze zachowanej morfologii. (D) Przykłady tkanek uszkodzonych w wyniku nadmiernego lub nieprawidłowego obchodzenia się z nimi podczas obróbki lub (E) z powodu zastosowania niefizjologicznych warunków hodowli (tj. nagłego wprowadzenia wysokiego przepływu) wykazują ubytek pokrycia światła oraz przerwanie ciągłości błony podstawnej. (FKontrola negatywna wskazuje specyficzność barwienia. CD31: zielony; αSMA: czerwony; DAPI: niebieski. Paski skali: 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 4: Ocena histologiczna tkanki przed i po hodowli perfuzyjnej.(A i B) Tkanka tętnicy została oceniona histologicznie w momencie pobrania i (C i D) po 7 dniach hodowli w systemie bioreaktora. (A i C) Barwienie H&E wykazuje zachowanie struktury i organizacji ściany tętnicy. (B i D) Barwienie immunofluorescencyjne tej samej tkanki potwierdza obecność pokrycia endotelialnego, uporządkowanie komórek mięśni gładkich oraz vasa vasorum w warstwie zewnętrznej. CD31: zielony; SMA: czerwony; DAPI: niebieski. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie możliwych konfiguracji perfuzji. Z wkładką perfuzyjną można zastosować różne alternatywne konfiguracje, aby umożliwić prowadzenie różnych badań eksperymentalnych. (A) Konfiguracja perfuzji z recyrkulacją minimalizuje objętość wymaganego medium. (B) Konfiguracja z ciągłym zasilaniem zapewnia stałą podaż medium do tkanki. (C) Cyrkulacja z jednym zbiornikiem (opisana w niniejszej pracy) zapewnia większą objętość medium dla długoterminowych inkubacji i obejmuje strefę buforową do wymiany powietrza i wyrównywania ciśnienia. (D) Konfiguracja z podwójną cyrkulacją zapewnia dwa odrębne obiegi, które niezależnie zasilają cyrkulację wewnętrzną (wewnątrz tętnicy) i zewnętrzną (przestrzeń reakcyjna). (E) Konfiguracja perfuzji dynamicznej obejmuje ciągłe doprowadzanie gazów i kontrolę pH za pomocą kontrolera proporcjonalno-całkująco-różniczkującego (PID). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Tabela 1: Komponenty do wykonania wkładów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający 1: Model 3D wkładki EasyFlow do produkcji metodą druku 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: Schematy konstrukcyjne zbudowanego urządzenia, przekrój, wydruk oraz elementy uszczelniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Systemy perfuzji naczyniowej ex vivo stanowią unikalną platformę do badania funkcji i zachowania komórek naczyniowych w ich natywnych tkankach w kontrolowanych warunkach, co umożliwia analizę złożonych procesów, takich jak pourazowa przebudowa naczyńkrwionośnych 22. Większość zgłoszonych bioreaktorów to jednak systemy własnej produkcji oparte na komponentach wykonanych na zamówienie i często są trudne do odtworzenia przez inne podmioty23. Istnieją alternatywne rozwiązania komercyjne, ale brakuje im elastyczności w projektowaniu i mogą być stosunkowo kosztowne24.
Opracowaliśmy alternatywny system, który zapewnia łatwą, tanią i powtarzalną platformę, którą można wytwarzać przy użyciu technik druku 3D typu open source13. W niniejszym artykule opisano konfigurację systemu w celu umożliwienia użytkownikom końcowym tworzenia powtarzalnych aplikacji. Taki układ umożliwia zastosowanie fizjologicznych i patologicznych warunków ciśnienia (40-180 mmHg), natężenia przepływu (6-30 ml/min) oraz w połączeniu z pożywkami naśladującymi lepkość krwi, o różnym stopniu naprężenia ścinającego.
Odtwarzalność jest istotnym aspektem procesu naukowego, ponieważ pozwala badaczom weryfikować odkrycia innych osób i wykorzystywać je do pogłębiania naszej wiedzy na temat chorób naczyniowych. Ponadto narzędzia, które umożliwiają i promują współpracę między grupami, są niezbędne do pogłębiania wiedzy naukowej. EasyFlow stanowi przykład takich dostępnych, dostępnych rozwiązań typu open source, które mogą być łatwo tworzone i wdrażane przez laboratoria pracujące nad szerokim zakresem projektów w dziedzinie nauk naczyniowych i nie tylko.
