Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

6 października 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Streszczenie

Fizjologia i patofizjologia trzustki są złożone. Choroby trzustki, takie jak zapalenie trzustki i gruczolakorak trzustki (PDAC), charakteryzują się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Obrazowanie przyżyciowe (IVI) to potężna technika umożliwiająca obrazowanie tkanek w wysokiej rozdzielczości zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym, pozwalająca na obserwację dynamiki komórek w czasie rzeczywistym. IVI mysiej trzustki stanowi poważne wyzwanie ze względu na głęboką trzewną i podatną naturę narządu, co czyni go bardzo podatnym na uszkodzenia i artefakty ruchowe.

Tutaj opisany jest proces implantacji Stabilizowanego W indowdo obrazowania I ntravital mysich Pancreas (SWIP). SWIP umożliwia IVI mysiej trzustki w normalnych stanach zdrowia, podczas transformacji ze zdrowej trzustki do ostrego zapalenia trzustki wywołanego przez ceruleinę oraz w stanach złośliwych, takich jak guzy trzustki. W połączeniu z genetycznie znakowanymi komórkami lub podawaniem barwników fluorescencyjnych, SWIP umożliwia pomiar dynamiki pojedynczej komórki i subkomórkowej (w tym migracji pojedynczej komórki i zbiorowej), a także seryjne obrazowanie tego samego obszaru zainteresowania przez wiele dni.

Zdolność do przechwytywania migracji komórek nowotworowych jest szczególnie ważna, ponieważ główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem w PDAC jest przytłaczające obciążenie przerzutami. Zrozumienie fizjologicznej dynamiki przerzutów w PDAC jest krytyczną, niezaspokojoną potrzebą i ma kluczowe znaczenie dla poprawy rokowania pacjentów. Ogólnie rzecz biorąc, SWIP zapewnia lepszą stabilność obrazowania i rozszerza zastosowanie IVI w zdrowych chorobach trzustki i złośliwych chorobach trzustki.

Wprowadzenie

Łagodne i złośliwe choroby trzustki są potencjalnie zagrażające życiu, ze znacznymi lukami w zrozumieniu ich patofizjologii. Zapalenie trzustki - zapalenie trzustki - jest trzecią główną przyczyną przyjęć do szpitala i ponownych przyjęć związanych z chorobami przewodu pokarmowego w USA i wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i obciążeniem społeczno-ekonomicznym1. Sklasyfikowany jako trzecia najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem2, gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) odpowiada za większość nowotworów złośliwych trzustki3 i zwiastuje słaby wskaźnik 5-letniego przeżycia wynoszący zaledwie 11%2. Główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem w PDAC jest przytłaczające obciążenie przerzutami. Niestety, u większości pacjentów występuje choroba z przerzutami. Dlatego zrozumienie dynamiki przerzutów w PDAC jest krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w dziedzinie badań nad rakiem.

Mechanizmy leżące u podstaw stanu zapalnego i kaskady przerzutowej trzustki są słabo poznane. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tej luki w wiedzy jest niemożność zaobserwowania dynamiki komórkowej trzustki in vivo. Bezpośrednia obserwacja tej dynamiki komórkowej może ujawnić kluczowe cele, które pozwolą wykorzystać i poprawić diagnostykę i leczenie osób z chorobami trzustki.

Obrazowanie przyżyciowe (IVI) to technika mikroskopowa, która pozwala naukowcom na wizualizację i badanie procesów biologicznych u żywych zwierząt w czasie rzeczywistym. IVI umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamiki wewnątrzkomórkowej i mikrośrodowiskowej w wysokiej rozdzielczości in vivo oraz w natywnym środowisku danego procesu biologicznego. Dlatego IVI pozwala na obserwację in vivo zdrowych i patologicznych procesów.

Współczesne metody obrazowania całego ciała, takie jak MRI, PET i CT, oferują doskonałe widoki całych narządów i mogą ujawnić patologie, nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych4. Nie są jednak w stanie osiągnąć rozdzielczości pojedynczej komórki ani ujawnić najwcześniejszych stadiów choroby - zapalenia trzustki lub nowotworu złośliwego.

