Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65488

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell and Gene Therapy Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Division of Oncology, Department of Pediatrics, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 4Division of Transfusion Medicine, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Streszczenie

Receptor antygenu chimerycznego (CAR)-T Limfocyty reprezentują obiecujące podejście immunoterapeutyczne w leczeniu różnych chorób złośliwych i niezłośliwych. Komórki CAR-T to genetycznie zmodyfikowane limfocyty T, które wyrażają chimeryczne białko, które rozpoznaje i wiąże się z celem na powierzchni komórki, powodując zabicie komórki docelowej. Tradycyjne metody produkcji ogniw CAR-T są pracochłonne, kosztowne i mogą wiązać się z ryzykiem zanieczyszczenia. CliniMACS Prodigy, zautomatyzowany procesor komórkowy, pozwala na wytwarzanie produktów terapii komórkowej na skalę kliniczną w systemie zamkniętym, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Przetwarzanie odbywa się półautomatycznie pod kontrolą komputera, a tym samym minimalizuje zaangażowanie człowieka w proces, co oszczędza czas i zmniejsza zmienność i błędy.

Ten manuskrypt i film opisują proces transdukcji limfocytów T (TCT) w produkcji komórek CAR-T przy użyciu tego procesora. Proces TCT obejmuje wzbogacanie limfocytów T CD4 + / CD8 +, aktywację, transdukcję wektorem wirusowym, ekspansję i zbiór. Korzystając z Matrycy Aktywności, funkcjonalności, która umożliwia uporządkowanie i określenie czasu tych kroków, proces TCT można w dużym stopniu dostosować. Przedstawiamy proces produkcji ogniw CAR-T zgodnie z aktualną Dobrą Praktyką Wytwarzania (cGMP) oraz omawiamy wymagane testy uwalniania i eksperymenty przedkliniczne, które będą wspierać wniosek o dopuszczenie do obrotu nowego leku eksperymentalnego (IND). Pokazujemy wykonalność i omawiamy zalety i wady stosowania półautomatycznego procesu do klinicznej produkcji komórek CAR-T. Na koniec opisujemy trwające badanie kliniczne zainicjowane przez badaczy, które jest ukierunkowane na nowotwory złośliwe komórek B u dzieci [NCT05480449] jako przykład tego, jak ten proces produkcyjny można zastosować w warunkach klinicznych.

Wprowadzenie

Adopcyjny transfer limfocytów T zmodyfikowanych tak, aby wyrażały chimeryczny receptor antygenowy (CAR), wykazał niezwykłą skuteczność w leczeniu pacjentów z opornymi na leczenie nowotworami złośliwymi komórek B1,2,3,4,5. Jednakże tradycyjne metody wytwarzania komórek CAR-T są pracochłonne, czasochłonne i wymagają wysoko wykwalifikowanych techników do przeprowadzenia bardzo specjalistycznych etapów. Na przykład tradycyjny proces produkcji autologicznego produktu z komórek CAR-T obejmuje wirowanie w gradiencie gęstości, elutriację lub separację magnetyczną w celu wzbogacenia frakcji limfocytów T, aktywację i transdukcję wektorem wirusowym w sterylnej kolbie oraz ekspansję w bioreaktorze przed zbiorem i formulacją. W ostatnim czasie pojawiło się wiele systemów mających na celu częściową automatyzację tego procesu. Przykładem jest Miltenyi CliniMACS Prodigy (zwany dalej „procesorem”), który jest zautomatyzowanym urządzeniem do przetwarzania komórek, mogącym wykonywać wiele z tych etapów w sposób zautomatyzowany6,7,8,9. Szczegółowa dyskusja na temat tradycyjnych i zautomatyzowanych metod wytwarzania CAR-T została przedstawiona w niedawnym artykule przeglądowym10.

