Artykuł metodologiczny

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65492

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Institute for Regeneration and Repair, University of Edinburgh, 2Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

Streszczenie

Serce jest pierwszym organem, który jest funkcjonalnie tworzony podczas rozwoju, inicjując w ten sposób krążenie krwi bardzo wcześnie w ciąży. Oprócz transportu tlenu i składników odżywczych w celu zapewnienia wzrostu płodu, krążenie płodu kontroluje wiele kluczowych wydarzeń rozwojowych zachodzących w warstwie śródbłonka za pomocą wskazówek mechanicznych. Sygnały biomechaniczne indukują zmiany strukturalne w naczyniach krwionośnych, ustalają specyfikację tętniczo-żylną i kontrolują rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Niedostępność rozwijających się tkanek ogranicza zrozumienie roli krążenia we wczesnym rozwoju człowieka; Dlatego modele in vitro są kluczowymi narzędziami do badania mechanobiologii naczyń krwionośnych. W artykule opisano protokół różnicowania komórek śródbłonka od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie ich umieszczania w urządzeniu fluidycznym w celu zbadania ich reakcji na sygnały mechaniczne. Takie podejście pozwala na długotrwałą hodowlę komórek śródbłonka pod wpływem stymulacji mechanicznej, a następnie pobranie komórek śródbłonka w celu charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej. Opracowany w ten sposób model in vitro będzie miał zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów molekularnych, które transdukują sygnalizację, w której pośredniczą sygnały mechaniczne, które ostatecznie kierują rozwojem naczyń krwionośnych podczas życia płodowego człowieka.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju embrionalnego, serce jest pierwszym organem, który osiąga funkcjonalność1, z wykrywalnymi skurczami od najwcześniejszego etapu tworzenia się rurki wsierdziowej2. Krążenie, wraz z mechanicznymi sygnałami, w których pośredniczy przepływ krwi w naczyniu, kontroluje wiele kluczowych aspektów wczesnego rozwoju. Przed ustanowieniem krążenia płodowego układ naczyniowy jest zorganizowany w pierwotny splot kapilarny; Po funkcjonowaniu serca splot ten reorganizuje się w naczynia żylne i tętnicze3. Rola wskazówek mechanicznych w specyfikacji tętniczo-żylnej znajduje odzwierciedlenie w panśródbłonkowej ekspresji markerów tętniczych i żylnych przed inicjacją przepływu krwi4.

Siły hemodynamiczne nie tylko kontrolują rozwój samego układu krwi, ale także odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu tworzenia się krwinek. Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) wyłaniają się z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka zwanych śródbłonkiem hemogennym5,6,7,8, obecne w różnych regionach anatomicznych zarodków wyłącznie we wczesnym stadium rozwoju. Modele z niedoborem serca, wraz z modelami in vitro, wykazały, że mechaniczne sygnały instruują i zwiększają produkcję HSPC z hemogennego śródbłonka9,10,11,12,13,14.

Wykazano, że różne rodzaje dynamiki przepływu w różny sposób kontrolują cykl komórkowy15, znane jako ważne zarówno w endothelium hemogennym16,17 i specyfikacji komórek tętniczych18. Ogólnie rzecz biorąc, sygnały mechaniczne są krytycznymi determinantami tożsamości i funkcji komórki podczas rozwoju. Nowatorskie urządzenia fluidyczne in vitro pozwalają nam przezwyciężyć ograniczenia związane z badaniem mechanobiologii rozwojowej podczas rozwoju ludzkiej krwi in vivo.

Ogólnym celem protokołu w tym manuskrypcie jest opisanie, krok po kroku, eksperymentalnego procesu badania wpływu naprężeń ścinających na ludzkie komórki śródbłonka pochodzące in vitro z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące różnicowania hiPSC w komórki śródbłonka, a następnie ich umieszczania w chipach płynnych w celu protokołu stymulacji. Korzystając z tego, różne komórki śródbłonka pochodzące z in vitro mogą być testowane pod kątem ich zdolności do wyczuwania naprężeń ścinających, analizując ich orientację w odpowiedzi na przepływ. Umożliwi to innym laboratoriom zajęcie się pytaniami dotyczącymi reakcji na naprężenia ścinające i ich funkcjonalnych konsekwencji dla różnych tożsamości komórek śródbłonka.

Protokół

UWAGA: Wszystkie techniki hodowli komórkowej muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze z przepływem laminarnym, a komórki muszą być inkubowane w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Instrukcje dotyczące przygotowania cytokin zarówno do leczenia podtrzymującego (rhbFGF), jak i do protokołu różnicowania (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) znajdują się w tabeli uzupełniającej S1.