Donosimy, że ta hodowla urządzenia utrzymuje żywotność tkanki tętniczej przez co najmniej 7 dni i może być używana do modelowania określonych etapów choroby naczyniowej. Na tej podstawie można modelować fizjologiczne natężenia przepływu i warunki ciśnienia13. Co ważne, ta hodowla perfuzyjna jest opłacalna ze względu na niskie koszty produkcji i niewielką ilość pożywki niezbędnej do działania systemu.
Projekt 3D można również dostosować do nowych zastosowań, a także przetestować nowe materiały do druku. Nawet w obecnym formacie przestrzeń do przechowywania próbek można łatwo dostosować do próbek o różnych rozmiarach poprzez zmianę długości złączek lub otworu złączy typu luer. Należy zauważyć, że ze względu na modułowy charakter urządzenia i jego niewielkie wymiary, bioreaktor ten może być używany w kilku konfiguracjach (ilustracja 5) i może być stosowany do hodowli multipleksowych, w których kilka próbek może być jednocześnie wystawionych na działanie różnych warunków w oddzielnych bioreaktorach.
Przewiduje się, że zastosowanie systemu zostanie w przyszłości rozszerzone w celu wspierania hodowli naczyń krwionośnych o różnym pochodzeniu (np. różnych gatunków) i o różnym charakterze (np. żyły, limfatyczne), a być może także zastosowane do hodowli innych pustych tkanek (np. tchawicy, jelita). W szczególności badania pokazują, że hodowla rusztowań inżynierii tkankowej w stałej perfuzji pomaga w jednorodnym rozmieszczeniu komórek w konstrukcji i dojrzewaniu powstałej tkanki25,26. Ponadto wysiewanie przeszczepów naczyniowych w perfuzji przyczynia się do uzyskania bardziej równomiernie komórkowego światła naczyń w porównaniu z metodami statycznymi27. Z tego powodu przewidujemy, że system zostanie zastosowany w inżynierii tkankowej, aby pomóc w sprostaniu obecnym wyzwaniom, umożliwiając przyszły rozwój powtarzalnych syntetycznych substytutów naczyń krwionośnych28.
Opisany tutaj protokół przedstawia kilka ważnych kroków krytycznych dla powodzenia kultury przepływu. Ustalenie i monitorowanie odpowiednich warunków przepływu nie jest trywialne i musi być wykonywane w każdym systemie, gdy jest on uruchamiany po raz pierwszy, aby zapewnić, że warunki hodowli są fizjologiczne. Przepływ i ciśnienie monitorowano za pomocą czujników ciśnienia i obrazowania ultradźwiękowego. Kolejnym krytycznym punktem jest upewnienie się, że tkanka jest żywotna i nienaruszona na początku hodowli. Wymaga to świeżego źródła, ostrożnego obchodzenia się i może być zweryfikowane za pomocą analizy histologicznej. Ponadto na początku każdego eksperymentu należy przeprowadzić rozwiązywanie problemów, aby zidentyfikować potencjalne zanieczyszczenie bakteryjne lub źródło wycieku z mediów.
Należy podkreślić, że opisany system perfuzyjny, choć zapewnia fizjologiczne warunki ciśnienia i przepływu, nie jest w stanie całkowicie naśladować złożonych wzorców fal ciśnienia zarejestrowanych in vivo. To ograniczenie można przypisać użyciu pompy perystaltycznej i można je rozwiązać za pomocą bardziej specjalistycznego sprzętu do odtwarzania zaawansowanych warunków hemodynamicznych. Hodowla naczyń krwionośnych w bioreaktorze również nie jest w stanie sprostać badaniom, w których układ odpornościowy lub interakcja z innymi narządami ma kluczowe znaczenie.