Poprzednie badania wykorzystywały rozdzielczość pojedynczej komórki IVI do obserwacji łagodnych i złośliwych chorób skóry5,6, breast7, lung8, liver9, brain10 i guzy trzustki11, co prowadzi do wglądu w mechanizmy progresji choroby12. Jednak mysia trzustka stanowi poważne przeszkody w osiągnięciu rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą IVI, przede wszystkim ze względu na jej głębokie położenie trzewne i wysoką podatność. Co więcej, jest to rozgałęziony, rozproszony narząd w krezce, który łączy się ze śledzioną, jelitem cienkim i żołądkiem, co utrudnia dostęp. Tkanka jest również bardzo wrażliwa na ruch spowodowany sąsiednią perystaltyką i oddychaniem. Minimalizacja ruchu trzustki jest niezbędna do mikroskopii jednokomórkowej, ponieważ artefakty ruchu nawet o wielkości kilku mikronów mogą rozmazywać i zniekształcać obrazy, uniemożliwiając śledzenie dynamiki poszczególnych komórek13.

Aby wykonać IVI, chirurgicznie musi być wszczepione okno obrazowania jamy brzusznej (AIW)9,11. Aby chirurgicznie wszczepić AIW, w ścianę jamy brzusznej wszywa się metalową ramę okienną. Następnie interesujący go narząd jest mocowany do ramy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Chociaż jest to wystarczające dla niektórych sztywnych narządów wewnętrznych (np. wątroby, śledziony, sztywnych guzów), próby obrazowania zdrowej mysiej trzustki są zagrożone przez nieoptymalną stabilność boczną i osiową ze względu na zgodną teksturę tkanki i złożoną architekturę14. Aby rozwiązać ten problem, Park et al.14 opracowali okno obrazowania zaprojektowane specjalnie dla zdrowej trzustki. To okienko obrazowania trzustki (PIW) minimalizuje wpływ ruchu jelit i oddychania poprzez włączenie poziomej metalowej półki w ramie okiennej, tuż pod szkiełkiem nakrywkowym, stabilizując tkankę i utrzymując jej kontakt ze szkłem nakrywkowym. Podczas gdy PIW oferuje zwiększoną stabilność boczną, stwierdziliśmy, że to okno nadal wykazuje dryf osiowy i dodatkowo zapobiega obrazowaniu dużych guzów litych ze względu na wąską szczelinę między metalową półką a szkiełkiem nakrywkowym15.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy tabelaryzowany Window dla Intravital obrazowania mysich Pancreas (SWIP), wszczepialne okno obrazowania, które jest w stanie osiągnąć stabilne, długoterminowe obrazowanie zarówno zdrowej, jak i chorej trzustki (Rysunek 1)15. W tym miejscu zapewniamy kompleksowy protokół procedury chirurgicznej stosowanej do wszczepienia SWIP. Chociaż głównym celem było zbadanie dynamicznych mechanizmów związanych z przerzutami, metoda ta może być również wykorzystana do zbadania różnych aspektów biologii i patologii trzustki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym z uprzednią zgodą Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Pasywacja okien

UWAGA: Pasywacja stali nierdzewnej oczyszcza metal z zanieczyszczeń i tworzy cienką warstwę tlenku, która znacznie zwiększa biokompatybilność metalu z tkankami miękkimi, nawet ponad tytan16.

  1. Proces pasywacji należy rozpocząć od umycia optycznych ram okiennych 1% (w/v) enzymatycznie aktywnym roztworem detergentu.
  2. Zanurz ramki w 5% (w/v) roztworze wodorotlenku sodu o temperaturze 70 °C na 30 minut w szklanym słoiku.
  3. Wyjmij ramki i opłucz je wodą dejonizowaną.
  4. Zanurz ramki w 7% (w/v) roztworze kwasu cytrynowego o temperaturze 55 °C na 10 minut w nowym szklanym słoiku.
  5. Zdejmij ramki i ponownie spłucz je wodą dejonizowaną.
  6. Powtórz krok 1.2 i na koniec po raz ostatni spłucz ramy okienne wodą dejonizowaną.

2. Przygotowanie do implantacji guza lub operacji okna

UWAGA: Do badań nad nowotworami trzustki, komórki nowotworowe muszą być wszczepione i pozwolić im wyrosnąć na jawne guzy. Aby uwidocznić komórki nowotworowe in vivo, zaleca się użycie komórek, które zostały genetycznie zmienione w celu ekspresji białek fluorescencyjnych, takich jak Dendra2. Stosowanie fluorescencyjnych znaczników białek, które są jasne, złagodzi potencjalne problemy z autofluorescencją tkanek. Inne potencjalne białka fluorescencyjne, barwniki i genetycznie kodowane fluorescencyjne modele myszy, które mogą być używane, zostały omówione gdzie indziej17,18. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pola operacyjnego, należy wykonać zabieg chirurgiczny w kapturze lub komorze laminarnej i upewnić się, że do przygotowania, operacji i rekonwalescencji używane są odrębne obszary.

