Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65530

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mogą różnicować się w dowolny rodzaj komórek, co czyni je doskonałym alternatywnym źródłem ludzkich komórek β trzustki. hPSC mogą być embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC) pochodzącymi z blastocysty lub indukowanymi komórkami pluripotencjalnymi (hiPSC) generowanymi bezpośrednio z komórek somatycznych w procesie przeprogramowywania. W tym artykule przedstawiono protokół oparty na wideo w celu nakreślenia optymalnych warunków hodowli i pasażu dla hPSC, przed ich różnicowaniem i późniejszym generowaniem komórek trzustki produkujących insulinę. Metodologia ta jest zgodna z sześcioetapowym procesem różnicowania ukierunkowanego na β komórek, w którym hPSC różnicują się w ostateczną endodermę (DE), prymitywną cewę jelitową, los tylnego jelita przedniego, komórki progenitorowe trzustki, endokrynologiczne komórki progenitorowe trzustki i ostatecznie komórki β trzustki. Warto zauważyć, że ta metodologia różnicowania potrzebuje 27 dni na wytworzenie ludzkich komórek β trzustki. Potencjał wydzielania insuliny oceniono za pomocą dwóch eksperymentów, które obejmowały barwienie immunologiczne i wydzielanie insuliny stymulowane glukozą.

Wprowadzenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają unikalną zdolność do różnicowania się w różne typy komórek, co czyni je realną alternatywą dla ludzkich komórek β trzustki1. Te hPSC dzielą się na dwa typy: embrionalne komórki macierzyste (hESC), pochodzące z blastocysty2, oraz indukowane komórki pluripotencjalne (hiPSC), generowane przez bezpośrednie przeprogramowanie komórek somatycznych3. Opracowanie technik różnicowania hPSC w komórki β ma ważne implikacje zarówno dla badań podstawowych, jak i praktyki klinicznej1,4. Cukrzyca jest chorobą przewlekłą, która dotyka >400 milionów ludzi na całym świecie i wynika z niezdolności organizmu do regulacji glikemii z powodu nieprawidłowego działania lub utraty komórek β trzustki5. Ograniczona dostępność komórek wysp trzustkowych do przeszczepu utrudniła rozwój terapii komórkowych w leczeniu cukrzycy2,4,6,7. Zdolność do generowania komórek wydzielających insulinę reagujących na glukozę za pomocą hPSC służy jako użyteczny model komórkowy do badania rozwoju i funkcji ludzkich wysp trzustkowych. Może być również stosowany do testowania potencjalnych kandydatów terapeutycznych do leczenia cukrzycy w kontrolowanym środowisku. Co więcej, hPSC mają potencjał do wytwarzania komórek wysp trzustkowych, które są genetycznie identyczne z pacjentem, zmniejszając ryzyko odrzucenia układu immunologicznego po przeszczepie2,4,7.

W ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w udoskonalaniu protokołów hodowli i różnicowania hPSC, co skutkuje zwiększoną wydajnością i powtarzalnością procesu różnicowania w kierunku generowania komórek β trzustki 8,9.

Poniższy protokół przedstawia podstawowe etapy ukierunkowanego różnicowania komórek β trzustki. Polega na regulacji określonych szlaków sygnalizacji komórkowej w różnych punktach czasowych. Opiera się na protokole opracowanym przez Sui L. et al.10 (2018) do generowania hPSC do komórek β trzustki. Protokół został dostosowany do ostatnich aktualizacji od Sui L. et al.11 (2021), ponieważ najnowsze badania podkreślają znaczenie stosowania leczenia afidikoliną (APH) w celu zwiększenia różnicowania komórek β. Obecny protokół obejmuje dodawanie APH do pożywki na późniejszych etapach procesu. Ponadto na wczesnych etapach różnicowania wprowadzono modyfikacje w składzie pożywki w porównaniu z początkowym protokołem. Zauważalną zmianą jest dodanie czynnika wzrostu keratynocytów (KGF) w dniu 6 i trwanie do dnia 8. Czynnik wzrostu keratynocytów (KGF) jest wprowadzany od 6 do 8 dnia, co nieznacznie różni się od początkowego protokołu10, gdzie KGF nie został włączony do pożywki etapu 4.