Podsumowując, przedstawiono prosty drukowany w 3D system perfuzyjny, który może naśladować fizjologiczne środowisko hemodynamiczne, co ma przyczynić się do standaryzacji kultur naczyń krwionośnych ex vivo . Jego potencjał w zakresie dostosowywania i stosowania w długotrwałej hodowli sprawia, że jest to niezbędne narzędzie do pogłębiania zrozumienia tych złożonych systemów biologicznych w fizjologii i stanach patologicznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Centrum Patologii Weterynaryjnej przy Szkole Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu w Surrey za usługi histologiczne. Dziękujemy również doktorom L. Dixonowi, A. Reisowi i M. Henstockowi z Instytutu Pirbright (Pirbright, Wielka Brytania) za ich wsparcie w pozyskiwaniu tkanek zwierzęcych oraz Wydziałowi Nauk Biochemicznych Uniwersytetu w Surrey, a zwłaszcza zespołowi technicznemu za nieustające wsparcie. RSM był wspierany przez Doctoral College Scholarshipship Award (University of Surrey), DM i PC były wspierane przez National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (numery grantów: NC/R001006/1 i NC/T001216/1).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| EasyFlow | - | druk 3D przez MultiJet Fusion by Protolabs | |
| PA12 - Druk 3D | Protolabs | - | |
| Pompa perystaltyczna | Heidolph | PD5201 | |
| Składniki pożywki hodowlanej: | |||
| roztwór amfoterycyny B, 250 kubków / ml w wodzie dejonizowanej | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dekstran z Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka glukoza, z 4500 mg/L glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu i wodorowęglanem sodu | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Materiały do barwienia immunologicznego: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Kozia surowica | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Koza α-Królik Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Związek do optymalnego chłodzenia w temperaturze - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Królik & alfa;-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| Prowadnica adhezyjna X72 SuperFrost Plus, 25x75x1mm, Biała, 90° Szlifowane krawędzie, obszar matowy 20mm, 72/pudełko | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Aktyna mięśni gładkich (SMA) Alexa Fluor® 647-sprzężone przeciwciało | R& D Systems | IC1420R | |
| Materiał do laserowego cięcia elementów: | |||
| Przezroczysty arkusz z tworzywa sztucznego, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (do laserowego cięcia podkładek) | RS Components | 258-6590 | |
| RS Pro Półprzezroczysty gumowy arkusz gąbki, 600 mm x 600 mm x 1,5 mm (do laserowego cięcia uszczelek silikonowych) | RS Components | 840-5541 | |
| Opcjonalne monitory ciśnienia: | |||
| Czujnik ciśnienia | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| Monitor ciśnienia SciPres | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Wstępnie sterylizowane jednorazowe naczynia z tworzywa sztucznego: | |||
| filtr 0,2 um | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 ml Sterylna strzykawka | IMS Euro | 40004 | |
| 50 Rurka wirówkowa ml | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Małe elementy: | |||
| Opaski kablowe | - | - | |
| Złączki adaptera Masterflex, żeńskie Luer do węża z zadziorem | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Adapter kolczasty |
| Masterflex Złączki Luer z poliwęglanu | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylonowy miniaturowy zawór zwrotny | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS Pro Półprzezroczysty arkusz gąbki gumowej, 600 mm x 600 mm x 1,5 mm (do laserowego cięcia uszczelek silikonowych) | RS Components | 840-5541 | |
| Nakrętki sześciokątne M2 ze stali nierdzewnej | RS Components | 527-218 | |
| Stal nierdzewna M2 x 6 mm | RS Components | 418-7426 | |
| Nakrętki sześciokątne M5 ze stali nierdzewnej | Components | 189-585 | |
| Pętla naczynia chirurgicznego | Naczynia krwionośne Silikonowe opaski, Międzynarodowe zaopatrzenie medyczne | 10-1003 | |
| Zawory trójdrogowe | IMS Euro | 91000 | |
| Sprzęt | |||
| Kleszcze anatomiczne, GRAEFE, zakrzywione, 10 cm SKU: BD-07 | Międzynarodowe materiały medyczne | SKU: BD-07 | |
| Mikrokleszcze, kątowe, 0,3 mm, 11 cm | Międzynarodowe materiały medyczne | SKU: BD-361 | |
| Mikronożyczki Noyes, zakrzywione, 12 cm | Międzynarodowe materiały medyczne | SKU: FD-12 | |
| Skalpele chirurgiczne Troge - rozmiar 23 - Pudełko zawierające 100 | międzynarodowych materiałów medycznych | 63114 | |
| Dren: | |||
| Rurka silikonowa Eppendorf (średnica wewnętrzna 1,6 mm, średnica zewnętrzna 4,7 mm) | systemowa | Eppendorf | M0740-2396 |
| Masterflex Rurka 3-oporowa PharMed BPT | ISMATEC | 95714-48 | Rurka o miękkich ściankach (do zacisku) |
| RS PRO Przezroczysta rura węża, 0,8 mm ID, Silikonowe | RS Components | 667-8432 | Rurka oporowa ( mała średnica wewnętrzna) |
| Tygon do żywności (ID 4,8 mm, WT 1,6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | Rura zaworu jednokierunkowego |
| Żółta rura węża Verderflex, średnica wewnętrzna 6,4 mm, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Rurka pompy |
Bibliografia
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: Endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Gugliandolo, E., et al. Palmitoylethanolamide and Polydatin combination reduces inflammation and oxidative stress in vascular injury. Pharmacological Research. 123, 83-92 (2017).