  1. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie i w razie potrzeby użyć sterylizatora z gorącymi kulkami do kolejnych zabiegów. Upewnij się, że w gabinecie zastosowano technikę opartą tylko na napiwkach.
  2. Włącz podgrzewaną podkładkę chirurgiczną i sterylizator kulek i poczekaj, aż osiągnie odpowiednią temperaturę roboczą. Temperaturę poduszki grzewczej należy monitorować za pomocą termometru powierzchniowego, aby uniknąć potencjalnych oparzeń. Umieść sterylną szmatkę na poduszce grzewczej, jeśli nie można odpowiednio kontrolować temperatury.
    UWAGA: Temperatura ciała podczas krótkich zabiegów (≤20 min), takich jak implantacja guza i okna, jest minimalnie zmieniona podczas korzystania z podgrzewanej podkładki chirurgicznej. Jednak dłuższe okresy znieczulenia, takie jak wydłużone obrazowanie poklatkowe, wymagają umieszczenia myszy w podgrzewanej komorze w celu utrzymania temperatury ciała.
  3. Znieczulić mysz 5% izofluranem w komorze anestezjologicznej.
  4. Krok krytyczny: Zmniejsz znieczulenie do 2%, gdy mysz jest nieprzytomna. Uważnie monitoruj poziom znieczulenia i parametry życiowe myszy (np. za pomocą pulsoksymetru)19.
  5. Umieść małą kroplę lubrykantu do oczu na każdym oku myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  6. Przed zabiegiem nałóż obficie krem do depilacji na lewą górną część brzucha, aby usunąć włosy. Po 20 s za pomocą zwilżonej bibuły mocno zetrzyj włosy i krem do depilacji. Powtarzaj proces w razie potrzeby, aż wszystkie włosy zostaną usunięte z obszaru operacyjnego.
  7. Wstrzyknąć podskórnie 10 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) rozcieńczonej w 90 μl PBS, aby zapewnić przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.

3. Implantacja guza trzustki

  1. Przygotuj porcje komórek nowotworowych o pożądanym stężeniu (na podstawie czasu podwojenia komórek nowotworowych). Umieść zawiesinę komórkową w strzykawce insulinowej i trzymaj ją na lodzie. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj 106 syngeneic KPC tumor cells20 zawieszonych w maksymalnej ilości 50 μl PBS, zgodnie z protokołem wstrzyknięcia ortotopowego zaadaptowanym z Erstad et al.21
    UWAGA: Ta linia komórkowa wstrzyknięta w tym stężeniu rutynowo wytwarzała wyczuwalne palpacyjnie lub odpowiednio duże guzy przez 10-14 dni. Subklony tej linii komórkowej i innych linii komórkowych trzustki musiałyby zostać ocenione pod kątem odpowiednich stężeń i ram czasowych, aby wytworzyć guzy o odpowiedniej wielkości).
  2. Umyj ręce mydłem antyseptycznym.
  3. Przed każdym nowym zabiegiem należy założyć nowe sterylne rękawiczki.
  4. Przenieś mysz do sterylnego kaptura chirurgicznego i umieść ją w częściowej prawej bocznej pozycji odleżynowa.
  5. Zabezpiecz kończyny taśmą papierową.
    UWAGA: Prawidłowe korzystanie z instrumentów jest ważne podczas całej procedury. Przykłady trzymania kleszczy, nożyczek Castroviejo i narzędzia do pobierania próżniowego są pokazane w Rysunek 2A-C.
  6. Wysterylizuj brzuch środkiem antyseptycznym (Rysunek 2D).
  7. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując test szczypania palców u stóp.
  8. Wykonaj 10-15 mm lewe nacięcie podżebrowe w skórze za pomocą kleszczy i nożyczek Castroviejo (Rysunek 2E).
  9. Kontroluj hemostazę za pomocą bawełnianych wacików lub wstrzykiwacza kauterycznego, kiedy/gdzie zostanie to uznane za konieczne.
  10. Ostrożnie podziel leżący pod spodem mięsień za pomocą kleszczy i nożyczek Castroviejo, aby wejść do otrzewnej (Ryc. 2F).
  11. Za pomocą sterylnych wacików bawełnianych atraumatycznie uzewnętrznij trzustkę i śledzionę.
  12. Rozchyl trzustkę tak, aby nie było fałd (Rysunek 2G).
  13. Zidentyfikuj pożądane miejsce wstrzyknięcia guza w ciele lub ogonie trzustki (z dala od naczyń krwionośnych).
  14. Krok krytyczny: Po dokładnym ustawieniu trzustki, użyj kleszczyków, aby naciągnąć tkankę i włóż końcówkę strzykawki insulinowej, skosem skierowanym do góry, w żądane miejsce trzustki na głębokość 4-5 mm (Rysunek 2H).
  15. Powoli wstrzyknij roztwór komórek nowotworowych. Poszukaj małego bąbelka, który potwierdza udane wstrzyknięcie (Rysunek 2I).
  16. Ostrożnie przywróć trzustkę do jamy brzusznej, nie naruszając pęcherzyka iniekcyjnego komórek nowotworowych (Rysunek 2J).
  17. Używając wchłanialnych szwów 5-0 polidioksanonu, najpierw zamknij warstwę mięśniową, a następnie skórę przerwanymi szwami (Rysunek 2K-N).
  18. Przykryj nacięcie klejem cyjanoakrylowym (Rysunek 2O), a następnie umieść mysz z powrotem w czystej klatce pod lampą grzewczą w celu odzyskania. Podawaj antybiotyki w wodzie pitnej, aby zapobiec infekcji. Monitoruj myszy i pozwól im całkowicie wyzdrowieć po operacji.
    UWAGA: Antybiotyki są podawane zgodnie z wymogami protokołu IACUC. Wszystkie zwierzęta trzymane są indywidualnie.
  19. Pozwól guzowi rozwijać się przez 10-14 dni, aż będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha.