Pierwszym i niezbędnym krokiem w tworzeniu komórek podobnych do komórek β jest ukierunkowane różnicowanie hPSC w ostateczną endodermę (DE), prymitywną warstwę zarodkową, która powoduje powstanie nabłonkowej wyściółki różnych organów, w tym trzustki. Po utworzeniu DE komórki ulegają różnicowaniu w pierwotną rurkę jelitową, po której następuje określenie losu tylnego jelita przedniego. Tylne jelito przednie rozwija się następnie w komórki progenitorowe trzustki, które mają potencjał różnicowania się we wszystkie typy komórek trzustki, w tym komórki endokrynne i zewnątrzwydzielnicze. Kolejnym etapem procesu są komórki progenitorowe endokrynne trzustki, które dają początek komórkom wydzielającym hormony znajdującym się w wysepkach Langerhansa. W końcu proces różnicowania osiąga swój końcowy etap poprzez wytworzenie w pełni funkcjonalnych komórek przypominających β komórki trzustki9,10. Należy zauważyć, że proces ten jest złożony i często wymaga optymalizacji warunków hodowli, takich jak określone czynniki wzrostu i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, w celu poprawy wydajności i swoistości różnicowania9,10. Co więcej, generowanie funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β z hPSC in vitro nadal stanowi poważne wyzwanie. Trwające badania koncentrują się na ulepszaniu protokołów różnicowania oraz poprawie dojrzewania i funkcji powstałych β-komórek9.

W tym protokole, zastosowanie łagodnej dysocjacji komórek podczas hodowli i pasażu hPSC jest niezbędne do utrzymania żywotności komórek i pluripotencji, znacznie poprawiając efektywność różnicowania w komórki β trzustki. Dodatkowo, każda pożywka specyficzna dla danego etapu została skrupulatnie zoptymalizowana zgodnie z protokołem opracowanym przez Sui L. et al.10 w celu promowania wysokiej wydajności komórek wydzielających insulinę w klastrach, które bardzo przypominają ludzką wyspę trzustkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przed rozpoczęciem różnicowania, zaleca się określenie wymaganej liczby organoidów podobnych do wysepek do celów eksperymentalnych. W płytce 6-dołkowej pojedyncza studzienka z ponad 80% konfluencją zwykle składa się z 2-2,3 miliona hPSC. Podczas gdy dokładna prognoza jest trudna ze względu na różnice w liniach hPSC i efektywność różnicowania, przybliżone oszacowanie to 1,5 raza więcej niż liczba początkowych odwiertów. Skutecznie ukierunkowane różnicowanie zwykle daje od 1,6 do 2 milionów komórek na studzienkę na płytkach sześciodołkowych, obejmujących wszystkie komórki w klastrach, a nie tylko komórki produkujące insulinę. W przypadku klastra 50 μm można w przybliżeniu oszacować, że zawiera około 10 000 komórek. Tabela 1 zawiera podsumowanie składu pożywek stosowanych dla każdego dnia/etapu ukierunkowanego różnicowania na podstawie macierzy i pożywki komórek macierzystych, wraz z buforem do wydzielania insuliny stymulowanym glukozą.

1. Przekazywanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed różnicowaniem w płytkach 6-dołkowych

UWAGA: Odpowiednie przejście ludzkich komórek macierzystych przed różnicowaniem się w komórki podobne do komórek β jest kluczowym krokiem w procesie eksperymentalnym. Nieprawidłowe rozcieńczenie pasażu lub liczba komórek przyłączeniowych może zagrozić wydajności i wierności różnicowania.