Procesor opiera się na funkcjonalności systemu CliniMACS Plus, urządzenia medycznego zatwierdzonego przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do przetwarzania komórek progenitorowych krwiotwórczych. Procesor zawiera jednostkę hodowli komórkowej, która umożliwia zautomatyzowane przemywanie, frakcjonowanie i hodowlę komórek (Rycina 1). Proces transdukcji limfocytów T (TCT) jest wstępnie zdefiniowanym programem w urządzeniu procesora, który w dużej mierze odtwarza ręczną produkcję komórek CAR-T. TCT pozwala na konfigurowalne przetwarzanie komórek za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (tzw. „Activity Matrix”, Rycina 2). Ponieważ procesor automatyzuje wiele etapów i konsoliduje funkcjonalność wielu urządzeń w jednej maszynie, wymaga on od technologów mniejszego przeszkolenia i rzadszego stosowania specjalistycznych umiejętności rozwiązywania problemów. Ponieważ wszystkie etapy są wykonywane w zamkniętym, jednorazowym zestawie drenów, procesor może być eksploatowany w placówkach z mniej rygorystyczną infrastrukturą uzdatniania powietrza, niż byłoby to uznane za dopuszczalne w przypadku otwartego procesu produkcyjnego. Na przykład procesor wykorzystujemy w placówce certyfikowanej zgodnie z normą ISO klasa 8 (odpowiednik klasy C według norm UE).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Produkcja komórek CAR-T przy użyciu systemu transdukcji limfocytów T. Przedstawiono procesor z zainstalowanym zestawem drenów. Zestaw drenów umożliwia połączenie innych komponentów, takich jak worki zawierające bufor procesowy, pożywkę hodowlaną i wektor lentiwirusowy, za pomocą zgrzewania sterylnego. Po dodaniu produktu leukaferezy do worka aplikacyjnego (Application bag), można go oznakować kuleczkami do selekcji limfocytów T (T Cell Selection Beads), przepuścić przez kolumnę separacyjną (Separation column), a następnie przenieść do worka reaktywacyjnego (Reapplication bag). Wyselekcjonowane komórki są następnie kierowane do jednostki hodowlanej (Cultivation unit) urządzenia w celu hodowli i aktywowane odczynnikiem aktywującym (patrz Tabela materiałów). Produkt końcowy jest zbierany do worka z komórkami docelowymi (Target cell bag). W trakcie całego procesu możliwe jest aseptyczne pobieranie próbek do kontroli jakości. Szare numery w kółkach reprezentują ponumerowane zawory w procesorze, które kierują przepływem cieczy przez zestaw drenów. Reprodukowano za zgodą 11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Macierz aktywności. Po selekcji i aktywacji limfocytów T pozostała część procesu wytwarzania komórek CAR-T jest w pełni konfigurowalna. Aktywności mogą być dodawane, usuwane i planowane na odpowiedni dzień i godzinę, a objętość hodowli po zakończeniu danej aktywności może zostać określona (Volume). Na przykład aktywność transdukcji została skonfigurowana tak, aby rozpoczęła się o godzinie 10:00 w dniu 1., a objętość hodowli na koniec tej aktywności została ustawiona na 100 mL. Macierz aktywności można edytować przez cały okres hodowli. Stan procesu można monitorować na zintegrowanym ekranie urządzenia procesowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Celem niniejszego opracowania jest szczegółowe przedstawienie procesu wytwarzania komórek CAR-T z wykorzystaniem procesora, a także udzielenie wskazówek dotyczących kontroli wewnątrzprocesowej oraz testów zwolnienia produktu, które prawdopodobnie będą wymagane przez organy regulacyjne w celu zatwierdzenia wniosku o dopuszczenie nowego leku do badań (IND). Przedstawiony protokół ściśle odpowiada zaleceniom producenta i stanowi podstawę protokołu IND 28617, który jest obecnie oceniany w jednocentrowym, inicjowanym przez badacza badaniu klinicznym fazy I/II. Badanie to ma na celu określenie bezpieczeństwa i skuteczności wykorzystania tego procesora do wytwarzania humanizowanych autologicznych komórek CAR-T skierowanych przeciwko CD19 dla pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B (B-ALL) lub chłoniakiem limfoblastycznym z linii B (B-Lly) [NCT05480449]. Badanie rozpoczęło się we wrześniu 2022 roku i zakłada włączenie do 89 pacjentów w wieku 0–29 lat z B-ALL lub B-Lly. W opracowaniu przedstawiamy niektóre wyniki procesu wytwarzania uzyskane w ramach tego badania.

Pragniemy zaznaczyć, że choć niniejszy tekst jest przedstawiony jako protokół z krokami do wykonania, należy go traktować jako punkt wyjścia dla innych osób rozpoczynających optymalizację własnego procesu wytwarzania komórek CAR-T. Niepełna lista możliwych modyfikacji przedstawionego protokołu obejmuje: wykorzystanie świeżych zamiast krio konserwowanych komórek T jako materiału wyjściowego; zastosowanie innej metody wzbogacania komórek T lub całkowite zrezygnowanie z tego etapu; użycie innych pożywek i koktajli cytokin, takich jak IL7/IL15 zamiast IL2; zmianę stężenia ludzkiej surowicy AB lub całkowitą rezygnację z niej; zmianę czasu transdukcji; zastosowanie transdukcji typu „multi-hit”; modyfikację intensywności mieszania, objętości hodowli i harmonogramu dokarmiania; wykorzystanie innych metod transferu genetycznego, w tym elektroporacji kwasów nukleinowych lub wektorów nielentiwiralnych; zastosowanie innego buforu do końcowej formulacji i/lub innego krioprotektanta; oraz infuzję świeżych komórek CAR-T zamiast ich krio konserwacji w celu późniejszej infuzji. Modyfikacje te mogą mieć istotny wpływ na skład komórkowy i aktywność produktu terapeutycznego.

Ogólny etap procesuDzień procesuSzczegóły techniczne
Wzbogacanie komórekDzień 0Selekcja limfocytów T CD4+/CD8+ 
Aktywacja komórekWysiew i aktywacja hodowli limfocytów T
Transdukcja komórekDzień 1Transdukcja lentiwirusowa (objętość hodowli 100 mL) 
Ekspansja komórek (następnie formulacja komórek)Dzień 2--
Dzień 3Płukanie hodowli (1 cykl); aktywacja wytrząsarki; zwiększenie objętości hodowli do 200 mL
Dzień 4--
Dzień 5Dokarmianie (50 mL); osiągnięcie końcowej objętości hodowli 250 mL
Dzień 6Próbka procesowa; wymiana pożywki (-125 mL / +125 mL)
Dzień 7Wymiana pożywki (-150 mL / +150 mL) lub zbiór 
Dzień 8Próbka procesowa; wymiana pożywki (-150 mL / +150 mL) lub zbiór
Dzień 9Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór
Dzień 10Próbka procesowa; wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór
Dzień 11Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór
Dzień 12Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór
Dzień 13Zbiór