4. Chirurgia okien trzustki

  1. Kiedy zwierzęta są gotowe do obrazowania, rozpocznij operację implantacji okna. Na początek umyj ręce mydłem antyseptycznym.
  2. Przed każdym kolejnym zabiegiem należy założyć świeże sterylne rękawiczki.
  3. Na podgrzewanym stanowisku chirurgicznym umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowa, aby odsłonić lewy brzuch.
  4. Zakotwicz przednie i tylne kończyny myszy w podgrzewanej fazie chirurgicznej czaszkowo i doogonowo za pomocą taśmy papierowej. Upewnij się, że śledziona (pod skórą) jest widoczna w polu operacyjnym (Rysunek 3A).
  5. Aby zachować sterylność, rozpakuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w kapturze.
  6. Zdezynfekuj miejsce operowane, przecierając wymaz ze skóry myszy z obfitym środkiem antyseptycznym.
  7. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, wykonując test szczypania palców u stóp.
  8. Krytyczny krok: Podnieś skórę lewego górnego kwadrantu brzucha za pomocą kleszczy i wykonaj ~10 mm okrągłe nacięcie w skórze i mięśniach za pomocą nożyczek Castroviejo (Rysunek 3B, C).
  9. Kontroluj krwawienie i utrzymuj hemostazę za pomocą wacików bawełnianych lub wstrzykiwacza kauterycznego, jeśli to konieczne.
  10. Zlokalizuj trzustkę, która jest przyczepiona do śledziony, i określ kierunek, w którym trzustka układa się w nacięciu, aby zdecydować, gdzie należy umieścić podtrzymujący haft krzyżykowy.
  11. Za pomocą jedwabnego szwu 5-0 umieść pierwszy ścieg w żądanym miejscu w warstwie mięśniowej. Zawiąż ten koniec z 3-5 węzłami. (Rysunek 3D,E)
  12. Kontynuuj szycie bezpośrednio w poprzek nacięcia. Wytnij i zostaw ogon o długości ~5 cm (Rysunek 3F).
  13. Powtórz kroki 4.11 i 4.12 prostopadle do pierwszego ściegu (Rysunek 3G, H).
  14. Krytyczny krok: Delikatnie unieś i umieść trzustkę nad haftem krzyżykowym (Rysunek 3I,J). Uważaj, aby nie uszkodzić trzustki podczas manipulacji.
  15. Krytyczny krok: Używając jedwabnego szwu 5-0, wykonaj ścieg torebkowo-sznurkowy ~1 mm od otworu, obwodowo, przeplatając warstwę skóry i mięśni (Rysunek 3K).
  16. Ustaw ramę okienną tak, aby krawędzie okrągłego nacięcia były osadzone w rowku okna (Rysunek 3L).
  17. Przymocuj wszczepione okno, mocno zawiązując jedwab 5-0.
  18. Do strzykawki o pojemności 1 ml należy załadować 100 μl płynnego kleju cyjanoakrylowego.
  19. Osusz tkankę, stosując delikatny strumień sprężonego powietrza przez ~10 s.
  20. Chwyć ościeżnicę okienną za jej zewnętrzną krawędź kleszczami i delikatnie podnieś, aby zapewnić oddzielenie trzustki od spodu ramy okiennej.
  21. Krytyczny krok: Dozuj cienką warstwę płynnego kleju cyjanoakrylowego wzdłuż wnęki okna (Rysunek 3M). Uważaj, aby klej nie dostał się na tkankę trzustki.
  22. Za pomocą podbieraczy próżniowych podnieś szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm.
  23. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe we wgłębieniu pośrodku ramy okna optycznego. Przytrzymaj z lekkim naciskiem, pozwalając klejowi cyjanoakrylowemu zastygnąć (~25 s).
  24. Oddziel szkiełko nakrywkowe od przetworników próżniowych za pomocą kleszczy.
  25. Zaciśnij szwy do haftu krzyżykowego, aby ściśle przymocować trzustkę do szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3N,O). Uwaga: Nie dokręcaj zbyt mocno haftu krzyżykowego, ponieważ może to spowodować uszkodzenie i niedokrwienie trzustki.
  26. Odetnij końce szwu.
  27. Zdejmij taśmę z myszy.
  28. Wyłącz parownik izofluranu.
  29. Przenieś mysz do czystej klatki lub bezpośrednio do mikroskopu przyżyciowego.
  30. Trzymaj zwierzęta indywidualnie po operacji okna i monitoruj je aż do pełnego wyzdrowienia.
  31. Obrazowanie jest następnie przeprowadzane na dwulaserowym mikroskopie wielofotonowym, jak opisaliśmy wcześniej 22,23,24 W przypadku długich sesji obrazowania mysz jest umieszczana w podgrzewanej komorze w celu utrzymania temperatury ciała i zaopatrywana w płyny pomocnicze zgodnie ze standardami IACUC.