- Anselmino, M., et al. Catheter ablation of atrial fibrillation in patients with left ventricular systolic dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Circulation, Arrhythmia, and Electrophysiology. 7 (6), 1011-1018 (2014).
- Viola, M., et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there. Journal of Controlled Release. 286, 301-314 (2018).
- Kim, D. D. In vitro cellular models for nasal drug absorption studies. Drug Absorption Studies: In Situ, In Vitro and In Silico Models. , 216-234 (2008).
- Lewis, D. I. Animal experimentation: Implementation and application of the 3Rs. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (6), 675-679 (2019).
- Rouwkema, J., et al. In vitro platforms for tissue engineering: Implications for basic research and clinical translation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e164-167 (2011).
- Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795(2021).
- Vaghela, R., et al. Vessel grafts for tissue engineering revisited-Vessel segments show location-specific vascularization patterns in ex vivo ring assay. Microcirculation. 29 (2), e12742(2022).
- Håkansson, J., et al. Individualized tissue-engineered veins as vascular grafts: A proof of concept study in pig. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 15 (10), 818-830 (2021).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. 45 (1), 50-59 (2010).
- Tosun, Z., McFetridge, P. S. Variation in cardiac pulse frequencies modulates vSMC phenotype switching during vascular remodeling. Cardiovascular Engineering and Technology. 6 (1), 59-70 (2015).
- Matos, R. S., Maselli, D., McVey, J. H., Heiss, C., Campagnolo, P. 3D printed bioreactor enabling the pulsatile culture of native and angioplastied large arteries. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 864580(2022).
- Neff, L. P., et al. Vascular smooth muscle enhances functionality of tissue-engineered blood vessels in vivo. Journal of Vascular Surgery. 53 (2), 426-434 (2011).
- Boparai, K. S., Singh, R. Advances in Fused Deposition Modeling. In: Module. Refrence in Materials Science and Materials Engineering. , Elsevier. (2017).
- McKeen, L. W. Chapter 6 - Polyamides (Nylons). The Effect of Creep and Other Time Related Factors on Plastics and Elastomers (Second Edition). McKeen, L. W. , William Andrew Publishing. 197-262 (2012).
- Moradi, M., Mehrabi, O., Azdast, T., Benyounis, K. Y. Enhancement of low power CO2 laser cutting process for injection molded polycarbonate). Optics & Laser Technology. 96, 208-218 (2017).
- Ghasem, N. Computer Methods in Chemical Engineering. , CRC Press. (2021).
- Lying, F., Gazi, F., Gardner, E. Preparation of tissues and cells for infrared and raman spectroscopy and imaging. Biomedical Applications of Synchrotron Infrared Microspectroscopy.RSC Analytical Spectroscopy Monographs. (11), 147-185 (2011).
- Sassi, L., et al. A perfusion bioreactor for longitudinal monitoring of bioengineered liver constructs. Nanomaterials. 11 (2), 275(2021).
- Haykal, S., et al. Double-chamber rotating bioreactor for dynamic perfusion cell seeding of large-segment tracheal allografts: Comparison to conventional static methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (8), 681-692 (2014).
- Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplant. 27 (9), 1375-1389 (2018).
- Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (97), 52565(2015).
- Alvino, V. V., et al. In vitro and in vivo preclinical testing of pericyte-engineered grafts for the correction of congenital heart defects. Journal of the American Heart Association. 9 (4), e014214(2020).
- Nerurkar, N. L., Sen, S., Baker, B. M., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Dynamic culture enhances stem cell infiltration and modulates extracellular matrix production on aligned electrospun nanofibrous scaffolds. Acta Biomaterialia. 7 (2), 485-491 (2011).
- Engebretson, B., Mussett, Z. R., Sikavitsas, V. I. The effects of varying frequency and duration of mechanical stimulation on a tissue-engineered tendon construct. Connective Tissue Research. 59 (2), 167-177 (2018).
- Saunders, S. K., et al. Evaluation of perfusion-driven cell seeding of small diameter engineered tissue vascular grafts with a custom-designed seed-and-culture bioreactor. PLoS One. 17 (6), e0269499(2022).
- Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Research. 7, (2018).
Przedruki i uprawnienia