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek macierzystych, roztwory powlekające i dysocjacyjne (jak określono w Tabeli 1).
  2. 1-2 godziny przed pasażowaniem pokryć sześciodołkową płytkę roztworem do powlekania na zimno (1 ml na dołek) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Ogrzewać porcję pożywki do hodowli komórek macierzystych w temperaturze pokojowej (15 -25 °C) przez 20 minut.
  4. Odessać pożywkę z komórek macierzystych i dodać 1 ml D-PBS wolnego od wapnia/magnezu.
  5. Powtórz krok 1.4. dwa razy.
    UWAGA: D-PBS dodaje się w celu umycia komórek i usunięcia poprzedniej pożywki i związków. Ważne jest, aby pamiętać, że nie są wymagane żadne konkretne ramy czasowe dla etapów mycia, ponieważ narażenie na D-PBS nie uszkadza hPSC, zapobiegając pękaniu lub kurczeniu się komórek spowodowanym osmozą.
  6. Odessać D-PBS, dodać 500 μl roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki i pozostawić na 2-5 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C).
  7. Podczas dysocjacji komórek odessać roztwór powlekający nowej 6-dołkowej płytki i dodać 1-2 ml D-PBS wolnego od wapnia / magnezu do każdego dołka.
  8. Regularnie sprawdzaj proces dysocjacji pod odwróconym mikroskopem.
  9. Odessać roztwór dysocjacyjny, gdy 80 - 90% komórek jest zaokrąglonych, ale nadal przylega.
  10. Dodać 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej 10 μM inhibitora ROCK.
  11. Zbierz zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, używając sterylnych końcówek do pipet z filtrem o pojemności 1 000 μl i pipety P1000.
  12. Powoli rozcieraj zawiesinę komórek w górę iw dół w pipecie za pomocą sterylnej końcówki z filtrem pipety o pojemności 1 000 μl, aby rozbić kolonie, ale nie przekraczaj 10 razy.
  13. Dodać 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej inhibitor ROCK, aby ułatwić odłączenie pozostałych hPSC i przenieść zawiesinę komórkową do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (1.10).
  14. Odessać D-PBS z nowo pokrytej płytki i natychmiast dodać zawiesinę komórek z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Aby zapewnić optymalny wzrost komórek, wysiewaj zakres 2 x 105- 1 x 106 żywotnych komórek na studzienkę, używając płytki 6-dołkowej (1 na 10 do 1 na 50 podziałów).
    UWAGA: Aby obliczyć objętość, każda studzienka na 6-dołkowej płytce musi zawierać 2 ml pożywki z komórek macierzystych z inhibitorem ROCK.
  15. Przesuwaj płytkę szybko do przodu i do tyłu oraz z boku na bok 5 - 10 razy.
  16. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny.
  17. Następnego dnia należy zastąpić świeżą pożywką z komórek macierzystych bez inhibitora ROCK, a następnie co 2 dni, aż zbieg hPSC osiągnie 80 - 95%.

2. Różnicowanie β komórek ludzkich pochodzących z komórek macierzystych

UWAGA: Komórki hPSC mogą być używane do bezpośredniego procesu różnicowania w komórki β trzustki, gdy osiągnięte jest 80-95% zbieżności.