Tabela 1: Harmonogram i przegląd procesu. Tabela ta podsumowuje etapy procesu TCT stosowane w aktualnym badaniu klinicznym [NCT05480449]. Proces rozpoczyna się w dniu 0 od wzbogacenia limfocytów T poprzez selekcję  CD4+/CD8+, zasiewu hodowli oraz aktywacji, a następnie transdukcji w dniu 1. Komórki spoczywają przez 48 h, po czym następuje przemycie hodowli, zwiększenie objętości hodowli do 200 mL oraz mieszanie za pomocą mechanizmu wstrząsowego. W dniu 6 pobierana jest pierwsza próbka kontrolna procesu. Komórki są zbierane, gdy dostępna jest ich liczba wystarczająca na co najmniej trzy pełne dawki komórek CAR-T (5 × 106 komórek CAR-T/kg, jeśli pacjent waży <50 kg, w przeciwnym razie 2.5 × 108 komórek CAR-T) oraz na testy kontroli jakości (~2 × 106 komórek CAR-T); lub gdy hodowla osiągnie łącznie 4-5 x 109 komórek. Skróty: TCT = transdukcja limfocytów T; CAR-T = limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym; MACS = magnetyczne sortowanie komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi za zgodą Institutional Review Board (IRB) szpitala, a wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na publikację danych zebranych w ramach badania.
UWAGA: Pierwsza sekcja protokołu zawiera ogólny przegląd procesu produkcji CAR-T. Pozostałe sekcje zawierają instrukcje krok po kroku. Protokół opisuje przebieg prac z wykorzystaniem oprogramowania TCT w wersji 1.4, która jest aktualna w momencie sporządzania tekstu. Interfejs użytkownika w innych wersjach oprogramowania TCT może się różnić.

1. Harmonogram i przegląd procesu (Tabela 1)

  1. Przygotuj się do procedury w poniedziałek (Dzień -1), przeprowadzając kontrole wstępne. Upewnij się, że procesor i pozostały sprzęt działają prawidłowo, a wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne są dostępne i mają aktualną datę ważności na cały cykl produkcyjny.
  2. W dniu 0 zainstaluj zestaw przewodów w urządzeniu. Rozmroź wcześniej kriokonserwowane limfocyty T w bloku grzejnym i połącz je za pomocą zgrzewania sterylnego z zestawem przewodów zainstalowanym w urządzeniu.
    UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że autologiczne limfocyty T zostały pobrane drogą aferezy, kriokonserwowane i przechowywane do rozpoczęcia produkcji. Choć możliwe jest użycie świeżo pobranych limfocytów T, zwiększa to obciążenie logistyczne, ponieważ wymaga skoordynowania poboru w aferezie z produkcją komórek CAR-T. Stanowczo zalecamy stosowanie procesu rozmrażania na sucho zamiast kąpieli wodnej, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji bakteryjnej.
  3. Oznacz limfocyty T odczynnikami CD4 i CD8 (patrz Tabela materiałów) i wzbogać je za pomocą selekcji magnetycznej.
    UWAGA: Można pominąć wzbogacanie limfocytów T lub przeprowadzić je przed załadowaniem komórek do procesora. Patrz sekcja 5 protokołu.
  4. Po wzbogaceniu komórek CD4+/CD8+ pobierz próbkę do zliczenia komórek. Zaszczep kulturę w ilości 1-2 × 108 komórek w początkowej objętości 70 mL pożywki (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej o 5% ludzkiej surowicy AB oraz rekombinantową ludzką IL2 (25 ng/mL).
  5. Dodaj fiolkę odczynnika aktywującego (koloidalną polimerową nanomatrycę sprzężoną z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28; patrz Tabela materiałów), aby aktywować limfocyty T, i inkubuj kulturę bez mieszania przez 24 h w temperaturze 37 ºC w atmosferze 5% CO2. Jeśli chcesz, kriokonserwuj pozostałe komórki CD4+/CD8+ jako zapasowe.
    UWAGA: W przypadku niepowodzenia produkcji można wykorzystać pozostałe wyselekcjonowane komórki CD4+/CD8+ jako materiał wyjściowy. Jeśli błąd był wyłącznie techniczny, np. kontaminacja lub błąd operatora, a pozostało wystarczająco dużo komórek, można rozważyć przeprowadzenie dodatkowego cyklu produkcyjnego z wykorzystaniem zapasowych komórek. Jeśli istnieje wątpliwość co do jakości materiału wyjściowego, może być konieczna nowa procedura aferezy; jest to jednak ostatecznie decyzja kliniczna. W każdym przypadku niepowodzenie produkcji jest istotnym zdarzeniem, które powinno zostać zbadane, a sponsor i ewentualnie organy regulacyjne powinny zostać o tym poinformowane.
  6. Po 24 h aktywacji przeprowadź transdukcję limfocytów T wektorem lentiwirusowym przy odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI).
    UWAGA: Przed rozpoczęciem produkcji produktów klinicznych krytyczne jest określenie miana wektora lentiwirusowego i ustalenie odpowiedniego MOI. Miano wektora należy określić, przeprowadzając eksperyment w małej skali, w którym pierwotne ludzkie limfocyty T są transdukowane przy różnych stężeniach wektora. Przy wyborze odpowiedniego MOI należy wziąć pod uwagę koszt wektora, pożądaną wydajność transdukcji oraz dopuszczalną liczbę kopii wektora. W tym protokole stosuje się MOI na poziomie 30-50%, aby zminimalizować koszt wektora i utrzymać średnią liczbę kopii wektora poniżej 8 kopii na transdukowaną komórkę.
  7. W dniu 3 uruchom czynność płukania kultury (Culture Wash) i rozpocznij mieszanie o niskiej intensywności. Zwiększ objętość kultury do 200 mL.
  8. W dniu 5 dodaj do kultury 50 mL pożywki, zwiększając objętość kultury do 250 mL.
  9. W 6. dniu hodowli pobierz próbkę z kultury i policz komórki CAR-T za pomocą cytometrii przepływowej. Wykorzystaj ten pomiar do oszacowania tempa wzrostu kultury i wyznaczenia optymalnego czasu zbioru.
    UWAGA: Każde pobranie próbki w trakcie procesu dostarcza 3 mL do badań i usuwa łącznie 7 mL objętości kultury.
  10. Od dnia 7 do 13, jeśli hodowla nie została zakończona, pobierz do dwóch dodatkowych próbek kontrolnych w dniach naprzemiennych i wykonuj codzienną wymianę pożywek, aby odżywić rosnącą kulturę. Zbierz produkt, gdy całkowita liczba komórek jądrzastych (TNC) osiągnie 5 × 109 i/lub gdy dostępna będzie wystarczająca liczba komórek dla wymaganej liczby dawek oraz badań zwalniających.
  11. W dniu zbioru pobierz próbkę kontrolną z aktywnie rosnącej kultury. Wykorzystaj tę próbkę do badań na obecność mikoplazmy, endotoksyn, lentiwirusów zdolnych do replikacji (RCL), badania liczby kopii wektora (VCN), zliczenia komórek, analizy wielkości komórek, cytometrii przepływowej oraz barwienia metodą Grama.
  12. Uruchom program końcowego zbioru, który inicjuje usunięcie pożywki hodowlanej i płukanie komórek końcowym buforem formulacyjnym (sterylnym izotonicznym roztworem krystaloidowym uzupełnionym o 4% ludzkiej albuminy surowiczej; patrz Tabela materiałów). Po zakończeniu zbioru docelowy worek z komórkami będzie zawierał 100 mL produktu komórkowego w końcowym buforze formulacyjnym. Dodaj dimetylosulfoksyd (DMSO) do stężenia 10% (v/v), podziel produkt na pojedyncze dawki i kriokonserwuj go, używając zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia.