1. Hodowla hiPSC - rozmrażanie, utrzymywanie i zamrażanie komórek

  1. Przygotowanie pożywki konserwacyjnej, czynników wzrostu i innych odczynników
    1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając cały suplement pożywki bez surowicy hESC, 36 ml 25% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 ml 55 mM β-merkaptoetanolu do podłoża podstawowego Dulbecco Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) (patrz tabela materiałów).
    2. Zawiesić 1 mg inhibitora kinazy Rho (iRock) w 1 ml DMSO, zrobić porcje 50 μl i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Te podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 rok. Po rozmrożeniu można je przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
    3. Rozmrozić roztwór witronektyny (VTN-N) na lodzie i porcji 60 μl na fiolkę przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C. Tuż przed pokryciem płytek należy rozcieńczyć 60 μl bulionu w 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco; końcowe stężenie 5 μg/ml.
  2. rozmrażanie linii komórkowej hiPSC
    UWAGA: Ludzka pluripotencjalna linia komórek macierzystych SFCi55 została wcześniej opracowana wewnętrznie i szeroko stosowana do różnicowania w różne typy komórek i różne linie embrionalne19,20,21,22.
    1. Pokryć jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml roztworu VTN-N przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po inkubacji powlekane płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    2. Odessać roztwór VTN-N za pomocą pipety aspiracyjnej i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 ng/ml rhbFGF (tabela uzupełniająca S1).
    3. Szybko rozmrozić fiolkę zawierającą hiPSC w łaźni wodnej i przenieść komórkę do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
    4. Wiruj komórki przez 3 minuty w temperaturze 300 × g w temperaturze pokojowej.
    5. Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 ng/ml rhbFGF.
    6. Przenieść komórki do jednego zbiornika powlekanego, zawierającego już 1 ml pożywki.
    7. Dodaj 5 μl iRock do studzienek zawierających komórki w sumie 1,5 ml pożywki.
    8. Hoduj komórki w inkubatorze, zmieniaj pożywkę codziennie w ciągu tygodnia i podwójnie nakarm komórki, dodając do komórek dwa razy więcej niż normalna objętość pożywki, aby zapewnić karmienie w weekend.
      UWAGA: Komórki są hodowane w obecności iRock tylko przez 24 godziny.
  3. Konserwacja i przenikanie hiPSC
    1. Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną uzupełnioną 20 ng/ml rhbFGF.
    2. Przechodzą komórki, gdy osiągną około 80% zbieżności, zwykle dwa razy w tygodniu.
      1. Aby przejść przez komórki, pokryj płytkę VTN-N, jak opisano wcześniej w krokach 1.2.1 i 1.2.2.
      2. Odessać pożywkę ze studzienek z komórkami i umyć je DPBS.
      3. Odessać DPBS i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 1 minutę.
      4. Zassać odczynnik dysocjacyjny i inkubować przez kolejne 3 minuty. Mocno postukać w płytkę 10 razy z każdej strony.
        UWAGA: Etap dysocjacji może wymagać optymalizacji specyficznej dla typu komórki w czasie inkubacji i procedurze stukania.
      5. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do komórek i za pomocą pipety Pasteura przemyć raz pożywką, aby upewnić się, że większość kolonii została zebrana.
      6. Dodaj 150 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, aby uzyskać współczynnik pasażu 1 studzienki do 6,
        UWAGA: Natychmiast po rozmrożeniu nowej fiolki lepiej jest pasażować komórki w niższych proporcjach, takich jak 1:1 lub 1:2 przez jedno lub dwa pasaże, aby umożliwić im osiągnięcie stałej fazy wzrostu przed pasażowaniem w stosunku 1:6.
      7. Hoduj komórki w inkubatorze, zmieniaj pożywkę codziennie w ciągu tygodnia i dwukrotnie nakarm komórki raz w ciągu weekendu.
  4. zamrażanie linii komórkowych hiPSCs
    UWAGA: Zamrozić komórki w ciągu ich pierwszych dwóch pasaży po rozmrożeniu, aby zapewnić utrzymanie stałej partii zamrożonych fiolek o niskim pasażu, aby rozpocząć hodowlę. Zamroź komórki, gdy osiągną zbieg około 80%.
    1. Zmienić pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę hodowlaną uzupełnioną 20 ng/ml rhbFGF i 5 μl iRock i inkubować przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Odłącz ogniwa zgodnie z opisem w krokach 1.3.2.2-1.3.2.5.
    3. Zebrać oderwane komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki hodowlanej.
    4. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 300 × g w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i dodać 1 ml roztworu do kriokonserwacji (patrz tabela materiałów).
    6. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół, aby wymieszać je w roztworze do krioprezerwacji.
      UWAGA: Należy unikać nadmiernego pipetowania, ponieważ może to spowodować dysocjację klastrów komórek.
    7. Podzielić zawiesinę komórek na dwie fiolki do krioprezerwacji po 0,5 ml każda.
    8. Przenieść fiolki do krioprezerwacji do pojemnika do krioprezerwacji wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C.
    9. Przenieść pojemnik z komórkami do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny przed przeniesieniem fiolek do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