  1. Dzień -1: Pasażowanie komórek Dzień -1 różnicowania:
    1. Na 1-2 godziny przed pasażem pokryć 6-dołkową płytkę roztworem do powlekania na zimno w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę.
    2. Wykonaj kroki od 1.1 do 1.10 i przejdź do liczenia komórek.
    3. Załaduj 10 μl mieszaniny komórek, dodaj równą objętość błękitu trypanowego i delikatnie wymieszaj.
    4. Oblicz stężenie komórek. Użyj 0,8 × 106 komórek/ml - 1,0 x 106 komórek/ml pożywki z komórek macierzystych zawierającej 10 μM inhibitora ROCK do pokrycia powlekanej 6-dołkowej płytki z 2 ml pożywki na dołek.
    5. Szybko przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu, trzy razy z boku na bok.
    6. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Szybko przesuń talerz do przodu i do tyłu i ponownie na bok 10 razy. Następnie inkubować płytkę przez 4 godziny
      UWAGA: Upewnij się, że maksymalne nasadowanie i równomierne rozmieszczenie komórek nie przeszkadzają komórkom, przesuwając płytkę po umieszczeniu w inkubatorze. Bardzo ostrożnie otwieraj i zamykaj inkubator.
    7. Umieścić butelkę z podłożem podstawowym na dni 0 do 4 w temperaturze 4 °C, aby rozmrozić ją przez noc.
  2. Dzień 0
    UWAGA: Komórki hPSC muszą być zlewające się w 80 - 95%, nie należy rozpoczynać procesu różnicowania do ostatecznej endodermy w tym zbiegu.
    1. Na lodzie rozmrozić zarówno podłoże podstawowe w dniach od 0 do 4, jak i suplementy (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotować w dwóch stożkowych probówkach tylko niezbędną objętość do użycia w dniu 1 (2 ml na dołek płytki 6-dołkowej), a w oddzielnej probówce podwoić objętość na dzień 2,5 do 4 (2 x 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej). Przechowywać podłoże z dnia 2,5 do dnia 4 w temperaturze 4 °C.
    3. Ogrzewać porcję niezbędnej objętości pożywki dnia 1 i pożywki myjącej 1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Odessać pożywkę z komórkami macierzystymi i dodać 2 ml pożywki myjącej 1,
      UWAGA: Pożywka myjąca zastosowana w protokole składa się z podłoża podstawowego specyficznego dla każdego dnia/etapu, uzupełnionego 1% antybiotykami. Etapy mycia w protokole bezpośredniego rozróżniania obejmują jedynie dodanie wyznaczonego środka myjącego (określanego jako "środek myjący 1 lub 2", tabela materiałów) i późniejsze zasysanie, zgodnie z opisaną procedurą ppkt 2.2.4. Należy wspomnieć, że nie ma określonych ram czasowych wskazanych dla tych etapów prania.
    5. Odessać pożywkę myjącą 1 i natychmiast dodać 2 ml pożywki dnia 1 na bok studzienki.
    6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Dzień 1
    1. Podgrzać podwielokrotność niezbędnej objętości pożywki z dni 2,5 do 4 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Odessać pożywkę dnia 1 i natychmiast dodać 2 ml pożywki dnia 2,5 do 4 z boku studzienki. Nie myj komórek.
    3. Umieść płytkę z powrotem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 36 godzin.
  4. Dni od 2,5 do 4
    1. Podgrzać podwielokrotność pozostałej objętości pożywki w temperaturze 2,5-4 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Odessać pożywkę i natychmiast dodać 2 ml świeżo przygotowanej pożywki Days 2,5 do 4 na bok studzienki.
    3. Umieść płytkę z powrotem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 36 godzin.
  5. Dzień 4
    UWAGA: Na tym etapie ekspresja ostatecznych markerów endodermy jest maksymalna, a komórki mogą inicjować prymitywne różnicowanie cewy jelitowej.
    1. Przygotować porcję niezbędnej objętości pożywki do pierwotnego stadium jelitowego dnia 4 (2 ml na studzienkę na płytce sześciodołkowej) i ogrzewać ją w temperaturze pokojowej (15 °C -25 °C) przez 20 minut.
    2. Odsysaj Dni 2,5 do 4 pożywki i dodaj 2 ml pożywki myjącej 1.
    3. Odessać pożywkę myjącą 1 i natychmiast dodać 2 ml pierwotnego stadium jelitowego dnia 4 na bok studzienki.
    4. Umieść płytkę z powrotem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 48 godzin.
  6. Dni od 6 do 8
    UWAGA: Na tym etapie komórki inicjują dalsze różnicowanie w kierunku losu tylnego jelita przedniego.
    1. Przygotować niezbędną objętość pożywki z tylnego jelita przedniego z dnia 6 do 8 (2 ml na dołek płytki 6-dołkowej) i ogrzać pożywkę w temperaturze pokojowej (15 °C -25 °C) przez 20 minut.
    2. Odessać pożywkę dnia 4 i natychmiast dodać 2 ml pożywki z tylnego jelita przedniego dnia 6 do 8 z boku studzienki.
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 na 48 godzin.
  7. Dni od 8 do 12
    UWAGA: Komórki są gotowe do poddania się różnicowaniu komórek progenitorowych trzustki.
    1. Przygotować niezbędną objętość pożywki etapowej dla przodków trzustki w dniach od 8 do 12 (2 ml na dołek na płytce 6-dołkowej) i ogrzewać pożywkę w temperaturze pokojowej (15 °C -25 °C) przez 20 minut.
    2. Odessać pożywkę z dni 6 do 8 i natychmiast dodać 2 ml pożywki z tylnego jelita przedniego z dni 6 do 8 z boku studzienki.
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO2 przez 48 godzin.
  8. Dzień 12: Wykonanie kroku grupowania