2. Dzień -1: Przygotowanie i kontrole przedstartowe

  1. Zweryfikuj, czy poziom gazu CO2 oraz sprężone powietrze są wystarczające, aby uzyskać ciśnienie wlotowe wynoszące co najmniej 20 psi w każdej linii.
  2. Włącz procesor i potwierdź, że podczas uruchamiania nie wystąpiły żadne błędy. W razie potrzeby ustaw zegar na właściwą godzinę. Wyłącz procesor.
  3. Upewnij się, że znane są liczba komórek, objętość oraz całkowita liczba komórek CD4+ i całkowita liczba komórek CD8+ w materiale wyjściowym limfocytów T.
  4. Upewnij się, że dostępne są wystarczające ilości wektora wirusowego, odczynników i materiałów eksploatacyjnych na cały cykl produkcyjny.
  5. Umieść butelkę ludzkiej surowicy grupy AB w lodówce w celu rozmrożenia przez noc.

3. Dzień 0: Instalacja zestawu drenów

  1. Przygotować 3 L buforu do przetwarzania (0,5% (w/v) ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) w buforze fosforanowym z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (PBS/EDTA)).
  2. Przygotować 2 L pożywki hodowlanej (2 L pożywki uzupełnionej o 100 mL ludzkiej surowicy grupy AB do stężenia końcowego 5% oraz dwie fiolki rekombinowanej ludzkiej IL2 w dawce 25 µg/fiolkę; więcej informacji na temat tych odczynników znajduje się w Tabeli materiałów). Przenieść 10 mL pożywki hodowlanej do 20 mL worka na odczynniki i przechowywać w temperaturze 4 ºC  przez noc.
  3. Włączyć urządzenie i wybrać z interfejsu ekranu dotykowego Proces transdukcji limfocytów T (TCT). Kliknąć Uruchom, aby rozpocząć proces TCT; należy postępować zgodnie z instrukcjami i komunikatami wyświetlanymi na ekranie urządzenia.
  4. Na ekranie Wprowadzanie parametrów, po pojawieniu się prośby, wpisać inicjały operatora, numer partii zestawu drenów oraz datę jego ważności.
  5. Ekran Konfiguracja procesu prezentuje cztery różne procesy. Wybrać Pełny proces (1).
    UWAGA: Inne dostępne procesy obejmują rozpoczęcie od wyselekcjonowanych limfocytów T CD4+/CD8+ (patrz sekcja 5 poniżej) oraz ponowne uruchomienie wcześniej przerwanej serii produkcyjnej.
  6. Po pojawieniu się prośby wybrać dwie fiolki odczynnika do selekcji, aby odzwierciedlić metodę selekcji CD4+/CD8+.
  7. Zainstalować zestaw drenów zgodnie z instrukcjami na ekranie. Upewnić się, że wszystkie połączenia Luer są szczelne i że zestaw drenów nie posiada wad.
  8. Postępować zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby zainicjować automatyczne testy szczelności górnej i dolnej.
    UWAGA: Test szczelności może zakończyć się niepowodzeniem z powodu wadliwego zestawu drenów, nieprawidłowej instalacji zestawu drenów lub usterki pompy perystaltycznej urządzenia. Stanowczo zalecamy posiadanie co najmniej jednego dodatkowego zestawu drenów podczas serii produkcyjnych. Zalecamy również, aby drugi technolog zweryfikował poprawność instalacji zestawu drenów.
  9. Postępować zgodnie z instrukcjami na ekranie w celu podłączenia worków z pożywką i buforem do przetwarzania.
  10. Rozpocząć automatyczne płukanie (priming) zestawu drenów.
    UWAGA: Proces TCT musi zostać kontynuowany w ciągu 3 h po płukaniu. Należy upewnić się, że materiał wyjściowy w postaci limfocytów T będzie gotowy.