2. Różnicowanie hiPSC w komórki śródbłonka

  1. Przygotowanie pożywki różnicującej, cytokin i czynników wzrostu
    1. Przygotować pożywkę różnicującą bez surowicy (SFD) zgodnie z tabelą 1. Użyj tego podłoża od dnia 0 do dnia 5 różnicowania.
    2. Przygotuj pożywkę bez surowicy dla komórek CD34+ (SFM-34), dodając 34 suplementy odżywcze i 5 ml suplementu L-glutaminy do podłoża podstawowego 34 SFM (patrz tabela materiałów). Stosuj tę pożywkę od 6 dnia różnicowania.
    3. Zawiesić 1 mg CHIR99021 w 716 μl DMSO, aby uzyskać roztwór 3 mM. Inkubować w temperaturze pokojowej aż do całkowitego zawieszenia; w razie potrzeby szybko rozgrzać w temperaturze 37 °C. Przygotować 20 μl porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Zużyć natychmiast po rozmrożeniu i nie zamrażać ponownie ani nie przechowywać.
    4. Zawiesić cytokiny zgodnie z instrukcją w tabeli uzupełniającej S1. Przechowywać wszystkie podwielokrotności cytokin w temperaturze -80 °C.
  2. Różnicowanie komórek śródbłonka
    UWAGA: Na każdy dzień różnicowania należy przygotować 18 ml (3 ml pożywki/basenik) wstępnie podgrzanej pożywki SFD, zgodnie z mieszankami cytokin opisanymi w Tabeli 2.
    1. Dzień 0 - tworzenie ciał zarodkowych (EB)
      1. Przygotować 18 ml pożywki SFD z mieszanką 1 cytokiny zgodnie z tabelą 2 dla każdej płytki 6-dołkowej (3 ml / dołek).
      2. Dodaj 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki SFD z wymieszaniem 1 cytokiny w każdym dołku 6-dołkowej płytki odstraszającej komórki (patrz Tabela materiałów).
      3. Aby utworzyć EB, wykonaj czynności opisane w krokach 1.3.2.2-1.3.2.4.
        UWAGA: Upewnij się, że hiPSC są zlewane w 70-80%, aby rozpocząć różnicowanie.
      4. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SFD z wymieszaniem 1 cytokin do każdej studzienki odłączonych klastrów komórek.
      5. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie przenieś skupiska komórek do pojedynczego dołka z dołkiem odstraszającym komórki w celu utworzenia EB w stosunku 1:1.
      6. Po umieszczeniu płytki w inkubatorze przesuwaj ją do przodu i do tyłu, w prawo i w lewo, aby równomiernie rozprowadzić EB w studzience.
    2. Dzień 1 - średnia zmiana w EBs
      UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy do 1 dnia różnicowania obok EB znajduje się wiele pojedynczych komórek w zawiesinie.
      1. Przygotować 18 ml pożywki SFD z mieszanką 1 cytokiny zgodnie z tabelą 2 dla każdej płytki 6-dołkowej (3 ml / dołek).
      2. Zakręć płytką z EBs, aby przesunąć je do środka i zebrać za pomocą pipety Pasteura do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
        UWAGA: Jeśli EB wyglądają na zlepione ze sobą jak w sznurkach, oddziel je, pipetując je w górę iw dół za pomocą P1000 przed zebraniem ich do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      3. Odczekaj 5-10 minut, aż EB osiądą na dnie probówki.
        UWAGA: Jeśli EB są zbyt małe, odwiruj je przez 5 minut w temperaturze 100 × g, aby pomóc im się ustabilizować.
      4. Umyj płytki odstraszające komórki sterylną wodą lub DPBS, aby usunąć wszelkie pojedyncze komórki lub zanieczyszczenia.
      5. Ostrożnie i powoli odsysać supernatant z EB, nie usuwając ich.
      6. Dodaj 2 ml SFD z cytokinami Mix 1 do każdej studzienki płytek odstraszających komórki.
      7. Ponownie zawiesić EB za pomocą 1 ml pożywki SFD z cytokinami Mix 1 dla każdej studzienki początkowej - w przypadku płytki 6-dołkowej dodać 6 ml pożywki.
      8. Przenieś EB na płytki odpychające komórki w objętości 1 ml na studzienkę, która zawiera już 2 ml pożywki SFD.
      9. Po umieszczeniu płytki w inkubatorze przesuwaj ją do przodu i do tyłu, w prawo i w lewo, aby równomiernie rozprowadzić EB w studzience.
    3. Dzień 2 - dodanie CHIR99021
      1. Zawiruj EB na środku płytki i dodaj CHIR99021 zgodnie z tabelą 2 z boku studzienki, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z komórkami.
        UWAGA: Jeśli pożywka nie została zmieniona w dniu 1, wymień całą pożywkę zamiast dodawać samą pożywkę. Przygotować 18 ml pożywki SFD z mieszanką 2 zgodnie z tabelą 2 dla każdej płytki 6-dołkowej (3 ml / dołek).
      2. Po umieszczeniu płytki w inkubatorze przesuwaj ją do przodu i do tyłu, w prawo i w lewo, aby równomiernie rozprowadzić EB w studzience.
    4. Dzień 3 - zmiana pożywki na EB i dodanie cytokin Mix 3
      1. Przygotuj 18 ml pożywki SFD z mieszanką 3 cytokin zgodnie z tabelą 2 dla każdej płytki 6-dołkowej (3 ml / dołek).
      2. Zbierz EB zgodnie z opisem w krokach 2.2.2.2-2.2.2.4.
      3. Dodaj podgrzane 2 ml pożywki SFD z mieszanką 3 cytokin do płytek odstraszających komórki.
      4. Ostrożnie odessać supernatant z EBs. Dodaj 1 ml / studzienkę SFD z mieszanką 3 cytokin.
      5. Rozprowadzić EB między studzienkami zgodnie z opisem w krokach 2.2.2.8-2.2.2.9.
    5. Dzień 6 - zmiana pożywki dla SFM-34 i dodanie cytokin Mix 4
      1. Przygotować 18 ml pożywki SFD z mieszanką 4 cytokin zgodnie z tabelą 2 dla każdej płytki 6-dołkowej (3 ml / dołek).
      2. Zbierz EB zgodnie z opisem w krokach 2.2.2.2-2.2.2.4.
      3. Dodaj 2 ml podgrzanej pożywki SFM-34 z wymieszaniem 4 cytokin do płytek odstraszających komórki.
      4. Ostrożnie odessać supernatant z EBs. Dodaj 1 ml / dołek SFM-34 z mieszanką 4 cytokin.
      5. Rozprowadzić EB między studzienkami zgodnie z opisem w krokach 2.2.2.8-2.2.2.9.

3. Izolacja komórek CD34+ i wprowadzenie ich do chipa

UWAGA: Komórki CD34+ są izolowane metodą pozytywnej izolacji za pomocą zestawu mikrokulek CD34 (patrz Tabela Materiałów), który zawiera mikrogranulki CD34 sprzężone z monoklonalnymi przeciwciałami myszymi, przeciwciałami antyludzkimi CD34 i odczynnikiem blokującym FcR (Human IgG). Ważne jest, aby potwierdzić skuteczność izolacji kolumny poprzez barwienie komórek przed i po izolacji w celu analizy cytometrii przepływowej, Poniżej wskazano, kiedy należy pobrać komórki do tej analizy.