    UWAGA: Na tym etapie komórki tworzą gęstą monowarstwę i zostaną przeniesione do hodowli komórkowej 3D w celu utworzenia klastrów. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla różnicowania w celu zwiększenia podobieństwa strukturalnego komórek podobnych do komórek podobnych do β do rodzimych ludzkich wysepek, ale także poprawia ich podobieństwo funkcjonalne zarówno na poziomie komórkowym, jak i klastrowym11(Rysunek 1).
    1. Płytkę 6-dołkową zawierającą mikrostudzienki o wielkości 400 μm (jak określono w tabeli materiałów: Różnicowanie ukierunkowane na β komórek macierzystych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, dzień 12) należy poddać działaniu 2 ml roztworu do płukania zapobiegającego przyleganiu w temperaturze pokojowej (15 °C - 25 °C).
      UWAGA: Mikrostudzienka zapobiega przyczepianiu się komórek do dna studzienki i ułatwia mechaniczne tworzenie klastrów 3D.
    2. Płytka wirówkowa o ciśnieniu 1 300 x g przez 5 min.
    3. Sprawdź, czy pod odwróconym mikroskopem nie ma pęcherzyków. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych pęcherzyków, odessać płyn płuczący zapobiegający przywieraniu i natychmiast dodać 2 ml środka myjącego 2 (tabela materiałów).
    4. Powtórz krok 1.8.3. dwa razy.
    5. Przygotować odpowiednią objętość pożywki zbiorczej i ogrzać ją w temperaturze pokojowej (15 -25 °C) przez 20 minut. Upewnić się, że dwie studzienki z płytki 6-dołkowej znajdują się w jednym dołku z 6-dołkową płytką mikrodołkową 400 μm z 4 ml pożywki klastrowej.
    6. Odessać pożywkę progenitorową trzustki i dodać bufor dysocjacyjny (0,5 ml na studzienkę).
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej (15 °C - 25 °C) przez 2-5 minut. Regularnie sprawdzaj proces dysocjacji pod odwróconym mikroskopem i aspiruj bufor dysocjacyjny, gdy większość komórek jest zaokrąglona, ale nadal przylega.
    8. Odessać bufor dysocjacyjny i natychmiast dodać 1 ml pożywki klastrowej do każdej studzienki.
    9. Dysocjacja komórek odbywa się poprzez sześciokrotne delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety P1000 i końcówek filtrujących o pojemności 1 000 μl.
    10. Przenieść komórki i mieszaninę pożywki zbiorczej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    11. Dodaj 1 ml pożywki klastrowej, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki.
    12. Dodaj pożywkę klastrową do całkowitej potrzebnej objętości, tak aby każda studzienka płytki mikrostudzienki zawierała 4 ml mieszaniny pożywki/komórek klastra.
    13. Odessać pożywkę płuczącą 2 z płytki 6-dołkowej mikrostudzienek i przenieść zawiesinę komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  9. Dzień 13: Postępowanie z komórkami po grupowaniu i zmiana ich pożywki od dnia 13.
    UWAGA: Klastry są bardzo wrażliwe i wymagają ostrożnego obchodzenia się z nimi, aby zapewnić ich integralność i żywotność w kolejnych dniach. Dlatego tak ważne jest ścisłe monitorowanie klastrów w okresie po grupowaniu po 12 dniu. Regularna ocena i korekty są niezbędne do promowania pomyślnych wyników w procesie eksperymentalnym.
    1. Przygotować niezbędną objętość pożywki z dnia 13 (2 ml na dołek z płytki 6-dołkowej) oraz w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml na dzień 15 do 20 pożywki progenitorowej trzustki.
    2. Powoli zbieraj klastry z 6-dołkowej płytki mikrostudzienki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety p1000 i przefiltrowanych końcówek o pojemności 1,000 μl.
    3. Dodać 1 ml pożywki z dnia 13, aby zebrać pozostałe grona i przenieść je do probówki.
    4. Pozwól komórkom naturalnie ustawić się pod wpływem grawitacji na dnie stożkowej rurki na 5 minut.
    5. Odessać jak najwięcej supernatantu z probówki, nie naruszając skupisk komórek. Końcówki pipet nie powinny dotykać ani zasysać klastrów, a jedynie supernatant.
    6. Dodać niezbędną objętość pożywki z dnia 13 zgodnie z następującymi zasadami: 1 studzienka mikrostudzienkowa Płytka 6-dołkowa trafia do trzech dołków 6-dołkowej płytki o niskim przyłączeniu (2 ml pożywki na studzienkę).
    7. Delikatnie pipetować w górę i w dół, unikając zasysania aparatów udowych.
    8. Przenieść zawiesinę na płytkę 6-dołkową o bardzo niskiej przyczepności.
    9. Przesuń płytkę szybko do przodu i do tyłu, z boku na bok sześć razy.
    10. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    11. Dokonać zmian pożywki we wszystkich następnych krokach, aż do końca różnicowania, jak opisano w niniejszej sekcji 2.9.
  10. Dni od 15 do 20
    1. Zmieniać na pożywkę progenitorową endokrynną trzustki co 48 godzin do 21 dnia różnicowania, zbierając zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wykonując kroki od 2.9.4 do 2.9.10 dla dnia 13.
  11. Dni od 21 do 27
    UWAGA: Na tym etapie klastry różnicują się w komórki β trzustki.
    1. Przygotuj pożywkę do fazy β komórkowej trzustki.
    2. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień zgodnie z opisem dla dni od 15 do 21,
      UWAGA: Po 25 dniu organoidy przypominające wysepki mogą zostać poddane analizie w celu potwierdzenia, że są w pełni funkcjonalne.