4. Wzbogacanie limfocytów T

  1. Gdy pojawi się ekran Transfer cell product (Transfer produktu komórkowego), rozpocznij rozmrażanie kriokonserwowanego produktu limfocytów T.
    UWAGA: Dopuszczalna objętość limfocytów T, którą można dodać do zestawu drenów, mieści się w zakresie od 50 do 280 mL. Maksymalna liczba komórek docelowych (suma CD4+ i CD8+) wynosi 3 × 109, a maksymalna liczba TNC wynosi 2 × 1010.
  2. Przenieś rozmrożone komórki do 150 mL worka transferowego. Zespawaj sterylnie worek transferowy z workiem aplikacyjnym (Application bag) zestawu drenów.
  3. Pobierz próbkę z worka aplikacyjnego za pomocą kieszeni kontroli jakości (QC pouch) i wykonaj zliczenie komórek.
  4. Podłącz fiolki z odczynnikami CD4 i CD8.
  5. Uruchom proces selekcji (wzbogacania limfocytów T).
  6. Po wzbogaceniu pobierz próbkę wyselekcjonowanych komórek CD4+/CD8+ z kieszeni kontroli jakości worka do ponownej aplikacji (Reapplication bag) w celu zliczenia komórek, analizy cytometrycznej oraz analizy wielkości komórek.
    ​UWAGA: Wynik zliczenia komórek jest niezbędny do przejścia do następnego kroku.

5. Alternatywa: Rozpoczęcie od wyselekcjonowanych komórek CD4+/CD8+

  1. Przygotować pożywkę zgodnie z opisem w kroku 3.2. Bufor procesowy nie jest wymagany.
  2. Włączyć procesor i wybrać opcję T cell cultivation with TS installation (3) na ekranie Process Setup. Postępować zgodnie z instrukcjami i komunikatami wyświetlanymi na ekranie.
  3. Zgodnie z instrukcjami na ekranie, przeprowadzić przygotowanie (priming) zestawu drenów za pomocą pożywki zamiast buforu procesowego.
  4. Gdy pojawi się ekran „Prepare cultivation-Connect cell product”, rozpocząć rozmrażanie wyselekcjonowanych limfocytów T CD4+/CD8+.
    UWAGA: Minimalna liczba limfocytów T (suma limfocytów T CD4+ i CD8+) dla tego procesu wynosi 1.0 × 108.
  5. Przenieść komórki do 150 mL worka transferowego i rozcieńczyć pożywką do objętości końcowej 50 mL.
  6. Połączyć sterylnie (sterile weld) zawiesinę komórkową z workiem Reapplication urządzenia.
  7. Pobrać próbkę wyselekcjonowanych komórek CD4+/CD8+ z kieszeni QC worka Reapplication w celu analizy liczby i wielkości komórek.

6. Przygotowanie hodowli i programowanie macierzy aktywności (Activity Matrix)

  1. Wprowadź stężenie komórek oraz pożądaną liczbę początkową (1-2 × 108 limfocytów T).
    UWAGA: Urządzenie automatycznie wpompuje odpowiednią objętość z worka do ponownego użycia do komory hodowlanej i dostosuje objętość końcową do 70 mL.
  2. Podłącz fiolkę z odczynnikiem aktywującym zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
  3. Wprowadź 5% dla stężenia CO2 oraz 39 °C dla temperatury komory hodowlanej.
    UWAGA: Producent zaleca wprowadzenie wartości 39 °C lub wartości specjalnie skalibrowanej dla danego urządzenia.
  4. Skonfiguruj Activity Matrix (macierz aktywności). Jako punkt wyjścia wykorzystaj Enhanced feeding protocol (rozszerzony protokół karmienia) i zmodyfikuj poszczególne kroki protokołu zgodnie z określonymi przez użytkownika specyfikacjami (Rysunek 2).
    1. Upewnij się, że czas aktywności Transduction (transdukcji) przypada na 24 h po wysianiu (Dzień 1).
    2. Upewnij się, że czas aktywności Culture Wash (płukania hodowli) przypada na 48 h po transdukcji (Dzień 3).
    3. Ustaw czas Activate Shaker (aktywacji wytrząsarki, typ wytrząsarki 2) na 30 min po rozpoczęciu płukania hodowli.
    4. Usuń wszystkie aktywności Medium Bag Exchange (wymiany worka z medium) oraz Waste Bag Exchange (wymiany worka na odpady).
  5. Dotknij przycisku ok na ekranie, aby rozpocząć hodowlę.
  6. W razie potrzeby zamroź pozostałe wyselekcjonowane komórki CD4+/CD8+ w worku aplikacyjnym do późniejszego użycia.

7. Dzień 1: transdukcja limfocytów T

  1. Oblicz objętość wektora lentiwirusowego do użycia na podstawie pożądanego MOI.
  2. Wyjmij worek z odczynnikiem o pojemności 20 ml zawierający 10 ml pożywki hodowlanej, który był przechowywany w temperaturze 4°C. ºC przez noc (krok 3.2). Rozmrozić fiolkę z wektorem i przenieść objętość obliczoną w punkcie 7.1 do 20-ml worka z odczynnikiem.
    UWAGA: Zalecamy zamrożenie wszelkich pozostały wektor do przechowywania lub do celów badawczo-rozwojowych.
  3. Zmodyfikuj macierz aktywności, aby ustawić czas Transdukcja do 2 min w przyszłość. Po wyświetleniu komunikatu naciśnij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby rozpocząć proces transdukcji.
  4. Wykonaj sterylne spawanie worka z wektorem z zestawem drenów, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
  5. Zmodyfikuj macierz aktywności na podstawie rzeczywistego czasu rozpoczęcia aktywności transdukcji.
    UWAGA: Sugerujemy rozpoczęcie transdukcji w ciągu 20–24 h po wysianiu komórek, aby zapewnić wykonanie czynności laboratoryjnych w standardowych godzinach pracy.
    1. Należy upewnić się, że czas Przemywanie hodowli minie 48 h po transdukcji (dzień 3).
    2. Ustaw czas Uruchom wytrząsarkę (inkubator wytrząsowy typ 2) przez 30 min po przemyciu hodowli (dzień 3).
    3. Upewnij się, że czas Wymiana pożywki odbywa się po południu (o godzinie 13:00) w dniu Dzień 6.