  1. Przygotuj materiały i odczynniki.
    1. Przygotować bufor do przemywania przez dodanie 5 ml 5% roztworu BSA i 200 μl EDTA 0,5 M do 45 ml DPBS w celu uzyskania PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Przygotuj świeże do każdej izolacji, przefiltruj-sterylizuj i przechowuj w lodówce do czasu użycia.
    2. Powłożyć płynne wióry roztworem lamininy przygotowanym przez rozcieńczenie rhLaminin 521 1:50 w DPBS Ca2 + Mg2+. Pokryć każdy wiór odpowiednią objętością dla używanego wióra i inkubować w inkubatorze przez 2 godziny przed siewem.
      UWAGA: Do powlekania można zastosować inne matryce, które powinny być testowane pod kątem określonego typu ogniwa/eksperymentu.
    3. Przygotować pożywkę Mix 4 SFM-34, uzupełniając 18 ml pożywki SFM-34 cytokinami Mix 4 zgodnie z tabelą 2 i umieścić mieszaninę w probówce o pojemności 50 ml w inkubatorze z lekko odkręconą pokrywą w celu ułatwienia wymiany gazowej.
    4. Umieść wybrane zestawy perfuzyjne i wszelkie inne rurki, które mają być używane w inkubatorze, aby odgazować.
  2. Dzień 8 - dysocjacja EB i izolacja CD34+
    1. Zbierz EB zgodnie z opisem w krokach 2.2.2.2-2.2.2.5.
    2. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek na początkową studzienkę zebranych EB (jeśli zebrano 6 studzienek, dodaj 6 ml).
    3. Przenieść z powrotem 1 ml zawiesiny EB w odczynniku do dysocjacji komórek do każdego dołka płytki odstraszającej komórki.
    4. Inkubować przez 10 minut w inkubatorze.
    5. Delikatnie pipetuj EB w górę iw dół do studzienki za pomocą P1000, nie więcej niż 10 razy.
    6. Powtórz kroki 3.2.4-3.2.5., aby uzyskać łącznie 3x.
      UWAGA: Jeśli EB są trudne do rozdzielenia, powtórz powyższe kroki łącznie 4x.
    7. Dodać 5 ml buforu płuczącego do każdej studzienki zdysocjowanych EB.
    8. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, przepuszczając je przez sitko o pojemności 40 μm. Weź 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć komórki.
      UWAGA: Aby przetestować skuteczność izolacji, przenieś 105 komórek/probówkę do dwóch różnych probówek (niebarwionej próbki kontrolnej i wstępnie posortowanej próbki testowej), które zostaną później wykorzystane do cytometrii przepływowej (jak opisano w krokach 4.3.9-4.3.13). W przypadku płytki 6-dołkowej należy zebrać ~106 komórek po filtracji.
    9. Wiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 300 × g.
    10. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu do płukania, delikatnie pipetując kilka razy, aby upewnić się, że nie ma grudek. Postępuj zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
  3. Wywoływanie komórek CD34+ do płynnych chipów
    UWAGA: Układ fluidyczny użyty w protokole ma wysokość kanału 0,6 mm i długość 50 mm, co daje całkowity obszar wzrostu 2,5 cm2 (rysunek uzupełniający S1). Ten rodzaj chipa jest wysiewany z całkowitą objętością zawiesiny komórek wynoszącą 150 μL. Można stosować różne wióry, a objętość wysiewu i gęstość komórek należy dostosować do obszaru wzrostu. Może być potrzebna dodatkowa optymalizacja w zależności od użytej linii komórkowej i jej wzrostu.
    1. Ponownie zawiesić wyizolowane komórki CD34 + w 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki SFM-34 z cytokinami Mix 4.
    2. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej i policzyć komórki.
    3. Zawiesić 2,5 × 105 komórek w końcowej objętości 150 μl uzupełnionego SFM-34; dodać 0,5 μl iRock.
      UWAGA: Aby przetestować skuteczność izolacji, przenieść 105 komórek/probówkę do probówki (posortowanej próbki testowej), która zostanie później wykorzystana do cytometrii przepływowej (zgodnie z opisem w krokach 4.3.9-4.3.13).
    4. Powoli odsysaj lamininę z płynnych wiórów, umieszczając końcówkę P200 w zbiorniku na krawędzi kanału.
      UWAGA: Jeśli płyn jest trudny do zebrania, powoli podnieś jedną stronę chipa, aby pomóc płynowi przesunąć się do przeciwległego zbiornika.
    5. Stopniowo dodawaj zawiesinę komórkową do kanału, aby upewnić się, że nie tworzą się pęcherzyki.
      UWAGA: Kroki 3.3.4-3.3.5 należy wykonać szybko, ale delikatnie, aby uniknąć wysychania lamininy i tworzenia się pęcherzyków w kanałach chipa. Jeśli utworzą się pęcherzyki, podnieś jedną stronę chipa i delikatnie postukaj w szkiełko, aby zmobilizować bąbelki; Kiedy dotrą do zbiornika, wzniosą się do interfejsu powietrza i nie powinny być w stanie wydzierżawić kanału.
    6. Przenieś chip do inkubatora i pozostaw je na noc, aby komórki były całkowicie przymocowane do kanału i wyglądały na wydłużone.
    7. Gdy komórki są w pełni połączone, odessać pożywkę jak w kroku 3.3.4 i zastąpić ją 200 μl SFM-34 uzupełnionego cytokinami.
    8. Od teraz wymieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 90%-100% zbieżności.