5. Leczenie ceruleiną w indukcji zapalenia trzustki

  1. Aby zbadać początek zapalenia trzustki, należy leczyć zdrowe myszy ceruleiną po implantacji SWIP. Upewnij się, że myszy są na czczo przez 14-18 godzin i otrzymują wodę ad libitum przed podaniem ceruleiny.
  2. Wstrzyknąć 50 μg/kg ceruleiny w 100 μl sterylnego 1x DPBS dootrzewnowo w odstępach 1 godziny na maksymalnie osiem wstrzyknięć. Podawać myszom kontrolnym równoważną objętość 1x sam DPBS, wstrzykiwany dootrzewnowo.
  3. Po obrazowaniu należy złożyć myszy, które należy złożyć w ofierze 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie ze standardami IACUC.
  4. Wykonaj obrazowanie na dwulaserowym mikroskopie wielofotonowym zgodnie z wcześniejszym opisem22,23,24. W przypadku długich sesji obrazowania umieść mysz w podgrzewanej komorze, aby utrzymać temperaturę ciała i zapewnić mu płyny pomocnicze zgodnie ze standardami IACUC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1, zaadaptowany z Du i wsp.15, przedstawia klatki z filmu IVI z zapisem poklatkowym trzustki mysiej. Podczas początkowego okresu stabilizacji można zaobserwować pewien ruch tkanki (pierwsza godzina obrazowania, Rysunek 1A). Jednakże, przy kontynuowaniu obrazowania po tym okresie stabilizacji (>75 min), zaobserwowaliśmy wzrost stabilności bocznej i osiowej (Rysunek 1B). Porównanie stabilności SWIP z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół SWIP zapewnia ulepszoną metodę stabilizacji tkanki trzustki poprzez wykorzystanie techniki haftu krzyżykowego. Wczesne okna obrazowania jamy brzusznej (AIW) umożliwiały obrazowanie przyżyciowe (IVI) narządów wewnętrznych jamy brzusznej, ale nie ograniczały odpowiednio ruchu tkanek miękkich, takich jak trzustka. W odpowiedzi Park i wsp. opracowali okienko do obrazowania trzustki (PIW), które zawiera poziomą metalową półkę i umożliwia lepszą stabilizację tkanki trzustki przy jednoczesnym utrzymaniu k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Fundacja Charytatywna Evelyn Lipper, Centrum Biofotoniki Gruss-Lipper, Zintegrowany Program Obrazowania dla Badań nad Rakiem, stypendium NIH T-32 (CA200561) oraz grant Departamentu Obrony Programu Badań nad Rakiem Trzustki (PCARP) PA210223P1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% (w/v) roztwór detergentu enzymatycznegoAlconox IncNASkoncentrowany, anionowy detergent z enzymami proteazy do czyszczenia ręcznego i ultradźwiękowego
5% (w/v) roztwór wodorotlenku soduSigma-AldrichS8045Odczynnik pasywacyjny
5 mm szkło nakrywkoweMikroskopia elektronowa Sciences72296-05Szkiełka nakrywkowe okrągłe 
7% (w/v) roztwór kwasu cytrynowegoSigma-Aldrich 251275Odczynnik pasywacyjny
28G 1 ml BD Strzykawka insulinowaBD329410Strzykawka do wstrzykiwań komórkowych
Baytril 100 (enrofloksacyna)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntybiotykowa
lampa grzewcza do montażu na stoleMcMaster-Carr3349K51Lampa grzewcza
Buprenorfina 0,3 mg / mlCovetrus Ameryka Północna059122Buprenorfina Analgezja