8. Dzień 6: Pierwsza próbka w trakcie procesu

  1. Naciśnij przycisk Sample i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby pobrać próbkę kontrolną (QC) z aktywnej hodowli.
  2. Wykonaj zliczanie komórek, cytometrię przepływową oraz analizę wielkości komórek. Prześlij 1 mL próbki do barwienia metodą Grama.
    UWAGA: Zliczanie komórek należy powtarzać mniej więcej co drugi dzień w celu monitorowania wzrostu hodowli.
  3. Przygotuj kolejne 2 L pożywki hodowlanej (patrz krok 3.2).
  4. Dodaj czynność Medium Bag Exchange do macierzy czynności (Activity Matrix), ustawiając czas rozpoczęcia na 2 min w przyszłości. Dostosuj czynność Media Exchange, aby rozpoczęła się za 20 min. Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie.
    UWAGA: Media Exchange to wymiana pożywki hodowlanej w komorze hodowlanej. Medium Bag Exchange to wymiana worka z pożywką hodowlaną zawieszonego na urządzeniu.

9. Dzień zbioru (od 7. do 13. dnia): Zbiór i kriokonserwacja

  1. Naciśnij przycisk Sample i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby pobrać próbkę kontroli jakości (QC) z aktywnej kultury.
  2. Podziel próbkę QC na trzy alikwoty po 1 mL każda. Wykorzystaj 1 mL do analizy cytometrii przepływowej, zliczenia komórek i analizy wielkości komórek. Wykorzystaj 1 mL do badań w kierunku obecności mycoplasma, liczby kopii wektora, obecności replikacyjnie kompetentnego lentiwirusa oraz endotoksyn. Ostatnie 1 mL przeznacz do barwienia metodą Grama.
  3. Przygotuj końcowy bufor formulacyjny (sterylny izotoniczny roztwór krystaloidowy uzupełniony o 4 % HSA w worku 2 L, patrz Tabela Materiałów). Odstaw 100 mL tego buforu do przygotowania roztworu krioprotektanta na późniejszym etapie.
  4. Zmodyfikuj macierz aktywności (Activity Matrix), aby ustawić czas End of Culture na 2 min w przyszłość i usuń wszystkie pozostałe aktywności. Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby podłączyć końcowy bufor formulacyjny do zestawu drenów i rozpocząć zbiór.
    UWAGA: Procesor automatycznie przeniesie komórki do docelowego worka z komórkami (Target cell bag). Objętość wyniesie 100 mL.
  5. Pobierz próbkę 0,5 mL z kieszeni QC docelowego worka z komórkami i wykonaj zliczenie komórek.
  6. Zamknij szczelnie docelowy worek z komórkami i odłącz go od zestawu drenów. Podziel produkt CAR-T na odpowiednie dawki i zamroź je w zamrażarce o kontrolowanej szybkości schładzania. Przechowuj komórki w fazie parowej zbiornika z ciekłym azotem w temperaturze ≤ -150 ºC.
    UWAGA: Końcowe formulowanie i rozlewanie dawek zależą od protokołu. Przedstawiamy tutaj przykład, w którym mrożone są trzy równe dawki komórek CAR-T oraz fiolki QC. Szczegóły znajdują się w sekcji 10.
  7. Pobierz dane procesowe z urządzenia, zdejmij i zutylizuj zestaw drenów, a następnie wykonaj procedurę wyłączania.

10. Kriokonserwacja komórek CAR-T

UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że komórki CAR-T są krio konserwowane po wytworzeniu i przechowywane do momentu, gdy pacjent będzie gotowy do infuzji. Choć możliwe jest podanie świeżo wytworzonych komórek CAR-T, zwiększa to obciążenie logistyczne, ponieważ wymaga koordynacji procesu produkcji komórek CAR-T z ich infuzją. Może to być problematyczne w przypadku niepowodzenia procesu produkcji. Szczególnie w sytuacji, gdy protokół kliniczny wymaga chemioterapii limfodeplecyjnej przed infuzją CAR-T, stanowczo zalecamy krio konserwację, ponieważ niepowodzenie produkcji może narazić pacjenta na ryzyko niepotrzebnej chemioterapii. Organy regulacyjne mogą wymagać od badaczy wykazania, że produkt przeszedł wszystkie testy zwalniające przed infuzją, co może być trudne do osiągnięcia bez krio konserwacji.