4. Zastosowanie ciągłego przepływu do komórek śródbłonka - Aorta-on-a-chip

  1. Przygotuj materiały i odczynniki.
    1. Przygotować pożywkę Mix 4 SFM-34, uzupełniając 18 ml pożywki SFM-34 cytokinami Mix 4 zgodnie z tabelą 2 i umieścić ją w probówce o pojemności 50 ml w inkubatorze z lekko odkręconą pokrywką w celu ułatwienia wymiany gazowej.
    2. Umieść wybrane zestawy perfuzyjne i wszelkie rurki, które mają być używane do konfiguracji płynowej w inkubatorze, aby odgazować.
  2. Montaż układu fluidycznego
    1. Zamontuj zestaw perfuzyjny w urządzeniu zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Pamiętaj o użyciu clamów w systemie. Jeśli do tego kroku używane są zaciski przesuwne, należy je nasunąć na rurkę przed podłączeniem do chipa.
    2. Podłącz nowy chip fluidyczny i dodaj pożywkę SFM-34 uzupełnioną cytokinami, upewniając się, że oba zbiorniki są napełnione w sterylnych warunkach w kapturze.
    3. Wykonaj program usuwania pęcherzyków powietrza i etap kalibracji.
    4. Wyjąć z inkubatora jednostkę fluidyczną wraz z podłączonym zestawem i przenieść ją do pokrywy; należy również pobrać wióry zawierające komórki z inkubatora.
    5. Clamp rurkę po obu stronach chipa testowego.
    6. Wyjmij rurkę z chipa testowego.
      UWAGA: Sprawdź, czy w złączu Luer na końcu rurki nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli widoczne są pęcherzyki, ostrożnie zassaj je za pomocą pipety P200 i jeśli to konieczne, dodaj więcej pożywki, aby upewnić się, że łącznik jest wypełniony medium.
    7. Połącz chip zawierający ogniwa z rurką.
    8. Zdejmij lub otwórz zaciski.
    9. Przenieś system do inkubatora i podłącz pompę powietrza do jednostki fluidycznej.
    10. Uruchomić wstępnie wybrany program za pomocą oprogramowania dedykowanego dla pompy (rysunek uzupełniający S2) ze stopniowym wzrostem naprężenia ścinającego opisanym w tabeli 3.
      UWAGA: W zależności od konkretnego eksperymentu, który jest potrzebny, program stymulacji może wymagać optymalizacji. Opisano tutaj stopniowy wzrost naprężenia ścinającego prowadzący do końcowej wartości 5 dyn/cm2, która naśladuje naprężenie ścinające obliczone na ścianę aorty grzbietowej na początku krążenia płodu 9. Niezależnie od końcowego naprężenia ścinającego, które zostanie zastosowane, konieczne jest stopniowe zwiększanie w czasie, aby umożliwić ogniwom dostosowanie się do siły bez powodowania odłączania się komórek od chipa. Jeśli wybrany protokół stymulacji jest dłuższy niż 3 dni, cytokiny należy uzupełnić do systemu poprzez dodanie 1 ml SFM-34 zawierającego cytokiny Mix 4, które normalnie zostałyby dodane do 18 ml. W tym celu program pompowania jest szybko zatrzymywany, a do każdej z dwóch strzykawek w zestawie fluidycznym dodaje się 500 μl uzupełnionego podłoża.
  3. Pobieranie komórek do analizy
    1. Podgrzej bufor dysocjacyjny w łaźni wodnej.
    2. Wyjmij jednostkę fluidyczną z inkubatora i przenieś ją do okapu.
    3. Zaciśnij rurkę otaczającą chip po obu stronach i wyjmij rurkę ze zbiorników na chipie.
    4. Delikatnie wyjmij pożywkę z chipa i zastąp ją DPBS Ca2+ Mg2+, aby umyć ogniwa.
      UWAGA: Ten etap mycia PBS można pominąć, jeśli komórki zaczną się odłączać.
    5. Delikatnie dodać 150 μl buforu dysocjacyjnego i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są pojedyncze i odłączone; W przeciwnym razie inkubuj przez dodatkowe 2 minuty. Istotne jest, aby komórki zostały całkowicie odłączone od kanału przed zasysaniem pożywki, ponieważ chip nie pozwala na pomoc w odłączaniu komórek przez pipetowanie. Do odłączenia komórek można zastosować inne roztwory, takie jak trypsyna lub na bazie EDTA.
    6. Zebrać bufor dysocjacyjny zawierający komórki z jednego zbiornika i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przemyć kanał raz DPBS, aby zebrać wszystkie oderwane komórki.
    7. Dodać 1 ml buforu płuczącego do probówki o pojemności 15 ml z komórkami i pobrać 10 μl, aby policzyć komórki.
    8. Podziel zawiesinę komórek w probówkach do cytometrii przepływowej, aby mieć10-5 komórek na probówkę.
    9. Wiruj probówki przez 5 minut w temperaturze 300 × g.
    10. Przygotuj roztwór barwiący tak, aby miał 50 μl na każdą probówkę do zabarwienia. Dodać CD34 PerCP-efluor710 lub CD34-PE w rozcieńczeniu odpowiednio 1:100 i 1:200.
    11. Zawiesić komórki w 50 μl roztworu barwiącego i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Umyj komórki, dodając 2 ml buforu płuczącego i wiruj przez 5 minut w temperaturze 300 × g.
    13. Zawiesić osady w 100 μl roztworu barwiącego i uzyskać dane za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: Komórki mogą być również poddawane lizie bezpośrednio w chipie w celu ekstrakcji RNA przy użyciu 150 μl buforu do lizy RNA lub utrwalane do obrazowania przy użyciu 4% paraformaldehydu w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Analiza orientacji komórki
    1. Przeanalizuj obrazy, aby określić ilościowo zmiany w orientacji komórki za pomocą FIJI23 (Rysunek uzupełniający S3).
      1. Otwórz menedżera obszaru zainteresowania (ROI) z punktu menu Analiza | Narzędzia | Menu menedżera ROI.
      2. Narysuj kontury komórek ręcznie za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i dodaj je do menedżera ROI, klikając przycisk Dodaj lub używając skrótu CTRL+T.
      3. Zmierz orientację każdego zwrotu z inwestycji, wybierając miarę Dopasuj elipsę w oknie Analizuj | Ustaw menu Measurements (Ustawianie pomiarów).
      4. Zastosuj pomiar do wszystkich zwrotów z inwestycji za pomocą Więcej... Polecenie wielomiarowe w menedżerze ROI.
        UWAGA: Ten krok dopasuje elipsę do każdego ROI i wygeneruje tabelę zawierającą długość osi elipsy głównej i pomocniczej, a także kąt.
      5. Wyeksportuj tabelę do pliku CSV, który zostanie zaimportowany do innego oprogramowania w celu wydruku.
        UWAGA: Skrypt używany do wykresów jest dostępny pod adresem https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
        0ddc.

Wyniki

Opisujemy tutaj protokół różnicowania i mechano-stymulacji komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC, który pozwala na badanie ich reakcji na sygnały mechaniczne (Rysunek 1). Protokół ten powoduje produkcję funkcjonalnie mechanowrażliwych komórek śródbłonka. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki i opisujemy oczekiwany fenotyp, aby ocenić, jak komórki reagują na stymulację cytokinami podczas różnicowania.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat protokołu różnicowania i stymulacji mechanicznej. Schemat protokołu różnicowania pokazujący czas różnych mieszanek cytokin, izolację komórek CD34 +, płynne wysiewanie chipów i końcową analizę komórek stymulowanych mechanicznie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kultura hiPSCs
Ważne jest, aby rozpocząć protokół od hiPSC, które prawidłowo rosną w warunkach samoodnawiania. Dobrym wskaźnikiem jakości kultury jest szybkość ich wzrostu. Po rozmrożeniu komórki mogą potrzebować 2-3 tygodni, aby osiągnąć prawidłową fazę wzrostu, która zapewni dobre różnicowanie. Kiedy komórki mogą być pasażowane dwa razy w tygodniu w stosunku 1:6, osiągając prawie pełną konfluencję, jest to czas, w którym są gotowe do różnicowania w tym samym dniu, w którym muszą zostać pasażowane.