3. Barwienie klastrów komórek β trzustki

UWAGA: Wykonaj ten krok, aby zbadać funkcjonalną ocenę klastrów po różnicowaniu

  1. Zbierz od pięciu do dziesięciu klastrów w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml pod koniec różnicowania.
  2. Utrwal klastry komórek za pomocą 200 μl 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 1 ml PBS do klastrów i usunąć PBS za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, nie naruszając klastrów.
  4. Dodać 200 μl 30% sacharozy do klastrów i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieś kiście do krioformy, usuń nadmiar sacharozy, dodaj kroplę pożywki OCT i wymieszaj grona z podłożem OCT.
  6. Zamrozić kriomold na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Wyciąć skrawki 5 μm z zamrożonego bloku na szkiełkach mikroskopowych za pomocą mikrotomu/lub kriostatu.
  8. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu zabrudzenia.
  9. W dniu barwienia wyjmij szkiełka z zamrażarki o temperaturze -80 °C.
  10. Ostrożnie usuń lód wokół sekcji krioformy.
  11. Zakreśl klastry komórek na szkiełkach za pomocą hydrofobowego pisaka.
  12. Nawilżaj szkiełka w słoiku do barwienia szkiełek zawierających PBS przez 15 minut.
  13. Dodać zimny metanol do słoika do barwienia szkiełek i umieścić słoik ze szkiełkami w temperaturze -20 °C na 10 minut.
  14. Zanurz szkiełka w słoiku PBS.
  15. Powtórz krok 3.14 trzy razy.
    UWAGA: Użyj tej metody dla wszystkich poniższych etapów prania.
  16. Usunąć PBS ze szkiełek i natychmiast zalać 100 μl roztworu blokującego z 2-5% BSA w PBS-T.
  17. Dodaj roztwór blokujący do każdego szkiełka i przykryj folią parafinową.
  18. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (15 -25 °C).
  19. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w roztworze blokującym, stosując proporcje podane w sekcji Odczynniki i roztwory.
  20. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek.
  21. Natychmiast dodać rozcieńczone przeciwciała i przykryć szkiełka parafilmem, aby zapobiec wyschnięciu szkiełka.
  22. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  23. Następnego dnia umyj szkiełka 3 - 5 razy za pomocą PBS-T.
  24. Przygotować rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe i barwienie DNA.
  25. Usuń nadmiar PBS-T ze szkiełek.
  26. Dodaj rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe i barwienie DNA. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej (15 -25 °C).
  27. Umyj szkiełka 3 - 5 razy za pomocą PBS-T.
  28. Usuń płyn ze szkiełek.
  29. Dodaj kroplę histologicznej pożywki montażowej do każdej sekcji.
  30. Przykryj szkiełko szklaną osłoną.
  31. Rób zdjęcia zabarwionych szkiełek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. GSIS (test wydzielania insuliny stymulowany glukozą)