Castroviejo Zakrzywione nożyczkiWorld Precision InstrumentsWP2220Nożyczki do cięcia tkanek
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 Mysz C57BL/6J
Roztwór chlorheksydynyDurvet7-45801-10258-3Roztwór dezynfekujący chlorheksydyny
Kanister ze sprężonym powietrzemFalconDPSJB-12Sprężone powietrze do suszenia tkanek
Akrylan cyjanowy - Żel SuperglueStaples234790-6Klej do skóry
Akrylan cyjanowy - PłynnezszywkiLOC1647358Klej do szkiełek nakrywkowych
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS do wstrzykiwań ceruleiny/komórek
Zestaw do kauteryzacji GeminiAparat Harvard726067Długopis kauteryczny
Germinator 500CellPoint ScientificGER  5287-120VSterylizator koralików
Graefe Mikro kleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "Roboz SurgicalRS-5135 Graefe Mikro kleszczyki preparacyjne
Mikroskop obrazowaniaNANAZobacz Entenberg et al. 2011 [27]
Oprogramowanie do obrazowaniaNANASee Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033Izofluran Anesthesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Chusteczki Kim
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific159015RTaśma laboratoryjna
Zestaw do preparowania myszy ŚwiatInstrumenty precyzyjneMOUSEKITInstrumenty chirurgiczne
Mysz Pulsoksymetr łapy Czujnik pulsoksymetruKent Scientific CorpoMSTAT Sensor-MSEPulsoksymetr
Mysz SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Podgrzewana platforma
do usuwania włosów Nair BalsamAmazonB001RVMR7KEmulsja do depilacji
OxygenTechAirOX TMTlen
PERMA-HAND Czarne plecione jedwabne szewy, ETHICON Rozmiar 5-0VWR95056-872Jedwabny szew
buforowany fosforanem soli fizjologicznej 1xLife Technologies10010-023
PBS PhysioSuite SystemKent ScientificPodgrzewana platforma PhysioSuite Kontroler
PuralubeHenry Schein Zdrowie zwierząt008897Smar do oczu
Puritan Niesterylne waciki z bawełnianą końcówką Waciki bawełnianeFisher Scientific867WCNOGLUE
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-100, 100 i mikro; LDenville Scientific Inc.P1125100 &mikro; L Końcówki do pipet
Izotiocyjanian tetrametylorodaminy– DextranSigma-AldrichT1287-500MGEtykieta naczyniowa
Płytka mocująca oknoNANAWykonana na zamówienie płytka do umieszczenia okienka na stoliku mikroskopowym. Płytka wykonana jest z 0,008 w kolbie ze stali nierdzewnej. Wymiary płytki można znaleźć w Entenberg et al., 2018 [8] .
Ościeżnicaokienna NANAOkno składa się ze stalowej ramy z centralnym otworem, który akceptuje szkiełko nakrywkowe o grubości 5 mm. Rowek o średnicy 1,75 mm na obwodzie ramy zapewnia przestrzeń na przyleganie warstw mięśni otrzewnej i skóry. Patrz Entenberg i in., 2018 [8].
Superglue

Bibliografia

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Stabilizacja trzustkigruczolakorak trzustkimodel zapalenia trzustkimigracja komórek nowotworowychobrazowanie pojedynczych komórekimplantacja okienkadynamika subkomórkowaobrazowanie seryjne
Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.