Różnicowanie hiPSC w komórki śródbłonka
Pierwszy etap różnicowania, polegający na tworzeniu ciał zarodkowych (EB), jest zależny od linii komórkowej i może wymagać pewnej optymalizacji dla konkretnej używanej linii komórkowej. Dysocjacja opisana w krokach protokołu 1.3.2.2-1.3.2.4 może być modyfikowana poprzez zmniejszenie lub wydłużenie inkubacji z odczynnikiem dysocjacyjnym, a następnie dysocjację za pomocą pipety Pasteura. Ponadto na tym etapie można zastosować inne odczynniki dysocjacyjne oprócz fizycznej dysocjacji kolonii za pomocą narzędzia tnącego lub końcówki do pipety P100. EB dobrej jakości wykazują wyraźną krawędź do 2 dnia różnicowania i wydają się wyraźne i jasne, gdy są obserwowane pod mikroskopem; ciemniejsze obszary mogą wskazywać na śmierć komórki w obrębie EB (Rysunek 2).

figure-results-2
Rysunek 2: Morfologia ciał embrionalnych. (A) Ciała embrionów dnia 2 z dobrze zaznaczonymi krawędziami zewnętrznymi i stałą wielkością. (B) Ciała embrionoidalne dnia 2 o niskiej jakości, wykazujące rozległą śmierć komórkową prowadzącą do dezagregacji struktury. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W dniu 2, dodanie CHIR99021 do EB hamuje białko GSK-3, co powoduje aktywację szlaku Wnt. Różne linie komórkowe mają różne odpowiedzi na leczenie CHIR i należy to zbadać, określając ilościowo liczbę komórek CD34 + uzyskanych w dniu 8 przy użyciu różnych stężeń (Figura 3).

figure-results-3
Rysunek 3: Różnicowanie komórek śródbłonka za pomocą różnych metod leczenia CHIR. Zaangażowanie komórek śródbłonka określone ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej w 8. dniu różnicowania przez ekspresję błony CD34, po leczeniu CHIR w dniu 2 w (A) 3 μM, (B) 5 μM i (C) 7 μM. Dane cytometrii przepływowej uzyskano przy użyciu cytometrii pięciolaserowej i dedykowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Izolacja komórek CD34+
Ważne jest, aby sprawdzić, czy wzbogacenie CD34+ za pomocą kulek magnetycznych zapewnia co najmniej 80% CD34+ po elucji kolumny. Aby zapewnić wystarczającą czystość, podwielokrotność komórek uzyskanych z izolacji magnetycznej może być analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, upewniając się, że używa się innego klonu przeciwciała niż ten, który został użyty do wzbogacenia magnetycznego. W tym przypadku użyto klonu 4H11 i osiągnięto czystość ~85% po wzbogaceniu (Rysunek 4).

figure-results-4
Rysunek 4: Ekspresja błonowa CD34 przed i po wzbogaceniu przez sortowanie magnetyczne. Zdysocjowane ciała zarodkowe (szare) i komórki po wzbogaceniu magnetycznym (zielone) dnia 8 wybarwiono pod kątem ekspresji CD34 i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej, wykazując pomyślne wzbogacenie po sortowaniu. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano za pomocą pięciu cytometrów laserowych i dedykowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Umieszczanie komórek w kanale fluidycznym
Podczas wysiewania komórek w kanale fluidycznym ważne jest śledzenie adhezji i proliferacji komórek śródbłonka. Po wysianiu komórki potrzebują ~5 godzin, aby w pełni przylegać do kanału (Rysunek 5A). Na tym etapie można również przetestować alternatywne rozwiązanie powłokowe w celu poprawy przyczepności. Aby potwierdzić, że badane komórki są mechanowrażliwe, a tym samym zdolne do reagowania na stymulację mechaniczną, można przetestować orientację komórek w czasie. Komórki przed stymulacją wykazują losową orientację (Rysunek 5A i Rysunek 5C) i zmieniają orientację równolegle do kierunku przepływu ( Rysunek 5B,C). Opisany tutaj protokół pozwala na pobranie komórek z kanału w celu przeprowadzenia dalszej analizy, na przykład cytometrii przepływowej, w celu zbadania ich immunofenotypu błonowego, zapewniając tożsamość śródbłonka stymulowanych komórek (Rysunek 5D, E).

figure-results-5
Rysunek 5: Mechanicoreaktywność komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC. (A) Zlewająca się warstwa izolowanych komórek CD34+ 48 godzin po wysiewie. (B) Reorientowana warstwa komórek śródbłonka 3 dni w dynamicznej hodowli. (C) Analiza orientacji komórek śródbłonka po 5 dniach dynamicznej hodowli. (D) Profil ekspresji CD34 w komórkach hodowanych pod przepływem przez 5 dni. (E) Procent komórek CD34+ w populacji komórek pobranych z kanału fluidycznego. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu z odwróconym inkubatorem; Dane z cytometrii przepływowej uzyskano przy użyciu cytometrów pięciolaserowych i dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela Materiałów). Podziałka = 100 μm (A,B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

OdczynnikiKoncentracja zapasówDodano głośnośćKońcowe stężenie
Zmodyfikowany Środek Dulbecco firmy Iscove (IMDM)-333 ml-
Szynka F-12 Mieszanka odżywcza (F-12)-167 ml-
Suplement N-2 (100x)100 razy5 ml1x
Suplement B-27 (50x) 50 razy10 ml1x
kwas askorbinowy10 mg/ml1,25 ml25 μg/ml
α-monotioglicerol (MTG)11,5 mln19,5 μL448,5 μM
Albumina surowicy ludzkiej100 mg/ml2,5 ml0,5 mg/ml
Holo-transferyna100 mg/ml0,75 ml150 μg/ml

Tabela 1: Skład i przepis na 500 ml pożywki do różnicowania bez surowicy (SFD).

powiedział: ) powiedział: powiedział: T powiedział:
Dni zróżnicowaniaMieszanka cytokinCytokinaKońcowe stężenie
Dzień 0 - 2Mieszać 1Zobacz materiał BMP420 ng/ml
Dzień 2Mieszanie 2CHIR990217 μM
Od 3 dniaMix 3 i 4VEGF (Fundusz Energii Nożnej15 ng/ml
bFGF (Fundusz Finansowy)5 ng/ml
Od 6 dniaMix 4IL610 ng/ml
FLT3L (Biblioteka FLT3L10 ng/ml
IGF125 ng/ml
IL115 ng/ml
Scf50 ng/ml
Europejskie Towarzystwo Informacji3 U/ml
Tpo30 ng/ml
IL330 ng/ml

Tabela 2: Mieszanki cytokin używane do różnicowania komórek śródbłonka, dni, w których są dodawane do pożywki SFD, oraz końcowe stężenie.