  1. Przygotuj trzy różne roztwory: roztwór KREBS o niskiej zawartości glukozy, roztwór KREBS o wysokiej zawartości glukozy i roztwór KREBS o niskiej zawartości glukozy z KCl.
  2. Podgrzać wszystkie roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Ostrożnie wybierz około 10 - 15 klastrów o podobnej wielkości za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml wraz z niewielką ilością zróżnicowanego podłoża, aby uniknąć wysuszenia klastrów.
    UWAGA: Klastry powinny być widoczne gołym okiem, ale jeśli nie, umieść płytkę zawierającą zróżnicowane skupiska pod odwróconym mikroskopem, aby wybrać klastry i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Umieść probówkę z klastrami i podłożem na stojaku na probówki i poczekaj, aż grona opadną na dno probówki.
  5. Powoli odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl i dodać 200 μl roztworu KREBS o niskiej zawartości glukozy.
  6. Inkubować wyspy trzustkowe w roztworze o niskiej zawartości glukozy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Aby zapewnić dokładną ocenę liczby klastrów i spójność w eksperymentach, zaleca się sprawdzenie obecności wszystkich skupisk w roztworze podczas przenoszenia, ponieważ mają one tendencję do przylegania do probówki.
  7. Wyjąć probówkę z inkubatora i powoli zassać 200 μl roztworu KREBS bez zasysania jakichkolwiek klastrów.
  8. Dodać 200 μl roztworu KREBS o niskiej zawartości glukozy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Odessać objętość 200 μl roztworu KREBS o niskiej zawartości glukozy do probówki o pojemności 500 μl i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C w celu pomiaru insuliny. Powtórz dla oddzielnych zabiegów.
  10. Aby umyć klastry, należy dodać 200 μl roztworu KREBS bez glukozy do probówki zawierającej klastry. Pozwól, aby klastry osiadły na dnie probówki i ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając ich obecności.
  11. Dodać 200 μl roztworu KREBS o wysokiej zawartości glukozy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  12. Odessać 200 μl leku KREBS o wysokiej zawartości glukozy do probówki o pojemności 500 μl i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C w celu pomiaru insuliny. Powtórz dla oddzielnych zabiegów.
  13. Aby umyć klastry, należy dodać 200 μl roztworu KREBS bez glukozy do probówki zawierającej klastry. Pozwól, aby klastry osiadły na dnie probówki i ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając ich obecności.
  14. Dodać 200 μl roztworu KCl KREBS i powtórzyć dla oddzielnych zabiegów.
  15. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  16. Odessać 200 μl roztworu KCl KREBS do probówki o pojemności 500 μl i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C w celu pomiaru insuliny. Powtórz dla innych zabiegów.
  17. Dodać 50 μl ultraczystej wody i przystąpić do pomiaru całkowitej zawartości insuliny.
  18. Dodaj 150 μl kwaśnego roztworu etanolu do probówki z wysepkami i wodą ultraczystą.
  19. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc (12–15 godzin).
  20. Następnego dnia należy wymieszać każdą próbkę.
  21. Wykonaj sonikację za pomocą elektrycznego sonikatora ustawionego na 20% mocy przez 1 s, aby zapewnić całkowitą lizę tkanki wysp trzustkowych.
    UWAGA: Powtarzaj krok 4.21, aż nie będą widoczne żadne pozostałe klastry.
  22. Wszystkie próbki należy odwirować o masie 10 000 × g przez 10 minut i zachować supernatant.
  23. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru nanokropli, który można następnie wykorzystać do normalizacji pomiarów insuliny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszej pracy oferuje wysoce wydajne podejście do różnicowania komórek podobnych do β z hPSC10. Proces ten wykorzystuje system hodowli 2D, który jest łatwo skalowalny, co umożliwia jego zastosowanie w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak nauka różnicowania, mniejsze projekty i laboratoria oraz testy pilotażowe w celu oceny potencjału różnicowania danej linii iPSC.