  1. Z końcowych 100 mL zebranego produktu odmierz i oddziel objętość wymaganą do uzyskania pożądanych dawek CAR-T oraz fiolek do kontroli jakości (QC) w celu przeprowadzenia dodatkowych testów uwalniania (np. żywotności), retencji oraz próbki do badania sterylności.
    UWAGA: Krytyczne jest opracowanie w pełni zdefiniowanej strategii rozdzielania produktu końcowego na alikwoty. Sugerujemy wytworzenie wielu dawek produktu, aby umożliwić ponowne infuzje, o ile dostępna jest wystarczająca ilość materiału. Objętość produktu wynosząca 10-20 mL w worku pozwala na szybkie rozmrażanie i łatwą infuzję za pomocą strzykawki. Zaleca się napełnianie każdego produktu do pożądanej dawki komórek CAR-T (np. 5 × 106 komórek CAR-T na kg lub 2,5 × 108 komórek CAR-T), co wyeliminuje konieczność obliczeń dawki w dniu infuzji. Zaleca się również krioskonserwację co najmniej czterech fiolek QC oraz uwzględnienie możliwości pozostania nadmiarowego materiału; sugerujemy zachowanie tego materiału, gdyż może on być przydatny do celów badawczo-rozwojowych.
  2. Odwiruj komórki, aby zmniejszyć objętość.
  3. Uzupełnij produkt(y) do połowy pożądanej objętości końcowej, używając części buforu do formulacji końcowej odłożonej w kroku 9.3.
  4. Przygotuj 2-krotny krioprotektant, tworząc 20% roztwór DMSO w buforze do formulacji końcowej.
    UWAGA: Skład krioprotektantu i stężenie DMSO mogą zostać zmodyfikowane.
  5. Dodaj 2-krotny krioprotektant do komórek w równej objętości, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO wynoszące 10%.
    UWAGA: Czas ekspozycji produktu na krioprotektant powinien być zminimalizowany.
  6. Napełnij worki z dawkami i fiolki QC. Prześlij 1 mL do badania sterylności.
    UWAGA: Organy regulacyjne zazwyczaj wymagają przeprowadzenia 14-dniowego testu sterylności na produkcie końcowym. Pojawiają się jednak szybkie testy sterylności; obecnie najpowszechniejszą jest farmakopealna metoda 14-dniowa.
  7. Krioskonserwuj produkty, używając zamrażarki o kontrolowanej szybkości chłodzenia.
    UWAGA: Program zamrażarki o kontrolowanej szybkości chłodzenia powinien zostać zwalidowany w celu uzyskania szybkości chłodzenia od ~ -1 ºC/min do ~ -45 ºC, z kompensacją punktu eutektycznego.
  8. Przechowuj produkt w fazie par zamrażarki niskotemperaturowej z ciekłym azotem w temperaturze ≤ -150 °C.

11. Ocena wydajności procedury

UWAGA: W trakcie procesu TCT z aktywnej hodowli pobieranych jest kilka próbek kontroli jakości (QC). Tabela 2 przedstawia zestawienie, które może pomóc czytelnikowi zorganizować wyniki do późniejszego odniesienia oraz obliczyć wskaźniki wydajności procedury. Poniższe oznaczenia składające się z litery i cyfry (np. „B4”) odnoszą się do komórek w siatce tej tabeli. W obliczeniach wydajności stosuje się następujące wartości: B3 = całkowita liczba komórek jądrowych (TNC) przed wzbogaceniem; B4 = TNC po wzbogaceniu; E2 = suma limfocytów T CD4+ i CD8+ jako procent całkowitej liczby komórek początkowego produktu aferezy; E4 = suma limfocytów T CD4+ i CD8+ jako procent całkowitej liczby komórek po wzbogaceniu; G2 = komórki CD19+ jako procent całkowitej liczby komórek produktu początkowego; G4 = komórki CD19+ jako procent całkowitej liczby komórek po wzbogaceniu CD4+/CD8+; B10 = TNC aktywnej hodowli w dniu zbioru.

figure-protocol-1
Tabela 2: Siatka wydajności procedury. Przedstawiamy tę siatkę, aby pomóc w organizacji wyników testów w trakcie procesu, niezbędnych do obliczenia statystyk wydajności procedury. Wiersze reprezentują próbki analizowane w różnych punktach czasowych podczas procedury i są oznaczone numerami 1-11. Wiersze 6-9 mogą być wykorzystane do zapisania wyników próbek pobranych po 6. dniu hodowli, ale przed dniem zbioru. Kolumny reprezentują mierzone parametry i są oznaczone literami A-H. Pola zacieniowane na szaro nie mają zastosowania. Niektóre dodatkowe pola mogą nie mieć zastosowania w zależności od tego, czy wzbogacanie CD4+/CD8+ jest wykonywane jako część procedury oraz od długości hodowli. Sugerujemy wpisanie w tych polach „N/A”. Skróty: TNC = całkowita liczba komórek jądrzastych; QC = kontrola jakości. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

  1. Oblicz odsetek odzysku komórek CD4+/CD8+ po selekcji, dzieląc całkowitą liczbę limfocytów T CD4+ i CD8+ po wzbogaceniu przez całkowitą liczbę limfocytów T CD4+ i CD8+ przed wzbogaceniem, korzystając z równania (1).
    odzysk limfocytów T CD4+/CD8+ = figure-protocol-2    (1)
  2. Oblicz stopień usunięcia komórek CD19+ po wzbogaceniu, dzieląc całkowitą liczbę komórek CD19+ po wzbogaceniu w kierunku CD4+/CD8+ przez całkowitą liczbę komórek CD19+ przed wzbogaceniem. Ponieważ oczekuje się, że liczba ta będzie bardzo mała, należy podać logarytm tego ułamka, zgodnie z równaniem (2):
    Log deplekcji komórek CD19 = log10 figure-protocol-3    (2)
  3. Oblicz całkowity przyrost (fold growth), dzieląc całkowitą liczbę komórek w aktywnej kulturze w momencie zbioru przez liczbę wysianych komórek, korzystając z równania (3):
    Całkowity przyrost krotny = figure-protocol-4    (3)
  4. Oblicz średni dzienny przyrost, wyciągając pierwiastek z całkowitego krotnego przyrostu w odniesieniu do dnia zbioru, korzystając z równania (4):
    Średnia dobowa przyrost = dzień zbioru √ (całkowity przyrost krotny)    (4)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki z trzech początkowych serii produkcji CAR-T w badaniu NCT05480449 przedstawiono poniżej w Tabeli 3. Materiał wyjściowy, wektor, cytokiny hodowlane oraz stężenia surowicy AB pozostawały stałe dla każdej serii. Produkty zbierano w dniu 7. lub 8. Średni dzienny wzrost komórek wynosił 46% (wzrost całkowitej liczby komórek), co wskazuje, że proces TCT był skuteczny w promowaniu ekspansji komórek. Wyniki te sugerują, że urządzenie może wytwarzać spójne i powtarzalne produkty komórek CAR-T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia komórkami CAR-T okazała się obiecującym podejściem do leczenia komórek B i innych nowotworów złośliwych. Jednak tradycyjne metody produkcji ogniw CAR-T mają kilka ograniczeń, takich jak wysokie koszty, pracochłonna produkcja i otwarte etapy, które zwiększają ryzyko zanieczyszczenia. Ostatnio pojawiło się kilka półautomatycznych platform, w tym Miltenyi CliniMACS Prodigy ("procesor"), aby rozwiązać te problemy. Proces transdukcji limfocytów T (TCT), zintegrowany z procesorem opisanym w tym manuskrypcie, obejmuje w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