Naprężenie ścinające (dyn / cm2) Czas (h)
0,51
11
1,51
cyfra arabska1
Rozdział 2.51
31
3,51
41
Rozdział 4.51
5Do końca eksperymentu

Tabela 3: Wartości naprężeń ścinających dla dynamicznej kultury i długości ich zastosowania.

Rysunek uzupełniający S1: Geometria i wymiary chipa i rurki użyte w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Przewodnik krok po kroku dla oprogramowania sterującego pompą powietrza z opisem każdego kroku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Przewodnik do analizy orientacji przy użyciu FIJI pokazujący rysunek kształtu komórki, dopasowanie eliptyczne i końcowy pomiar. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Wielkość jednostki, objętość reprodukcji i stężenia zapasów cytokin używanych w protokole różnicowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół, który tutaj opisujemy, pozwala na generowanie mechanowrażliwych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i badanie ich reakcji na stymulację mechaniczną, w której pośredniczy kontrolowane naprężenie ścinające. Protokół ten jest całkowicie oparty na cytokinach i w pełni kompatybilny z odczynnikami GMP w celu potencjalnej translacji na produkcję komórek do terapii komórkowej.

Wyprowadzenie hiPSC dostarcza naukowcom instrumentalnego modelu dla wczesnych etapów rozwoju embrionalnego, który umożliwia badanie procesów, które w innym przypadku byłyby trudne do zbadania in vivo24. W rzeczywistości ludzkie tkanki embrionalne dostępne do badań są pobierane z zarodków pozbawionych krążenia, co może mieć znaczący wpływ na sygnaturę molekularną kontrolowaną przez sygnały mechaniczne. Opisane tutaj podejście umożliwia obrazowanie na żywo i badanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórek na naprężenia ścinające. Połączenie hiPSC z płynami zapewnia model badania, który przezwycięża ograniczoną dostępność i niedostępność rozwijających się tkanek płodu, gdy inicjacja krążenia przebudowuje i kontroluje tworzenie układu sercowo-naczyniowego i krwionośnego 3,9,10,25.

Ograniczeniem protokołu jest to, że komórki śródbłonka pochodzące z tego protokołu mogą nie odzwierciedlać różnych tożsamości różnych komórek śródbłonka obecnych w rozwijających się tkankach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, podczas procesu różnicowania poprzedzającego stymulację płynną może być potrzebna specyficzna kombinacja cytokin w celu uzyskania pożądanej tożsamości lub fenotypu specyficznego dla tkanki26. Izolację podzbiorów śródbłonka można uzyskać przy użyciu bardziej wyrafinowanego immunofenotypu na etapie izolacji. Protokół ten izoluje komórki śródbłonka wyłącznie na podstawie ekspresji CD34, umożliwiając w ten sposób izolację kolumn zamiast sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS); Zmniejsza to śmierć komórek i ryzyko zanieczyszczenia. Co więcej, protokół ten został specjalnie zaprojektowany do badania roli naprężeń ścinających, w których pośredniczy przepływ laminarny. Alternatywne podejścia fluidyczne będą musiały zostać zastosowane do zbadania wpływu innych sygnałów mechanicznych, takich jak rozciąganie lub kompresja, lub innych rodzajów przepływu, takich jak przepływ zaburzony lub zakłócony.

Wcześniej wykazaliśmy, że komórki śródbłonka pochodzące z iPSC naśladują heterogeniczne tożsamości komórkowe tętniczo-żylne27 podobne do obserwowanej w aorcie grzbietowej płodu 28,29,30. Ma to szczególne znaczenie w kontekście rozwoju naczyń krwionośnych i specyfikacji komórkowej, o której wiadomo, że jest kontrolowana przez krążenie krwi. Badania na różnych modelach wykazały, że brak krążenia powoduje zmienioną specyfikację tętniczo-żylną 11,14,31. Mechanizmy, które łączą sygnały mechaniczne ze specyfikacją komórki, są nadal nieznane, a opisana tutaj linia pozwala na wyrafinowane badania funkcjonalne, których nie można było przetestować in vivo.

Linia ta opisuje produkcję i stymulację komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC przy użyciu dostępnych na rynku kanałów płynowych, unikając konieczności odlewania urządzeń, jak w przypadku szeroko stosowanych urządzeń z polidimetylosiloksanu (PDMS)12. Co więcej, zastosowanie chipów PDMS sprawia, że zbieranie stymulowanych komórek jest szczególnie trudne, podczas gdy dzięki temu protokołowi komórki można łatwo pobrać z kanału. To znacznie poprawia moc analityczną, umożliwiając późniejsze analizy, takie jak analizy proteomiczne i transkryptomiczne, cytometria przepływowa i testy funkcjonalne, które mogą wymagać dalszej hodowli lub testów in vivo .