Kluczowe jest scharakteryzowanie właściwości funkcjonalnych zróżnicowanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślne różnicowanie hPSC w komórki β trzustki zależy od optymalizacji wszystkich aspektów rutynowej hodowli i pasażu wybranych komórek hPSC. Obejmuje to zapewnienie, że linia komórkowa ma prawidłowy kariotyp, jest ujemna pod względem zakażenia mykoplazmą i jest wolna od genomów plazmidów lub wektorów wirusowych. Ponadto w przypadku korzystania z hiPSC ważne jest, aby unikać korzystania z najwcześniejszych przejść, które są jeszcze w trakcie przeprogramowywania, do eksperymentów pilotażowych. Eksperymenty te powinny być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ines Cherkaoui otrzymała wsparcie od Diabetes UK (BDA 18/0005934) dla GAR, która również dziękuje Wellcome Trust za Nagrodę Badacza (212625/Z/18/Z), UKRI MRC za grant Programu (MR/R022259/1), Diabetes UK za grant na projekt (BDA16/0005485), CRCHUM dla funduszy start-upowych, Innovation Canada za Nagrodę Lidera Johna R. Evansa (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) w przypadku grantu na projekt oraz CIHR, JDRF w przypadku grantu zespołowego (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4--2023-1182-S-N). Camille Dion i dr Harry Leitch za pomoc w tworzeniu i hodowli hiPSC u ludzi, NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid Facility, Londyn.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówek TubeOneStarlabsS1615-5500
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermoFisher Scientific165218
Płytka 6-dołkowa AggreWell 400 STEMCELL Technologies34425
Anty-glukagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Antyinsulinowy DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anty-PDX1 Abcamab84987
Suplement AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 (50X), bez surowicy Thermo Fisher Scientific17504044
Surowica bydlęca Albumina, bez kwasów tłuszczowychSigma-AldrichA3803-100G
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC3306
Bez wapnia/magnezu D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyklopamina-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glukoza, BioXtraSigma-AldrichG7528
Wodorofosforan disodowy, bezwodnySigma-Aldrich94046-100ML-DMEM
plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016Do Prania Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Szkiełka adhezyjne Epredi SuperFrost Plus ThermoFisher Scientific10149870
EtanolVWR20821.33
Surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10270098
Inhibitor gamma-sekretazy XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Zredukowany czynnik wzrostu BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 do zimnego podłoża DMEM/F-12, aby zapewnić końcowe rozcieńczenie 1:100.
Kozia świnka anty-gwinejska, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Kozia świnia anty-morska, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Kozie przeciwciało wtórne anty-króliczą IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparynaSigma-AldrichH3149
Bufor HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrichlorowodorekThermo Fisher ScientificH1399
Ludzkie FGF-7 (KGF) Rekombinowane białkoThermo Fisher ScientificPHG0094
ChlorowodórSigma-Aldrich295426
ImmEdge Bariera hydrofobowa PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM9272-500G
Związek OCT 118 mlAgar ScientificAGR1180
PBS Tabletki, sól fizjologiczna buforowana fosforanem, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicylina-Streptomycyna (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Chlorek potasuSigma-Aldrich7447-40-7
Rekombinowane ludzkie białko EGFR& D Systems236-EG-200
Okulary nakrywkowe prostokątne, 22 razy; 50 mmVWR631-0137
RepSox (chlorowodorek)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAX   Thermo Fisher Scientific61870036Medium do prania 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6014-500G
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Diwodorofosforan sodu bezwodnySigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderma STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Rozmrażaj suplement StemFlex przez noc w temperaturze 4& C, przenieść pozostały płyn z butelki z suplementem do StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Reprocell kwasu retinowego04-0021 
Tarczyca Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
Enzym ekspresowy trypL (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Płytka o bardzo niskiej przyczepności do hodowli zawiesinyThermo Fisher Scientific38071
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNazThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (dichlorowodorek) STEMCELL Technologies72302
SiarczanSigma-Aldrich Z4750
płodu powiedział:

Bibliografia

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
  5. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
  6. Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
  7. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  8. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
  9. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
  10. Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).
  11. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).
  12. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  13. Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
  14. Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
  15. Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

komórki beta trzustkiróżnicowanie komórek betaostateczna endodermaprogenitorzy trzustkiglukozostymulowana sekrecja insulinyobrazowanie immunofluorescencyjnepasażowanie komórekinhibitor ROCK
Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.