S.K., S.G. i Y.W. otrzymały wsparcie badawcze od Miltenyi Biotec.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wkład kilku osób i organizacji w tę pracę. Laboratorium Terapii Komórkowej i Genowej oraz Laboratorium Badań Translacyjnych i Korelacyjnych Uniwersytetu Pensylwanii zapewniły cenną pomoc w opracowywaniu procesów i przygotowaniu do składania wniosków IND. Melissa Varghese i Amanda DiNofia przyczyniły się do opracowania procesu i przygotowania zgłoszeń IND, które leżą u podstaw tego manuskryptu. Prace te zostały wsparte grantem akceleracyjnym Cell and Gene Therapy Collaborative ze Szpitala Dziecięcego w Filadelfii. Autorzy pragną również podziękować firmie Miltenyi Biotec za wsparcie techniczne i badawcze. Rysunek 1 jest objęty prawami autorskimi © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Wszelkie prawa zastrzeżone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12 x 75 probówek borokrzemianowychCharles RiverTL1000
20 ml Worek na odczynnikiMiltenyi Biotec170-076-631
50 ml Rurka stożkowaFisher05-539-10
150 ml Zestaw transferowyFenwal4R2001
2,000 ml Zestaw transferowyFenwal4R2041
7AADFisher Scientific
Alkohol PrepTyco/Healthcare
Bag AccessMedline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 CAR Odczynnik do wykrywania BiotynaMiltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Koraliki referencyjne do celometru 10umNexcelomB10-02-020
Koraliki referencyjne do celometru 15umNexcelomB15-02-010
Koraliki referencyjne do celometru 5umNexcelomB05-02-050
Szkiełka do celometruNexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec276-01Odczynnik CD4
CliniMACS CD8 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec275-01Odczynnik CD8
CliniMACS PBS/EDTA BufferMiltenyi Biotec130-021-201Bufor
DMSOOrigenCP-10
Worek do zamrażania 50 mlMiltenyi Biotec200-074-400
Fiolka do zamrażania, 1,8 mlNunc12565171N
Fiolka do zamrażania, 4,5 mlNunc12565161N
Ludzka surowicaAB Valley BiomedicalSterylna filtrowana, inaktywowana termicznie
albumina surowicy ludzkiej 25%Grifols68516-5216-1
Albumina surowicy ludzkiej 5%Grifols68516-5214-1
MACS GMP Rekombinowana ludzka IL-2Miltenyi Biotec170-076-148Cytokiny
MACS GMP T Cell TransActMiltenyi Biotec200-076-202Odczynnik aktywacyjny
MycoSeq Mycoplasma Zestaw detekcjiLife Technologies4460623
Igły, Igły do SWD200573Medline
, Końcówki do pipet SlideSafe 18GBDB-D305918
2-200 μ L, pojedynczo pakowaneEppendorf022492209
, 50-1000 &mm; L, pakowane pojedynczoEppendorf022492225
Pipety 10 mlFisher13-678-27F
Pipety 25 mlFisher13-675-30
Pipety 5 mlFisher13-678-27E
Plasmalyte-ABaxter2B2544XRoztwór elektrolitu
Zestaw węży Prodigy TS520Miltenyi Biotec170-076- 600Zestaw wężyków
Sterile FieldMedlineNON21001
Streptawidyna PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
Strzykawka 1 mlBD309628
Strzykawka 10 mlBD302995
Strzykawka 3 mLBD309657
Strzykawka 30 mlBD302832
Strzykawka 50 mlBD309653
TexMACS GMP MediumMiltenyi Biotec170-076-306Średni
adapter do potrójnego pobierania próbekMiltenyi Biotec170-076-609
Wektor wirusowyCHOP Wektor kliniczny RdzeńhuCART19
Sprzęt
Bezpieczeństwo biologiczne SzafkaBaker Co
Celometr Auto 2000Nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301Procesor
Sterowana szybkość zamrażarkiStrugarka/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150KCharles River
Mettler BalanceMettler
Wirówka z chłodzeniemThermo Fisher
Wirówka z chłodzeniemFisher Sci
SCD Sterylna spawarka do rurTerumo
Sebra Zgrzewarka do rurSebra
VarithermBarkeyUrządzenie do rozmrażania na sucho
XN-330 Analizator hematologicznySysmex
BDB559925podskórne 14G , końcówki do pipet

Bibliografia

  1. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  2. Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217(2016).
  6. Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
  7. Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).
  8. Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
  9. Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
  10. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  11. Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
  12. Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
  13. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
  14. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki CAR Ttransdukcja limfocyt w Twzbogacanie CD4 i CD8transdukcja wektorem wirusowymwytwarzanie terapii kom rkowychprzetwarzanie w systemie zamkni tymmacierz aktywno ciwytwarzanie w standardzie klinicznymekspansja kom rkowa
Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.