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Research Advanced Grant 2021 od Europejskiego Towarzystwa Hematologicznego, Global Research Award 2021 od American Society of Hematology oraz Fundusz Wsparcia Strategii Wewnętrznej ISSF3 finansowany przez Welcome Trust i Uniwersytet w Edynburgu. Dziękujemy Fionie Rossi z Zakładu Cytometrii Przepływowej za wsparcie w analizie cytometrii przepływowej. Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,6 Niepowlekane szkiełko podstawoweibidiIB-80186
25% BSALife TechnologiesA10008-01
Płytki 6-dołkoweGreiner Bio-one657160
AccutaseLife TechnologiesA1110501Podawany jako odczynnik dysocjacyjny
Kwas askorbinowyMerckA4544-100G
Pipeta aspiracyjnaSardtedt86.1252.011
B27 suplementLife Technologies17504044cytowany jako suplement do hodowli komórek neuronalnych (50x)
BD FACS DIVABD Bioscienceswersja 8.0.1Cytowany jako oprogramowanie do cytometrii przepływowej
BD LSR Fortessa 5 LaserBD Biosciences
bFGFLife TechnologiesPHG0021
CD34 Zestaw mikrokulekMiltenyil Biotec30-046-702
CD34 PE klon 4H11Invitrogen12-0349-42
CD34 PerCP-eFluor 710 klon 4H11Invitrogen44-0349-42
Płytki 6-dołkowe Cellstar z powierzchnią odstraszającą komórkiGreiner Bio-one657970Cytowany jako płytka odstraszająca komórki
CHIR99021Cayman Chemicals 13122-1mg-CAY
Cryostor CS10  kriokonserwacja komórekMerckC2874-100MLCytowany jako roztwór do kriokonserwacji
Dimetylosulfotlenek VWR200-664-3Cytowany jako DMSO
DMEM/F-12Life Technologies10565-018
DPB Ca2+ Mg2+Life Technologies14080055
DPBSLife Technologies14200075
Filtr siatkowy EASY 40 μ mGreiner Bio-one542040
EDTALife technologies15575020
Odczynnik blokujący FcRMiltenyil Biotec130-059-901
FidżiWersja 1.53c
Flow JoWersja 10.7.1Cytowany jako analiza cytometrii przepływowej
FLT3LPeprotech300-19-10uG
Jednostka fluidycznaibidi10903
GlutaMaxLife Technologies35050038Cytowana jako suplement L-glutaminy
Ham F-12 Life Technologies11765054
Holo-transferynaMerkT0665-500MG
Albumina ludzkiej surowicyFujifilm UK LTD9988
System pomp Ibidiibidi10902Cytowany jako system pomp
IMDMLife Technologies12440053
Mikroskop odwróconyioLight/Thisle ScientificIOL-IO-INVERTCytowany jako odwrócony mikroskop inkubatorowy
Liofilizowany BSA Separator MerckA2153-100G
MiniMACSMiltenyil Biotec130-042-102Cytowany jako separator magnetyczny
Kolumny MSMiltenyil Biotec130-042-201Cytowany jako Kolumna magnetyczna
MTGMerckM6145-25ML
N2 suplementLife Technologies17502048
Notebook do systemu pompowegoibidi10908
Paraformaldehyd 37-41%Fisher ChemicalsF/1501/PB15
PastetteGreiner Bio-one612398
długopis/paciorkowiecGibco15070063
Zestaw do perfuzji ŻÓŁTY/ZIELONY: 50 cm, ID 1,6 mm, zbiorniki 10 mlIbidiIB-10964Cytowany jako zestaw perfuzyjny
Polistyrenowe rurki z okrągłym dnemFalcon352008Cytowany jako Probówki do cytometrii przepływowej
Prism 9Verison 9.4.0
Oprogramowanie sterujące pompąibidiwersja 1.6.1Cytowane jako Oprogramowanie pompy
ReLeSRTechnologie komórek macierzystych5872Cytowane jako Rozwiązanie odłączające
rhBMP4R& D314-BP-010
rhEPOR& D287-TC-500
rhIGF1Peprotech100-11-100uG
rhIL11Peprotech200-11-10uG
rhIL3Peprotech200-03-10uG
rhIL6R& D206-IL-010
rhLaminin-521Life technologiesA29248 Cytowanyjako Laminin
rhSCFLife TechnologiesPHC2111
rhTPOR& D288-TPN-025
rhVEGFR& D293-VE-010
RLT Lysis BufferQiagen79216
Złącze szeregowe do &mikro-szkiełek: Sterylne, sterylneibidiIB-10830
StemPro-CD34 SFMMedia Life Technologies10639011cytowane jako pożywka bez surowicy dla komórek CD34+ (SFM-34)
StemPro-CD34 Suplement odżywczy Life Technologies10641-025Cytowany jako 34 suplement odżywczy
StemPro hESC SFMLife TechnologiesA1000701cytowany jako pożywka hodowlana 
Suplement StemProLife TechnologiesA10006-01
Vitronectin (VTN-N) rekombinowane białko ludzkie, skróconeInvitrogenA31804
Y-27632 dichlorowodorekTocris1254Cytowany jako iRock
β-MerkaptoetanolGibco21985023

Bibliografia

  1. Copp, A. J. Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).
  2. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).
  3. Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. Hemodynamic control of endothelial cell fates in development. Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).
  4. Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis. Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).
  5. Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny. Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).
  6. Zovein, A. C., et al. Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  7. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  8. Boisset, J. C., et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  9. Adamo, L., et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).
  10. Diaz, M. F., et al. Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).
  11. North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
  12. Lundin, V., et al. YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow. Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).
  13. Li, J., et al. Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development. Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).
  14. Azzoni, E., et al. The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition. Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).
  15. Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).
  16. Batsivari, A., et al. Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture. Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).
  17. Canu, G., et al. Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation. Genome Biology. 21 (1), 157(2020).
  18. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).
  19. Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  20. Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).
  21. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).
  22. Fidanza, A., et al. Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs. Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  25. North, T. E., et al. Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow. Cell. 137 (4), 736-748 (2009).
  26. Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs. Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).
  27. Petazzi, P., et al. Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2. bioRxiv. , (2022).
  28. Crosse, E. I., et al. Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).
  29. Calvanese, V., et al. Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth. Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).
  30. Zeng, Y., et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing. Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).
  31. Hwa, J. J., et al. Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow. Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uk ad naczy p odowych na chipier nicowanie kom rek r db onkaindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystestymulacja mechanicznahodowla w urz dzeniu fluidycznymtworzenie cia embrionalnychkom rki CD34 dodatniecytometria przep ywowasystem perfuzyjnymechanobiologia naczy

Powiązane artykuły